CN114486865A - 一种磁微粒保存液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医疗领域,尤其设计一种磁微粒保存液。所述保存液包括以下成分;缓冲液10~100mmol/L,蛋白保护剂2~30g/L,水溶性糖5~50g/L,二价盐离子2~200mmol/L,非离子型表面活性剂1~10g/L和防腐剂1~10g/L;所述保存液调节pH值至7~7.5。本发明保存液能够有效降低磁微粒本底,提高检测的精度;确保磁微粒能够在保存液中始终保持均匀分散的状态;显著提高保存液的热稳定性,使其在低热环境中能够更有效、长期保持磁微粒的活性。
Description
技术领域
本发明属于生物医疗领域,尤其设计一种磁微粒保存液。
背景技术
现代免疫学的检测一种是发展的生物医疗领域的发展热点,从第一代的放射免疫技术,到第二代的酶联免疫技术,再到第三代的板式化学发光,以及目前的***纳米磁微粒管式化学发光,经历多年的迭代和发展。
至今形成的***纳米磁微粒管式化学发光技术,是目前最为先进的现代免疫学检测技术之一。其是通过免疫反应中的酶作用于发光底物,使之发生化学反应并释放大佬的能量,产生激发态中间体,当激发态中间体回到最稳定、能量最低的稳定基态时,发射出光子。利用光信号测量仪测量光量子的产额,并且基于光量子的产额与样本中的待测物质在物质量上成正比的关系,计算出样本中待测物质的摩尔量等。而***纳米磁微粒管式化学发光技术是今年来发展、推广和应用最快的免疫分析方法,相较于第一代和第二代的酶免法、第三代的荧光法,其检测精度和灵敏度均高出数个数量级。
而在这***纳米磁微粒管式化学发光技术中,最为关键的便是磁微粒。磁微粒是指磁性纳米粒子与有机或无机分子结合形成的可均匀分散于一定基质中、具有高度稳定性的胶态复合体。磁微粒具有独特的磁响应性,还具有低成本、低能耗和无污染等优秀的特点,研究人员在磁微粒表面或通过磁微粒表面的功能基团将酶、抗体、寡核苷酸等生物活性物质进行固定,可以进一步用于酶的固定化、靶向药物载体、细胞分选、免疫检测、蛋白和核酸的分离纯化以及杂交检测等领域。悬浮性磁微粒作为磁微粒中较为独特的一种,其作为载体使用时具有更高的比表面积,能够更为充分地与样品反应,加之外磁场的灵活应用,使其具有更高的灵敏度、更快的检测速度和更好的重复性。目前已被广泛应用于生物及医学检测等领域。
但是,现有的悬浮性磁微粒经过包被后本底高,信噪比低,存在较大的检测噪音,而检测过程无法实现有效的降噪,导致假阳性检测结果的出现,有时需要进行多次的重复测定。并且现有的悬浮性磁微粒在保存液中分散性差,容易沉降、团聚或吸附到容器内壁上,导致经过保存后悬浮性磁微粒在保存液中极不均匀,使用时难以快速混匀。此外,包被后所得的磁微粒热稳定性差,通常在37℃条件下保存7天后,活性会下降约20%。
发明内容
为解决现有的磁微粒在常规保存液中保存效果差,悬浮性磁微粒不易均匀分散、容易出现软团聚导致悬浮性磁微粒出现浓差,同时还存在检测噪音大等问题,本发明提供了一种磁微粒保存液,以及该保存液的应用。
本发明的目的在于:
一、能够有效降低磁微粒本底;
二、提高磁微粒在保存液中的分散性;
三、对磁微粒产生一定的热保护效果。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案。
一种磁微粒保存液,
所述保存液包括以下成分;
缓冲液10~100mmol/L,蛋白保护剂2~30g/L,水溶性糖5~50g/L,二价盐离子2~200mmol/L,非离子型表面活性剂1~10g/L和防腐剂1~10g/L;所述保存液调节pH值至7~7.5。
在传统的保存液中,通常并不添加水溶性糖、二价盐和非离子型表面活性剂。在本发明技术方案中,特定的水溶性糖与特定的盐、非离子型表面活性剂配合下实际能够对保存液的佩克莱特数和雷诺数产生改变,能够一定程度上增大保存液的佩克莱特数并减小其雷诺数,在保存液内形成强对流、低粘滞的情况,改变溶液体系通过微观流体力学驱动磁微粒进行低惯性对流,避免由于单向流动惯性导致容器壁产生团聚等问题。且所用的水溶性糖和用量均需要进行严格的控制,改变水溶性糖和/或盐和/或非离子型表面活性剂的种类均需对其用量进行适应性调整,如糖用量过大的情况会导致对流过强、粘滞系数过小,也容易产生时空性的团聚,而用量过小则无法有效改善导电炭黑的分散性。而二价盐离子相较于常规的碱金属盐离子,除配合水溶性糖之外能够有效调节缓冲液基质和蛋白保护剂基质,进而提高检测效果,避免缓冲液基质和/或蛋白保护剂基质产生噪音干扰。而非离子型表面活性剂,则除配合水溶性糖以外还能够起到增溶、乳化、分散和润湿的效果,可以辅助增强磁微粒的分散性,且确保磁微粒不产生沾壁现象。
作为优选,
所述缓冲液为PB和/或Tris-HCl和/或HEPES和/或MOPS。
上述的缓冲液均为简单易得且常用的缓冲液类型,通常实际使用过程中并不仅限于次几类,但在本发明技术方案中,由于需要控制缓冲液、蛋白保护剂和防腐剂构成的低液流体性能,采用上述的缓冲液效果更优。
作为优选,
所述蛋白保护剂为牛血清白蛋白和/或人血清白蛋白和/或水解明胶和/或酪蛋白钠盐。
同理,实际蛋白保护剂并不仅局限于上述几种,但用于本发明技术方案时,采用上述的蛋白保护剂类型能够更有效地确保保存液能够具备强对流、低粘滞的特性。
作为优选,
所述水溶性糖为蔗糖和/或海藻糖。
上述的水溶性糖是经过选择后对于本发明具有特异性的糖种类。其首先具有良好的生物相容性,另一方面,其并不会导致本底噪音增大。且对于本发明技术方案而言,其具有最独特的性质便在于有效提高保存液的佩克莱特数并降低雷诺数。次特性是经试验其他常见的水溶性糖不具备的。因此对于本发明技术方案而言,蔗糖和海藻糖具有显著的特殊性。
作为优选,
所述二价盐为二价锌盐和/或二价镁盐。
二价锌盐和二价镁盐通常需要配合EDTA使用,但在本发明技术方案中单独使用二价锌盐和/或二价镁盐除配合强化水溶性糖对保存液流体特性进行调整外,还能够起到增强热稳定性的效果。虽然经试验钠盐在一定程度上也能够提高保存液的热稳定性,甚至效果更优,但实际钠盐容易导致磁微粒的本底增大,后续的检测效果变差,出现假阳性等问题。同时,二价镁离子在一定程度上还具有保护磁微粒上的抗原或抗体不受降解。
作为优选,
所述非离子型表面活性剂包括Tween 20和/或Tween 80和/或曲拉通X-100。
以上的非离子型表面活性剂均为常见、常用且更加适用于本发明方案的活性剂成分。
作为优选,
防腐剂为Proclin300和/或三氮化钠。
上述防腐剂能够有效抑制微生物细胞的生长以及促进微生物细胞的凋亡。提高检测精度。
一种磁微粒保存液的应用,
所述保存液用于磁微粒的保存;
所述磁微粒为磁性纳米材料与非磁性的无机和/或有机材料结合形成的复合材料。
本发明的有益效果是:
1)本发明保存液能够有效降低磁微粒本底,提高检测的精度;
2)确保磁微粒能够在保存液中始终保持均匀分散的状态;
3)显著提高保存液的热稳定性,使其在低热环境中能够更有效、长期保持磁微粒的活性。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作出进一步清楚详细的描述说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外,下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例,而不是全部的实施例。因此,基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
如无特殊说明,本发明实施例所用原料均为市售或本领域技术人员可获得的原料;如无特殊说明,本发明实施例所用方法均为本领域技术人员所掌握的方法。
如无特殊说明,本发明实施例所用磁微粒为羧基磁珠0.75mg/mL,阳性血清为乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性血清。
实施例1
一种磁微粒保存液,其具体构成为:
以去离子水为溶剂,其成分如下表所示:
Tris-HCl | 50mM | 海藻糖 | 5g/L | Tween20 | 1g/L |
牛血清白蛋白(BSA) | 2g/L | 氯化镁 | 200mM | Proclin300 | 1g/L |
对比例1
一种磁微粒保存液,其具体构成为:
以去离子水为溶剂,其成分如下表所示:
Tris-HCl | 50mM |
测试I
以上述对比例1的磁微粒保存液标记为保存液1,以实施例1的磁微粒保存液标记为保存液2,对保存液1和保存液2进行热稳定性试验。
热稳定性的实验条件为:将相同磁微粒分别放置于4℃和37℃环境下6天,取出后用同批次试剂同时测相同的样本得到实验结果,计算37℃环境下的磁微粒相对于4℃发光值的下降率。
其中,保存液1的测试结果如下表表1所示。
表1:保存液1的磁微粒热稳定性测试结果。
保存液2的测试结果如下表表2所示。
表2:保存液2的磁微粒热稳定性测试结果。
表1和表2中,Spec.表示样本,S0~S5分别为阳性血清浓度由低到高的样本,S0均为0浓度的空白对照,表1和表2中各个样本浓度对应,S1阳性血清样本浓度为0.5IU/mL,S2阳性血清样本浓度为5.0IU/mL,S3阳性血清样本浓度为50IU/mL,S4阳性血清样本浓度为100IU/mL,S5阳性血清样本浓度为200IU/mL。此外,表1和表2中:CV为变异系数,指标准偏差与平均值的比值,用于反应数据的离散程度;Mean为平均值;下降率为正数表示上升,负数表示下降。
从上表中可以看出,本发明技术方案配制所得的保存液2,能够使得发光值的下降率有效控制在6%以下,而对比例1的保存液1发光值下降率达到20%以上,产生了极为显著的区别。表明采用本发明的磁微粒保存液对于低热保持磁珠性能具有显著作用。
另一方面,观察保存液1和保存液2在4℃和37℃环境中保存6d后是否出现团聚现象。观察表明,在37℃条件下保存时,保存液1更容易发生团聚,出现部分较大的团聚颗粒,这也是导致其发光值显著下降的原因之一。
再以阳性血清和阴性血清标准样进行血清检测试验。
试验结果如下表表3所示。
表3:血清检测结果。
表中:N1至N30为随机阴性血清样本编号;P1至P30为浓度由低到高逐渐增大的阳性血清样本编号。
从上表可以看出,保存液1的磁微粒测阳性血清发光值总体偏低且发光值与血清浓度的相关性差,而保存液2的磁微粒测阳性血清发光值随浓度的增大而升高,相关性好。
此外,从表3中可以明显看出,保存液1出现假阳性现象。而假阳性的出现代表其检测的准确度和可信度相对较低,导致现有的大部分检测均需要进行复检等流程。而出现该现象的原因在于保存液1存在本底噪音且保存效果不佳,一旦出现磁微粒团聚等现象,则非常容易导致检测结果出现较大的偏差。
实施例2
一种磁微粒保存液,其具体构成为:
以去离子水为溶剂,其成分如下表所示:
对实施例2所得的各个保存液进行与测试I中相同的热稳定性测试和血清检测,测试结果显示,保存液3和保存液4有近似于保存液2的性能,下降率可有效控制在6%以内,尤其保存液4可将下降率控制在4.5%以内。而保存液5的下降率虽然控制在6%以内,但实际在血清检测出现阴性血清的假阳性情况,并且观察在37℃条件下出现少量团聚现象,且血清检测中CV值相对更高,表明其实际出现了时空性的团聚,时空性的团聚导致了磁微粒的保存效果不佳。而另一方面保存液6则在血清检测和热稳定性测试中表现均明显不佳,表明了糖用量需要相对较为严格的把控。
此外,除蔗糖和海藻糖以外,采用葡萄糖或果糖等常见水溶性糖来替代,经试验均出现效果不显著或不稳定的情况,部分糖类物质需要大量添加进而产生本底噪音,而部分糖类物质添加量需要极低、难以控制,并且实际分散效果较弱。因而经过大量的试验表明,对于本发明而言,蔗糖和/或海藻糖是最理想的可溶性糖类选择,并且具有难以替代的特点。
Claims (8)
1.一种磁微粒保存液,其特征在于,
所述保存液包括以下成分;
缓冲液10~100mmol/L,蛋白保护剂2~30g/L,水溶性糖5~50g/L,二价盐离子2~200mmol/L,非离子型表面活性剂1~10g/L和防腐剂1~10g/L;
所述保存液调节pH值至7~7.5。
2.根据权利要求1所述的一种磁微粒保存液,其特征在于,
所述缓冲液为PB和/或Tris-HCl和/或HEPES和/或MOPS。
3.根据权利要求1所述的一种磁微粒保存液,其特征在于,
所述蛋白保护剂为牛血清白蛋白和/或人血清白蛋白和/或水解明胶和/或酪蛋白钠盐。
4.根据权利要求1所述的一种磁微粒保存液,其特征在于,
所述水溶性糖为蔗糖和/或海藻糖。
5.根据权利要求1所述的一种磁微粒保存液,其特征在于,
所述二价盐为二价锌盐和/或二价镁盐。
6.根据权利要求1所述的一种磁微粒保存液,其特征在于,
所述非离子型表面活性剂包括Tween 20和/或Tween 80和/或曲拉通X-100。
7.根据权利要求1所述的一种磁微粒保存液,其特征在于,
防腐剂为Proclin300和/或三氮化钠。
8.一种磁微粒保存液的应用,其特征在于,
所述保存液用于磁微粒的保存;
所述磁微粒为磁性纳米材料与非磁性的无机和/或有机材料结合形成的复合材料。
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