CN114487448B - 用于检测重症肌无力相关抗体的组合物、试剂盒及应用 - Google Patents
用于检测重症肌无力相关抗体的组合物、试剂盒及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114487448B CN114487448B CN202210072137.2A CN202210072137A CN114487448B CN 114487448 B CN114487448 B CN 114487448B CN 202210072137 A CN202210072137 A CN 202210072137A CN 114487448 B CN114487448 B CN 114487448B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- antibody
- myasthenia gravis
- vector
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 title claims abstract description 123
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 60
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 38
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims abstract description 8
- 108010009685 Cholinergic Receptors Proteins 0.000 claims description 105
- 102000034337 acetylcholine receptors Human genes 0.000 claims description 105
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 61
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 58
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 58
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 58
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 claims description 26
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 claims description 26
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 25
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 claims description 24
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 claims description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 22
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 21
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 14
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 10
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 7
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 6
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 claims description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 4
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 claims description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 21
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 14
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 abstract description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 108
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 241000402754 Erythranthe moschata Species 0.000 description 14
- 101150078127 MUSK gene Proteins 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 102100021918 Low-density lipoprotein receptor-related protein 4 Human genes 0.000 description 11
- 238000003156 radioimmunoprecipitation Methods 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 101000952934 Homo sapiens Atrial natriuretic peptide-converting enzyme Proteins 0.000 description 10
- 101001043598 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor-related protein 4 Proteins 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 206010028372 Muscular weakness Diseases 0.000 description 3
- DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-N Tyramine Natural products NCCC1=CC=C(O)C=C1 DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000036473 myasthenia Effects 0.000 description 3
- 210000000715 neuromuscular junction Anatomy 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 229960003732 tyramine Drugs 0.000 description 3
- DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-O tyraminium Chemical group [NH3+]CCC1=CC=C(O)C=C1 DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 3
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001039256 Caenorhabditis elegans Low-density lipoprotein receptor-related protein Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 101000694288 Homo sapiens 40S ribosomal protein SA Proteins 0.000 description 2
- 101001030069 Homo sapiens Major vault protein Proteins 0.000 description 2
- 101001043564 Homo sapiens Prolow-density lipoprotein receptor-related protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000738769 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase alpha Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004108 Neurotransmitter Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108090000590 Neurotransmitter Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 230000001004 anti-acetylcholinic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000000544 cholinesterase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- 102100039791 43 kDa receptor-associated protein of the synapse Human genes 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 208000003164 Diplopia Diseases 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101000744504 Homo sapiens 43 kDa receptor-associated protein of the synapse Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010061306 Lipoprotein Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000011965 Lipoprotein Receptors Human genes 0.000 description 1
- 101710123602 Low-density lipoprotein receptor-related protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 208000032376 Lung infection Diseases 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 206010033661 Pancytopenia Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 208000017787 Paraneoplastic neurologic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 201000009362 combined thymoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003792 cranial nerve Anatomy 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 1
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 208000027905 limb weakness Diseases 0.000 description 1
- 231100000861 limb weakness Toxicity 0.000 description 1
- 230000029226 lipidation Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000020763 muscle atrophy Effects 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000004237 neck muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 208000012111 paraneoplastic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002616 plasmapheresis Methods 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001242 postsynaptic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 201000003004 ptosis Diseases 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
- C12Y207/01112—Protein-tyrosine kinase (2.7.1.112)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70571—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/91—Transferases (2.)
- G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
- G01N2333/9121—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases
- G01N2333/91215—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases with a definite EC number (2.7.1.-)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于免疫检测领域,具体来说,本发明涉及一种用于检测重症肌无力相关抗体的组合物、试剂盒及其应用,以及检测重症肌无力相关抗体的方法。本发明提供的用于检测重症肌无力相关抗体的组合物,能够利用表达重症肌无力相关抗原的细胞、第二抗体、显色物构建“一抗‑HRP二抗‑TSA”的荧光检测***,实现对抗AChR抗体、抗MuSK抗体和抗LRP4抗体的高效检测,具有高的灵敏度和特异性,为MG患者的早期诊断、预后评估提供有效的诊断信息,具有重要的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测领域,具体来说,本发明涉及一种用于检测重症肌无力相关抗体的组合物、试剂盒及其应用,以及检测重症肌无力相关抗体的方法。
背景技术
重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是由自身抗体介导的获得性神经-肌肉接头传递障碍的自身免疫性疾病。全球患病率为(150-250)/百万,预估年发病率为(4-10)/百万。我国MG发病率约为0.68/10万,女性发病率略高,各个年龄阶段均可发病,70-74岁年龄组为高发人群。全身骨骼肌均可受累,表现为波动性无力和易疲劳性,症状呈“晨轻暮重”,活动后加重、休息后可减轻。早期易累及颅神经,眼外肌受累最常见,表现为眼睑下垂和复视。目前,MG的治疗以胆碱酯酶抑制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂、静脉注射免疫球蛋白、血浆置换以及胸腺切除为主。部分患者短期内病情可出现迅速进展,发生肌无力危象。其住院死亡率为14.69‰,主要死亡原因包括呼吸衰竭、肺部感染等。
MG患者血清中可以检测到多种自身抗体,乙酰胆碱受体(acetylcholinereceptor,AChR)抗体是最常见的致病性抗体,约80%MG患者抗体阳性,同一患者抗体滴度与病情严重程度呈正相关。发病年龄晚、高滴度的AChR抗体和合并胸腺瘤等因素可能会增加MG的继发性泛化的风险。在早期使用免疫抑制药物,被认为可以降低继发性泛化的风险。因此,早发现、早诊断对于MG患者的治疗、预后具有重要意义。
MG也与肌肉特异性酪氨酸激酶(muscle-specific tyrosine kinase,MuSK)抗体、低密度脂蛋白4(anti-low-density lipoprotein receptor-related protein 4,LRP4)抗体等也是MG致病性抗体。在AChR抗体阴性患者中,约5%-8%MG患者MuSK抗体阳性,多见于年轻女性,眼球和颈部肌肉受累最重,肌肉萎缩发生率更高,常为快速病程,发病数周就可出现呼吸衰竭等威胁生命的症状,MuSK-Ab阳性MG患者临床分型均为全身型,抗体的滴度水平与疾病严重程度相关,胆碱酯酶抑制剂及激素治疗效果不佳。低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体(LRP4-Ab)是近年来发现的新的MG自身抗体,可与上述两种自身抗体同时存在,或单独致病。LRP4是存在于神经肌肉接头处突触后膜上的跨膜蛋白质,作为聚集蛋白的受体对MuSK激活,AChR聚集以及维持神经肌肉接头的结构起重要作用。
临床上常用的检测重症肌无力患者血清抗体(AChR、MuSK、LRP4)的方法包括放射免疫沉淀法(Radio-immunoprecipitation Assay,RIPA),酶联免疫吸附法(The enzyme-linked immunosorbent assay Elisa)和细胞免疫荧光染色法(Cell-Based fluorescentimmunostaining Assay,CBA)。抗体滴度定量对于MG病情监测很重要。虽然RIPA通过检测放射性标记物定量换算出MG患者血清中抗体的实际浓度,为较好的定量检测方法,但放射性的使用有一定的技术限制,试剂的有效期短,约为1个月,而且还存在放射性污染。RIPA的诊断敏感性在成年发作的全身型MG中较高(80%-85%),但在眼部MG中较低(约50%),仍有约10%的MG患者体内抗体无法通过RIPA检出。酶联免疫方法(ELISA)虽然有效期长,灵敏度高,但由于其难以维持抗原的空间构象,致使其特异性不高,容易出现假阳性,并且其检测试剂因为强酸性而污染环境。基于以上两种方法的试剂盒依赖进口,其价格昂贵、检测成本较高,极大的限制了这些检测手段的推广。
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在的问题,例如,重症肌无力的检测方法存在灵敏性和特异性低,无法实现针对MG患者的有效检出。为此,本发明提供了用于检测重症肌无力相关抗体的组合物,能够利用表达重症肌无力相关抗原的细胞、第二抗体、显色物构建“一抗-HRP二抗-TSA”的荧光检测***,实现对抗AChR抗体、抗MuSK抗体和抗LRP4抗体中至少一种的高效检测,具有高的灵敏度和特异性,为MG患者的早期诊断、预后评估提供有效的诊断信息。
用于解决问题的方案
第一方面,本发明提供了一种用于检测重症肌无力相关抗体的组合物,其中,所述组合物包括:表达重症肌无力相关抗原的细胞、第二抗体、显色物;其中,
所述重症肌无力相关抗原包括乙酰胆碱受体、肌肉特异性酪氨酸激酶和低密度脂蛋白4中的一种或两种以上的组合;
所述第二抗体偶联有标记物;并且,当所述第二抗体与所述重症肌无力相关抗体结合时,所述标记物催化所述显色物产生荧光或发生荧光猝灭。
在一些实施方式中,根据本发明所述的组合物,其中,所述表达重症肌无力相关抗原的细胞包含如下(i)-(iii)组成的组中的一种或两种以上的组合:
(i)包括编码形成乙酰胆碱受体各亚基的第一多核苷酸组;
(ii)编码肌肉特异性酪氨酸激酶的第二多核苷酸;
(iii)编码低密度脂蛋白4的第三多核苷酸;
优选地,所述第一多核苷酸组包括如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列的多核苷酸;或者,包括如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示序列的多核苷酸;
优选地,所述第二多核苷酸为如SEQ ID NO:1所示序列的多核苷酸;
优选地,所述第三多核苷酸为如SEQ ID NO:2所示序列的多核苷酸。
在一些实施方式中,根据本发明所述的组合物,其中,所述表达重症肌无力相关抗原的细胞包括:表达乙酰胆碱受体的第一细胞,表达肌肉特异性酪氨酸激酶的第二细胞,和表达低密度脂蛋白4的第三细胞;
优选地,所述第一细胞选自如下的至少一种:包含如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列的多核苷酸的第一细胞,包含如SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示序列的多核苷酸的第一细胞;
所述第二细胞包含如SEQ ID NO:1所示序列的多核苷酸;所述第三细胞包含如SEQID NO:2所示序列的多核苷酸。
在一些实施方式中,根据本发明所述的组合物,其中,所述标记物为辣根过氧化物酶,所述显色物为酪酰胺荧光素;可选地,所述荧光素选自如下的任一种:异硫氰酸荧光素,罗丹明,四甲基罗丹明异硫氰酸盐,Texas Red,藻红蛋白,碘化丙啶,Alexa Fluor系列,Dylight系列,iFluor系列。
在一些实施方式中,根据本发明所述的组合物,其中,所述表达重症肌无力相关抗原的细胞的制备方法包括:
载体构建步骤:构建表达形成乙酰胆碱受体的各亚基第一载体组,表达肌肉特异性酪氨酸激酶的第二载体,以及表达低密度脂蛋白4的第三载体;
转染步骤:使用第一载体组、第二载体和第三载体中的至少一种转染细胞;
筛选步骤:筛选表达乙酰胆碱受体、肌肉特异性酪氨酸激酶和/或低密度脂蛋白4的细胞,获得表达重症肌无力相关抗原的细胞。
在一些实施方式中,根据本发明所述的组合物,其中,所述转染步骤包括:分别使用第一载体组、第二载体和第三载体转染细胞,得到转入有第一载体组的第一转染细胞、转入有第二载体的第二转染细胞,和转入有第三载体的第三转染细胞;
所述筛选步骤包括:对所述第一转染细胞、第二转染细胞和第三转染细胞进行筛选,得到表达乙酰胆碱受体的第一细胞,表达肌肉特异性酪氨酸激酶的第二细胞,以及表达低密度脂蛋白4的第三细胞;
优选地,所述第一载体组合、所述第二载体与所述第三载体转染细胞的质量比为1:1:1。
在一些实施方式中,根据本发明所述的组合物,其中,所述第一载体组中分别包含如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列的重组表达载体转染细胞的质量比为1:2:1:1:1;或者,
所述第一载体组中分别包含如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:8所示序列的重组表达载体转染细胞的质量比为1:2:1:1:1。
第二方面,本发明提供了一种用于检测重症肌无力相关抗体的试剂盒,其中,所述试剂盒包括如第一方面所述的组合物。
第三方面,本发明提供了一种根据第一方面所述的组合物或根据第二方面所述的试剂盒在如下(a)-(b)至少一种中的用途:
(a)检测重症肌无力相关抗体,或制备用于检测重症肌无力相关抗体的试剂盒;
(b)制备用于重症肌无力的诊断或预后诊断的试剂盒。
第四方面,本发明提供了一种检测重症肌无力相关抗体的方法,其中,所述方法包括如下步骤:
将待测样品与如第一方面所述的组合物或如第二方面所述的试剂盒接触;
获取荧光信号,根据所述荧光信号判断所述待测样品中是否含有抗乙酰胆碱受体抗体、抗肌肉特异性酪氨酸激酶抗体和/或抗低密度脂蛋白4抗体。
发明的效果
在一些实施方式中,本发明提供的用于检测重症肌无力相关抗体的组合物,能够利用表达重症肌无力相关抗原的细胞、第二抗体、显色物构建“一抗-HRP二抗-TSA”的荧光检测***,实现对抗乙酰胆碱受体(AChR)抗体、抗肌肉特异性酪氨酸激酶(MuSK)抗体和抗低密度脂蛋白4(LRP4)抗体中至少一种的高效检测,具有高的灵敏度和特异性,为重症肌无力患者的早期诊断、预后评估提供有效的诊断信息。
本发明利用细胞表达重症肌无力相关抗原,利用CBA法进行MG患者的诊断。由于CBA法能够维持AChR抗原构象,在检测抗体检测方面不仅具有类似RIPA法的高特异性,同时clustered AChR抗体的检出率比放免法提高21-56%。因此,CBA法在AChR和MuSK抗体检测方面具有较好的特异性和灵敏性的优势。
此外,由于MG患者中MuSK抗体和LRP4抗体阳性的患者比例较低(≤10%),本发明通过开发一种用于检测重症肌无力相关抗体(含AChR、MuSK和LRP4三种致病性抗体)的组合物,最大程度提高MG抗体检出率,为MG临床诊治提供更全面的抗体检测支持。此外,本试剂盒利用新型的“一抗-HRP二抗-TSA”的荧光检测***,能够实现对血清中含低丰度的AChR抗体、MuSK抗体和抗LRP4抗体的高效检测,具有高的灵敏度和特异性,为MG患者的早期诊断、预后评估提供有效的诊断信息,具有重要的临床应用价值。
在一些优选的实施方式中,本发明提供的组合物,能够同时实现对抗AChR抗体、抗MuSK抗体,以及抗LRP4抗体的联合检出,显著提高了针对重症肌无力的诊断准确性,减轻漏检及误检的发生,具有重要的临床应用价值。
在一些实施方式中,本发明直接以表达重症肌无力相关抗原的细胞对MG进行检测,通过在细胞内表达相关抗原,可维持抗原的天然三维构象,提高抗原与抗体结合的特异性和亲和力,进而提高检出重症肌无力的准确性。
在一些优选的实施方式中,本发明使用的具有特定核酸序列的多核苷酸或重组表达载体表达目标抗原,能够提高临床抗体检测呈阴性患者的检出率,具有重要的诊断意义。
在一些实施方式中,本发明提供的组合物能够实现针对胚胎型AChR抗体和成人型AChR抗体的有效检出,对不同MG患者的抗AChR抗体均具有较高检出率。
附图说明
图1示出了实施例1中载体PEGFP-N1的载体图谱;
图2示出了实施例1中转染AChR重组质粒的细胞荧光观察结果;
图3示出了实施例2中以试剂盒对AChR、MuSK、LRP4抗体进行检测的荧光观察结果,其中A为AChR阳性的第一细胞、B为MuSK阳性的第二细胞、C为空白对照、D为LRP4阳性的第三细胞;
图4示出了实施例3中MuSK四种亚基对AChR抗体阴性MG患者的检出率的比较结果;
图5示出了实施例4中采用CBA-TSA、Elisa与RIPA诊断MG患者的特异性和灵敏度的比较结果。
具体实施方式
定义
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时,词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”,但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的,词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的,并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中,术语“约”表示:一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”,但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外,权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
术语“HRP”为辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP),催化“Donor+H2O2→Oxidized donor+2H2O”的反应过程。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换地使用并且为任意长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线形或分支的,它可以包含修饰的氨基酸,并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如,二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作,如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。多肽可以从天然来源分离,可以通过重组技术从真核或原核宿主产生并且可以是合成方法的产物。
术语“多核苷酸”或“核酸分子”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式,也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分,其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的,能够通过标准分子生物学方法(例如,使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时,这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C),其中“U”取代“T”。换句话说,“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物,或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分,如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。“重组多核苷酸”、“重组核酸分子”属于“多核苷酸”中的一种。
术语“载体”指的是DNA构建体,其含有与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列,从而在合适的宿主中表达目的基因。术语“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括,例如包含i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合,例如启动子和增强子;ii)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列;以及iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要,并可以使用任何载体,包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。
如本公开所使用的,术语“表达”、“编码”包括涉及RNA产生及蛋白产生的任何步骤,包括但不限于:转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
术语“待测样品”涉及需要确定其中是否含有与重症肌无力相关抗体的任意种类的样品。示例性的,待测样品可以是受试者产生的任何产物、或源自于受试者产生产物的任何产物。样品可以取自任何组织或体液,例如血液样品(包括得自血液的样品)、血清样品、脑脊液样品、淋巴样品、唾液样品、关节滑液等等。
技术方案
在本发明的技术方案中,说明书核苷酸和氨基酸序列表的编号所代表的含义如下所示:
SEQ ID NO:1示出编码肌肉特异性酪氨酸激酶(MUSK)的核苷酸序列;
SEQ ID NO:2示出编码低密度脂蛋白4(LRP4)的核苷酸序列;
SEQ ID NO:3示出编码形成乙酰胆碱受体(AChR)的RAPSN亚基的核苷酸序列;
SEQ ID NO:4示出编码形成乙酰胆碱受体(AChR)的α亚基的核苷酸序列;
SEQ ID NO:5示出编码形成乙酰胆碱受体(AChR)的β亚基的核苷酸序列;
SEQ ID NO:6示出编码形成乙酰胆碱受体(AChR)的δ亚基的核苷酸序列;
SEQ ID NO:7示出编码形成乙酰胆碱受体(AChR)的γ亚基的核苷酸序列;
SEQ ID NO:8示出编码形成乙酰胆碱受体(AChR)的ε亚基的核苷酸序列。
用于检测重症肌无力相关抗体的组合物
本发明提供的用于检测重症肌无力相关抗体的组合物,包括:表达重症肌无力相关抗原的细胞、第二抗体、显色物;其中,
所述重症肌无力相关抗原包括乙酰胆碱受体、肌肉特异性酪氨酸激酶和低密度脂蛋白4中的一种或两种以上的组合;
所述第二抗体偶联有标记物;并且,当所述第二抗体与所述重症肌无力相关抗体结合时,所述标记物催化所述显色物产生荧光或发生荧光猝灭。
本发明提供的组合物,利用细胞表达重症肌无力相关抗原,可以结合至少一种的重症肌无力相关抗体,第二抗体进一步结合重症肌无力相关抗体,在显色物存在时,第二抗体偶联的标记物催化显色物产生荧光或发生荧光猝灭,实现对抗AChR抗体、抗MuSK抗体、抗LRP4抗体中至少一种的免疫荧光检测,为重症肌无力患者的临床诊断提供有效的诊断信息。
本发明利用表达重症肌无力相关抗原的细胞、第二抗体、显色物成功构建了“一抗-HRP二抗-TSA”的酪酰胺信号放大***,具有高的灵敏度和特异性,解决了目前重症肌无力诊断时存在的检出率低、存在假阳性等的问题。
<表达重症肌无力相关抗原的细胞>
在本发明中,通过表达乙酰胆碱受体、肌肉特异性酪氨酸激酶和低密度脂蛋白4中的一种或两种以上的组合的细胞,可用于结合待测样品中抗AChR抗体、抗MuSK抗体、抗LRP4抗体中至少一种,进而实现对MG患者的免疫检测。
在一些实施方式中,表达重症肌无力相关抗原的细胞包括表达乙酰胆碱受体(AChR)的第一细胞。利用第一细胞表达AChR,可维持AChR的天然空间构象,提高与抗AChR抗体结合的亲和力,进而提高对抗AChR抗体检测的灵敏性和特异性。
进一步的,第一细胞包含第一多核苷酸组,第一多核苷酸组包括编码形成乙酰胆碱受体的多肽的多核苷酸。乙酰胆碱受体是一种五聚体跨膜糖蛋白,在一些具体的实施方式中,第一多核苷酸组包括如下的多核苷酸:编码AChR的α亚基的多核苷酸,编码AChR的β亚基的多核苷酸,编码AChR的δ亚基的多核苷酸,编码AChR的γ亚基的多核苷酸,以及编码突触受体关联蛋白Rapsn的多核苷酸。第一细胞利用第一多核苷酸组编码的多肽,可稳定表达乙酰胆碱受体,实现对抗AChR抗体的特异性结合、检测。
在一些优选的实施方式中,第一多核苷酸组包含如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列的多核苷酸。上述的多核苷酸能够编码形成胚胎型AChR,维持蛋白的天然三维构象,实现对胚胎型AChR抗体的准确检测。
在一些具体的实施方式中,第一多核苷酸组包括如下的多核苷酸:编码AChR的α亚基的多核苷酸,编码AChR的β亚基的多核苷酸,编码AChR的δ亚基的多核苷酸,编码AChR的ε亚基的多核苷酸,以及编码突触受体关联蛋白Rapsn的多核苷酸。第一细胞利用第一多核苷酸组编码的多肽,可稳定表达乙酰胆碱受体,实现对抗AChR抗体的特异性结合、检测。
在一些优选的实施方式中,第一多核苷酸组包含如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示序列的多核苷酸。上述的多核苷酸能够编码形成成人型AChR,维持蛋白的天然三维构象,实现对成人型AChR抗体的准确检测。
本发明中的组合物不仅能实现对成人型AChR抗体的检测,还能实现对胚胎型AChR抗体的检测,有利于提高对重症肌无力患者抗AChR抗体的检出率,具有高的临床诊断意义。
在一些实施方式中,表达重症肌无力相关抗原的细胞包括表达肌肉特异性酪氨酸激酶(MuSK)的第二细胞。利用第二细胞表达MuSK,可维持MuSK的天然空间构象,提高与抗MuSK抗体结合的亲和力,进而提高对抗MuSK抗体检测的灵敏性和特异性。
进一步的,第二细胞包含编码肌肉特异性酪氨酸激酶的第二多核苷酸,第二细胞内利用第二多核苷酸编码形成具有天然三维构象的肌肉特异性酪氨酸激酶。
在一些优选的实施方式中,第二多核苷酸为如SEQ ID NO:1所示序列的多核苷酸。本发明发现利用SEQ ID NO:1所示序列的多核苷酸编码的MuSK,对抗MuSK抗体阳性的MG患者具有更高的检出率,有利于提高对MG患者诊断的准确率。
在一些实施方式中,表达重症肌无力相关抗原的细胞包括表达低密度脂蛋白4(LRP4)的第三细胞。利用第三细胞表达LRP4,可维持LRP4的天然空间构象,提高与抗LRP4抗体结合的亲和力,进而提高对抗LRP4抗体检测的灵敏性和特异性。
进一步的,第三细胞包含编码低密度脂蛋白4的第三多核苷酸,第三细胞内利用第三多核苷酸编码形成具有天然三维构象的低密度脂蛋白4。
在一些优选的实施方式中,第三多核苷酸为如SEQ ID NO:2所示序列的多核苷酸。本发明利用SEQ ID NO:2所示序列的多核苷酸编码的LRP4,对抗LRP4抗体具有高的结合特异性和灵敏度,有利于提高对MG患者诊断的准确率。
在一些实施方式中,表达重症肌无力相关抗原的细胞包括表达表达乙酰胆碱受体(AChR)的第一细胞,表达肌肉特异性酪氨酸激酶(MuSK)的第二细胞,以及表达低密度脂蛋白4(LRP4)的第三细胞。在另外一些实施方式中,表达重症肌无力相关抗原的细胞还可以同时表达乙酰胆碱受体、肌肉特异性酪氨酸激酶和低密度脂蛋白4,均能够同时对抗AChR抗体、抗MuSK抗体和抗LRP4抗体进行同时检测,并且具有高特异性和高灵敏度,进而实现对MG患者的准确检出。
<表达重症肌无力相关抗原的细胞的制备方法>
本发明提供的表达重症肌无力相关抗原的细胞的制备方法包括:
载体构建步骤:构建表达形成乙酰胆碱受体的多肽的第一载体组,表达肌肉特异性酪氨酸激酶的第二载体,以及表达低密度脂蛋白4的第三载体;
转染步骤:使用第一载体组、第二载体和第三载体中的至少一种转染细胞;
筛选步骤:筛选表达乙酰胆碱受体、肌肉特异性酪氨酸激酶和/或低密度脂蛋白4的细胞,获得表达重症肌无力相关抗原的细胞。
在一些实施方式中,所述转染步骤包括:分别使用第一载体组、第二载体和第三载体转染细胞,得到转入有第一载体组的第一转染细胞、转入有第二载体的第二转染细胞,和转入有第三载体的第三转染细胞;
所述筛选步骤包括:对所述第一转染细胞、第二转染细胞和第三转染细胞进行筛选,得到表达乙酰胆碱受体的第一细胞,表达肌肉特异性酪氨酸激酶的第二细胞,以及表达低密度脂蛋白4的第三细胞。
在一些优选地实施方式中,所述第一载体组合、所述第二载体与所述第三载体转染细胞的质量比为1:1:1。
在一些优选地实施方式中,所述第一载体组中分别包含如SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列的重组表达载体转染细胞的质量比为1:2:1:1:1。
在另外一些优选地实施方式中,所述第一载体组中分别包含如SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示序列的重组表达载体转染细胞的质量比为1:2:1:1:1。
本发明提供的方法能够构建表达乙酰胆碱受体、肌肉特异性酪氨酸激酶和/或低密度脂蛋白4的细胞,重整肌无力相关抗原与抗体结合的特异性和准确性高,且极其稳定,检测成本降低。
<第二抗体>
在本发明中,待测样品中含有的抗AChR抗体、抗MuSK抗体和/或抗LRP4抗体是第一抗体,第一抗体能够与细胞表达的重症肌无力相关抗原发生抗原-抗体特异性结合。第二抗体又能与第一抗体发生抗原-抗体特异性结合,在标记物的催化作用下实现对靶蛋白高密度原位标记的酶学检测。
在一些实施方式中,标记物为酶,示例性的,包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP),碱性磷酸酶(AP)或其衍生物等。酶与第二抗体可以是直接连接或间接连接。当第二抗体与重症肌无力相关抗体结合后,酶催化显色物,使显色物产生荧光或发生荧光猝灭。
在一些优选的实施方式中,标记物为辣根过氧化物酶(HRP),利用辣根过氧化酶(HRP)能够对靶蛋白进行高密度原位标记,并且可与高性能染料Alexa传统荧光染料和比色检测***相兼容,构建酪酰胺信号放大***。
在一些优选的实施方式中,HRP与第二抗体是间接连接,示例性的,标记物连接生物素,第二抗体连接亲和素;或者HRP连接亲和素,第二抗体连接生物素。通过生物素与亲和素之间的高亲和力结合使HRP标记于第二抗体上,并且实现多级的信号放大效应。
在一些实施方式中,第二抗体为抗人抗体。示例性的,第二抗体包括但不限于山羊抗人抗体,大鼠抗人抗体,小鼠抗人抗体,猪抗人抗体,驴抗人抗体,绵羊抗人抗体,鸡抗人抗体,马抗人抗体,兔抗人抗体,仓鼠抗人抗体,狗抗人抗体,牛抗人抗体等,优选山羊抗人抗体。
在一些实施方式中,第二抗体的类型包括但不限于IgG,IgA,IgM,IgG(Fc),IgG(ab’)2等;优选IgG。
<显色物>
在本发明中,显色物可在标记物催化下产生荧光或发生荧光淬灭,产生可供检测的荧光信号。
在一些优选的实施方式中,显色物为酪胺荧光素。酪胺荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化,跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联,使得蛋白样品与荧光素稳定结合。进一步的,荧光素包括但不限异硫氰酸荧光素,罗丹明,四甲基罗丹明异硫氰酸盐,Texas Red,藻红蛋白,碘化丙啶,AlexaFluor系列,Dylight系列,iFluor系列。当第二抗体结合重症肌无力相关抗体后,酪胺荧光素发生活化,并与靶蛋白共价偶联,产生可供检测的荧光信号。
本发明提供的表达重症肌无力相关抗原的细胞、第二抗体、显色物能够构建“一抗-HRP二抗-TSA”***,建立高灵敏度和高特异性的检测待测样品中抗AChR抗体、抗Musk抗体和/或抗LRP4抗体的方法,检测灵敏度和特异性显著高于ELISA的检测方法,并且灵敏度高于放射免疫检测法,对于提高不同抗体分型的MG患者的检出率具有重要意义,为重症肌无力的早期诊断和预后评估提高可靠的临床诊断信息。
用于检测重症肌无力相关抗体的试剂盒
本发明提供的用于检测重症肌无力相关抗体的试剂盒,包括用于检测重症肌无力相关抗体的组合物。
酪酰胺信号放大技术(TSA,Tyramide Signal Amplification),又称作催化信号放大技术(CSA,Catalyzed Signal Amplification),TSA技术是一类利用辣根过氧化物酶(HRP,Horseradish Peroxidase)对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。目前应用较为广泛,包括免疫荧光(Immunofluorescence,IF)、免疫组化。该技术可与高性能染料Alexa Fluor、传统荧光染料和比色检测***相兼容。TSA技术的原理为酪胺-荧光化合物在HRP的催化下与靶标原位及附近的酪氨酸残基以共价键结合,生成稳定的荧光化合物。也可通过HRP催化将酪胺-半抗原化合物(如酪胺-生物素)以共价键结合在靶标原位及附近的酪氨酸残基上,再与随后加入的Streptavidin-HRP/荧光基团结合,经几轮循环放大,可以结合大量的酶分子或荧光基团,结果使其检测信号得到100-1000倍放大。通过使用该技术可以检测到传统方法无法检出的低丰度靶标。该法的优点为放大的荧光信号具有理想的光、热、pH稳定性,样品可长时间保存,且利用TSA进行的多色荧光标记不受一抗种属的限制。
本发明提供的试剂盒能够构建“一抗-HRP二抗-TSA”***,实现对检测待测样品中抗AChR抗体、抗Musk抗体和/或抗LRP4抗体的高灵敏度和高特异性检测,对于提高MG患者的检出率及诊断准确性具有重要意义。
实施例
本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是,应当理解的是,详细描述和具体实施例(虽然表示本发明的具体实施方式)仅为解释性目的而给出,因为在阅读该详细说明后,在本发明的精神和范围内所作出的各种改变和修饰,对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
实施例中采用的所有试剂,除非另有强调,否则均可以通过商业途径购买获得。
实施例1:检测AChR/Musk/LRP4抗体的试剂盒的制备
1、质粒的扩增与提取
利用全基因合成方式合成AChR各亚基、MuSK全长基因和LRP4全长基因。利用核酸内切酶,DNA连接酶等将如SEQ ID NO:1~8所示的目的基因与分别与载体进行连接,得到分别包含如SEQ ID NO:1~8所示的目的基因的重组表达载体。本实施例中利用PEGFP-N1载体构建(GenBank Accession:U55762.1)重组表达载体,如SEQ ID NO:1~8所示的目的基因连接至PEGFP-N1载体的多克隆位点区(MSC)。将组建好的质粒导入感受态大肠杆菌中。将大肠杆菌涂板后于培养箱中培养,挑出单克隆菌株进行测序并保种。将鉴定测序正确的克隆菌涂于固体培养基上。予37℃培养箱培养1-2天,将长出的菌落置于液体培养基中,振荡培养过夜。离心扩增后菌液,用质粒大量抽提试剂盒,按说明书要求提取质粒。nanodrop测量质粒浓度,分装后-20℃保存。
2、293T细胞的培养
(1)细胞复苏:取15ml离心管加入2-4mL培养基预热至37℃。从液氮中取出冷冻细胞,在37℃水浴中轻轻旋转<1min直至融化,用75%酒精消毒后迅速移至15mL离心管中,1000rmp离心5分钟,弃上清,重悬细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,37℃,5%CO2、饱和湿度下培养。
(2)细胞传代:镜下观察细胞,生长密度达到90%以上即可进行传代;弃掉培养基,沿瓶壁无细胞侧加入1.5~3mL无菌PBS缓冲液,轻晃一圈立即弃去PBS,重新加入500μLPBS及1mL胰酶消化细胞,十字摇晃至有白膜脱落,消化时长约1min,加入3mL DMEM完全培养基终止消化;将上述液体转移至15mL离心管中,1000rpm离心5min;弃去上清,加1mL完全培养基重悬后转移到加有培养基的96孔板,每96孔板需100-150μL细胞+9.6mL培养基;细胞悬液混匀后,每孔加入100μL细胞悬液,十字摇晃混匀后转至培养箱中继续培养。
3、细胞转染
(1)质粒准备:
Musk质粒、LRP4质粒转染试剂配制时分别加5μg质粒。
AChR质粒组合:共6个亚基,分2种组合,每种组合总量5μg进行转染:
表1
比例 | 使用量 | 比例 | 使用量 | ||
α | 2 | 1.66 | α | 2 | 1.66 |
β | 1 | 0.83 | β | 1 | 0.83 |
Rapsn | 1 | 0.83 | Rapsn | 1 | 0.83 |
δ | 1 | 0.83 | δ | 1 | 0.83 |
ε | 1 | 0.83 | ε | 1 | 0.83 |
(2)细胞转染:镜下观察细胞,细胞密度60%-70%左右开始转染。取无菌1.5ml EP管,标记A,分别依次加入OPTI-MEM 125μL、质粒5μg、P3000 10μL,轻轻吹匀2-3次,避免气泡;另取无菌1.5ml EP管,标记B,分别依次加入OPTI-MEM 125μL、Lipofectamine 3000 3.8μL,轻轻吹匀2-3次,避免气泡。将A液加入B液中,轻轻吹匀5-7次,避免气泡,静置13分钟。将AB混合液逐滴加入96孔板中,轻轻摇晃,37℃培养箱中过夜培养,于6小时换成新的DMEM完全培养基,继续于CO2培养箱中培养1-2天,直至细胞长满。其中,质粒包括Musk质粒、LRP4质粒和AChR质粒组合,三种质粒分开转染细胞,得到分别转入有AChR质粒组合的第一细胞,转入有Musk质粒的第二细胞,以及转入有LRP4质粒的第三细胞。
在荧光显微镜下观察转染效果:转染AChR重组质粒的293T细胞能够表达绿色荧光蛋白(GFP)和乙酰胆碱受体蛋白(AChR蛋白)。由图2可见,293T细胞成功转染了AChR重组质粒,可表达绿色荧光蛋白。
(3)转染细胞固定与保存:转染后细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次,每次5min;每孔中加入4%多聚甲醛固定30min;PBS洗涤2次,每次5min;加入蛋白保存液,4℃保存。
实施例2:AChR/Musk/LRP4抗体的试剂盒用于待测样品的检测
(1)复温:孔板及相关试剂(包括洗涤液,封闭液)从4度冰箱中取出,室温复温10-15分钟后进行染色。
(2)洗涤:弃去保存液,每孔加入150μl PBS溶液,洗涤2次。
(3)破膜:每孔加入50μl 0.5%Triton X-100(PBS稀释)溶液,室温静置20分钟。
(4)洗板:每孔中加入150μl PBS溶液,摇床洗涤,3次×3min。
(5)过氧化物酶处理:每孔中加入50μl过氧化物酶溶液,室温静置20分钟。
(6)洗板:每孔中加入150μl PBST溶液,摇床洗涤,3次×3min。
(7)PBST溶液配制:500ml PBS+800μl Tween20+300μl Triton-100,摇晃至完全溶解,试剂于4℃保存。
(8)血清封闭:每孔中加入50μl血清封闭液,室温静置30分钟。
(9)一抗孵育:每孔加入60μl,37℃恒温箱静置40min。
(10)血清配置:1:40稀释(血清封闭液稀释)。
(11)洗板:每孔中加入150μl PBST溶液,摇床洗涤,3次×7min。
(12)二抗孵育:每孔中加入50μl二抗工作溶液,室温静置30分钟。
(13)二抗工作液配制:羊抗人IgG,1:2000稀释(PBST稀释)。
(14)洗板:每孔中加入150μl PBST溶液,摇床洗涤,3次×7min。
(15)TSA显色:每孔中加入50μl TSA显色液,室温静置1分钟(注意:每排单独计1min)。
(16)洗板:每孔中加入150μl PBST溶液,摇床洗涤,2次×4min。
(17)观察:每孔加入50-100μl PBST,镜下观察(注意:避免有气泡)。
荧光显微镜下观察实验结果。以转染空载体的细胞对照,在20倍物镜视野下依据激发荧光(激发波长555nm)的信号强弱来标示抗体浓度的相对量。如图3所示,其中A为AChR阳性的第一细胞、B为阳性的第二细胞、C为空白对照、D为LRP4阳性的第三细胞。
实施例3:比较不同的MuSK亚基对AChR抗体阴性的MG患者的检出率
本实施例构建4种Musk过表达质粒,其中亚基1为(NCBI:NM_005592.4)所示序列的Musk亚基,亚基2为(NCBI:NM_001166280.2)所示序列的Musk亚基,亚基3为(NM_001166281.2)所示序列的Musk亚基,亚基4为(NM_001369398.1)所示序列的Musk亚基。
选择临床上诊断为MG但AChR抗体阴性的MG患者,利用4种Musk过表达质粒对病人血清中抗Musk抗体进行检测,结果如图4所示,在MG患者血清中,MuSK亚基1的抗体阳性患者为10例,MuSK亚基2和3抗体阳性患者为8例,MuSK亚基4抗体阳性患者为7例,说明本公开中基于表达MuSK亚基1的重组表达载体(SEQ ID NO:2所示序列)构建的细胞能够高特异性结合抗MuSK抗体,提高针对AChR抗体阴性的MG患者的检出率。
实施例4:检测试剂盒对MG患者抗AChR抗体的检出率
本实施例收集335例临床诊断为MG患者,利用实施例1中构建的试剂盒检测AChR抗体亚型,包括胚胎型和成人型。检测结果见表格1,335例患者中,胚胎型和成人型AChR抗体都是阳性的患者为179例,单独成人型AChR抗体阳性为50例,单独胚胎型AChR抗体阳性为35例,胚胎型和成人型AChR抗体全为阴性的患者为70例。
以上结果说明本发明构建的用于检测重症肌无力相关抗体的组合物中,除了可以用于检测成人型的AchR(含a,β,δ,ε,rapsn)抗体外,也可以检测胚胎型的AchR(含a,β,δ,γ,rapsn)抗体,提高对于重症肌无力疾病中AchR的检出率。
表2检测335例MG患者中胚胎型和成人型AChR抗体情况
胚胎型AChR阳性 | 胚胎型AChR阴性 | |
成人型AChR阳性 | 179 | 50 |
成人型AChR阴性 | 36 | 70 |
实施例5:检测试剂盒的灵敏度和特异性
为进一步验证CBA-TSA法(使用实施1中构建的试剂盒)检测AChR抗体的灵敏度和特异性,本实施例比较了从2021年2月份到5月份天津医科大学总医院收取的34例患者(MG患者29例;非MG患者5例)血清。将这些血清分别利用放射性免疫法,Elisa和CBA-TSA盲法检测AChR抗体。结果显示:选取的34例样本中利用三种方法检测到AChR抗体阳性的MG患者26例,其中非MG患者3例(1例神经***副肿瘤综合征;1例肢体无力待查;1例副肿瘤综合征相关性肌无力综合征)利用三种方法检测均为AChR抗体阴性。值得注意的是利用Elisa方法检测到2例非MG患者(1例免疫相关性全血细胞减少;1例胸腺囊肿)为AChR抗体阳性,而RIPA和CBA-TSA检测为阴性;2例临床诊断为重症肌无力患者利用CBA-TSA检测为AChR抗体阳性,而RIPA和Elisa检测为阴性。这些结果提示CBA-TSA方法检测AChR抗体特异性与RIPA一致,而灵敏度较RIPA和Elisa高(图5)。
本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围,提供所述实施方案例如来说明本公开的各方面。从本文的描述和教导,对所述组合物和方法的各种修改将变得明显。可以在不脱离本公开的真正范围和精神的情况下实践这类变化,并且这类变化旨在落入本公开的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津天海新域生物科技有限公司
<120> 用于检测重症肌无力相关抗体的组合物、试剂盒及应用
<130> 6886-2143600I
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2610
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of MUSK
<400> 1
atgagagagc tcgtcaacat tccactggta catattctta ctctggttgc cttcagcgga 60
actgagaaac ttccaaaagc tcctgtcatc accactcctc ttgaaacagt ggatgcctta 120
gttgaagaag tggctacttt catgtgtgca gtggaatcct acccccagcc tgagatttcc 180
tggactagaa ataaaattct cattaaactc tttgacaccc ggtacagcat ccgggagaat 240
gggcagctcc tcaccatcct gagtgtggaa gacagtgatg atggcattta ctgctgcacg 300
gccaacaatg gtgtgggagg agctgtggag agttgtggag ccctgcaagt gaagatgaaa 360
cctaaaataa ctcgtcctcc cataaatgtg aaaataatag agggattaaa agcagtccta 420
ccatgtacta caatgggtaa tcccaaacca tcagtgtctt ggataaaggg agacagccct 480
ctcagggaaa attcccgaat tgcagttctt gaatctggga gcttgaggat tcataacgta 540
caaaaggaag atgcaggaca gtatcgatgt gtggcaaaaa acagcctcgg gacagcatat 600
tccaaagtgg tgaagctgga agttgaggtt tttgccagga tcctgcgggc tcctgaatcc 660
cacaatgtca cctttggctc ctttgtgacc ctgcactgta cagcaacagg cattcctgtc 720
cccaccatca cctggattga aaacggaaat gctgtttctt ctgggtccat tcaagagagt 780
gtgaaagacc gagtgattga ctcaagactg cagctgttta tcaccaagcc aggactctac 840
acatgcatag ctaccaataa gcatggggag aagttcagta ctgccaaggc tgcagccacc 900
atcagcatag cagaatggag taaaccacag aaagataaca aaggctactg cgcccagtac 960
agaggggagg tgtgtaatgc agtcctggca aaagatgctc ttgtttttct caacacctcc 1020
tatgcggacc ctgaggaggc ccaagagcta ctggtccaca cggcctggaa tgaactgaaa 1080
gtagtgagcc cagtctgccg gccagctgct gaggctttgt tgtgtaacca catcttccag 1140
gagtgcagtc ctggagtagt gcctactcct attcccattt gcagagagta ctgcttggca 1200
gtaaaggagc tcttctgcgc aaaagaatgg ctggtaatgg aagagaagac ccacagagga 1260
ctctacagat ccgagatgca tttgctgtcc gtgccagaat gcagcaagct tcccagcatg 1320
cattgggacc ccacggcctg tgccagactg ccacatctag attataacaa agaaaaccta 1380
aaaacattcc caccaatgac gtcctcaaag ccaagtgtgg acattccaaa tctgccttcc 1440
tcctcctctt cttccttctc tgtctcacct acatactcca tgactgtaat aatctccatc 1500
atgtccagct ttgcaatatt tgtgcttctt accataacta ctctctattg ctgccgaaga 1560
agaaaacaat ggaaaaataa gaaaagagaa tcagcagcag taaccctcac cacactgcct 1620
tctgagctct tactagatag acttcatccc aaccccatgt accagaggat gccgctcctt 1680
ctgaacccca aattgctcag cctggagtat ccaaggaata acattgaata tgtgagagac 1740
atcggagagg gagcgtttgg aagggtgttt caagcaaggg caccaggctt acttccctat 1800
gaacctttca ctatggtggc agtaaagatg ctcaaagaag aagcctcggc agatatgcaa 1860
gcggactttc agagggaggc agccctcatg gcagaatttg acaaccctaa cattgtgaag 1920
ctattaggag tgtgtgctgt cgggaagcca atgtgcctgc tctttgaata catggcctat 1980
ggtgacctca atgagttcct ccgcagcatg tcccctcaca ccgtgtgcag cctcagtcac 2040
agtgacttgt ctatgagggc tcaggtctcc agccctgggc ccccacccct ctcctgtgct 2100
gagcagcttt gcattgccag gcaggtggca gctggcatgg cttacctctc agaacgtaag 2160
tttgttcacc gagatttagc caccaggaac tgcctggtgg gcgagaacat ggtggtgaaa 2220
attgccgact ttggcctctc caggaacatc tactcagcag actactacaa agctaatgaa 2280
aacgacgcta tccctatccg ttggatgcca ccagagtcca ttttttataa ccgctacact 2340
acagagtctg atgtgtgggc ctatggcgtg gtcctctggg agatcttctc ctatggcctg 2400
cagccctact atgggatggc ccatgaggag gtcatttact acgtgcgaga tggcaacatc 2460
ctctcctgcc ctgagaactg ccccgtggag ctgtacaatc tcatgcgtct atgttggagc 2520
aagctgcctg cagacagacc cagtttcacc agtattcacc gaattctgga acgcatgtgt 2580
gagagggcag agggaactgt gagtgtctaa 2610
<210> 2
<211> 5718
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of LRP4
<400> 2
atgaggcggc agtggggcgc gctgctgctt ggcgccctgc tctgcgcaca cggcctggcc 60
agcagccccg agtgtgcttg tggtcggagc cacttcacat gtgcagtgag tgctcttgga 120
gagtgtacct gcatccctgc ccagtggcag tgtgatggag acaatgactg cggggaccac 180
agcgatgagg atggatgtat actacctacc tgttcccctc ttgactttca ctgtgacaat 240
ggcaagtgca tccgccgctc ctgggtgtgt gacggggaca acgactgtga ggatgactcg 300
gatgagcagg actgtccccc ccgggagtgt gaggaggacg agtttccctg ccagaatggc 360
tactgcatcc ggagtctgtg gcactgcgat ggtgacaatg actgtggcga caacagcgat 420
gagcagtgtg acatgcgcaa gtgctccgac aaggagttcc gctgtagtga cggaagctgc 480
attgctgagc attggtactg cgacggtgac accgactgca aagatggctc cgatgaggag 540
aactgtccct cagcagtgcc agcgcccccc tgcaacctgg aggagttcca gtgtgcctat 600
ggacgctgca tcctcgacat ctaccactgc gatggcgacg atgactgtgg agactggtca 660
gacgagtctg actgctcctc ccaccagccc tgccgctctg gggagttcat gtgtgacagt 720
ggcctgtgca tcaatgcagg ctggcgctgc gatggtgacg cggactgtga tgaccagtct 780
gatgagcgca actgcaccac ctccatgtgt acggcagaac agttccgctg tcactcaggc 840
cgctgtgtcc gcctgtcctg gcgctgtgat ggggaggacg actgtgcaga caacagcgat 900
gaagagaact gtgagaatac aggaagcccc caatgtgcct tggaccagtt cctgtgttgg 960
aatgggcgct gcattgggca gaggaagctg tgcaacgggg tcaacgactg tggtgacaac 1020
agcgacgaaa gcccacagca gaattgccgg ccccggacgg gtgaggagaa ctgcaatgtt 1080
aacaacggtg gctgtgccca gaagtgccag atggtgcggg gggcagtgca gtgtacctgc 1140
cacacaggct accggctcac agaggatggg cacacgtgcc aagatgtgaa tgaatgtgcc 1200
gaggaggggt attgcagcca gggctgcacc aacagcgaag gggctttcca atgctggtgt 1260
gaaacaggct atgaactacg gcccgaccgg cgcagctgca aggctctggg gccagagcct 1320
gtgctgctgt tcgccaatcg catcgacatc cggcaggtgc tgccacaccg ctctgagtac 1380
acactgctgc ttaacaacct ggagaatgcc attgcccttg atttccacca ccgccgcgag 1440
cttgtcttct ggtcagatgt caccctggac cggatcctcc gtgccaacct caacggcagc 1500
aacgtggagg aggttgtgtc tactgggctg gagagcccag ggggcctggc tgtggattgg 1560
gtccatgaca aactctactg gaccgactca ggcacctcga ggattgaggt ggccaatctg 1620
gatggggccc accggaaagt gttgctgtgg cagaacctgg agaagccccg ggccattgcc 1680
ttgcatccca tggagggtac catttactgg acagactggg gcaacacccc ccgtattgag 1740
gcctccagca tggatggctc tggacgccgc atcattgccg atacccatct cttctggccc 1800
aatggcctca ccatcgacta tgccgggcgc cgtatgtact gggtggatgc taagcaccat 1860
gtcatcgaga gggccaatct ggatgggagt caccgtaagg ctgtcattag ccagggcctc 1920
ccgcatccct tcgccatcac agtgtttgaa gacagcctgt actggacaga ctggcacacc 1980
aagagcatca atagcgctaa caaatttacg gggaagaacc aggaaatcat tcgcaacaaa 2040
ctccacttcc ctatggacat ccacaccttg cacccccagc gccaacctgc agggaaaaac 2100
cgctgtgggg acaacaacgg aggctgcacg cacctgtgtc tgcccagtgg ccagaactac 2160
acctgtgcct gccccactgg cttccgcaag atcagcagcc acgcctgtgc ccagagtctt 2220
gacaagttcc tgctttttgc ccgaaggatg gacatccgtc gaatcagctt tgacacagag 2280
gacctgtctg atgatgtcat cccactggct gacgtgcgca gtgctgtggc ccttgactgg 2340
gactcccggg atgaccacgt gtactggaca gatgtcagca ctgataccat cagcagggcc 2400
aagtgggatg gaacaggaca ggaggtggta gtggatacca gtttggagag cccagctggc 2460
ctggccattg attgggtcac caacaaactg tactggacag atgcaggtac agaccggatt 2520
gaagtagcca acacagatgg cagcatgaga acagtactca tctgggagaa ccttgatcgt 2580
cctcgggaca tcgtggtgga acccatgggc gggtacatgt attggactga ctggggtgcg 2640
agccccaaga ttgaacgagc tggcatggat gcctcaggcc gccaagtcat tatctcttct 2700
aatctgacct ggcctaatgg gttagctatt gattatgggt cccagcgtct atactgggct 2760
gacgccggca tgaagacaat tgaatttgct ggactggatg gcagtaagag gaaggtgctg 2820
attggaagcc agctccccca cccatttggg ctgaccctct atggagagcg catctattgg 2880
actgactggc agaccaagag catacagagc gctgaccggc tgacagggct ggaccgggag 2940
actctgcagg agaacctgga aaacctaatg gacatccatg tcttccaccg ccgccggccc 3000
ccagtgtcta caccatgtgc tatggagaat ggcggctgta gccacctgtg tcttaggtcc 3060
ccaaatccaa gcggattcag ctgtacctgc cccacaggca tcaacctgct gtctgatggc 3120
aagacctgct caccaggcat gaacagtttc ctcatcttcg ccaggaggat agacattcgc 3180
atggtctccc tggacatccc ttattttgct gatgtggtgg taccaatcaa cattaccatg 3240
aagaacacca ttgccattgg agtagacccc caggaaggaa aggtgtactg gtctgacagc 3300
acactgcaca ggatcagtcg tgccaatctg gatggctcac agcatgagga catcatcacc 3360
acagggctac agaccacaga tgggctcgcg gttgatgcca ttggccggaa agtatactgg 3420
acagacacgg gaacaaaccg gattgaagtg ggcaacctgg acgggtccat gcggaaagtg 3480
ttggtgtggc agaaccttga cagtccccgg gccatcgtac tgtaccatga gatggggttt 3540
atgtactgga cagactgggg ggagaatgcc aagttagagc ggtccggaat ggatggctca 3600
gaccgcgcgg tgctcatcaa caacaaccta ggatggccca atggactgac tgtggacaag 3660
gccagctccc aactgctatg ggccgatgcc cacaccgagc gaattgaggc tgctgacctg 3720
aatggtgcca atcggcatac attggtgtca ccggtgcagc acccatatgg cctcaccctg 3780
ctcgactcct atatctactg gactgactgg cagactcgga gcatccaccg tgctgacaag 3840
ggtactggca gcaatgtcat cctcgtgagg tccaacctgc caggcctcat ggacatgcag 3900
gctgtggacc gggcacagcc actaggtttt aacaagtgcg gctcgagaaa tggcggctgc 3960
tcccacctct gcttgcctcg gccttctggc ttctcctgtg cctgccccac tggcatccag 4020
ctgaagggag atgggaagac ctgtgatccc tctcctgaga cctacctgct cttctccagc 4080
cgtggctcca tccggcgtat ctcactggac accagtgacc acaccgatgt gcatgtccct 4140
gttcctgagc tcaacaatgt catctccctg gactatgaca gcgtggatgg aaaggtctat 4200
tacacagatg tgttcctgga tgttatcagg cgagcagacc tgaacggcag caacatggag 4260
acagtgatcg ggcgagggct gaagaccact gacgggctgg cagtggactg ggtggccagg 4320
aacctgtact ggacagacac aggtcgaaat accattgagg cgtccaggct ggatggttcc 4380
tgccgcaaag tactgatcaa caatagcctg gatgagcccc gggccattgc tgttttcccc 4440
aggaaggggt acctcttctg gacagactgg ggccacattg ccaagatcga acgggcaaac 4500
ttggatggtt ctgagcggaa ggtcctcatc aacacagacc tgggttggcc caatggcctt 4560
accctggact atgatacccg caggatctac tgggtggatg cgcatctgga ccggatcgag 4620
agtgctgacc tcaatgggaa actgcggcag gtcttggtca gccatgtgtc ccaccccttt 4680
gccctcacac agcaagacag gtggatctac tggacagact ggcagaccaa gtcaatccag 4740
cgtgttgaca aatactcagg ccggaacaag gagacagtgc tggcaaatgt ggaaggactc 4800
atggatatca tcgtggtttc ccctcagcgg cagacaggga ccaatgcctg tggtgtgaac 4860
aatggtggct gcacccacct ctgctttgcc agagcctcgg acttcgtatg tgcctgtcct 4920
gacgaacctg atagccggcc ctgctccctt gtgcctggcc tggtaccacc agctcctagg 4980
gctactggca tgagtgaaaa gagcccagtg ctacccaaca caccacctac caccttgtat 5040
tcttcaacca cccggacccg cacgtctctg gaggaggtgg aaggaagatg ctctgaaagg 5100
gatgccaggc tgggcctctg tgcacgttcc aatgacgctg ttcctgctgc tccaggggaa 5160
ggacttcata tcagctacgc cattggtgga ctcctcagta ttctgctgat tttggtggtg 5220
attgcagctt tgatgctgta cagacacaaa aaatccaagt tcactgatcc tggaatgggg 5280
aacctcacct acagcaaccc ctcctaccga acatccacac aggaagtgaa gattgaagca 5340
atccccaaac cagccatgta caaccagctg tgctataaga aagagggagg gcctgaccat 5400
aactacacca aggagaagat caagatcgta gagggaatct gcctcctgtc tggggatgat 5460
gctgagtggg atgacctcaa gcaactgcga agctcacggg ggggcctcct ccgggatcat 5520
gtatgcatga agacagacac ggtgtccatc caggccagct ctggctccct ggatgacaca 5580
gagacggagc agctgttaca ggaagagcag tctgagtgta gcagcgtcca tactgcagcc 5640
actccagaaa gacgaggctc tctgccagac acgggctgga aacatgaacg caagctctcc 5700
tcagagagcc aggtctaa 5718
<210> 3
<211> 1239
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of RAPSN
<400> 3
atggggcagg accagaccaa gcagcagatc gagaaggggc tccagctgta ccagtccaac 60
cagacagaga aggcattgca ggtgtggaca aaggtgctgg agaagagctc ggacctcatg 120
gggcgcttcc gcgtgctggg ctgcctggtc acagcccact cggagatggg ccgctacaag 180
gagatgctga agttcgctgt ggtccagatc gacacggccc gggagctgga ggatgccgac 240
ttcctcctgg agagctacct gaacctggca cgcagcaacg agaagctgtg cgagtttcac 300
aagaccatct cctactgcaa gacctgcctt gggctgcctg gtaccagggc aggtgcccag 360
ctcggaggcc aggtcagcct gagcatgggc aatgccttcc tgggcctcag cgtcttccag 420
aaggccctgg agagcttcga gaaggccctg cgctatgccc acaacaatga tgacgccatg 480
ctcgagtgcc gcgtgtgctg cagcctgggc agcttctatg cccaggtcaa ggactacgag 540
aaagccctgt tcttcccctg caaggcggca gagcttgtca acaactatgg caaaggctgg 600
agcctgaagt accgggccat gagccagtac cacatggccg tggcctatcg cctgctgggc 660
cgcctgggca gtgccatgga gtgttgtgag gagtctatga agatcgcgct gcagcacggg 720
gaccggccac tgcaggcgct ctgcctgctc tgcttcgctg acatccaccg gagccgtggg 780
gacctggaga cagccttccc caggtacgac tccgccatga gcatcatgac cgagatcgga 840
aaccgcctgg ggcaggtgca ggcgctgctg ggtgtggcca agtgctgggt ggccaggaag 900
gcgctggaca aggctctgga tgccatcgag agagcccagg atctggccga ggaggtgggg 960
aacaagctga gccagctcaa gctgcactgt ctgagcgaga gcatttaccg cagcaaaggg 1020
ctgcagcggg aactgcgggc gcacgttgtg aggttccacg agtgcgtgga ggagacggag 1080
ctctactgcg gcctgtgcgg cgagtccata ggcgagaaga acagccggct gcaggcccta 1140
ccttgctccc acatcttcca cctcaggtgc ctgcagaaca acgggacccg gagctgtccc 1200
aactgccgcc gctcatccat gaagcctggc tttgtatga 1239
<210> 4
<211> 1449
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of α subunit
<400> 4
atggagccct ggcctctcct cctgctcttt agcctttgct cagctggcct cgtcctgggc 60
tccgaacatg agacccgtct ggtggcaaag ctatttaaag actacagcag cgtggtgcgg 120
ccagtggaag accaccgcca ggtcgtggag gtcaccgtgg gcctgcagct gatacagctc 180
atcaatgtgg atgaagtaaa tcagatcgtg acaaccaatg tgcgtctgaa acagggtgac 240
atggtagatc tgccacgccc cagctgcgtg actttgggag ttcctttgtt ttctcatctg 300
cagaatgagc aatgggtgga ttacaaccta aaatggaatc cagatgacta tggcggtgtg 360
aaaaaaattc acattccttc agaaaagatc tggcgcccag accttgttct ctataacaat 420
gcagatggtg actttgctat tgtcaagttc accaaagtgc tcctgcagta cactggccac 480
atcacgtgga cacctccagc catctttaaa agctactgtg agatcatcgt cacccacttt 540
ccctttgatg aacagaactg cagcatgaag ctgggcacct ggacctacga cggctctgtc 600
gtggccatca acccggaaag cgaccagcca gacctgagca acttcatgga gagcggggag 660
tgggtgatca aggagtcccg gggctggaag cactccgtga cctattcctg ctgccccgac 720
accccctacc tggacatcac ctaccacttc gtcatgcagc gcctgcccct ctacttcatc 780
gtcaacgtca tcatcccctg cctgctcttc tccttcttaa ctggcctggt attctacctg 840
cccacagact caggggagaa gatgactctg agcatctctg tcttactgtc tttgactgtg 900
ttccttctgg tcatcgtgga gctgatcccc tccacgtcca gtgctgtgcc cttgattgga 960
aaatacatgc tgttcaccat ggtgttcgtc attgcctcca tcatcatcac tgtcatcgtc 1020
atcaacacac accaccgctc acccagcacc catgtcatgc ccaactgggt gcggaaggtt 1080
tttatcgaca ctatcccaaa tatcatgttt ttctccacaa tgaaaagacc atccagagaa 1140
aagcaagaca aaaagatttt tacagaagac attgatatct ctgacatttc tggaaagcca 1200
gggcctccac ccatgggctt ccactctccc ctgatcaaac accccgaggt gaaaagtgcc 1260
atcgagggca tcaagtacat cgcagagacc atgaagtcag accaggagtc taacaatgcg 1320
gcggcagagt ggaagtacgt tgcaatggtg atggaccaca tactcctcgg agtcttcatg 1380
cttgtttgca tcatcggaac cctagccgtg tttgcaggtc gactcattga attaaatcag 1440
caaggatga 1449
<210> 5
<211> 1506
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of β subunit
<400> 5
atgaccccag gggctctgct gatgctgctg ggggcgctgg gggcgccgct cgccccaggc 60
gtccgcggct cggaggcgga gggtcgactc cgggagaaac ttttctctgg ctatgatagc 120
tccgtgcggc cagcgcggga ggtgggagac cgtgtcaggg tcagcgttgg tctcatcctg 180
gcgcaactca tcagcctgaa cgagaaggat gaagagatga gcacaaaggt gtacttagac 240
ctggagtgga ctgactacag gctgagctgg gaccctgcgg agcacgacgg catcgattcg 300
ctccgcatca cggcggaatc cgtgtggctc cctgacgtgg tgctactgaa caacaatgat 360
gggaattttg acgtggctct ggacattagc gtcgtggtgt cctccgacgg ctccgtgcgt 420
tggcaacccc cgggcatcta tcgcagcagc tgcagcatcc aggtcaccta cttccccttc 480
gactggcaga attgcactat ggtgttcagc tcctacagct acgacagctc ggaggtcagc 540
ctgcagacag gcctgggtcc tgacgggcaa gggcatcagg aaatccacat tcatgaaggg 600
actttcattg agaatggcca gtgggagatt atccacaagc cctctcggct aatccagcct 660
ccaggcgatc ctaggggagg gagggaagga cagcgccagg aagtcatctt ctacctcatc 720
atccgccgca agcctctctt ctacctggtc aacgtcattg ccccatgcat cctcatcact 780
cttctggcca tcttcgtctt ctacctgcca ccagatgcag gagagaagat ggggctctca 840
atctttgccc tgctgaccct tactgtgttc ctgctgctgc tggctgacaa agtacctgag 900
acctcactat cagtacccat tattatcaag tacctcatgt ttaccatggt cctcgtcacc 960
ttctcagtca tccttagtgt cgtggttctc aacctgcacc accgctcacc ccacacccac 1020
caaatgcccc tttgggtccg tcagatcttc attcacaaac ttccgctgta cctgcgtcta 1080
aaaaggccca aacccgagag agacctgatg ccggagcccc ctcactgttc ttctccagga 1140
agtggctggg gtcggggaac agatgaatat ttcatccgga agccgccaag tgattttctc 1200
ttccccaaac ccaataggtt ccagcctgaa ctgtctgccc ctgatctgcg gcgatttatc 1260
gatggtccaa accgggctgt ggccctgctt ccggagctac gggaggtcgt ctcctctatc 1320
agctacatcg ctcgacagct gcaggaacag gaggaccacg atgcgctgaa ggaggactgg 1380
cagtttgtgg ccatggtagt ggaccgcctc ttcctgtgga ctttcatcat cttcaccagc 1440
gttgggaccc tagtcatctt cctggacgcc acgtaccact tgccccctcc agaccccttt 1500
ccttga 1506
<210> 6
<211> 1554
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of δ subunit
<400> 6
atggaggggc cagtgctgac actggggctg ctggctgccc tggcggtgtg tggcagctgg 60
gggctgaacg aggaggagcg gctgatccgg cacctgtttc aagagaaggg ctacaacaag 120
gagctccggc ccgtggcaca caaagaggag agtgtggacg ttgccctggc cctcacactc 180
tccaacctca tctccctgaa agaagttgag gagaccctca ctaccaatgt gtggatagag 240
cacggctgga cagacaaccg gctgaagtgg aatgctgaag aatttggaaa catcagtgtc 300
ctgcgcctcc ccccggacat ggtgtggctc ccagagattg tgctggagaa caacaatgac 360
ggctccttcc agatctccta ctcctgcaac gtgcttgtct accactacgg cttcgtgtac 420
tggctgccac ctgccatctt ccgctcctcc tgccccatct ctgtcaccta tttccccttc 480
gactggcaga actgctccct caagttcagt tccctcaagt atacggccaa agagatcacc 540
ctgagcctga aacaggatgc caaggagaac cgcacctacc ccgtggagtg gatcatcatt 600
gatcctgaag gcttcacaga gaacggggag tgggagatag tccaccggcc ggccagggtc 660
aacgtggacc ccagagcccc tctggacagc cccagccgcc aggacatcac cttctacctc 720
atcatccgcc gcaagcccct cttctacatc atcaacatcc tggtgccctg cgtgctcatc 780
tccttcatgg tcaacctggt cttctaccta ccggctgaca gtggtgagaa gacatcagtg 840
gccatctcgg tgctcctggc tcagtctgtc ttcctgctgc tcatctccaa gcgtctgcct 900
gccacatcca tggccatccc ccttatcggc aagttcctgc tcttcggcat ggtgctggtc 960
accatggttg tggtgatctg tgtcatcgtg ctcaacatcc acttccgaac acccagcacc 1020
catgtgctgt ctgagggggt caagaagctc ttcctggaga ccctgccgga gctcctgcac 1080
atgtcccgcc cagcagagga tggacccagc cctggggccc tggtgcggag gagcagctcc 1140
ctgggataca tctccaaggc cgaggagtac ttcctgctca agtcccgcag tgacctcatg 1200
ttcgagaagc agtcagagcg gcatgggctg gccaggcgcc tcaccactgc acgccggccc 1260
ccagcaagct ctgagcaggc ccagcaggaa ctcttcaatg agctgaagcc agctgtggat 1320
ggggcaaact tcattgttaa ccacatgagg gaccagaaca attacaatga ggagaaagac 1380
agctggaacc gagtggcccg cacagtggac cgcctctgcc tgtttgtggt gacgcctgtc 1440
atggtggtgg gcacagcctg gatcttcctg cagggcgttt acaaccagcc accaccccag 1500
ccttttcctg gggaccccta ctcctacaac gtgcaggaca agcgcttcat ctag 1554
<210> 7
<211> 1554
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of γ subunit
<400> 7
atgcatgggg gccaggggcc gctgctcctc ctgctgctgc tggctgtctg cctgggggcc 60
cagggccgga accaggagga gcgcctgctc gcagacctga tgcaaaacta cgaccccaac 120
ctgcggcccg cggaacgaga ctcggatgtg gtcaatgtca gcctgaagct aaccctcacc 180
aacctcatct ccctgaacga gcgagaggaa gccctcacca ccaatgtctg gatagagatg 240
cagtggtgcg actatcgcct gcgctgggat ccgcgagact acgaaggcct gtgggtgctg 300
agggtgccgt ccaccatggt gtggcggccg gatatcgtgc tggagaacaa cgtggacggt 360
gtcttcgagg tggccctcta ctgcaatgtg ctcgtgtccc ctgacggctg tatctactgg 420
ctgccgcctg ccatcttccg ttccgcctgc tctatctcag tcacctactt ccccttcgac 480
tggcagaact gctcccttat cttccagtcc cagacttaca gcaccaatga gattgatctg 540
cagctgagtc aggaagatgg ccagaccatc gagtggattt tcattgaccc tgaggccttc 600
acagagaatg gggagtgggc catccagcac cgaccagcca agatgctcct ggacccagcg 660
gcgccagccc aggaagcagg ccaccagaag gtggtgttct acctgctcat ccagcgcaag 720
cccctcttct acgtcatcaa catcatcgcc ccctgtgtgc tcatctcctc tgtcgccatc 780
ctcatccact tccttcctgc caaggctggg ggccagaagt gtaccgtcgc catcaacgtg 840
ctcctggccc agactgtctt cctcttcctt gtggccaaga aggtgcctga aacctcccag 900
gcggtgccac tcatcagcaa gtacctgacc ttcctcctgg tggtgaccat cctcattgtc 960
gtgaatgctg tggttgtgct caatgtctcc ttgcggtctc cacacacaca ctccatggcc 1020
cgaggggtcc gcaaggtgtt cctgaggctc ttgccccagc tgctgaggat gcacgttcgc 1080
ccgctggccc cggcagctgt gcaggacacc cagtcccggc tacagaatgg ctcctcggga 1140
tggtcgatca caactgggga ggaggtggcc ctctgcctgc ctcgcagtga actcctcttc 1200
cagcagtggc agcggcaagg gctggtggcg gcagcgctgg agaagctaga gaaaggcccg 1260
gagttagggc tgagccagtt ctgtggcagc ctgaagcagg ctgccccagc catccaggcc 1320
tgtgtggaag cctgcaacct cattgcctgt gcccggcacc agcagagtca ctttgacaat 1380
gggaatgagg agtggttcct ggtgggccga gtgctggacc gcgtctgctt cctggccatg 1440
ctctcgctct tcatctgtgg cacagctggc atcttcctca tggcccacta caaccgggtg 1500
ccggccctgc cattccctgg agatccacgc ccctacctgc cctcaccaga ctga 1554
<210> 8
<211> 1482
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequence of ε subunit
<400> 8
atggcaaggg ctccgcttgg ggtcctgctc ctcttggggc ttctcggcag gggtgtgggg 60
aagaacgagg aactgcgtct ttatcaccat ctcttcaaca actatgaccc aggaagccgg 120
ccagtgcggg agcctgagga tactgtcacc atcagcctca aggtcaccct gacgaatctc 180
atctcactga atgaaaaaga ggagactctc accactagcg tctggattgg aatcgattgg 240
caggattacc gactcaacta cagcaaggac gactttgggg gtatagaaac cctgcgagtc 300
ccttcagaac tcgtgtggct gccagagatt gtgctggaaa acaatattga tggccagttc 360
ggagtggcct acgacgccaa cgtgctcgtc tacgagggcg gctccgtgac gtggctgcct 420
ccggccatct accgcagcgt ctgcgcagtg gaggtcacct acttcccctt cgattggcag 480
aactgttcgc ttattttccg ctctcagacg tacaatgccg aagaggtgga gttcactttt 540
gccgtagaca acgacggcaa gaccatcaac aagatcgaca tcgacacaga ggcctatact 600
gagaacggcg agtgggccat cgacttctgc ccgggggtga tccgccgcca ccacggtggc 660
gccaccgacg gcccagggga gactgacgtc atctactcgc tcatcatccg ccggaagccg 720
ctcttctacg tcattaacat catcgtgccc tgtgtgctca tctcgggcct ggtgctgctc 780
gcctacttcc tgccggcgca ggccggcggc cagaaatgca cggtctccat caacgtcctg 840
ctcgcccaga ccgtcttctt gttcctcatt gcccagaaaa tcccagagac ttctctgagc 900
gtgccgctcc tgggcaggtt ccttattttc gtcatggtgg tcgccacgct cattgtcatg 960
aattgcgtca tcgtgctcaa cgtgtcccag cggacgccca ccacccacgc catgtccccg 1020
cggctgcgcc acgttctcct ggagctgctg ccgcgcctcc tgggctcccc gccgccgccc 1080
gaggcccccc gggccgcctc gcccccaagg cgggcgtcgt cggtgggctt attgctccgc 1140
gcggaggagc tgatactgaa aaagccacgg agcgagctcg tgtttgaggg gcagaggcac 1200
cggcagggga cctggacggc tgccttctgc cagagcctgg gcgccgccgc ccccgaggtc 1260
cgctgctgtg tggatgccgt gaacttcgtg gccgagagca cgagagatca ggaggccacc 1320
ggcgaggaag tgtccgactg ggtgcgcatg gggaatgccc ttgacaacat ctgcttctgg 1380
gccgctctgg tgctcttcag cgtgggctcc agcctcatct tcctcggggc ctacttcaac 1440
cgagtgcctg atctccccta cgcgccgtgt atccagcctt ag 1482
Claims (9)
1.一种用于检测重症肌无力相关抗体的组合物,其中,所述组合物包括:表达重症肌无力相关抗原的细胞、第二抗体、显色物;其中,
所述重症肌无力相关抗原包括乙酰胆碱受体、肌肉特异性酪氨酸激酶和低密度脂蛋白4的组合;
所述第二抗体偶联有标记物;并且,当所述第二抗体与所述重症肌无力相关抗体结合时,所述标记物催化所述显色物产生荧光或发生荧光猝灭;
所述表达重症肌无力相关抗原的细胞包含如下(i)-(iii)的组合:
(i)编码形成乙酰胆碱受体各亚基的第一多核苷酸组;
(ii)编码肌肉特异性酪氨酸激酶的第二多核苷酸;和
(iii)编码低密度脂蛋白4的第三多核苷酸;
所述第一多核苷酸组包括如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列的多核苷酸;或者,所述第一多核苷酸组包括如SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示序列的多核苷酸;
所述第二多核苷酸为如SEQ ID NO:1所示序列的多核苷酸;
所述第三多核苷酸为如SEQ ID NO:2所示序列的多核苷酸;
所述表达重症肌无力相关抗原的细胞包括:表达乙酰胆碱受体的第一细胞,表达肌肉特异性酪氨酸激酶的第二细胞,和表达低密度脂蛋白4的第三细胞;
所述第一细胞选自如下的至少一种:包含如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列的多核苷酸的第一细胞,或者,包含如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示序列的多核苷酸的第一细胞;
所述第二细胞包含如SEQ ID NO:1所示序列的多核苷酸;所述第三细胞包含如SEQ IDNO:2所示序列的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中,所述标记物为辣根过氧化物酶,所述显色物为酪酰胺荧光素。
3.根据权利要求2所述的组合物,其中,所述荧光素选自如下的任一种:异硫氰酸荧光素,罗丹明,四甲基罗丹明异硫氰酸盐,Texas Red,藻红蛋白,碘化丙啶,Alexa Fluor系列,Dylight系列,iFluor系列。
4.根据权利要求1所述的组合物,其中,所述表达重症肌无力相关抗原的细胞的制备方法包括:
载体构建步骤:构建表达形成乙酰胆碱受体各亚基的第一载体组,表达肌肉特异性酪氨酸激酶的第二载体,以及表达低密度脂蛋白4的第三载体;
转染步骤,包括:分别使用第一载体组、第二载体和第三载体转染细胞,得到转入有第一载体组的第一转染细胞、转入有第二载体的第二转染细胞,和转入有第三载体的第三转染细胞;
筛选步骤,包括:对所述第一转染细胞、第二转染细胞和第三转染细胞进行筛选,得到表达乙酰胆碱受体的第一细胞,表达肌肉特异性酪氨酸激酶的第二细胞,以及表达低密度脂蛋白4的第三细胞。
5.根据权利要求4所述的组合物,其中,所述第一载体组、所述第二载体与所述第三载体转染细胞的质量比为1:1:1。
6.根据权利要求4所述的组合物,其中,所述第一载体组中分别包含如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示序列的重组表达载体转染细胞的质量比为1:2:1:1:1;或者,
所述第一载体组中分别包含如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8所示序列的重组表达载体转染细胞的质量比为1:2:1:1:1。
7.一种用于检测重症肌无力相关抗体的试剂盒,其中,所述试剂盒包括如权利要求1-6任一项所述的组合物。
8.如权利要求1-6任一项所述的组合物在制备用于检测重症肌无力相关抗体的试剂盒中的用途。
9.如权利要求1-6任一项所述的组合物在制备用于重症肌无力的诊断或预后的试剂盒中的用途。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210072137.2A CN114487448B (zh) | 2022-01-21 | 2022-01-21 | 用于检测重症肌无力相关抗体的组合物、试剂盒及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210072137.2A CN114487448B (zh) | 2022-01-21 | 2022-01-21 | 用于检测重症肌无力相关抗体的组合物、试剂盒及应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114487448A CN114487448A (zh) | 2022-05-13 |
CN114487448B true CN114487448B (zh) | 2022-10-18 |
Family
ID=81472837
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210072137.2A Active CN114487448B (zh) | 2022-01-21 | 2022-01-21 | 用于检测重症肌无力相关抗体的组合物、试剂盒及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114487448B (zh) |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5041389A (en) * | 1986-01-06 | 1991-08-20 | The Salk Institute For Biological Studies | Assays for myasthenia gravis |
US5578496A (en) * | 1991-12-19 | 1996-11-26 | Board Of Regents, Baylor College Of Medicine | Detection of autoantibodies associated with the disease myasthenia gravis |
JP4495776B1 (ja) * | 2009-07-30 | 2010-07-07 | 日本製薬株式会社 | 融合蛋白質 |
GR1007341B (el) * | 2010-04-21 | 2011-07-05 | ΕΛΛΗΝΙΚΟ ΙΝΣΤΙΤΟΥΤΟ ΠΑΣΤΕΡ (κατά ποσοστό 40%), | Διαγνωστικος προσδιορισμος |
CN113383018A (zh) * | 2018-09-05 | 2021-09-10 | 波赛达治疗公司 | 同种异体细胞组合物和使用方法 |
EP3850014A1 (en) * | 2018-09-10 | 2021-07-21 | Academisch Ziekenhuis Leiden h.o.d.n. LUMC | Musk inhibition |
CN111089972B (zh) * | 2019-12-18 | 2021-05-14 | 天津天海新域生物科技有限公司 | 一种用于检测抗人体髓鞘碱性蛋白抗体的试剂盒及其应用 |
EP3842802A1 (en) * | 2019-12-20 | 2021-06-30 | Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG | Method for the detection of an autoantibody to acetylcholine receptor |
-
2022
- 2022-01-21 CN CN202210072137.2A patent/CN114487448B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114487448A (zh) | 2022-05-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN112707968B (zh) | 一种用于检测新冠病毒中和抗体的重组的受体结合蛋白、重组的受体蛋白 | |
CN116874597B (zh) | 鼠抗人血管内皮生长因子的单克隆抗体及应用 | |
CN111100199A (zh) | 一种荧光素标记的蛋白四聚体及其制备方法与应用 | |
CN114044822A (zh) | 血清淀粉样蛋白a抗体的重链和轻链可变区、抗体及运用 | |
CN116925218B (zh) | 小热休克蛋白hspb1的抗体、抗体组合物、杂交瘤细胞株及其应用 | |
US20230029322A1 (en) | Tools and methods to detect and isolate colibactin producing bacteria | |
CN117384295A (zh) | 小鼠抗鹅IgY单克隆抗体及其应用 | |
CN114487448B (zh) | 用于检测重症肌无力相关抗体的组合物、试剂盒及应用 | |
CN110964745B (zh) | 一种检测vegf靶向治疗药物生物学活性的方法 | |
CN114891091B (zh) | 一种抗nmdar脑炎重组抗原及应用 | |
CN114369154B (zh) | 一种n-甲基-d-天冬氨酸受体重组抗原、其制备方法及含有该重组抗原的试剂盒 | |
CN112540176B (zh) | 用于诊断fap表达异常相关疾病的试剂盒、方法及计算机可读存储介质 | |
Strand et al. | Structural proteins of mammalian RNA tumor viruses: relatedness of the interspecies antigenic determinants of the major internal protein | |
CN113687067B (zh) | 针对AChR单亚基抗体的检测试剂盒及其应用 | |
CN114891118A (zh) | 抗原pla2r-thsd7a-nell-1融合蛋白及其产品和用途 | |
EP0421139B1 (en) | Process for the production of human thyroid peroxidase | |
CN110240644B (zh) | 人生长激素受体突变体、人生长激素免疫原、多克隆抗体及检测试剂盒 | |
CN110702913A (zh) | 一种用于定量检测贝氏柯克斯体i相株的单抗组合物 | |
JP2009108013A (ja) | Gタンパク質共役受容体に対する機能抗体およびその応用 | |
CN116925219B (zh) | 小热休克蛋白hspb1的抗体、杂交瘤细胞株及其应用 | |
CN111378039A (zh) | 治疗恶性肿瘤的抗体及其应用 | |
CN117683131B (zh) | 一种抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(mog)抗体及其应用 | |
CN114686443B (zh) | 杂交瘤细胞、抗血栓调节蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
CN114686444B (zh) | 杂交瘤细胞、抗血栓调节蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
CN114317730B (zh) | Ttpal作为胃癌监测或预后判断标志物的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |