CN114480401B - 一种氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物化学领域，特别是涉及一种氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸。本发明提供一种氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸，包括核酸适配体片段，所述核酸适配体片段修饰有氯法拉滨亚磷酰胺单体基团。本发明将核苷药物氯法拉滨和/或吉西他滨设计合成为可用于固相合成的亚磷酰胺单体，使用固相合成技术实现氯法拉滨和/或吉西他滨对寡聚核苷酸上的定点精准功能化，制备获得的氯法拉滨和/或吉西他滨修饰的寡聚核苷酸可以在核酸酶的作用下释放氯法拉滨，对肿瘤细胞仍具有较高的细胞毒性，保留了氯法拉滨和/或吉西他滨的药物活性，具有良好的产业化前景。

Description

一种氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸
技术领域
本发明涉及药物化学领域，特别是涉及一种氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸。
背景技术
氯法拉滨是一种嘌呤核苷抗代谢药，与其他嘌呤核苷类似物不同的是氯法拉滨的嘌呤环中存在氯，核糖部分中存在氟。氯法拉滨通过干扰核酸的合成来阻止细胞产生DNA和RNA，从而阻止癌细胞的生长。氯法拉滨通过脱氧胞苷激酶在细胞内代谢为活性5'-单磷酸代谢物，并通过单和二磷酸激酶代谢为5'-三磷酸代谢物。从而达到对核糖核苷酸还原酶的抑制作用，以及终止DNA链的延伸并通过竞争性抑制DNA聚合酶来抑制修复，进而抑制了DNA的合成。在临床前模型中，氯法拉滨已显示出通过在修复过程中掺入DNA链来抑制DNA修复的能力。氯法拉滨5'-三磷酸酯还破坏线粒体膜的完整性，导致促凋亡线粒体蛋白，细胞色素C和凋亡诱导因子的释放，导致程序性细胞死亡。目前，氯法拉滨已在全球多个国家被批准用于儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的临床治疗。
寡聚核苷酸是短的单链或双链DNA或RNA分子，在分子生物学中正发挥着越来越重要的作用，其可以用于核酸序列检测的探针、单碱基多样性分析、反义寡聚核苷酸等，是一种非常有效的研究工具。通过对寡聚核苷酸进行功能化修饰，可以赋予寡聚核苷酸新的功能，拓宽寡聚核苷酸的应用范围。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸，包括核酸适配体片段，所述核酸适配体片段修饰有氯法拉滨亚磷酰胺单体基团。
在本发明一些实施方式中，所述核酸适配体片段修饰有一个或多个氯法拉滨亚磷酰胺单体基团，所述氯法拉滨亚磷酰胺单体基团修饰于核酸适配体片段的5’端和/或修饰于核酸适配体片段的3’端和/或添加于核酸适配体片段的中间。
在本发明一些实施方式中，所述氯法拉滨亚磷酰胺单体基团与核酸适配体片段之间通过磷酸二脂键连接。
在本发明一些实施方式中，修饰于核酸适配体片段的5’端的氯法拉滨亚磷酰胺单体基团的化学结构式如下所示：
添加于核酸适配体片段的中间的氯法拉滨亚磷酰胺单体基团的化学结构式如下所示：
修饰于核酸适配体片段的3’端的氯法拉滨亚磷酰胺单体基团的化学结构式如下所示：
在本发明一些实施方式中，所述核酸适配体片段还修饰有吉西他滨亚磷酰胺单体基团。
在本发明一些实施方式中，所述核酸适配体片段修饰有一个或多个吉西他滨亚磷酰胺单体基团，所述吉西他滨亚磷酰胺单体基团修饰于核酸适配体片段的5’端和/或修饰于核酸适配体片段的3’端和/或添加于核酸适配体片段的中间。
在本发明一些实施方式中，所述吉西他滨亚磷酰胺单体基团与核酸适配体片段之间通过磷酸二脂键连接。
在本发明一些实施方式中，修饰于核酸适配体片段的5’端的吉西他滨亚磷酰胺单体基团的化学结构式如下所示：
添加于核酸适配体片段的中间的吉西他滨亚磷酰胺单体基团的化学结构式如下所示：
修饰于核酸适配体片段的3’端的吉西他滨亚磷酰胺单体基团的化学结构式如下所示：
在本发明一些实施方式中，所述核酸适配体片段的多核苷酸序列包括如SEQ IDNO.11～20其中之一所示的序列。
在本发明一些实施方式中，所述氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸的多核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1～10其中之一所示的序列。
本发明另一方面提供上述的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸的制备方法，包括：
将氯法拉滨亚磷酰胺单体通过固相合成法与核酸适配体片段连接。
在本发明一些实施方式中，固相合成法的反应温度为15～35℃，反应时间为1～20分钟，空气湿度为30％～70％。
在本发明一些实施方式中，所述氯法拉滨亚磷酰胺单体的化学结构式如下所示：
在本发明一些实施方式中，所述吉西他滨亚磷酰胺单体的化学结构式如下所示：
本发明另一方面提供所述的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸在制备药物中的用途。
附图说明
图1显示为本发明实施例3中氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸质谱鉴定结果示意图。
图2显示为本发明实施例3中氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸质谱鉴定结果示意图。
图3显示为本发明实施例3中氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸质谱鉴定结果示意图。
图4显示为本发明实施例4中吉西他滨和氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸对于癌细胞抑制实验结果示意图。
图5显示为本发明实施例5中氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸对于癌细胞特异性结合实验结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容容易地了解本申请发明的其他优点及功效。
本发明发明人经过大量实践研究后意外地发现，修饰有氯法拉滨的寡聚核苷酸不仅可以保持氯法拉滨原有的药物活性，还可以增加药物的靶向性、减少毒副作用并提高生物利用度，在此基础上完成了本发明。
本发明第一方面提供一种氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸，包括核酸适配体片段，所述核酸适配体片段修饰有氯法拉滨亚磷酰胺单体基团。氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸通常可以由氯法拉滨亚磷酰胺单体通过固相合成法制备获得，制备获得的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸可以包括由氯法拉滨亚磷酰胺单体所对应形成的氯法拉滨亚磷酰胺单体基团、以及与氯法拉滨亚磷酰胺单体基团连接的核酸适配体片段。
本发明所提供的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸中，可以包括氯法拉滨亚磷酰胺单体基团。氯法拉滨亚磷酰胺单体基团的具体结构通常与所使用的氯法拉滨亚磷酰胺单体是相对应的。在本发明一具体实施例中，所使用的氯法拉滨亚磷酰胺单体的化学结构式如下所示：
本发明所提供的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸中，氯法拉滨亚磷酰胺单体基团可以修饰于核酸适配体片段的各个位置，例如，氯法拉滨亚磷酰胺单体基团可以修饰于核酸适配体片段的5’端，也可以修饰于核酸适配体片段的3’端，也可以添加于核酸适配体片段的中间。核酸适配体片段可以修饰有一个或多个氯法拉滨亚磷酰胺单体基团，例如，含60个碱基的寡聚核苷酸序列可以修饰有1-11个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、或11个氯法拉滨亚磷酰胺单体基团。当核酸适配体片段修饰有多个氯法拉滨亚磷酰胺单体基团时，各氯法拉滨亚磷酰胺单体基团之间可以是非连续的，或至少部分的氯法拉滨亚磷酰胺单体基团之间是连续的。
本发明所提供的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸中，如上所述，氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸通常可以由氯法拉滨亚磷酰胺单体通过固相合成法制备获得，所以在形成的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸中，氯法拉滨亚磷酰胺单体所形成的氯法拉滨亚磷酰胺单体基团与(被修饰的)核酸适配体片段之间可以通过磷酸二脂键连接。具体来说，氯法拉滨亚磷酰胺单体中的三价磷基团可以与核酸适配体片段的5’端的羟基基团偶联，从而可以形成磷酸二脂键，而氯法拉滨亚磷酰胺单体中的脱去保护(例如，DMT保护)的羟基基团可以与核酸适配体片段的3’端的亚磷酰胺基团偶联，从而可以形成磷酸二脂键，而氯法拉滨亚磷酰胺单体中的脱去保护(例如，DMT保护)的羟基基团可以与氯法拉滨亚磷酰胺单体中的亚磷酰胺基团反应，从而可以形成磷酸二脂键
在本发明一具体实施例中，当氯法拉滨亚磷酰胺单体基团修饰于核酸适配体片段的5’端时，所形成的基团的化学结构式可以如下所示：
在本发明一具体实施例中，当氯法拉滨亚磷酰胺单体基团添加于核酸适配体片段的中间时，所形成的基团的化学结构式可以如下所示：
在本发明一具体实施例中，当氯法拉滨亚磷酰胺单体基团修饰于核酸适配体片段的3’端时，所形成的基团的化学结构式可以如下所示：
本发明所提供的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸中，所述核酸适配体片段还修饰有吉西他滨亚磷酰胺单体基团。同时由氯法拉滨和吉西他滨修饰的寡聚核苷酸通常可以由氯法拉滨亚磷酰胺单体和吉西他滨亚磷酰胺单体通过固相合成法制备获得，制备获得的同时包括氯法拉滨和吉西他滨修饰的寡聚核苷酸可以包括由氯法拉滨亚磷酰胺单体所对应形成的氯法拉滨亚磷酰胺单体基团、吉西他滨亚磷酰胺单体所对应形成的吉西他滨亚磷酰胺单体基团、以及与氯法拉滨亚磷酰胺单体基团和/或吉西他滨亚磷酰胺单体基团连接的核酸适配体片段。
本发明所提供的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸中，可以包括吉西他滨亚磷酰胺单体基团。吉西他滨亚磷酰胺单体基团的具体结构通常与所使用的吉西他滨亚磷酰胺单体是相对应的。在本发明一具体实施例中，所使用的吉西他滨亚磷酰胺单体的化学结构式如下所示：
本发明所提供的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸中，吉西他滨亚磷酰胺单体基团可以修饰于核酸适配体片段的各个位置，例如，吉西他滨亚磷酰胺单体基团可以修饰于核酸适配体片段的5’端，也可以修饰于核酸适配体片段的3’端，也可以添加于核酸适配体片段的中间，再例如，氯法拉滨亚磷酰胺单体基团的两端可以各自独立地是未修饰的、与核酸适配体片段、吉西他滨亚磷酰胺单体基团或其他氯法拉滨亚磷酰胺单体基团连接，再例如，吉西他滨亚磷酰胺单体基团的两端可以各自独立地是未修饰的、与核酸适配体片段、氯法拉滨亚磷酰胺单体基团、或其他吉西他滨亚磷酰胺单体基团连接。核酸适配体片段可以修饰有一个或多个吉西他滨亚磷酰胺单体基团，例如，含60个碱基的寡聚核苷酸序列可以修饰有1-10个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个吉西他滨亚磷酰胺单体基团。当核酸适配体片段修饰有多个吉西他滨亚磷酰胺单体基团时，各吉西他滨亚磷酰胺单体基团之间可以是非连续的，或至少部分的吉西他滨亚磷酰胺单体基团之间可以是连续的。
本发明所提供的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸中，如上所述，氯法拉滨和吉西他滨修饰的寡聚核苷酸通常可以由氯法拉滨亚磷酰胺单体和吉西他滨亚磷酰胺单体通过固相合成法制备获得，所以在形成的氯法拉滨和吉西他滨修饰的寡聚核苷酸中，氯法拉滨亚磷酰胺单体所形成的氯法拉滨亚磷酰胺单体基团与临近的基团或片段之间可以通过磷酸二脂键连接，吉西他滨亚磷酰胺单体所形成的吉西他滨亚磷酰胺单体基团与临近的基团或片段之间可以通过磷酸二脂键连接。具体来说，氯法拉滨亚磷酰胺单体、或吉西他滨亚磷酰胺单体中的三价磷基团可以与临近的基团或片段(例如，核酸适配体片段、氯法拉滨亚磷酰胺单体基团、或吉西他滨亚磷酰胺单体基团)的羟基基团偶联，从而可以形成磷酸二脂键，而氯法拉滨亚磷酰胺单体、或吉西他滨亚磷酰胺单体中的脱去保护(例如，DMT保护)的羟基基团可以与临近的基团或片段(例如，核酸适配体片段、氯法拉滨亚磷酰胺单体基团、或吉西他滨亚磷酰胺单体基团)的亚磷酰胺基团偶联，从而可以形成磷酸二脂键。
在本发明一具体实施例中，当吉西他滨亚磷酰胺单体基团修饰于核酸适配体片段的5’端时，所形成的基团的化学结构式可以如下所示：
在本发明一具体实施例中，当吉西他滨亚磷酰胺单体基团添加于核酸适配体片段的中间时，所形成的基团的化学结构式可以如下所示：
在本发明一具体实施例中，当吉西他滨亚磷酰胺单体基团修饰于核酸适配体片段的3’端时，所形成的基团的化学结构式可以如下所示：
本发明所提供的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸中，可以包括核酸适配体片段。核酸适配体片段的具体序列的选择很大程度上决定了寡聚核苷酸的靶向性，也很大程度上决定了寡聚核苷酸整体上的稳定性，核酸适配体片段的多核苷酸序列(即未修饰氯法拉滨亚磷酰胺单体基团前的多核苷酸序列)可以包括如SEQ ID NO.11～20其中之一所示的序列。核酸适配体片段通常靶向于其所对应的蛋白，例如，如上所示的核酸适配体片段可以靶向蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)，均能够实现肿瘤细胞的特异性靶向。再例如，氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸的多核苷酸序列可以包括如SEQ ID NO.1～10其中之一所示的序列。
在本发明一具体实施例中，氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸中氯法拉滨亚磷酰胺单体基团所形成基团可以是如下之一所述：
其中，n1为0、或正整数，例如，可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、或9；
n2为正整数，例如，可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10；
n3为0、或正整数，例如，可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、或9；
表示与氯法拉滨亚磷酰胺单体基团相连接的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸中的其他片段。
在本发明另一具体实施例中，氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸中吉西他滨亚磷酰胺单体基团所形成基团可以是如下之一所述：
其中，n4为0、或正整数，例如，可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、或9；
n5为正整数，例如，可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10；
n6为0、或正整数，例如，可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、或9；
表示与吉西他滨亚磷酰胺单体基团相连接的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸中的其他片段。
本发明第二方面提供本发明第一方面所提供的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸的制备方法，包括：将氯法拉滨亚磷酰胺单体和/或吉西他滨亚磷酰胺单体通过固相合成法与核酸适配体片段连接。
本发明所提供的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸的制备方法中，合适的固相合成法的条件对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，固相合成的反应条件可以是A、T、C、G等天然碱基的偶联反应条件。再例如，固相合成法的反应温度可以为15～35℃、15～20℃、20～25℃、25～30℃、或30～35℃；反应时间可以为1～20分钟、1～2分钟、2～4分钟、4～6分钟、6～8分钟、8～10分钟、10～15分钟、或15～20分钟；空气湿度可以为30％～70％、30％～35％、35％～40％、40％～45％、45％～50％、50％～55％、55％～60％、60％～65％、或65％～70％；溶剂可以为腈类溶剂、醚类溶剂、卤代烷烃类溶剂等，具体可以为乙腈、四氢呋喃、三氯甲烷、1,2-二氯乙烷等。
本发明所提供的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸的制备方法中，氯法拉滨亚磷酰胺单体的制备方法可以包括：将式I化合物与2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺进行缩合反应，以提供氯法拉滨亚磷酰胺单体，反应方程式如下：
上述缩合反应中，反应通常可以在碱存在的条件下进行，所述碱通常可以是有机碱，具体可以是例如，DIPEA、三乙胺、DMPA、吡啶等。碱的用量相对于式I化合物来说通常是过量的，从而可以保证反应的转化率、并能够使反应充分正向进行。例如，上述缩合反应中，式I化合物和碱的摩尔比可以为1：3～12、1：3～4、1：4～5、1：5～6、1：6～7、1：7～8、1：8～9、1：9～10、1：10～11、或1：11～12，优选可以为1：5.5～6.5。
上述缩合反应中，2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺的用量相对于式I化合物来说通常是过量的，从而可以保证反应的转化率、并能够使反应充分正向进行。例如，上述缩合反应中，式I化合物和2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺的摩尔比可以为1：1.5～6、1：1.5～2、1：2～2.5、1：2.5～3、1：3～3.5、1：3.5～4、1：4～4.5、1：4.5～5、1：5～5.5、或1：5.5～6，优选可以为1：2.5～3.5。
上述缩合反应中，反应可以在反应溶剂存在的条件下进行，缩合反应中所使用的反应溶剂通常可以是非质子性溶剂，合适的反应溶剂的种类和使用量对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，缩合反应中，反应溶剂可以是卤代烷烃类溶剂、亚砜类溶剂等，更具体可以是二氯甲烷、二甲基亚砜、三氯甲烷、1,2-二氯乙烷等。
上述缩合反应中，反应通常需要避免在过高温度下进行。例如，缩合反应中的反应温度可以为15～30℃、15～20℃、20～25℃、或25～30℃。本领域技术人员可根据反应进程调整反应时间，例如，缩合反应中，可以通过TLC、色谱法等方法判断缩合反应的反应进程，再例如，缩合反应的反应时间可以是0.5～3h、0.5～1h、1～1.5h、1.5～2h、或2～3h。
上述缩合反应中，反应通常需要在气体保护的条件下进行。合适的提供气体保护的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过氮气、惰性气体等提供气体保护的条件，所述惰性气体具体可以是氦气、氖气、氩气、氪气等。
上述缩合反应中，本领域技术人员可选择合适的方法对反应所得产物进行后处理，例如，可以包括：脱溶、纯化。反应结束以后，可以将产物脱除溶剂，进一步纯化以后，可以提供氯法拉滨亚磷酰胺单体。合适的纯化方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是柱层析色谱等方法。
本发明所提供的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸的制备方法中，还可以包括：将式II化合物与4,4'-双甲氧基三苯甲基氯(DMTrCl)进行第一羟基保护反应，以提供式I化合物，反应方程式如下：
上述第一羟基保护反应中，反应通常可以在碱存在的条件下进行，所述碱通常可以是有机碱，具体可以是例如，吡啶、DMAP、三乙胺、二乙胺等。碱的用量相对于式I化合物来说通常是大大过量的，其本身亦可以作为反应体系的溶剂。
上述第一羟基保护反应中，反应可以在反应溶剂存在的条件下进行，第一羟基保护反应中所使用的反应溶剂通常可以是非质子性溶剂，合适的反应溶剂的种类和使用量对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，第一羟基保护反应中，反应溶剂可以是卤代烷烃类溶剂、亚砜类溶剂等，更具体可以是二氯甲烷、二甲基亚砜、三氯甲烷、1,2-二氯乙烷等。
上述第一羟基保护反应中，DMTrCl的用量相对于式II化合物来说通常是基本等量或者过量的，从而可以保证反应的转化率、并能够使反应充分正向进行。例如，上述第一羟基保护反应中，式II化合物和DMTrCl的摩尔比可以为1：1～1.5、1：1～1.1、1：1.1～1.2、1：1.2～1.3、1：1.3～1.4、或1：1.4～1.5，优选可以为1：1.15～1.25。
上述第一羟基保护反应中，反应通常可以在室温至溶剂沸点的温度条件下进行。例如，第一羟基保护反应中的反应温度可以为15～45℃、15～20℃、20～25℃、25～30℃、30～35℃、35～40℃、或40～45℃。本领域技术人员可根据反应进程调整反应时间，例如，第一羟基保护反应中，可以通过TLC、色谱法等方法判断第一羟基保护反应的反应进程，再例如，第一羟基保护反应的反应时间可以是2～24h、2～3h、3～4h、4～6h、6～8h、8～12h、12～16h、16～20h、或20～24h。
上述第一羟基保护反应中，反应通常需要在气体保护的条件下进行。合适的提供气体保护的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过氮气、惰性气体等提供气体保护的条件，所述惰性气体具体可以是氦气、氖气、氩气、氪气等。
上述第一羟基保护反应中，本领域技术人员可选择合适的方法对反应所得产物进行后处理，例如，可以包括：脱溶、纯化。反应结束以后，可以将产物脱除溶剂，进一步纯化以后，可以提供式I化合物。合适的纯化方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是柱层析色谱等方法。
本发明所提供的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸的制备方法中，还可以包括：将式III化合物与四丁基氟化铵(TBAF)进行TBDMS脱除反应，以提供式II化合物，反应方程式如下：
上述TBDMS脱除反应中，反应通常可以在酸存在的条件下进行，所述酸通常可以是有机酸，具体可以是例如，甲酸、乙酸、丙酸等。酸的用量相对于式III化合物来说通常是过量的，从而可以保证反应的转化率、并能够使反应充分正向进行。例如，上述TBDMS脱除反应中，式I化合物和酸的摩尔比可以为1：5～20、1：5～6、1：6～8、1：8～10、1：10～12、1：12～14、1：14～16、1：16～18、或1：18～20，优选可以为1：10～14。
上述TBDMS脱除反应中，四丁基氟化铵的用量相对于式III化合物来说通常是基本等量或者过量的，从而可以保证反应的转化率、并能够使反应充分正向进行。例如，上述TBDMS脱除反应中，式III化合物和四丁基氟化铵的摩尔比可以为1：1～10、1：1～2、1：2～3、1：3～4、1：4～6、1：6～8、或1：8～10，优选可以为1：2～4。
上述TBDMS脱除反应中，反应可以在反应溶剂存在的条件下进行，TBDMS脱除反应中所使用的反应溶剂通常可以是非质子性溶剂，合适的反应溶剂的种类和使用量对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，TBDMS脱除反应中，反应溶剂具体可以是卤代烷烃类溶剂、亚砜类溶剂、醚类溶剂、酰胺类溶剂等，更具体可以是四氢呋喃、三氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、1,2-二氯乙烷等。
上述TBDMS脱除反应中，反应通常需要避免在过高温度下进行。例如，TBDMS脱除反应中的反应温度可以为15～30℃、15～20℃、20～25℃、或25～30℃。本领域技术人员可根据反应进程调整反应时间，例如，TBDMS脱除反应中，可以通过TLC、色谱法等方法判断缩合反应的反应进程，再例如，TBDMS脱除反应的反应时间可以是3～12h、3～4h、4～6h、6～8h、或8～12h。
上述TBDMS脱除反应中，反应通常需要在气体保护的条件下进行。合适的提供气体保护的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过氮气、惰性气体等提供气体保护的条件，所述惰性气体具体可以是氦气、氖气、氩气、氪气等。
上述TBDMS脱除反应中，本领域技术人员可选择合适的方法对反应所得产物进行后处理，例如，可以包括：脱溶、纯化。反应结束以后，可以将产物脱除溶剂，进一步纯化以后，可以提供氯法拉滨亚磷酰胺单体。合适的纯化方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是柱层析色谱等方法。
本发明所提供的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸的制备方法中，还可以包括：将式IV化合物与苯甲酰氯(BzCl)进行氨基保护反应，以提供式III化合物，反应方程式如下：
上述氨基保护反应中，反应通常可以在碱存在的条件下进行，所述碱通常可以是有机碱，具体可以是例如，咪唑、三乙胺或N,N-二异丙基乙胺等。碱的用量相对于式III化合物来说通常是过量的，从而可以保证反应的转化率、并能够使反应充分正向进行。例如，上述氨基保护反应中，式I化合物和碱的摩尔比可以为1：3～30、1：3～4、1：4～6、1：6～8、1：8～10、1：10～12、1：12～14、1：14～16、1：16～18、1：18～20、1：20～25、或1：25～30，优选可以为1：16～20。
上述氨基保护反应中，苯甲酰氯的用量相对于式IV化合物来说通常是基本等量或者过量的，从而可以保证反应的转化率、并能够使反应充分正向进行。例如，上述氨基保护反应中，式IV化合物和苯甲酰氯的摩尔比可以为1：2～20、1：2～3、1：3～4、1：4～6、1：6～8、1：8～10、1：10～12、1：12～14、1：14～16、1：16～18、或1：18～20，优选可以为1：6～8。
上述氨基保护反应中，反应可以在反应溶剂存在的条件下进行，氨基保护反应中所使用的反应溶剂通常可以是非质子性溶剂，合适的反应溶剂的种类和使用量对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，氨基保护反应中，反应溶剂具体可以是卤代烷烃类溶剂、亚砜类溶剂、酰胺类溶剂等，更具体可以是二氯甲烷、三氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、1,2-二氯乙烷等。
上述氨基保护反应中，反应通常需要避免在过高温度下进行。例如，氨基保护反应中的反应温度可以为室温、15～30℃、15～20℃、20～25℃、或25～30℃。本领域技术人员可根据反应进程调整反应时间，例如，氨基保护反应中，可以通过TLC、色谱法等方法判断缩合反应的反应进程，再例如，氨基保护反应的反应时间可以是4～12h、4～6h、6～8h、8～10h、或10～12h。
上述氨基保护反应中，反应通常需要在气体保护的条件下进行。合适的提供气体保护的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过氮气、惰性气体等提供气体保护的条件，所述惰性气体具体可以是氦气、氖气、氩气、氪气等。
上述氨基保护反应中，本领域技术人员可选择合适的方法对反应所得产物进行后处理，例如，可以包括：脱溶、纯化。反应结束以后，可以将产物脱除溶剂，进一步纯化以后，可以提供氯法拉滨亚磷酰胺单体。合适的纯化方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是柱层析色谱等方法。
本发明所提供的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸的制备方法中，还可以包括：将式V化合物与叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)进行第二羟基保护反应，以提供式IV化合物，反应方程式如下：
上述第二羟基保护反应中，反应通常可以在碱存在的条件下进行，所述碱通常可以是有机碱，具体可以是例如，咪唑、三乙胺或N,N-二异丙基乙胺等。碱的用量相对于式V化合物来说通常是大大过量的，例如，上述第二羟基保护反应中，式V化合物和碱的摩尔比可以为1：4～25，优选可以为1：6～10
上述第二羟基保护反应中，反应可以在反应溶剂存在的条件下进行，第二羟基保护反应中所使用的反应溶剂通常可以是非质子性溶剂，合适的反应溶剂的种类和使用量对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，第二羟基保护反应中，反应溶剂可以是卤代烷烃类溶剂、亚砜类溶剂、酰胺类溶剂等，更具体可以是N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、1,2-二氯乙烷等。
上述第二羟基保护反应中，叔丁基二甲基氯硅烷的用量相对于式V化合物来说通常是过量的，从而可以保证反应的转化率、并能够使反应充分正向进行。例如，上述第二羟基保护反应中，式V化合物和叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔比可以为1：2～10、1：2～3、1：3～4、1：4～6、1：6～8、或1：8～10，优选可以为1：3～4。
上述第二羟基保护反应中，反应通常可以在室温至溶剂沸点的温度条件下进行。例如，第二羟基保护反应中的反应温度可以为15～45℃、15～20℃、20～25℃、25～30℃、30～35℃、35～40℃、或40～45℃。本领域技术人员可根据反应进程调整反应时间，例如，第二羟基保护反应中，可以通过TLC、色谱法等方法判断第二羟基保护反应的反应进程，再例如，第二羟基保护反应的反应时间可以是3～24h。
上述第二羟基保护反应中，反应通常需要在气体保护的条件下进行。合适的提供气体保护的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过氮气、惰性气体等提供气体保护的条件，所述惰性气体具体可以是氦气、氖气、氩气、氪气等。
上述第二羟基保护反应中，本领域技术人员可选择合适的方法对反应所得产物进行后处理，例如，可以包括：脱溶、纯化。反应结束以后，可以将产物脱除溶剂，进一步纯化以后，可以提供式I化合物。合适的纯化方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是柱层析色谱等方法。
本发明所提供的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸的制备方法中，吉西他滨亚磷酰胺单体的制备方法可以包括：将式VI化合物与2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺进行缩合反应，以提供吉西他滨亚磷酰胺单体，反应方程式如下：
上述缩合反应中，反应通常可以在碱存在的条件下进行，所述碱通常可以是有机碱，具体可以是例如，DIPEA、三乙胺、DMPA、吡啶等。碱的用量相对于式VI化合物来说通常是过量的，从而可以保证反应的转化率、并能够使反应充分正向进行。例如，上述缩合反应中，式VI化合物和碱的摩尔比可以为1：3～12、1：3～4、1：4～5、1：5～6、1：6～7、1：7～8、1：8～9、1：9～10、1：10～11、或1：11～12，优选可以为1：5.5～6.5。
上述缩合反应中，2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺的用量相对于式VI化合物来说通常是过量的，从而可以保证反应的转化率、并能够使反应充分正向进行。例如，上述缩合反应中，式VI化合物和2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺的摩尔比可以为1：1.5～6、1：1.5～2、1：2～2.5、1：2.5～3、1：3～3.5、1：3.5～4、1：4～4.5、1：4.5～5、1：5～5.5、或1：5.5～6，优选可以为1：2.5～3.5。
上述缩合反应中，反应可以在反应溶剂存在的条件下进行，缩合反应中所使用的反应溶剂通常可以是非质子性溶剂，合适的反应溶剂的种类和使用量对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，缩合反应中，反应溶剂可以是卤代烷烃类溶剂、醚类溶剂、腈类溶剂等，更具体可以是二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈等。
上述缩合反应中，反应通常需要避免在过高温度下进行。例如，缩合反应中的反应温度可以为15～30℃、15～20℃、20～25℃、或25～30℃。本领域技术人员可根据反应进程调整反应时间，例如，缩合反应中，可以通过TLC、色谱法等方法判断缩合反应的反应进程，再例如，缩合反应的反应时间可以是0.5～3h、0.5～1h、1～1.5h、1.5～2h、或2～3h。
上述缩合反应中，反应通常需要在气体保护的条件下进行。合适的提供气体保护的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过氮气、惰性气体等提供气体保护的条件，所述惰性气体具体可以是氦气、氖气、氩气、氪气等。
上述缩合反应中，本领域技术人员可选择合适的方法对反应所得产物进行后处理，例如，可以包括：脱溶、纯化。反应结束以后，可以将产物脱除溶剂，进一步纯化以后，可以提供吉西他滨亚磷酰胺单体。合适的纯化方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是柱层析色谱等方法。
本发明所提供的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸的制备方法中，还可以包括：将式VII化合物与4,4'-双甲氧基三苯甲基氯(DMTrCl)进行羟基保护反应，以提供式VI化合物，反应方程式如下：
上述羟基保护反应中，反应通常可以在碱存在的条件下进行，所述碱通常可以是有机碱，具体可以是例如，吡啶、DMAP、三乙胺、二乙胺等。碱的用量相对于式VII化合物来说通常是大大过量的，其本身亦可以作为反应体系的溶剂。
上述羟基保护反应中，反应可以在反应溶剂存在的条件下进行，羟基保护反应中所使用的反应溶剂通常可以是非质子性溶剂，合适的反应溶剂的种类和使用量对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，羟基保护反应中，反应溶剂可以选自是卤代烷烃类溶剂、亚砜类溶剂等，更具体可以是二氯甲烷、二甲基亚砜、三氯甲烷、1,2-二氯乙烷等。
上述羟基保护反应中，DMTrCl的用量相对于式VII化合物来说通常是基本等量或者过量的，从而可以保证反应的转化率、并能够使反应充分正向进行。例如，上述羟基保护反应中，式VII化合物和DMTrCl的摩尔比可以为1：1～1.5、1：1～1.1、1：1.1～1.2、1：1.2～1.3、1：1.3～1.4、1：或1.4～1.5，优选可以为1：1.15～1.25。
上述羟基保护反应中，反应通常可以在室温至溶剂沸点的温度条件下进行。例如，羟基保护反应中的反应温度可以为15～45℃、15～20℃、20～25℃、25～30℃、30～35℃、35～40℃、或40～45℃。本领域技术人员可根据反应进程调整反应时间，例如，羟基保护反应中，可以通过TLC、色谱法等方法判断羟基保护反应的反应进程，再例如，羟基保护反应的反应时间可以是2～24h、2～3h、3～4h、4～6h、6～8h、8～12h、12～16h、16～20h、或20～24h。
上述羟基保护反应中，反应通常需要在气体保护的条件下进行。合适的提供气体保护的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过氮气、惰性气体等提供气体保护的条件，所述惰性气体具体可以是氦气、氖气、氩气、氪气等。
上述羟基保护反应中，本领域技术人员可选择合适的方法对反应所得产物进行后处理，例如，可以包括：脱溶、纯化。反应结束以后，可以将产物脱除溶剂，进一步纯化以后，可以提供式VI化合物。合适的纯化方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是柱层析色谱等方法。
本发明所提供的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸的制备方法中，还可以包括：将式VIII化合物与乙酸酐进行氨基保护反应，以提供式VII化合物，反应方程式如下：
上述氨基保护反应中，乙酸酐的用量相对于式VIII化合物来说通常是基本等量或者过量的，从而可以保证反应的转化率、并能够使反应充分正向进行。例如，上述氨基保护反应中，式VIII化合物和乙酸酐的摩尔比可以为1：1～1.5、1：1～1.1、1：1.1～1.2、1：1.2～1.3、1：1.3～1.4、1：1.4～1.5，优选可以为1：1.05～1.15。
上述氨基保护反应中，反应可以在反应溶剂存在的条件下进行，氨基保护反应中所使用的反应溶剂通常可以是非质子性溶剂，合适的反应溶剂的种类和使用量对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，氨基保护反应中，反应溶剂可以选自酰胺类溶剂、醚类溶剂、卤代烷烃类溶剂等，更具体可以是DMF、四氢呋喃、二氧六环、1,2-二氯乙烷等。
上述氨基保护反应中，反应通常可以在室温至溶剂沸点的温度条件下进行。例如，氨基保护反应中的反应温度可以为15～35℃、15～20℃、20～25℃、25～30℃、或30～35℃。本领域技术人员可根据反应进程调整反应时间，例如，氨基保护反应中，可以通过TLC、色谱法等方法判断缩合反应的反应进程，再例如，氨基保护反应的反应时间可以是5～6h、6～8h、8～10h、10～12h、12～16h、16～24h、或24～36h。
上述氨基保护反应中，反应通常需要在气体保护的条件下进行。合适的提供气体保护的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过氮气、惰性气体等提供气体保护的条件，所述惰性气体具体可以是氦气、氖气、氩气、氪气等。
上述氨基保护反应中，本领域技术人员可选择合适的方法对反应所得产物进行后处理，例如，可以包括：脱溶、纯化。反应结束以后，可以将产物脱除溶剂，进一步纯化以后，可以提供式VII化合物。合适的纯化方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是柱层析色谱等方法。
本发明第三方面提供本发明第一方面所提供的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸在制备药物中的用途。本发明所提供的氯法拉滨和/或吉西他滨修饰的寡聚核苷酸对于靶标细胞(例如，可以是肿瘤细胞，具体可以是胰腺导管腺癌、急性淋巴细胞白血病、急性T淋巴细胞白血病、三阴性乳腺癌、结直肠癌等)具有良好的特异性和靶向性，可以保持氯法拉滨原有的药物活性，并可以减少毒副作用并提高生物利用度，从而可以被作为肿瘤治疗药物。
本发明将核苷药物氯法拉滨和/或吉西他滨设计合成为可用于固相合成的亚磷酰胺单体，使用固相合成技术实现氯法拉滨和/或吉西他滨对寡聚核苷酸上的定点精准功能化，制备获得的氯法拉滨和/或吉西他滨修饰的寡聚核苷酸可以在核酸酶的作用下释放氯法拉滨，对肿瘤细胞仍具有较高的细胞毒性，保留了氯法拉滨和/或吉西他滨的药物活性，具有良好的产业化前景。
下面通过实施例对本申请的发明予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。
实施例1
氯法拉滨亚磷酰胺单体的制备：
1)在单口瓶中加入氯法拉滨(1当量)，加入N,N-二甲基甲酰胺20mL，咪唑(15当量)，室温下向溶液中加入叔丁基二甲基氯硅烷(3.2当量)。将混合物搅拌12h。使用旋转蒸发仪真空除去溶剂，通过硅胶柱层析色谱进行分离纯化，得到白色固体状的TBDMS-氯法拉滨(99％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.05(d,J＝2.6Hz,1H),6.51(s,2H),6.43(dd,J＝17.5,3.9Hz,1H),4.99(dt,J＝52.1,2.9Hz,1H),4.61(dt,J＝18.0,2.9Hz,1H),3.94(q,J＝4.5Hz,1H),3.84(d,J＝4.6Hz,2H),0.92(d,J＝3.8Hz,18H),0.14(d,J＝1.9Hz,6H),0.10(s,6H)ppm.
氯法拉滨在咪唑(imidazole)作用下与叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中反应的反应式如下:
2)在单口瓶中加入TBDMS-氯法拉滨(1当量)和三乙胺(18当量)，加入二氯甲烷50mL，0℃下向溶液中加入苯甲酰氯(6.8当量)。反应8小时，使用旋转蒸发仪真空除去溶剂，通过硅胶柱层析色谱进行分离纯化，得到无色油状的TBDMS-Bz2-氯法拉滨(80％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.27(d,J＝2.5Hz,1H),7.86(s,2H),7.84-7.83(m,2H),7.49(q,J＝7.5Hz,2H),7.37(t,J＝7.7Hz,4H),6.48(dd,J＝18.9,3.4Hz,1H),5.07-4.89(m,1H),4.66-4.57(m,1H),3.97(q,J＝4.4Hz,1H),3.83(d,J＝4.6Hz,2H),0.92(d,J＝6.9Hz,18H),0.15(d,J＝2.4Hz,6H),0.09-0.08(m,6H)ppm.
TBDMS-氯法拉滨与苯甲酰氯(BzCl)在三乙胺作用下在二氯甲烷中反应的反应式如下：
3)在单口瓶中加入TBDMS-Bz2-氯法拉滨(1当量)和醋酸(12当量)，加入四氢呋喃100mL，在0℃下加入四丁基氟化铵(3当量)。室温反应6小时。使用旋转蒸发仪除去溶剂，通过快速柱层析色谱分离纯化，得到白色固体状的Bz2-氯法拉滨(71％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.39(s,1H),7.81(d,J＝7.7Hz,4H),7.49(t,J＝7.4Hz,2H),7.36(t,J＝7.6Hz,4H),6.40(dd,J＝15.4,3.6Hz,1H),5.02(d,J＝51.8Hz,1H),4.52(d,J＝17.8Hz,1H),3.96-3.91(m,1H),3.82-3.67(m,2H)ppm.
TBDMS-Bz2-氯法拉滨在醋酸作用下与四丁基氟化铵(TBAF)在四氢呋喃中反应的反应式如下：
4)在单口瓶中加入Bz2-氯法拉滨(1当量)，溶于40mL吡啶中，在室温下向溶液中分3次加入DMTrCl(1.2当量)。将混合物在N2保护下搅拌8h，使用旋转蒸发仪真空除去溶剂，通过快速柱层析色谱进行分离纯化，得到白色发泡状的DMTr-Bz2-氯法拉滨(82％)。1H NMR(400MHz,Acetonitrile-d3)δ8.26(d,J＝2.0Hz,1H),7.82(d,J＝7.4Hz,4H),7.58(t,J＝7.5Hz,2H),7.42(t,J＝7.8Hz,6H),7.30(d,J＝8.6Hz,4H),7.25(t,J＝7.3Hz,2H),7.19(t,J＝7.1Hz,1H),6.83(d,J＝8.7Hz,4H),6.44(dd,J＝14.7,4.3Hz,1H),5.19(dt,J＝51.9,3.9Hz,1H),4.55(dt,J＝18.1,3.9Hz,1H),4.13-4.09(m,1H),3.73(s,6H),3.38(ddd,J＝34.7,10.5,4.9Hz,2H)ppm.
Bz2-氯法拉滨与4,4'-双甲氧基三苯甲基氯(DMTrCl)在吡啶中反应的反应式如下：
5)在单口瓶中加入DMTr-Bz2-氯法拉滨(1当量)和DIPEA(6当量)，溶解于100mL二氯甲烷。在0℃和N2保护下，向混合溶液中加入2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(3当量)。10min后将混合物恢复至室温，并继续搅拌1h。室温下使用旋转蒸发仪真空除去溶剂通过快速柱层析色谱进行分离纯化，得到白色发泡状固体为氯法拉滨亚磷酰胺单体(73％)。1H NMR(400MHz,Acetonitrile-d3)δ8.30(s,1H),7.82(d,J＝7.8Hz,4H),7.59(t,J＝7.4Hz,2H),7.43(t,J＝7.6Hz,6H),7.31(d,J＝8.7Hz,4H),7.25(t,J＝7.5Hz,2H),7.22-7.17(m,1H),6.83(d,J＝8.0Hz,4H),6.45(dd,J＝14.0,4.5Hz,1H),5.35(dt,J＝51.9,4.1Hz,1H),4.84-4.73(m,1H),4.23(q,J＝5.0Hz,1H),3.74(s,6H),3.69-3.63(m,2H),3.63-3.55(m,2H),3.44(t,J＝5.2Hz,2H),2.52(t,J＝6.0Hz,2H),1.16(dd,J＝12.1,6.8Hz,12H)ppm.31PNMR(162MHz,Acetonitrile-d3)δ150.54ppm.
DMTr-Bz2-氯法拉滨与2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺在二氯甲烷中反应的反应式如下：
实施例2
吉西他滨亚磷酰胺单体的制备：
1)在100mL单口圆底烧瓶中加入吉西他滨(710mg，2.7mmol)，20mL DMF，在室温下向溶液中加入乙酸酐(280μL，2.96mmol)。N2保护下将混合物搅拌过夜。使用旋转蒸发仪真空除去溶剂DMF，将残余物与硅胶混合，通过硅胶柱层析色谱进行分离纯化，得到白色固体状的Ac-吉西他滨(616mg，75％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.02(s,1H),8.24(d,J＝7.6Hz,1H),7.25(d,J＝7.6Hz,1H),6.33(d,J＝6.6Hz,1H),6.17(t,J＝7.4Hz,1H),5.31(t,J＝5.4Hz,1H),4.24-4.14(m,1H),4.11(q,J＝5.3Hz,1H),3.89(dt,J＝8.5,3.0Hz,1H),3.80(ddd,J＝12.7,5.2,2.4Hz,1H),3.65(ddd,J＝12.7,5.9,3.6Hz,1H),3.16(d,J＝5.3Hz,2H),2.11(s,3H)ppm.
吉西他滨与醋酸酐(Ac2O)在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中反应的反应式如下：
2)在100mL单口圆底烧瓶中加入Ac-吉西他滨(2.12g，6.95mmol)溶于50mL吡啶中，在室温下向溶液中分3次加入DMTrCl(2.53g，7.65mmol)。将混合物在N2保护下搅拌8h后使用旋转蒸发仪真空除去溶剂吡啶，将残余物与硅胶混合，通过快速柱层析色谱进行分离纯化，得到白色发泡状的DMTr-Ac-吉西他滨(3.04g，72％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.04(s,1H),8.15(d,J＝7.6Hz,1H),7.39(d,J＝7.7Hz,2H),7.34(t,J＝7.6Hz,2H),7.27(d,J＝8.2Hz,5H),7.11(d,J＝7.6Hz,1H),6.92(d,J＝8.3Hz,4H),6.42(d,J＝6.7Hz,1H),6.23(t,J＝7.2Hz,1H),4.44-4.30(m,1H),4.07(d,J＝7.3Hz,2H),3.75(s,6H),3.43(dd,J＝11.4,4.5Hz,1H),3.32(s,1H),2.11(s,3H)ppm.
Ac-吉西他滨与4,4'-双甲氧基三苯甲基氯(DMTrCl)在吡啶中反应的反应式如下：
3)在100mL单口圆底烧瓶中加入DMTr-Ac-吉西他滨(637mg，1.05mmol)和DIPEA(1.055mL，6.30mmol)，20mL二氯甲烷。在0℃和N2保护下，向混合溶液中加入2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(755μL，3.148mmol)。10min后将混合物恢复至室温，并继续搅拌1h。室温下使用旋转蒸发仪真空除去溶剂，将残余物与硅胶混合，通过快速柱层析色谱进行分离纯化，得到白色发泡状固体为吉西他滨亚磷酰胺单体(795mg，95％)。1H NMR(400MHz,Acetonitrile-d3)δ8.95(d,J＝10.8Hz,1H),8.10(d,J＝7.6Hz,1H),7.46(d,J＝7.5Hz,2H),7.34(t,J＝9.8Hz,5H),7.28(d,J＝7.4Hz,1H),7.11(d,J＝7.9Hz,1H),6.90(d,J＝7.7Hz,4H),6.30(t,J＝7.7Hz,1H),4.60(p,J＝10.6Hz,1H),4.20(d,J＝8.3Hz,1H),3.80(s,6H),3.57(q,J＝13.1,10.0Hz,3H),3.50-3.44(m,1H),3.15(p,J＝6.7,6.3Hz,1H),2.65(t,J＝5.8Hz,2H),2.18(s,3H),1.84(s,2H),1.16(d,J＝6.5Hz,6H),1.01(d,J＝6.6Hz,6H)ppm.31P NMR(162MHz,Acetonitrile-d3)δ151.74ppm.
DMTr-Ac-吉西他滨与2-氰乙基N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺在二氯甲烷中反应的反应式如下：
实施例3
氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸的制备：
将氯法拉滨亚磷酰胺单体和吉西他滨亚磷酰胺单体分别溶解于无水乙腈，配制为0.1M的浓度，用于DNA固相合成仪进行固相合成。25-35℃进行偶联，每次偶联时间为5分钟，偶联两次，在3’端通用Universal-CPG上合成不同序列的氯法拉滨和/或吉西他滨修饰寡聚核苷酸，所偶联的寡聚核苷酸的多核苷酸序列如表1所示。偶联结束后使用浓氨水将寡聚核苷酸从固相负载切割下来，使用HPLC进行纯化。纯化后进行质谱表征，质谱分子测量获得的各序列的物质的分子量与理论分子量均吻合，示例性给出如下表征结果：序列5质谱表征结果如图1所示，MS：Calculated:18471.9(Found:18472.9)，序列8质谱表征结果如图2所示，MS：Calculated:18106.2(Found:18102.6)，序列10质谱表征结果如图3所示，MS：Calculated:12670.2(Found:12667.6)。
表1氯法拉滨和/或吉西他滨修饰的寡聚核苷酸序列
实施例4
将实施例3制备获得的吉西他滨和氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸(SEQ ID NO.5-SEQID NO.9)用于癌细胞抑制实验，将吉西他滨和氯法拉滨作为对比例。将人结肠癌细胞HCT-116细胞按照5万/mL细胞密度分散在RPMI-1640培养基中，配制不同浓度药物的培养基溶液，将药物溶液与细胞溶液1:1混合，加入96孔板中，每个孔加入100μL，放置在恒温培养箱中培养。72h后去除培养基，加入100μL溶有CCK-8的新鲜培养基溶液，振荡混匀后37℃孵育1h，使用Synergy-2多功能酶标仪测定450nm处的吸收，实验结果如4图所示。由图4可知，吉西他滨和氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸对癌细胞具有较高的抑制活性，IC50值约为12.82nM-139.0nM，依然基本上保持了两种药物原有的药物活性。
实施例5
将实施例3中制备获得的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸(SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.4)用于癌细胞的特异性识别，实现氯法拉滨的靶向递送，以空白细胞作为对比例。以人急性淋巴细胞白血病细胞CCRF-CEM细胞进行流式细胞实验为例，首先按照每个样品15万个细胞的量取适量体积的CCRF-CEM细胞悬浮液，800r/min的转速离心3min，去掉上清，每个样品中加入200μL的结合缓冲液，加入一定体积的核酸适体母液混合至最终浓度200nM，4℃避光放置1h。800r/min离心3min，去掉上清，加入清洗缓冲液混匀，离心，洗涤三次。加入400μL清洗缓冲液使用流式细胞仪进行实验，实验结果图5所示。由图5可知，氯法拉滨修饰寡聚核苷酸对癌细胞仍能够特异性结合，实现了氯法拉滨药物的靶向递送。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 湖南大学
<120> 一种氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atctmactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag a 41
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atctamctgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag a 41
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atctaactgc tgcgccgccg ggmaaatact gtacggttag a 41
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atctaactgc tgcgccgccg ggamaatact gtacggttag a 41
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
kmmactcata gggttagggg ctgctggcca gatactcaga tggtagggtt actatgagc 59
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
kkkmactcat agggttaggg gctgctggcc agatactcag atggtagggt tactatgagc 60
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
kkmactcata gggttagggg ctgctggcca gatactcaga tggtagggtt actatgagc 59
<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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kmactcatag ggttaggggc tgctggccag atactcagat ggtagggtta ctatgagc 58
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
kmmmactcat agggttaggg gctgctggcc agatactcag atggtagggt tactatgagc 60
<210> 10
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<212> DNA
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mactcatagg gttaggggct gctggccaga tactcagatg gtagggttac tatgagc 57
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atctaactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag a 41
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<212> DNA
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atctaactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag a 41
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<212> DNA
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atctaactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag a 41
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atctaactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag a 41
<210> 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actcataggg ttaggggctg ctggccagat actcagatgg tagggttact atgagc 56
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actcataggg ttaggggctg ctggccagat actcagatgg tagggttact atgagc 56
<210> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actcataggg ttaggggctg ctggccagat actcagatgg tagggttact atgagc 56
<210> 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actcataggg ttaggggctg ctggccagat actcagatgg tagggttact atgagc 56

Claims (3)

1.一种氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸，包括核酸适配体片段，所述核酸适配体片段修饰有氯法拉滨亚磷酰胺单体基团；
所述核酸适配体片段修饰有一个或多个氯法拉滨亚磷酰胺单体基团，所述氯法拉滨亚磷酰胺单体基团修饰于核酸适配体片段的5’端和/或修饰于核酸适配体片段的3’端和/或添加于核酸适配体片段的中间；
所述氯法拉滨亚磷酰胺单体基团与核酸适配体片段之间通过磷酸二脂键连接；
和/或，修饰于核酸适配体片段的5’端的氯法拉滨亚磷酰胺单体基团的化学结构式如下所示：
添加于核酸适配体片段的中间的氯法拉滨亚磷酰胺单体基团的化学结构式如下所示：
修饰于核酸适配体片段的3’端的氯法拉滨亚磷酰胺单体基团的化学结构式如下所示：
所述核酸适配体片段还修饰有吉西他滨亚磷酰胺单体基团；
所述核酸适配体片段修饰有一个或多个吉西他滨亚磷酰胺单体基团，所述吉西他滨亚磷酰胺单体基团修饰于核酸适配体片段的5’端和/或修饰于核酸适配体片段的3’端和/或添加于核酸适配体片段的中间；
所述吉西他滨亚磷酰胺单体基团与核酸适配体片段之间通过磷酸二脂键连接；
和/或，修饰于核酸适配体片段的5’端的吉西他滨亚磷酰胺单体基团的化学结构式如下所示：
添加于核酸适配体片段的中间的吉西他滨亚磷酰胺单体基团的化学结构式如下所示：
修饰于核酸适配体片段的3’端的吉西他滨亚磷酰胺单体基团的化学结构式如下所示：
所述氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸的多核苷酸序列如SEQ ID NO.5～9其中之一所示，所述SEQ ID NO.5～9中M为氯法拉滨，K为吉西他滨。
2.如权利要求1所述的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸的制备方法，包括：
将氯法拉滨亚磷酰胺单体和/或吉西他滨亚磷酰胺单体通过固相合成法与核酸适配体片段连接，所述固相合成法的反应温度为15～35℃，反应时间为1～20分钟，空气湿度为30％～70％；
和/或，所述氯法拉滨亚磷酰胺单体的化学结构式如下所示：
和/或，所述吉西他滨亚磷酰胺单体的化学结构式如下所示：
3.如权利要求1所述的氯法拉滨修饰的寡聚核苷酸在制备治疗人结肠癌疾病药物中的用途。
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