CN114480602B - 一种鉴定红螯螯虾遗传性别的snp标记及其所用引物对和应用 - Google Patents

一种鉴定红螯螯虾遗传性别的snp标记及其所用引物对和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种鉴定红螯螯虾遗传性别的SNP标记及其所用引物对和应用。本发明SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，SNP标记的核苷酸序列中第229bp碱基位置表现为TG杂合的是雌性个体，SNP标记的核苷酸序列中第229bp碱基位置表现为TT纯合的是雄性个体；本发明还给出了上述SNP标记所用的引物对，并给出了上述SNP标记在鉴定红螯螯虾遗传性别中的应用。本发明的SNP标记是与遗传性别相关的SNP标记，通过SNP标记可以成功鉴定红螯螯虾的遗传性别，SNP标记在鉴定雄性红螯螯虾时的成功率超过90％，在鉴定雌性红螯螯虾时的成功率超过80％，从而指导红螯螯虾的育种和养殖，提高经济收益。

Description

一种鉴定红螯螯虾遗传性别的SNP标记及其所用引物对和 应用
技术领域
本发明涉及分子生物学的技术领域，特别是指一种鉴定红螯螯虾遗传性别的SNP标记及其所用引物对和应用。
背景技术
红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)，俗称澳洲淡水龙虾，原产于澳大利亚北部和新几内亚南部，隶属于拟螯虾科，光壳虾属，具有生长快、抗逆强、肉质细嫩、出肉率高等特点，被认为是具有重要经济价值的世界名贵淡水虾之一。两性成熟的红螯螯虾具有明显的性别二态性特征，一方面，雄虾在生长速度和个体大小上优于雌虾；另一方面，与其它经济养殖虾相比，红螯螯虾抱卵量较少(300-700颗/尾)，规模化繁育中雌雄配比高于3:1，为此在生产上需要更多的雌虾来满足养殖户对苗种的需求。然而，目前还没有可以高效的对红螯螯虾的性别进行控制的技术。
遗传标记是指用来区分不同的个体或群体并且能够稳定遗传的物质或性状。SNP(单核苷酸多态性，single nucleotide polymorphism)是指基因组特定位置上一个碱基的变异，且任一种等位基因在种群中的发生频率高于1％，变异的形式包括转换、颠换、***/缺失等。SNP作为第三代分子标记因其具有数量巨大、分布广泛、共显性、高度稳定、易于自动化规模分析、能够显示其它技术无法检测的隐藏多态性、可能与基因功能相关的众多优点，在分子标记辅助育种中得到广泛应用。
目前，现有技术中没有关于红螯螯虾性别遗传标记的研究或报道。因此，开发与红螯螯虾性别鉴定相关的遗传标记，实施和发展红螯螯虾全雄或全雌育种，可以实现红螯螯虾的单性养殖，提高养殖户的经济收益，对红螯螯虾的育种和养殖具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定红螯螯虾遗传性别的SNP标记及其所用引物对和应用，旨在解决现有技术无法对红螯螯虾的性别进行控制从而导致无法实现红螯螯虾的单性育种，进而影响了红螯螯虾的育种、养殖以及养殖户的经济收益等问题。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是这样实现的：
在一个方面，本发明的一种鉴定红螯螯虾遗传性别的SNP标记，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述SNP标记的核苷酸序列中第229bp碱基位置表现为TG杂合的是雌性个体，所述SNP标记的核苷酸序列中第229bp碱基位置表现为TT纯合的是雄性个体。
本发明的SNP标记是与遗传性别相关的SNP标记，通过SNP标记可以成功鉴定红螯螯虾的遗传性别，为后续单性育种过程中性逆转个体的鉴定提供理论依据；其中，SNP标记在鉴定雄性红螯螯虾时的成功率超过90％，在鉴定雌性红螯螯虾时的成功率超过80％，能够作为红螯螯虾遗产性别鉴定的分子标记，从而指导红螯螯虾的育种和养殖，实现红螯螯虾的单性育种，实施红螯螯虾的全雄或全雌养殖，提高了养殖户的经济收益。
在另一个方面，本发明的一种用于检测上述鉴定红螯螯虾遗传性别的SNP标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列为：
Fst2-F：5’-TCAGTGCTCTAGTGTCCAACAAGG-3’；
Fst2-R：5’-TGACTAAAACAATACACAGATAAC-3’。
本发明批量化设计引物，引物对Fst2-F和Fst2-R所得的SNP标记的核苷酸序列的第229bp碱基位置，雌性个体全部表现为TG杂合，雄性个体表现为TT纯合，这符合红螯螯虾ZZ/ZW雌性异配型性别决定方式。
在再一个方面，本发明的一种SNP标记在用于鉴定红螯螯虾遗传性别中的应用。通过SNP标记可以成功鉴定红螯螯虾的遗传性别，SNP标记在鉴定雄性红螯螯虾时的成功率超过90％，在鉴定雌性红螯螯虾时的成功率超过80％。
作为一种优选的实施方案，所述SNP标记鉴定红螯螯虾遗传性别的步骤为：红螯螯虾提取DNA后，使用上面所述的用于检测鉴定红螯螯虾遗传性别的SNP标记的引物对进行PCR扩增，获得SNP标记；对SNP标记进行测序和序列比对分析，所述SNP标记的核苷酸序列中第229bp碱基位置表现为TG杂合的是雌性个体，所述SNP标记的核苷酸序列中第229bp碱基位置表现为TT纯合的是雄性个体。
本发明的SNP标记鉴定红螯螯虾遗传性别的步骤操作简单，容易实现，鉴定结果准确率高，为后续单性育种过程中性逆转个体的鉴定提供理论依据，从而指导红螯螯虾的育种和养殖，实现红螯螯虾的单性育种，实施红螯螯虾的全雄或全雌养殖，提高了养殖户的经济收益。
作为一种优选的实施方案，所述测序是Sanger测序。本发明是委托上海生物工程有限公司进行Sanger测序，测序时使用Illumina Novaseq PE150测序平台进行高通量测序，这是一种通过Super-GBS高通量测序技术筛选获得一种红螯螯虾遗传性别相关的SNP标记。
作为一种优选的实施方案，所述序列比对分析时使用的是SeqMan软件。本发明使用SeqMan软件进行序列比对分析，操作方便，分析效果好。
作为一种优选的实施方案，所述PCR扩增反应的程序为：98℃，预变性5min；98℃，变性5s，55℃，退火5s，72℃，延伸20s，重复40个循环；最后，72℃，延伸1min。本发明的PCR扩增反应的程序控制方便，扩增效果好。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的SNP标记是与遗传性别相关的SNP标记，通过SNP标记可以成功鉴定红螯螯虾的遗传性别，为后续单性育种过程中性逆转个体的鉴定提供理论依据；其中，SNP标记在鉴定雄性红螯螯虾时的成功率超过90％，在鉴定雌性红螯螯虾时的成功率超过80％，能够作为红螯螯虾遗产性别鉴定的分子标记，从而指导红螯螯虾开展性控育种和单性养殖，实现了红螯螯虾的单性育种，实施了红螯螯虾的全雄或全雌养殖，提高了养殖户的经济收益。
附图说明
图1为本发明一个实施例雄性个体的测序对比结果图；
图2为本发明一个实施例雌性个体的测序对比结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明的具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的一种鉴定红螯螯虾遗传性别的SNP标记，所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述SNP标记的核苷酸序列中第229bp碱基位置表现为TG杂合的是雌性个体，所述SNP标记的核苷酸序列中第229bp碱基位置表现为TT纯合的是雄性个体。
本发明的一种用于检测上述鉴定红螯螯虾遗传性别的SNP标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列为：
Fst2-F：5’-TCAGTGCTCTAGTGTCCAACAAGG-3’；
Fst2-R：5’-TGACTAAAACAATACACAGATAAC-3’。
本发明的一种SNP标记在用于鉴定红螯螯虾遗传性别中的应用。
优选地，所述SNP标记鉴定红螯螯虾遗传性别的步骤为：红螯螯虾提取DNA后，使用上面所述的用于检测鉴定红螯螯虾遗传性别的SNP标记的引物对进行PCR扩增，获得SNP标记；对SNP标记进行测序和序列比对分析，所述SNP标记的核苷酸序列中第229bp碱基位置表现为TG杂合的是雌性个体，所述SNP标记的核苷酸序列中第229bp碱基位置表现为TT纯合的是雄性个体。
优选地，所述测序是Sanger测序。本发明是委托上海生物工程有限公司进行Sanger测序，测序时使用Illumina Novaseq PE150测序平台进行高通量测序，这是一种通过Super-GBS高通量测序技术筛选获得一种红螯螯虾遗传性别相关的SNP标记。
优选地，所述序列比对分析时使用的是SeqMan软件。
优选地，所述PCR扩增反应的程序为：98℃，预变性5min；98℃，变性5s，55℃，退火5s，72℃，延伸20s，重复40个循环；最后，72℃，延伸1min。
实施例一
1、基因组文库构建及Super-GBS测序
首先，提取已知性别的红螯螯虾雌雄各50个个体的基因组DNA，经限制性内切酶酶切(PstI-HF/MspI)、接头连接后，进行PCR扩增；使用Qubit测定每个样品的最终浓度，浓度>5ng/μL为合格；对检测合格的样品，取相同总量的DNA混合成库，使用Illumina NovaseqPE150测序平台对混合好的文库进行高通量测序。
2、二代测序数据的生物信息学分析
将测序下机数据进行拆分(Raw Reads)、质控得到Clean Reads；使用Stacks软件依据建库过程中连接的barcode及酶切位点信息对测序下机数据进行拆分，获得每个样本的Raw Reads；为消除测序错误对结果的影响，进一步对Raw Reads进行质量过滤，获取Clean Reads；利用BWA软件采用mem算法将Clean Reads比对到参考基因组上，随后进行变异检测，最终对SNP进行性别标记筛选，主要采取以下四种方法进行性别标记查找：
(1)根据表型信息，利用GWAS方法进行SNP与表型关联分析，筛选p值小的位点，进行验证；
(2)根据表型信息将样品分为两组，计算两组样品间的Fst值，筛选Fst趋近于1的位点，进行验证；
(3)组内不允许缺失且所有样品分型一致作为组内归一后分型，然后，筛选组间差异位点，进行验证；
(4)组内允许一定比例缺失且所有样品分型一致率高于一定阈值作为组内归一后分型，然后，筛选组间差异位点，进行验证。
3、性别特异性SNP位点的验证分析
选择红螯螯虾雌雄个体各10尾，提取基因组，使用批量化设计的引物，扩增上述获得的所有排名在TOP20以内的候选SNP位点，每个个体的PCR扩增产物委托上海生物工程有限公司进行Sanger测序，使用SeqMan软件进行序列比对分析。由附图1和附图2可以看出，SEQ ID No.1所述的核苷酸序列的第229bp碱基位置，雌性个体全部表现为TG杂合，雄性个体表现为TT纯合，这符合红螯螯虾ZZ/ZW雌性异配型性别决定方式；其中，所用的引物对为：
Fst2-F：5’-TCAGTGCTCTAGTGTCCAACAAGG-3’；
Fst2-R:5’-TGACTAAAACAATACACAGATAAC-3’。
SEQ ID No.1序列：
Figure BDA0003490747770000061
M＝T/G或T/T；
雌性个体的基因序列：
Figure BDA0003490747770000062
雄性个体的基因序列：
Figure BDA0003490747770000063
Figure BDA0003490747770000071
实验1
SNP标记在扩大群体中的实施应用
为进一步验证上述结果的可靠性，选取不同遗传背景的红螯螯虾群体进行验证。
考虑到实际鉴定过程中，核酸提取费时费力，选用一种无需核酸提取纯化就可直接PCR的预混液试剂盒(PhireTM Tissue Direct PCR Master Mix，Thermo ScientificTM)，预混液试剂盒的组成如表1所示。
表1预混液试剂盒组成
Figure BDA0003490747770000072
具体方法如下所示：
(1)样品处理：在组织样品中加入20μL稀释液，并加入0.5μL核酸裂解添加剂；样品管短暂涡旋、离心，室温孵育2-5分钟；随后98℃变性2分钟，取上清液置于-20℃备用；
(2)PCR扩增：取1μL上述样品进行PCR扩增，PCR反应体系为20μL，包括：2×PhireTissue Direct PCR Master Mix 10μL，正反引物各2μL，去离子水5μL；
正引物，Fst2-F：5’-TCAGTGCTCTAGTGTCCAACAAGG-3’；
反引物，Fst2-R:5’-TGACTAAAACAATACACAGATAAC-3’；
PCR扩增程序为：98℃预变性5min；40个循环包括：98℃变性5s，55℃退火5s，72℃延伸20s；最后72℃延伸1min，4℃保存；
(3)测序分析：PCR产物送上海生物工程有限公司进行单向测序，测序峰图如果在229bp出现单峰(TT纯合)则判定为雄性，如果出现重叠峰(TG杂合)则判定为雌性。
表2红螯螯虾不同群体雌雄个体的基因型分析
Figure BDA0003490747770000081
在所有已知性别的红螯螯虾群体进行峰图分析，由表2可以看出，本发明筛选到的遗传性别相关SNP标记雄性鉴定成功率超过90％，雌性鉴定成功率超过80％，能够作为红螯螯虾遗产性别鉴定的分子标记及方法。
因此，与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的SNP标记是与遗传性别相关的SNP标记，通过SNP标记可以成功鉴定红螯螯虾的遗传性别，为后续单性育种过程中性逆转个体的鉴定提供理论依据；其中，SNP标记在鉴定雄性红螯螯虾时的成功率超过90％，在鉴定雌性红螯螯虾时的成功率超过80％，能够作为红螯螯虾遗产性别鉴定的分子标记，从而指导红螯螯虾的育种和养殖，实现红螯螯虾的单性育种，实施红螯螯虾的全雄或全雌养殖，提高了养殖户的经济收益。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0003490747770000101
Figure BDA0003490747770000111
Figure BDA0003490747770000121
Figure BDA0003490747770000131
/>
序 列 表
<110> 浙江省淡水水产研究所
<120> 一种鉴定红螯螯虾遗传性别的SNP标记及其所用引物对和应用
<130> 2022
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 364
<212> DNA
<213> Artificial sequence（SEQ ID NO:1）
<220>
<223> M=T/G或T/T
<400> 1
tgcctggtga tggtaccaga aatcagtgct ctagtgtcca acaaggcgag ctgttactgc 60
tttgcagctt ccatgaccat ggctgcacca cagccaggct cagcaacgat tgttttccga 120
ggtgcttttc aaaattactg accctgtagc tggttttgat cccggtggct tgaagctaga 180
cttccagaac tgtggcttat atactggctc cctctccttc gcgcttcmgt ataactagtt 240
aatggttcac gtcggaccga aacgtcgtca caagtttcag tctcctatgt acgtgttatc 300
tgtgtattgt tttagtcacg gtattgtgac tattatttta aggatacttt tccctcacca 360
gtaa 364
<210> 2
<211> 365
<212> DNA
<213> 人工序列（雌性个体）
<400> 2
tgcctggtga tggtaccaga aatcagtgct ctagtgtcca acaaggcgag ctgttactgc 60
tttgcagctt ccatgaccat ggctgcacca cagccaggct cagcaacgat tgttttccga 120
ggtgcttttc aaaattactg accctgtagc tggttttgat cccggtggct tgaagctaga 180
cttccagaac tgtggcttat atactggctc cctctccttc gcgcttctgg tataactagt 240
taatggttca cgtcggaccg aaacgtcgtc acaagtttca gtctcctatg tacgtgttat 300
ctgtgtattg ttttagtcac ggtattgtga ctattatttt aaggatactt ttccctcacc 360
agtaa 365
<210> 3
<211> 365
<212> DNA
<213> 人工序列（雄性个体）
<400> 3
tgcctggtga tggtaccaga aatcagtgct ctagtgtcca acaaggcgag ctgttactgc 60
tttgcagctt ccatgaccat ggctgcacca cagccaggct cagcaacgat tgttttccga 120
ggtgcttttc aaaattactg accctgtagc tggttttgat cccggtggct tgaagctaga 180
cttccagaac tgtggcttat atactggctc cctctccttc gcgcttcttg tataactagt 240
taatggttca cgtcggaccg aaacgtcgtc acaagtttca gtctcctatg tacgtgttat 300
ctgtgtattg ttttagtcac ggtattgtga ctattatttt aaggatactt ttccctcacc 360
agtaa 365
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Fst2-F）
<400> 4
tcagtgctct agtgtccaac aagg 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Fst2-R）
<400> 5
tgactaaaac aatacacaga taac 24

Claims (5)

1.一种鉴定红螯螯虾遗传性别的SNP标记，其特征在于：
所述SNP标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述SNP标记的核苷酸序列中第229bp碱基位置表现为TG杂合的是雌性个体，所述SNP标记的核苷酸序列中第229bp碱基位置表现为TT纯合的是雄性个体。
2.检测权利要求1所述的鉴定红螯螯虾遗传性别的SNP标记的试剂在鉴定红螯螯虾遗传性别中的应用，所述鉴定红螯螯虾遗传性别的步骤为：
红螯螯虾提取DNA后，使用引物对进行PCR扩增，获得SNP标记；对SNP标记进行测序和序列比对分析，所述SNP标记的核苷酸序列中第229bp碱基位置表现为TG杂合的是雌性个体，所述SNP标记的核苷酸序列中第229bp碱基位置表现为TT纯合的是雄性个体，所述引物对的核苷酸序列为：
Fst2-F：5’-TCAGTGCTCTAGTGTCCAACAAGG-3’；
Fst2-R：5’-TGACTAAAACAATACACAGATAAC-3’。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述测序是Sanger测序。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述序列比对分析时使用的是SeqMan软件。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述PCR扩增反应的程序为：98℃，预变性5min；98℃，变性5s，55℃，退火5s，72℃，延伸20s，重复40个循环；最后，72℃，延伸1min。
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