CN114478770A - 抗体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抗体及其制备方法，抗体诸如人源化抗人CD47单克隆抗体或其片段和靶向PD‑L1和CD47的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中，双特异性抗体包括两条重链和两条轻链，其中所述两条重链的可变区是异源的，所述两条轻链可变区序列相似。本公开提供的双特异性抗体，具有相似序列的轻链，因而克服了双特异性抗体装配过程中轻重链错配的技术问题。

Description

抗体及其制备方法
优先权信息
本申请请求2020年11月12日向中国国家知识产权局提交的、专利申请号为202011260418.8的专利申请的优先权和权益，以及2020年11月13日向中国国家知识产权局提交的、专利申请号为202011269292.0的专利申请的优先权和权益，并且通过参照将其全文并入此处。
技术领域
本发明属于抗体工程领域，具体涉及抗体及其制备方法，更具体地，涉及人源化抗人CD47单克隆抗体或其片段、多特异性抗体、靶向PD-L1和CD47的双特异性抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞、制备抗体或其抗原结合片段的方法和组合物及其相关应用。
背景技术
CD47在大部分肿瘤细胞中高表达，并且它可以作为肿瘤诊断及判断预后的一个标准。如在急慢性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤以及膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、直肠癌、***癌、肾癌、多发性骨髓瘤等多种实体肿瘤细胞或肿瘤干细胞(如白血病干细胞leukemia stem cells，LSC)存在过表达，并且其高表达与临床预后差相关。研究表明，肿瘤细胞表面的CD47通过与巨噬细胞、DC细胞等免疫细胞表面的SIRPα结合，激活SHP-1的负向调节效应，抑制巨噬细胞的迁移及吞噬作用。该作用是高表达CD47的肿瘤细胞发生免疫逃逸的主要原因之一。通过抗体或其他阻断剂阻断肿瘤细胞表面的CD47与巨噬细胞表面的SIRP的相互作用，可以促进巨噬细胞、DC细胞对肿瘤细胞的吞噬，并进一步增加肿瘤抗原的提呈，激活适应性免疫，为肿瘤的治疗提供了新的思路。目前有多个靶向CD47的治疗性抗体处于临床实验阶段。其中具有代表性的是Hu5F9。靶向CD47的治疗性抗体在血液肿瘤上虽然表现出良好的治疗效果，但是在实体瘤上进展并不顺利。此外，由于CD47广泛表达于红细胞和血小板表面，因此具有较强的红细胞和血小板毒性，并且抗原沉降导致半衰期短，用药量大。
PD-L1全称是程序性死亡配体-1，可以结合T细胞表面的受体PD-1，发挥免疫抑制作用。PD-L1属于抑制型免疫检查点分子，表达于黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、头颈部鳞癌等多种恶性肿瘤细胞表面。PD-L1与T细胞表面的免疫抑制性受体PD-1结合后，可诱导T细胞凋亡、失能、耗竭，进而抑制肿瘤抗原特异性T细胞的激活、增殖和抗肿瘤功能，实现肿瘤免疫逃逸。PD-1/PD-L1阻断型抗体可以解除PD-L1的免疫抑制作用，增强体内免疫细胞T细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤，从而达到杀灭肿瘤的作用。目前，全球范围内已上市多个靶向PD-1/PD-L1的抗体类药物，在临床上对黑色素瘤、肺癌、肾癌、霍奇金淋巴瘤、头颈鳞癌和尿路上皮癌等多种肿瘤显示出不错的治疗效果。目前PD-1/PD-L1治疗性抗体虽然取得了一定的临床效果，但临床上使用有效率偏低，对于绝大多数癌种来说，如果不加选择地单独使用，有效率平均只有10％-20％。因此需要开发更加有效的抗体类药物分子以满足临床需求。
在肿瘤微环境中，癌细胞会通过将PD-L1表达水平上调，躲避人体免疫***的识别和攻击。CD47蛋白是癌细胞上过度表达的免疫调节分子，主要通过与抑制性受体信号调节蛋白α(SIRPα)作用而抑制巨噬细胞的吞噬作用，并介导多种恶性肿瘤的免疫逃逸。靶向PD-L1/CD47的双特异抗体，可以同时阻断CD47和PD-L1两个通路，有望获得更强的抗肿瘤活性，从而解决临床上PD-L1抗体单独使用有效率偏低的问题。目前临床上尝试将抗PD-L1抗体和抗CD47抗体联用，期望将二者的免疫调节作用叠加，获得更好的治疗效果。而更多的研究者尝试通过构建靶向PD-L1/CD47的双特异抗体，同时阻断CD47和PD-L1两个通路，以期获得更强的抗肿瘤活性，从而解决临床上PD-L1抗体单独使用有效率偏低的问题。
尽管目前PD-L1/CD47双特异性抗体在肿瘤治疗上取得了一定的进展，一定程度上克服了单独使用抗PD-L1和抗CD47的缺陷，但仍存在以下缺陷：1.抗CD47一侧的分子选择上，主要选择SIRPα蛋白作为结合相，而非抗体分子。这种类抗体重组蛋白在稳定性、质量、以及PK/PD特点上都与单抗有较大差距。2.抗体结构上A、B两条链序列结构上的差异给表达、纯化工艺以及质量控制带来较大的难度，轻重链错配率高，正确装配的双特异性抗体分子纯化困难、回收率低。3.PD-L1/CD47双特异性抗体仍存在结合红细胞产生溶血、凝集的可能，需进一步降低对红细胞的结合能力。
由此，抗CD47人源化抗体和PD-L1/CD47双特异性抗体有待进一步研究。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种抗CD47人源化抗体和PD-L1/CD47双特异性抗体，其中，抗CD47人源化抗体能结合人CD47，阻断CD47与SIRPα的结合，并且，该抗体为抗CD47的中低亲和力抗体，同时，该抗体仅特异性结合肿瘤细胞表面CD47，而与人红细胞表面CD47不结合，从而解决了抗体结合红细胞产生的溶血和凝集等问题；其中，该双特异性抗体包括两条重链和两条轻链，其中所述两条重链的可变区是异源的，所述两条轻链的可变区序列相同，具体地，针对CD47和PD-L1的双特异性抗体，其中的两条重链的可变区分别衍生自抗CD47单克隆抗体的重链可变区和抗PD-L1单克隆抗体的重链可变区，两条序列相同的轻链是基于抗CD47单克隆抗体轻链和抗PD-L1单克隆抗体轻链序列相似性优化设计产生的。本公开提供的双特异性抗体，具有序列相同的轻链因而能在一定程度上有效解决了双特异性抗体装配过程中轻重链错配的技术问题。
抗CD47抗体
本发明实施例制备了特异性结合人CD47鼠源抗体，在鼠源抗体序列分析的基础上，选择近似的人抗体种系模板制备了人源化抗人CD47单抗或其片段。提供一种具有阻断SIRPα与细胞表面CD47结合的活性以及肿瘤抑制活性的人源化抗人CD47单抗或其片段。进而，在人源化抗人CD47单抗的基础上通过对CDRs区和FR区序列的点突变改造，调整对人CD47的亲和力，并进一步通过轻链突变差异化抗体与肿瘤细胞表面CD47和人红细胞表面CD47的结合活性，获得一系列不具有红细胞结合活性的抗CD47抗体。进一步，选择使人源化抗人CD47单抗在保持CD47特异性结合能力的情况下，容忍轻链CDRs的多个氨基酸位点突变，从而为共轻链双特异性抗体的研发提供新的平台。具体而言：
根据本发明的一个方面，本发明提供一种人源化抗人CD47单抗或其片段。根据本发明的实施例，人源化抗人CD47单克隆抗体或其片段，其特征在于，该人源化抗人CD47单抗或其片段包括：重链CDR1，包括X1YX2MX3，其中X1选自N、S，X2选自V、A，X3选自H、S；重链CDR2，包括YINPX4NX5X6IKYNEKFX7G，其中X4选自Y、G，X5选自D、E，X6选自G、A，X7选自T、Q；重链CDR3，包括EGDFYANYGRLGFX8Y，其中X8选自A、D；并且，轻链CDR1，包括RASQDIX9NYLN，其中X9选自S、T；轻链CDR2，包括YTSRLX10S，其中X10选自H、Q、S；轻链CDR3，包括QQGX11X12X13PX14T，其中X11选自D、A，X12选自T、G，X13选自F、R、Y、K、S、E、N，X14选自Y、R。
根据本发明的实施例，其种系模板选择IGKV1-33*01|IGKJ4*02和IGHV1-3*01|IGHJ1*01。
根据本发明的实施例，该人源化抗人CD47单抗或其片段的CDRs和/或FR区包括点突变，所述点突变有助于减少或消除对红细胞的结合活性，并至少部分地保留人源化抗人CD47单抗或其片段对肿瘤细胞的结合能力。
根据本发明的实施例，所述重链CDR1具有SEQ ID NO:76、77、78或87所示的序列；所述重链CDR2具有SEQ ID NO:79、80、81、82、83或84所示的序列；所述重链CDR3具有SEQ IDNO:85或86所示的序列。
根据本发明的实施例，所述轻链CDR1具有SEQ ID NO:46或47所示的序列；所述轻链CDR2具有SEQ ID NO:50、51或52所示的序列；所述轻链CDR3具有SEQ ID NO:56、57、58、59、60、61、62、63、64、65或68所示的序列。
根据本发明的实施例，人源化抗人CD47单抗或其片段所述的人源化抗人CD47单抗或其片段具有SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23所示重链可变区，SEQ区ID NO:5所示轻链可变区。
根据本发明的实施例，该人源化抗人CD47单抗或其片段所述单克隆抗体为衍生化抗体，所述衍生化抗体包括在初始单克隆抗体的基础上进行CDRs移植、亲和力成熟、点突变改造和化学修饰获得的抗体，其中，所述化学修饰包括糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、蛋白酶切割、与细胞配体或效应分子连接、活性反应基团保护和/或封闭。
进一步，本发明任一所述人源化抗人CD47单抗或其片段，其特征在于：所述人源化抗人CD47单抗或其片段部分包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv或dAb。
进一步地，根据本发明另一方面，本发明提供一种人源化抗人CD47单抗或其片段，其是在鼠源抗人CD47单抗的基础上，选择IGKV1-33*01|IGKJ4*02和IGHV1-3*01|IGHJ1*01为种系模板进行人源化得到的。
根据本发明的实施例，该人源化抗人CD47单抗或其片段的重链可变区具有SEQ IDNO:8所示的序列，所述重链可变区具有CDRs序列(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，轻链可变区具有SEQ ID NO:5所示的序列，所述轻链可变区具有CDRs序列(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。
根据本发明的实施例，该人源化抗人CD47单抗或其片段的重链可变区如SEQ IDNO:8所示，轻链可变区如SEQ ID NO:5所示。
进一步地，根据本发明的实施例，该人源化抗人CD47单抗或其片段具有：
重链CDR1，包括X1YX2MX3，其中X1选自N、S，X2选自V、A，X3选自H、S；
重链CDR2，包括YINPX4NX5X6IKYNEKFX7G，其中X4选自Y、G，X5选自D、E，X6选自G、A，X7选自T、Q；
重链CDR3，包括EGDFYANYGRLGFX8Y，其中X8选自A、D；
进一步，根据本发明的实施例，该人源化抗人CD47单抗或其片段具有：
轻链CDR1，包括RASQDIX9NYLN，其中X9选自S、T；
轻链CDR2，包括YTSRLX10S，其中X10选自H、Q、S；
轻链CDR3，包括QQGX11X12X13PX14T，其中X11选自D、A，X12选自T、G，X13选自F、R、Y、K、S、E、N，X14选自Y、R。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种多特异性抗体。根据本发明的实施例，所述多特异性抗体至少包括一个针对人CD47的特异性的结合位点，所述针对人CD47的特异性结合位点是由前述人源化抗人CD47单抗或其片段提供的。
根据本发明的实施例，所述多特异性抗体包括针对人CD47不同表位的多个特异性结合位点。
根据本发明的实施例，所述多特异性抗体还包括针对非人CD47靶向的特异性结合位点。
根据本发明的实施例，所述多特异性抗体为双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体。
本发明实施例的人源化抗人CD47单抗或其片段至少具有以下有益的技术效果之一：
(1)本发明实施例的人源化抗人CD47单抗或其片段能特异与细胞表面CD47结合，亲和力高，有效阻断癌细胞表面的CD47与SIRPa的相互作用，具有良好的抑瘤效果；
(2)在人源化抗人CD47单抗的基础上通过对CDRs区和FR区序列的点突变改造，调整抗体对人CD47的亲和力，并进一步通过轻链突变差异化抗体与肿瘤细胞表面CD47和人红细胞表面CD47的结合活性，获得一系列对与肿瘤细胞表面CD47结合活性高而对红细胞结合活性低的抗CD47抗体，有效解决了抗CD47抗体在临床上由于红细胞及血小板等结合所带来的抗体浓度低，从而导致临床用药剂量较高的问题，并且，显著降低了抗人CD47抗体的毒副作用，同时，为改善由抗原沉降所导致的体内血药浓度较低的问题提供了新的分子选择。
(3)本发明的人源化抗人CD47单抗能够在保持CD47特异性结合能力的情况下，容忍轻链可变区多个氨基酸位点突变，从而为共轻链双特异性抗体的研发提供新的平台。
靶向PD-L1和CD47的双特异性抗体或其抗原结合片段
根据本发明的一方面，本发明提供了一种制备双特异性抗体的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
(1)选择轻链种系相同、序列相似的两株单克隆抗体，
(2)构建共表达杂合抗体，检测对第一抗原的结合能力。该杂合抗体的重链和轻链分别包括第一抗体的重链可变区和第二抗体的轻链可变区。
(3)可选的，对所述杂合抗体进行位点突变，构建抗体杂合体群，检测其中每一个抗体对第一抗原的结合能力，从中选定第一重链，该第一重链与第二抗体的轻链形成的杂合抗体对第一抗原的亲和力高，特异性好。
(4)对第二抗体的轻链可变区进行突变构建第二抗体轻链突变体群，，通过与步骤(3)中选定的第一重链共表达制备第一重链/第二抗体突变体杂合抗体，检测对第一抗原的结合能力，选定共同轻链；
(5)根据第二抗体的重链可变区选定第二重链可变区；
(6)将含有步骤(3)选定的第一重链可变区、步骤(4)选定的共同轻链可变区、步骤(5)选定的第二重链可变区的抗体重链和轻链共表达制备双特异性抗体。
根据本发明的实施例，所述步骤(4)中第二抗体轻链突变体可变区的每个氨基酸残基位点至少与第一抗体分子轻链可变区相应位点的氨基酸残基、和/或第二抗体分子轻链可变区相应位点的氨基酸残基相同。
根据本发明的实施例，可选的还包括：(7)检测双特异性抗体对第一抗原和第二抗原的特异性结合能力。
根据本发明的实施例，如果步骤(4)中选定的共同轻链可变区与第二抗体的轻链可变区存在差异，步骤(5)中根据第二抗体的重链可变区选定第二重链可变区包括：构建第二抗体重链可变区突变体群，将其与共同轻链可变区共表达制备第二抗体重链可变区突变体/共同轻链可变区杂合抗体，检测其对第二抗体的结合能力，选定第二重链；
如果步骤(4)中选定的共同轻链与第二抗体的轻链相同，步骤(5)中根据第二抗体的重链可变区选定第二重链可变区即为将第二抗体的重链作为第二重链。
根据本发明的另一方面，本发明提供一种双特异性抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施例，该双特异性抗体或其抗原结合片段包括两条重链和两条轻链，其中，第一重链可变区源自抗CD47单克隆抗体的重链可变区、其能够与轻链可变区形成CD47结合位点，第二重链可变区源自抗PD-L1单克隆抗体的重链可变区、其能够与轻链可变区形成PD-L1结合位点；其中，所述两条轻链的轻链可变区的序列相同，并且，选自抗CD47单克隆抗体的轻链、抗PD-L1单克隆抗体的轻链、序列结构上介于抗CD47单克隆抗体轻链、抗PD-L1单克隆抗体轻链之间的共同轻链，其中，所述抗CD47单克隆抗体为权利要求1-6任一所述的人源化抗人CD47单抗或其片段。
根据本发明的实施例，所述第一抗体分子的轻链可变区与第二抗体分子的轻链可变区属于相同的抗体轻链种系，具有相同或高度相似的框架区(FR)。
根据本发明的实施例，所述共同轻链可变区具有第一抗体分子轻链可变区和第二抗体分子轻链可变区之间共同的氨基酸残基，并且在第一抗体分子轻链可变区和第二抗体分子轻链可变区之间存在差异的氨基酸位点，所述共同轻链与第一抗体分子轻链相同或与第二抗体分子轻链相同。
根据本发明的实施例，所述双特异性抗体或其抗原结合片段中的第一重链可变区是在第一抗体分子的重链可变区基础上进行点突变获得的，所述第一重链可变区至少部分的保留了第一抗体分子重链可变区与轻链可变区形成第一抗原结合位点的能力。
根据本发明的另一方面，本发明还提供一种靶向PD-L1和CD47的双特异性抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施例，该双特异性抗体或其抗原结合片段包括两条重链和两条轻链，其中，第一重链可变区源自抗CD47单克隆抗体的重链可变区、其能够与轻链可变区形成CD47结合位点，第二重链可变区源自抗PD-L1单克隆抗体的重链可变区、其能够与轻链可变区形成PD-L1结合位点；其中，所述两条轻链的轻链可变区的序列相同，并且，所述轻链可变区是基于抗CD47单克隆抗体的轻链和抗PD-L1单克隆抗体的轻链得到的，且所述轻链可变区与所述第一重链可变区形成的第一可变区结合位点与CD47特意性结合，且所述轻链可变区与所述第二重链可变区相匹配形成的第二可变区结合位点与PD-L1特意性结合，
根据本发明的实施例，第一可变区结合位点并与CD47特意性结合，其亲和力与原始的CD47单抗的可变区与CD47的亲和力相近，并且，第一可变区结合位点并与PD-L1特意性结合，其亲和力与原始的PD-L1单抗的可变区与与PD-L1的亲和力相近。
根据本发明的实施例，所述抗PD-L1单克隆抗体包括SEQ ID NO:3所示重链可变区和SEQ ID NO:1所示轻链可变区。
根据本发明的实施例，第一重链包括选自SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23的重链可变区。
根据本发明的实施例，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:1、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34所示的序列。
根据本发明的实施例，所述抗体或其抗原结合片段包括但不限于完全抗体、F(ab')2。
根据本发明的实施例，所述完全抗体为IgG1或IgG4型。
根据本发明的实施例，所述两条重链的Fc段包含“knobs-into-holes”突变；
根据本发明的实施例，所述第一重链的Fc段包含H315R突变、另一条所述第二重链的Fc段包括K319E突变，所述Fc段氨基酸突变位点使用Kabat的Eu编号***。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种多核苷酸。根据本发明的实施例，该多核苷酸编码前述的人源化抗人CD47单抗或其片段，或前述的多特异性抗体，或前述的靶向PD-L1和CD47的双特异性抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种载体。根据本发明的实施例，该载体包括前述的多核苷酸。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种宿主细胞。根据本发明的实施例，该宿主细胞包括前述的多核苷酸或前述的载体。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种制备抗体或其抗原结合片段的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：(1)在适合表达双特异性抗体或其抗原结合片段的条件下培养权利要求21所述宿主细胞；(2)从细胞培养物中分离纯化双特异性抗体或其片段。
与现有技术相比，本发明实施例的靶向PD-L1和CD47的双特异性抗体或其抗原结合片段的技术方案至少具有以下优点之一：
第一，本发明实施例制备的双特异性抗体，具有天然抗体的双结合臂，每个结合臂均具有完整的Fab结构，避免了在抗体分子中引入受体链(例如CD47受体SIRPα)等非抗体组件而产生的结构不稳定、功能相互干扰等缺点。进而，通过本发明实施例在共同轻链可变区、重链可变区进行突变改造的基础上，实现了对两条结合臂结合能力的调控，例如制备出对第一抗原/抗原表位具有高度结合能力、并且对第二抗原/抗原表位具有适度结合能力的双特异性抗体。
第二，根据现有技术中抗原结合位点中6个CDRs对抗原结合活性影响程度的差异，即重链三个CDRs的作用大于轻链三个CDRs、CDR3的作用大于CDR2和CDR1。结合抗PD-L1单克隆抗体hz182和抗CD47单克隆抗体hz140轻链序列结构的相似性，发明人设计了具有相同轻链的抗人PD-L1/CD47双特异性抗体。共同轻链的设计不仅简化了重组表达方法，而且彻底消除了双特异性抗体重组表达过程中轻重链错配的难题，显著简化了生产工艺、提高了产品合格率和均一性。此外，还可在Fc段引入“knobs-into-holes”突变，增强双特异性抗体重链Fc段配对的准确性，避免同源重链二聚化。
第三，在双特异性抗体的设计制备过程中，通过对抗CD47抗体的重链进行有限的氨基酸突变，使得重组抗体中抗CD47的结合臂中重链可变区和轻链可变区均与抗CD47初始单克隆抗体存在结构上微小的差异。通过在上述抗CD47的抗原结合位点上引入序列结构的微小差异使所述双特异性抗体具有适度的抗CD47活性，既保持了双特异性抗体对肿瘤细胞表面CD47的结合活性、增强了抗PD-L1活性的肿瘤抑制作用；又显著降低了对红细胞表面CD47的结合，不仅减少或消除了溶血、红细胞凝集等不期望的后果，而且还能减少全身给药的用量。
抗体的应用和用途
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种组合物。根据本发明的实施例，该组合物包含前述的人源化抗人CD47单抗或其片段、前述的多特异性抗体、前述的靶向PD-L1和CD47的双特异性抗体或其抗原结合片段、前述多核苷酸、前述载体和前述宿主细胞中的至少一种。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了前述的人源化抗人CD47单抗或其片段、前述的多特异性抗体、前述的靶向PD-L1和CD47的双特异性抗体或其抗原结合片段、前述多核苷酸、和前述组合物在制备***和/或提高机体免疫应答药物中的用途。
根据本发明的实施例，所述肿瘤包括黑色素瘤、肺癌、肾癌、霍奇金淋巴瘤、头颈鳞癌、尿路上皮癌、急慢性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、直肠癌、***癌、肾癌和多发性骨髓瘤。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了治疗患有肿瘤的对象的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的组合物，所述组合物为前述的组合物。
为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
术语“PD-L1”，即PD-L1(programmed death ligand 1)全称程序性死亡受体配体1，也称为表面抗原分化簇274(cluster of differentiation 274，CD274)或B7同源体(B7homolog 1，B7-H1)，由CD274基因编码，是PD-1(programmed cell death 1,程序性死亡受体1)的配体。PD-L1是大小为40kDa的第一型跨膜蛋白，表达在T细胞、B细胞等免疫细胞以及肿瘤细胞上，正常情形下免疫***会对聚集在***或脾脏的外来抗原产生反应，促发具抗原特异性的细胞毒杀性T细胞(CD8+Tcell增生)。当肿瘤细胞膜上的PD-L1与T细胞等免疫细胞上的PD-1结合后，肿瘤细胞发出抑制性信号，减低***CD8+T细胞的增殖，进而导致T细胞不能识别肿瘤细胞和对肿瘤细胞产生杀伤作用，机体的免疫功能受到抑制。
术语“CD47”，又称整合素相关蛋白，分子量约50kDa，在正常细胞和肿瘤细胞中均表达。CD47可与巨噬细胞上蛋白SIRPα结合，提供一种“别吃我”信号，从而抑制巨噬细胞吞噬功能，导致肿瘤的免疫逃逸。在肿瘤细胞、衰老的红细胞和血小板，阻断CD47-SIRPα的相互作用会引发吞噬作用。一方面，根据该作用机制，近些年来CD47在肿瘤免疫治疗中逐渐升温，是肿瘤免疫治疗的一个潜在有效和广泛应用的靶点，许多抑制剂已经被开发出来，可以特异性地阻断CD47-SIRPα信号通路，以增强对肿瘤的免疫应答。然而另一方面，阻断CD47-SIRPα相互作用的机制导致红细胞减少和血小板减少是成药性的最大挑战。
术语“特异性”是指在蛋白和/或其他生物异质群体中确定是否存在所述蛋白，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著的量与样本中存在的其它蛋白结合。
本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫***细胞(例如，效应细胞)和传统补体***的第一组分(C1q)。
术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。
本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段；(v)由VH构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv)；参见例如Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。
本发明的抗原结合片段包括能够特异性结合抗原分子的那些。抗体结合片段的实例包括例如但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、单链Fv(scFv)片段和单结构域片段。
Fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端处的少数残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。通过切割在F(ab')2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键产生Fab'片段。抗体片段的另外化学偶联是本领域普通技术人员已知的。Fab和F(ab')2片段缺乏完整抗体的片段可结晶(Fc)区，从动物的循环中更快速地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(参见例如，Wahl等人，1983，J.Nucl.Med.24:316)。
如本领域通常理解的，“Fc”区是不包含抗原特异性结合区的抗体的片段可结晶恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由两个相同的蛋白质片段组成，衍生自抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域(分别为CH2和CH3结构域)。IgM和IgE Fc区在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域(CH2、CH3和CH4结构域)。
“人源抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或动物中分离的抗体，所述动物对于一种或多种人免疫球蛋白是转基因的，并且不表达内源免疫球蛋白。人抗体可以通过本领域已知的各种方法制备，所述方法包括使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及PCT公开WO 98/46645；WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO96/33735；和WO 91/10741。还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。参见例如，PCT公开WO 98/24893；WO92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598。另外，使用与上述类似的技术，公司例如LakePharma，Inc.(Belmont，CA)或Creative BioLabs(Shirley，NY)可以从事于提供针对所选抗原的人抗体。可以使用被称为“引导选择”的技术生成识别所选表位的全人抗体。在该方法中，选择的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，用于引导识别相同表位的完全人抗体的选择(参见，Jespers等人，1988，Biotechnology12:899-903)。
术语“重链”，重链(heavy chain，H链)大小约为轻链的2倍，含450～550个氨基酸残基，分子量约为55或75kD。每条H链含有4～5个链内二硫键所组成的环肽。不同的H链由于氨基酸组成的排列顺序、二硫键的数目和位置、含的种类和数量不同，其抗原性也不相同，根据H链抗原性的差异可将其分为5类：μ链、γ链、α链、δ链和ε链，不同H链与L链(κ或λ链)组成完整免疫球蛋白的分子分别称之为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。γ、α和δ链上含有4个肽，μ和ε链含有5个环肽。
术语“轻链”，轻链(light chain，L)指在免疫球蛋白单体分子中相对于重链而论，在分子量上较小的多肽链。每条轻链近氨基末端(N端)1/2区域内的氨基酸组成序列多变处为轻链可变区(VL)，是Ig分子与抗原结合部位的一个组成部分。其余1/2区域内的氨基酸组成及排列顺序相对稳定处为轻链恒定区(CL)。由于轻链恒定区内氨基酸序列存在某些差异，故轻链有k和λ两型。
术语“种系”，又称胚系(germline)，抗体形成细胞具有编码Ig分子的全部基因(即有限数量的C基因和未知数量的V基因，它是通过长期进化形成并通过生殖细胞从亲代传给子代，人免疫球蛋白的重链基因由V-D-J-C基因片段编码而成；轻链基因由V-J-C基因片段编码而成，基因片段的个数不等。人重链基因定位于第14号染色体长臂，跨度约1,100kb，由V、D、J和C四种基因片段组成，包含约95个Va基因片段(分VHl～VH7七个家族，其中功能性基因片段65个、27个D基因片段、6个JH基因片段和9个CH基因片段。Va基因片段位于上游，D基因片段位于VH和JH基因簇之间，JH基因位于DH下游，与下游C基因区相隔7Kb左右，CH基因成簇(cluster)排列，跨度约200kb，P和S基因紧位于JH基因片段下游，C8下游依次是Cγ、Cα和Cε。人轻链基因分为λ和x基因，分别定位于第22号染色体长臂和第2号染色体短臂。功能性VK基因片段约40个，Vc基因片段后是5个功能性J和1个Cκ；Vλ基因片段约30个，4个Jλ基因片段和4个Cλ基因片段。
术语“EC50”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。
术语“双特异性抗体”(bispecific antibodies)，一种可与相同或不同抗原上的不同表位结合的抗体结构。因此，双特异性抗体能够桥连两种不同的分子，起到将效应分子、效应细胞、病毒和药物载体***招募至靶标结构的作用。双特异性抗体这种可同时识别两种不同分子(受体和/或配体)的特点，提高了抗体的选择性和功能性亲和力。
术语“错配”(mispair)，类IgG结构的双特异性抗体通常采用单细胞进行表达，但抗体由2条轻链(L)和2条重链(H)构成，用单细胞系共表达的体系中理论上存在轻重链随机错配的问题，可能出现10种HHLL的组合，而实际上具有应用意义的目标异源抗体组合仅占12.5％。从含近10种混合物的复杂体系中纯化出足量的目标抗体极富挑战性，因此带来的问题是产品的均一性和产率较低、后续纯化工艺复杂。上市产品Catumaxomab(抗体类型为Triomab)的生产策略在此基础上进行了改进，Triomab采用大鼠杂交瘤和小鼠杂交瘤进行体细胞融合(somatic fusion)，其种属限制性H-L链配对(Species restricted H-Lchainpairing)的策略可减少随机轻重链错配的比例(＜10％)。根据不同种属和不同亚类(subclass)的抗体Fc段对蛋白A介质的结合能力不同，通过一步蛋白A亲和层析纯化即可分离出同时具有大鼠Fc段和小鼠Fc段的目标抗体，因此简化了纯化步骤。但是，基于Triomab技术构建的双特异性抗体为鼠源抗体，具有很强的免疫原性，因此其临床应用范围受到限制。
需要说明的是，根据本发明实施例的确定DNA样品的序列信息的方法是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才完成的。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1：Fortebio测定Hz140与CD47-his的亲和力结果示意图；
图2：FACS分析hz140与肿瘤细胞U937的结合活性结果示意图；
图3：FACS分析hz140与肿瘤细胞CCRF的结合活性结果示意图；
图4：FACS分析hz140与红细胞的结合活性结果示意图；
图5：FACS分析hz140对SIRPa与CCRF细胞表面CD47阻断活性结果示意图；
图6：FACS分析hz140对SIRPa与U937细胞表面CD47阻断活性结果示意图；
图7：hz140对CCRF-SB白血病模型小鼠生存期观测结果结果示意图；
图8：抗CD47抗体对人源异种移植淋巴瘤Raji模型的体内药效观察结果示意图；
图9：2MW1531对免疫缺陷小鼠尾静脉异种移植Raji血液肿瘤模型抗肿瘤药效检测信号强度定量结果示意图；
图10：hz140轻链和hz182轻链氨基酸序列比对结果示意图；
图11：2MW1531与MC38-hPD-L1/hCD47细胞结合活性分析结果示意图；
图12：2MW1531与A431细胞结合活性分析结果示意图；
图13：2MW1531与人红细胞结合活性分析结果示意图；
图14：抗人CD47/PD-L1双特异抗体体外红细胞凝集试验结果示意图；
图15：2MW1531对hPD-L1/hCD47/hSIRPα转基因小鼠皮下同种移植MC38-hPDL1鼠结肠癌肿瘤模型的抗肿瘤药效实验结果示意图(肿瘤体积)；
图16：2MW1531对免疫缺陷小鼠尾静脉异种移植Raji血液肿瘤模型抗肿瘤药效检测活体成像图。
发明详细描述
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。
实施例1：抗CD47高亲和力抗体140及对照抗体的制备
CD47-mFc免疫Balb/c小鼠进行杂交瘤制备。并分别于初次免疫后34天或57天进行血清抗体滴度检测。挑选血清滴度达到融合实验要求的小鼠(血清抗体效价：1:102400)脾细胞与骨髓瘤细胞FO以适当的比例(5:1)，在融合剂的作用下进行融合，制备杂交瘤单克隆细胞。利用选择性培养基R1640-HAT对杂交瘤细胞进行培养，于第10-14天采用ELISA的方法对651个杂交瘤上清样品进行检测，包括细胞结合活性(FACS)、
Figure BDA0003351828190000121
阻断、以及与重组cyno-CD47-mFc的交叉反应情况，筛选出克隆140。调取上述克隆轻重链可变区基因，并将其轻重链可变区基因克隆入含有人Cκ和IgG4基因阅读框的重组表达载体，在HEK293细胞上进行瞬时表达，纯化后获得蛋白纯品进行分析，克隆140鼠源抗体轻、重链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44。
SEQ ID NO.43:鼠源140轻链可变区氨基酸序列
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDITNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTITNLEQEDIATYFCQQGDTFPRTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO.44:鼠源140重链可变区氨基酸序列
EVQLQQSGPELIKPGPSVKMSCKASGYKFTNYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGIKYNEKFTGKATLTSDKSSNTAYMELISLTSEDSAVYYCAREGDFYANYGRLGFAYWGQGTLVTVSA
制备如下抗体作为参照抗体，均采用IgG4的形式。对照抗体的重组表达策略采用常规分子生物学方法实现，利用HEK293瞬时表达完成表达和纯化。Forty Seven公司临床在研抗体hu5F9(US2015/0183874A1，hu5F9V2,轻重链可变区序列：SEQ ID NO.35和SEQ IDNO.36)，I-Mab公司的抗CD47抗体1F8(CN 110582515 A，轻重链可变区SEQ ID NO.37和SEQID NO.38)。
SEQ ID NO.35:hu5F9轻链可变区氨基酸序列
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVYSNGNTYLGWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO.36:hu5F9重链可变区氨基酸序列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.37:1F8轻链可变区氨基酸序列
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNRNYLAWYQQKPGQPPKLLINQASTRASGVPDRFSGSGSGTEFTLIISSLHAEDVAIYYCQQYYTPPLAFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO.38:1F8重链可变区氨基酸序列
KVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMNWVRQAPGKGLEWVGRIKRKTDGETTDYAAPVKGRFSISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCAGSNRAFDIWGQGTMVTVSA
实施例2：抗人CD47抗体140的人源化改造及评价
2.1鼠源抗体140的人源化
对鼠源抗体140进行人源化设计，选择IGKV1-33*01|IGKJ4*02和IGHV1-3*01|IGHJ1*01为germline模板。人源化后轻重链序列见SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.5。
SEQ ID NO.8 140人源化后重链可变区氨基酸序列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTNYVMHWVRQAPGQRLEWMGYINPYNDGIKYNEKFTGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGDFYANYGRLGFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.5 140人源化后轻链可变区氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDITNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYFCQQGDTFPRTFGGGTKVEIKR
2.2细胞表面结合和阻断活性评价
分别利用Fortebio和FACS对人源化140进行了评价。Fortebio结果如图1和表1所示。将不同浓度的人源化140(hz140)上样至固定有CD47-His的表面，所述hz140的浓度分别为75nm、60nm、30nm、15nm，经测定kon(1/Ms)＝2.47E+05，kdis(1/s)＝3.70E-04、KD(M)＝1.50E-09。提示人源化后的hz140保持了较好的亲和力。
表1：Fortebio测定Hz140与CD47-his的亲和常数
Figure BDA0003351828190000141
利用FACS对hz140与U937、CCRF和人RBC细胞表面的CD47抗原的结合活性进行评价。结果如图2-图4所示，在三种细胞上hz140与对照抗体hu5F9的结合曲线相似，表明hz140在三种细胞表面的结合活性均与对照抗体hu5F9基本相当。SIRPa-Fc(AAH26692.1，FITClabeled rhSIRPa-Fc)与U937和CCRF细胞表面的CD47结合阻断实验结果如图5和图6所示，在CD47丰度较高的U937细胞上，hz140的阻断活性与hu5F9基本相当；在CD47丰度相对较低的CCRF细胞上，hz140的阻断活性明显强于hu5F9。
2.3Hz140对人急性B淋巴细胞的白血病模型CCRF-SB的抗肿瘤药效
Balb/c裸鼠，6-8周，腹腔注射环磷酰胺2mg/只/200μl进行免疫抑制，48小时后尾静脉接种新鲜处理的CCRF-SB细胞6.25×106。接种5天后(D5)，测量小鼠体重，按照体重数据将小鼠随机分配到各实验组中，每组8只。分组当天开始分别给予不同剂量受试抗体(i.v.，每周2次，共6次)，并观察小鼠的生存期。结果如图7所示，与hIgG阴性对照相比，阳性对照抗体hu5F9能够延长模型小鼠的生存期，但hu5F9的高剂量组(10mg/kg)和低剂量组(3.3mg/kg)之间无明显差异。hz140不仅与阴性对照相比显著延长了模型小鼠的生存期，而且效果优于相同剂量的阳性对照抗体hu5F9。另外，hz140高剂量组的效果优于hz140低剂量组，提示hz140对延长模型小鼠生存期呈现出剂量依赖性。
上述结果表明本发明制备的hz140在人急性B淋巴细胞白血病动物模型中治疗效果优于同剂量的hu5F9，且呈现剂量依赖性、具有更高的可靠性。
实施例3.Hz140的亲和力改造
在人源化hz140抗体轻重链可变区序列(SEQ ID NO.8)的基础上，对重链CDRs序列进行突变设计，通过降低抗体与CD47结合的Koff值以期降低其对RBC及PLT的影响。构建了多个的人源化hz140的重链突变体，对人源化hz140的重链进行氨基酸定点突变，将突变的重链与人源化hz140的轻链配对表达，测定亲和力，比较结果如下表2所示。并进一步在hm10的基础上进行突变，获得140Hm13最终的序列如SEQ ID NO.23所示。
表2.hz140-Hm/hz140L重链突变体序列信息及其与CD47胞外区重组抗原的亲和力
Figure BDA0003351828190000142
Figure BDA0003351828190000151
SEQ ID NO.23：人源化140抗体的重链突变体140Hm13
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTNYVMSWVRQAPGQRLEWMGYINPYNDAIKYNEKFTGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGDFYANYGRLGFAYWGQGTLVTVSS
实施例4红细胞结合活性降低突变体筛选
以140Hm13为重链，分别与h140L(SEQ ID NO.5)和另一异源抗体的相似轻链序列hz182L(SEQ ID NO.1)进行突变体设计和组合，评估其突变体与肿瘤细胞表面CD47和红细胞表面CD47的结合差异。对hz140的轻链可变区序列进行突变设计，突变体设计如下表3所示；对hz182的轻链(h182L)进行突变设计，突变体设计如下表4所示。通过FACS评估不同突变体与肿瘤细胞(1μg/mL)和红细胞(150μg/mL)的结合情况，寻找具有结合差异的突变位点。
SEQ ID NO.1：人源化182抗体的轻链序列hz182L
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLLYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGAGRPYTFGGGTKVEIK
将hz140重链突变体h140Hm13，分别与h140轻链系列突变体(h140Lm1～h140Lm18)、h182轻链系列突变体(hz182-Lm1～hz182-Lm11)组合共表达制备重组抗体，发现了一系列与红细胞无特异性结合的抗CD47特异性抗体。根据表3、表4中h140L和h182L的突变体结果，发现h140Lmut8-mut10的红细胞结合能力明显降低，同时肿瘤的结合活性虽然降低，但仍然保持一定的结合活性。尤其是mut8和mut10，红细胞结合能力完全丧失，但肿瘤细胞结合能力保持，提示位于CDR3区的96位氨基酸从R突变为Y后，是红细胞结合的关键位点。而h182L的反向突变也证实，将h182L突变为h182Lmut8(Y突变为R),其红细胞结合活性恢复。
表3.H140L突变体氨基酸序列
Figure BDA0003351828190000161
Figure BDA0003351828190000171
Figure BDA0003351828190000181
实施例5：初始单克隆抗体的制备
1.抗人PD-L1单克隆抗体的制备
抗人PD-L1人源化抗体根据在先申请专利(专利申请号：CN201911419802.5)制备。该人源化抗体的轻链可变区(hz182-L)氨基酸序列见序列SEQ ID NO.1，编码核苷酸序列见序列SEQ ID NO.2；重链可变区(hz182-H)氨基酸序列见序列SEQ ID NO.3，编码核苷酸序列见序列SEQ ID NO.4。
2.抗人CD47单克隆抗体的制备
采用实施例2制备的抗人CD47抗体140，hz140的轻链可变区(hz140-L)氨基酸序列见SEQ ID NO.5，核苷酸序列见SEQ ID NO.6；轻链恒定区氨基酸序列见SEQ ID NO.7；重链可变区(hz140-H)氨基酸序列见SEQ ID NO.8，核苷酸序列见SEQ ID NO.9；重链恒定区氨基酸序列见SEQ ID NO.10。
实施例6：抗CD47抗体重链/抗PD-L1抗体轻链杂合抗体(hz140-H/hz182-L)的制备通过序列比对，发现实施例2中的hz182抗体的轻链(hz182-L)和hz140抗体的轻链(hz140-L)序列高度相似(同源性96.26％，图10)。图10的序列比对结果显示：hz140轻链和hz182轻链在序列结构上共有8个氨基酸残基的差异，其中CDR1区和FR2区各有1个氨基酸残基的差异，FR3区有2个氨基酸残基的差异，CDR3区有4个氨基酸残基的差异。
试将hz182(hz182-L)的轻链和hz140的重链(hz140-H)进行组合表达，表达上清进行亲和纯化，获得与hz182共轻链的抗人CD47抗体hz140-H/hz182-L。利用Fortebio公司的Octet QKe仪器测定抗体的亲和力，将抗体固定在抗人Fc捕获抗体的传感器表面(AHCSensor)，与液相中的CD47胞外区重组抗原反应(购自义翘神州，Cat:12283-H08H；工作浓度为100nM)，测定动力学参数。结果显示，hz140-H-/hz182-L与CD47重组蛋白具有良好的结合活性(表5)。
表5.Hz140、hz140-H/hz182-L亲和力检测结果
Figure BDA0003351828190000182
实施例7：抗CD47抗体重链突变体/抗PD-L1抗体轻链杂合抗体(hz140-Hm/hz182-L)的制备
对杂合抗体hz140-H/hz182-L的重链进行基因工程改造，并评估对重组抗体对CD47的亲和力。具体的，通过分析抗体可变区各个位点氨基酸种类的分布频率，在可能影响抗体亲和力的氨基酸位点，合理设计突变，并进行不同突变位点的组合；随后通过定点突变PCR将突变引入抗体编码基因相应位点，构建突变体表达质粒。最后将突变后的重链hz140-Hm和轻链hz182-L进行组合表达，表达上清进行亲和纯化。获得的突变体抗体和CD47重组蛋白间的亲和力通过Fortebio进行测定，将抗体固定在抗人Fc捕获抗体的传感器表面(AHCSensor)，与液相中的CD47胞外区重组抗原反应(工作浓度为100nM)，结合时间和解离时间均为300秒，测定动力学参数。重链hz140-H的突变位点、突变体hz140-Hm与重组CD47的亲和力如表6所示。
实施例8：抗CD47抗体重链突变体13/抗PD-L1抗体轻链突变体杂合抗体(hz140-Hm13/hz182-Lm)的制备
对杂合抗体hz140-Hm13/hz182-L的轻链进行基因工程改造，并评估对重组抗体对CD47的亲和力。所述轻链突变体设计原则如下：保留hz140抗体轻链和hz182抗体轻链之间共有的氨基酸残基，突变存在差异的氨基酸残基，突变的氨基酸残基优先是hz140抗体轻链或hz182抗体轻链该位点的氨基酸，也可以是其他类型氨基酸。随后采用实施例2中的方法检测了这些突变体和CD47间的亲和力。轻链hz182-L突变位点、突变体hz182-Lm与重组CD47的亲和力如表7所示。
表6.hz140-Hm/hz182-L重链突变体序列信息及其与CD47胞外区重组抗原的亲和力
Figure BDA0003351828190000191
Figure BDA0003351828190000201
表7.hz140-Hm13/hz182-L轻链突变体序列信息及与重组CD47的亲和力
Figure BDA0003351828190000202
Figure BDA0003351828190000211
实施例9：抗CD47/PD-L1双特异抗体2MW1531-p及其突变体的制备与效果评估
1、抗CD47对照抗体制备
参照专利，合成抗CD47对照抗体hu5F9(公开号：US 9017675B2)和1F8(公开号：CN110582515 A)的轻、重链可变区的编码基因，将轻、重链可变区编码基因分别克隆至装有人轻链恒定区和人IgG4重链恒定区编码基因的真核表达载体中，获得轻、重链表达质粒，转入大肠杆菌扩增，分离获得大量质粒，利用该质粒，根据转染试剂293fectin的操作说明，将对照抗体的轻、重链质粒转入HEK293细胞中重组表达。细胞转染后5-6天，取培养上清，利用ProA亲和层析柱对表达上清进行纯化，获得对照抗体。本申请中，对照抗体hu5F9的轻链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO.35，重链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO.36。对照抗体1F8的轻链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO.37，重链可变区氨基酸序列见SEQ ID NO.38。
2、抗人CD47/PD-L1双特异抗体2MW1531-p及其突变体的制备
将上述hz140-H突变体的可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.23)的编码基因与KIH的A链的恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO.39)的编码基因串联克隆到瞬时表达载体中，构建双特异抗体重链hz140-H-A(氨基酸序列：SEQ ID NO.40)的表达载体；将上述hz182-H的可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.3)的编码基因(SEQ ID NO.4)与KIH的B恒定区氨基酸序列(SEQ IDNO.41)的编码基因串联克隆到瞬时表达载体中，构建双特异性抗体重链hz182-H-B(氨基酸序列SEQ ID NO.42)的表达载体。然后将两条重链表达载体和两个抗体的共同轻链或其突变体的表达载体(轻链及其突变体可变区氨基酸序列：SEQ ID NO.1,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34)同时转入真核细胞中表达，并通过亲和纯化获得共轻链“knobs-into-holes”形式的双特异抗体，命名为2MW1531-p及2MW1531-m1～m11。突变体信息如下表所示。2MW1531 hz140-H的Fc突变位点为：H315R，突变后的恒定区氨基酸序列(命名为hz140-H-knobs，A链Fc)见SEQ ID NO.39，hz140-H-A氨基酸序列见SEQ ID NO.40，hz182-H的Fc突变位点为：K319E，突变后的恒定区氨基酸序列(命名为hz182-H-holes，B链Fc)见SEQ IDNO.41；hz182-H-B氨基酸序列见SEQ ID NO.42。轻、重链匹配信息见表8。
表8.双特异抗体2MW1531-p及其突变体轻重链匹配信息表
Figure BDA0003351828190000221
Figure BDA0003351828190000231
3、CD47/PD-L1双特异抗体亲和力分析
利用Fortebio测定2MW1531-p及其突变体的亲和力。对各个突变体与PD-L1、CD47的亲和力分析如下表9所示。
表9.双特异抗体2MW1531-p及其突变体亲和力测定结果
Figure BDA0003351828190000232
Figure BDA0003351828190000241
4、CD47/PD-L1双特异抗体2MW1531-p及其突变体与人红细胞和肿瘤细胞结合活性分析
通过FACS对2MW1531-p及突变体与人红细胞和肿瘤细胞(SKOV-3，该肿瘤细胞株体外培养时不表达PD-L1)的结合活性进行了分析。在分析和人红细胞结合的实验中，选取的抗体浓度为1000nM；分析和肿瘤细胞结合的实验中，选取的抗体浓度为100nM。分析结果如下表10所示，2MW1531-p及大部分突变体与人红细胞不结合或弱结合，但对肿瘤细胞呈现良好的结合活性。
表10.双特异抗体2MW1531-p及其突变体与人红细胞和肿瘤细胞结合活性分析结果
Figure BDA0003351828190000242
Figure BDA0003351828190000251
实施例10：抗CD47/PD-L1双特异抗体2MW1531与细胞表面抗原结合活性分析
1.抗人CD47/PD-L1双特异抗体2MW1531与MC38-hPD-L1/hCD47细胞结合活性分析
利用CD47和PD-L1都进行了人源化改造的小鼠黑色素瘤细胞株MC38-hPD-L1/hCD47对2MW1531(m9)的结合活性进行了流式细胞术分析。结果如图11所示，结果显示，对于表达人CD47和人PD-L1的小鼠黑色素瘤细胞株MC38-hPD-L1/hCD47的结合能力：抗人CD47/PD-L1双特异性抗体2MW1531高于对CD47具有高度特异性结合能力的5F9对照单抗、抗PD-L1单抗(轻链/重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.3，恒定区氨基酸序列为SEQID NO.7/SEQ ID NO.10)；抗CD47单抗(轻链/重链可变区序列为SEQ ID NO.5/SEQ IDNO.8，恒定区序列为SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.10)。图11的结果表明：2MW1531及其抗CD47侧臂单抗和抗PD-L侧臂单抗均与MC38-hPD-L1/hCD47细胞有良好的结合活性，2MW1531的结合信号高于同源的两个单抗，提示双抗对细胞的结合活性具有叠加或协同效应。
2.抗人CD47/PD-L1双特异抗体2MW1531与A431细胞结合活性分析
利用同时表达CD47和PD-L1的人皮肤鳞癌细株A431对2MW1531(m9)的结合活性进行流式细胞术分析，结果如图12所示，实验结果显示，对于同时表达CD47和PD-L1的人皮肤鳞癌细胞株A431的结合能力，抗人CD47/PD-L1双特异性抗体2MW1531高于抗PD-L1单抗、以及对照抗CD47单抗1F8。上述结果表明，2MW1531的结合活性强于同源单特异性抗PD-L1单抗和对照抗CD47单抗1F8。
实施例11：抗人CD47/PD-L1双特异抗体2MW1531与红细胞表面抗原结合活性
取人新鲜抗凝外周血，人红细胞分离试剂盒分离红细胞。分为5×105cells/样品/100μL，加入梯度稀释的2MW1531(m7)，加入的抗体终浓度为200nM。冰上孵育2h，冰冷PBS(含0.05％吐温)洗涤细胞2遍；加入FITC标记的抗人Fc二抗(厂家，货号)，冰上孵育1h，冰冷PBS(含0.05％吐温)洗涤细胞2遍，重悬于200μL流式缓冲液中，流式细胞仪检测。检测结果如图13所示。图13的流式细胞仪检测结果显示，2MW1531和阴性对照抗体Isotype对人红细胞的结合无显著差异，抗CD47单抗1F8对人红细胞有结合活性，抗CD47单抗5F9对人红细胞有高度结合能力。
图13的结果表明当前条件下，2MW1531不结合人红细胞，1F8有微弱结合，5F9和人红细胞有很强的结合。
实施例12：抗人CD47/PD-L1双特异抗体2MW1531体外RBC凝集试验
取人、人CD47转基因C57小鼠(hCD47/C57)、食蟹猴新鲜抗凝外周血，红细胞分离试剂盒分离红细胞；计数红细胞并调整细胞密度，加入U型底96孔细胞板至1X107细胞/孔/100μL；PBS稀释2MW1531(m11)，800μg/ml起始，4倍稀释7个梯度，等体积(100μL)加入细胞孔中，轻轻混匀，使细胞终浓度为0.5X107细胞/孔/200μL，待测抗体最终工作浓度为400μg/ml起始；将加入样品后的细胞板放置于37℃细胞培养箱孵育4h；肉眼观察凝血现象，判断标准为红细胞沉积于底部且上清清亮为不凝集，上清清亮但红细胞在培养板底部弥散分布为凝集，上清浑浊呈红棕色为溶血。
结果如图14所示，实验结果显示在对人红细胞、CD47人源化的C57小鼠红细胞、猴红细胞的凝集实验结果中，抗CD47单抗5F9和1F8无红细胞凝集现象，2MW1531和NC-IgG4红细胞全部集中于微孔板底部，无网状凝集产生。上述结果表明，2MW1531在当前浓度条件下，未见红细胞聚集或溶血现象。
实施例13：抗人CD47/PD-L1双特异抗体2MW1531体内抗肿瘤活性
1. 2MW1531对hPD-L1/hCD47/hSIRPα转基因小鼠皮下同种移植MC38-hPDL1鼠结肠癌肿瘤模型的抗肿瘤药效检测
将PD-L1和CD47双人源化的鼠结肠癌肿瘤细胞hPDL1/CD47-MC38的接种于雌性hPD-L1/hCD47/hSIRPα转基因小鼠(C57来源的hPD-L1/hCD47/hSIRPα转基因小鼠)右侧前胁肋部皮下，在肿瘤生长至50-100mm3左右时分组并腹腔给予2MW1531(m7)或同型对照IgG，给药剂量为20mg/kg、10mg/kg，每周2次。每次给药的同时测量肿瘤体积及体重，记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积的变化与给药时间的关系，结果如图15所示，图15中，结肠癌肿瘤动物模型体内试验结果显示，在给药同等剂量(10mg/kg)的情况下2MW1531对肿瘤体积的抑制作用强于抗CD47单抗，与抗PD-L1单抗相比较效果相当或略强。在加大剂量的情况下(20mg/kg)，2MW1531对肿瘤体积的抑制作用进一步显著提高。上述结果表明，双特异性抗体2MW1531有效地抑制肿瘤的生长，且成剂量依赖性，其活性强于CD47和PD-L1的单抗。
2. 2MW1531对裸小鼠Raji-Luc血液肿瘤模型的抗肿瘤药效检测
为了检测双特异性抗体2MW1531中抗CD47结合臂对肿瘤治疗的作用，进一步采用不表达PD-L1的Raji-Luc细胞进行动物体内。在免疫缺陷小鼠(NCG)尾静脉异种移植Raji-Luc血液肿瘤模型上，对2MW1531(m11)的抗肿瘤药效进行了分析。首先将血液肿瘤细胞Raji-Luc经尾静脉异种移植接种在雌性免疫缺陷小鼠(NCG)体内，随后借助小鼠活体成像***，通过测定小鼠体内的荧光信号强度来指示血液肿瘤细胞的增殖情况，结果如图16和9所示，图16的活体成像图显示，在不表达PD-L1的Raji肿瘤细胞移植小鼠模型中，抗人CD47/PD-L1双特异性抗体2MW1531对Raji肿瘤细胞生长具有显著抑制作用，对Raji肿瘤细胞增殖的抑制效果与抗CD47单抗5F9相当；图9对放射信号进行定量分析的结果显示，静脉接种Raji肿瘤细胞后利用2MW1531进行腹腔内注射治疗，每周2次，能够显著抑制肿瘤细胞生长，治疗效果与抗CD47单抗5F9相当。上述结果表明，接种在NCG小鼠体内的Raji-Luc细胞可以快速增殖，给予2MW1531治疗后可抑制并清除小鼠体内的肿瘤细胞，提示当肿瘤细胞上不存在PD-L1靶点的情况下，2MW1531可以通过单侧臂阻断CD47信号通路，进而促巨噬细胞吞噬作用，发挥抗肿瘤药效。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
序列表
<110> 北京科诺信诚科技有限公司
<120> 抗体及其制备方法
<150> 202011260418.8
<151> 2020-11-12
<150> 202011269292.0
<151> 2020-11-13
<160> 87
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ala Gly Arg Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 2
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacatccaga tgacccagtc tccctcctct ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgca gagcctccca ggacatctcc aactacctga actggtacca gcagaagcct 120
ggcaaggctc ccaagctgct gctgtactac acctccaggc tgcactccgg agtgccctct 180
cggttctctg gctccggctc tggcaccgac tacaccctga ccatctcctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctactt ctgccagcag ggcgctggac ggccctacac cttcggagga 300
ggcaccaagg tggagatcaa g 321
<210> 3
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Thr Val
1 5 10 15
Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ile Tyr Met
20 25 30
His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg
35 40 45
Ile Asp Pro Ala Asn Ala Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Asp
50 55 60
Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu
65 70 75 80
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser
85 90 95
Gly Gln Leu Gly Pro Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaggtgcagc tggtgcagtc cggagccgag gtgaagaagc ctggagccac cgtgaagatc 60
tcctgcaagg tgtccggctt caacatcaag gacatctaca tgcactgggt gcagcaggct 120
cctggcaagg gcctggagtg gatgggacgg atcgaccctg ccaacgccaa caccaagtac 180
gaccccaagt tccaggaccg ggtgaccatc accgctgaca cctccaccaa caccgcctac 240
atggagctgt cctccctgcg gtccgaggac accgctgtgt actactgcgc ctctggccag 300
ctgggacctc tgggcttcga ctactgggga cagggcacca ccgtgaccgt gtcctcc 357
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asp Thr Phe Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atcacctgca gagcctccca ggacatcacc aactacctga actggtacca gcagaagcct 120
ggcaaggctc ccaagctgct gatctactac acctctcggc tgcactccgg agtgccctct 180
cggttctccg gctctggctc tggcaccgac tacaccttca ccatctcctc cctgcagccc 240
gaggacatcg ccacctactt ctgccagcag ggcgacacct tccctcggac cttcggcgga 300
ggcaccaagg tggagatcaa g 321
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> DNA
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tcctgcaagg cctccggcta caagttcacc aactacgtga tgcactgggt gcggcaggct 120
cctggccaga ggctggagtg gatgggctac atcaaccctt acaacgacgg catcaagtac 180
aacgagaagt tcaccggacg ggtgaccatc accagggaca cctccgcctc caccgcctac 240
atggagctgt cctccctgcg gtccgaggac accgccgtgt actactgcgc tcgggagggc 300
gacttctacg ccaactacgg acggctgggc ttcgcctact ggggacaggg caccctggtg 360
accgtgtcct cc 372
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<212> PRT
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1 5 10 15
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Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
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180 185 190
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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
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260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
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Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
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Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
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Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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115 120
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asn Tyr
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Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asn Tyr
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Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
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Thr Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
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Thr Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Gly Asp Phe Tyr Ala Asn Tyr Gly Arg Leu Gly Phe Ala
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Gly Asn Asp Gly Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp Phe Tyr Ala Asn Tyr Gly Arg Leu Gly Phe Ala
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Gly Asp Phe Tyr Ala Asn Tyr Gly Arg Leu Gly Phe Ala
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp Phe Tyr Ala Asn Tyr Gly Arg Leu Gly Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Ala Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Gly Asp Phe Tyr Ala Asn Tyr Gly Arg Leu Gly Phe Ala
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 20
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Trp Met Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Glu Gly Ile Lys Tyr Asn Glu
1 5 10 15
Lys Phe Thr Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr
20 25 30
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr
35 40 45
Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Asp Phe Tyr Ala Asn Tyr Gly Arg Leu Gly
50 55 60
Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
65 70 75
<210> 21
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Ala Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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Ala Arg Glu Gly Asp Phe Tyr Ala Asn Tyr Gly Arg Leu Gly Phe Ala
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
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Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Ala Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
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Ala Arg Glu Gly Asp Phe Tyr Ala Asn Tyr Gly Arg Leu Gly Phe Ala
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
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50 55 60
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100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ala Gly Arg Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
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115 120 125
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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210
<210> 25
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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165 170 175
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 26
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 27
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
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115 120 125
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130 135 140
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195 200 205
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210
<210> 28
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 29
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ala Thr Arg Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 30
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ala Gly Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 31
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ala Gly Arg Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 32
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asp Thr Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 33
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ala Gly Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 34
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asp Thr Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 35
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 36
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Asn Gln Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu His Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Thr Pro Pro Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 38
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Arg Lys Thr Asp Gly Glu Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Gly Ser Asn Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 39
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Lys Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 40
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Ala Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp Phe Tyr Ala Asn Tyr Gly Arg Leu Gly Phe Ala
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
130 135 140
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn
195 200 205
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
210 215 220
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Gly Lys
450
<210> 41
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 42
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ile
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Ala Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Gln Leu Gly Pro Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 43
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asp Thr Phe Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 44
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Ile Lys Pro Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ile Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Asp Phe Tyr Ala Asn Tyr Gly Arg Leu Gly Phe Ala
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 45
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 47
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Tyr Thr Ser Arg Leu Ser Ser
1 5
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<211> 7
<212> PRT
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
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<400> 87
Asn Tyr Ala Met His
1 5

Claims (19)

1.一种人源化抗人CD47单克隆抗体或其片段，其特征在于，包括：
重链CDR1，包括X1YX2MX3，其中X1选自N、S，X2选自V、A，X3选自H、S；
重链CDR2，包括YINPX4NX5X6IKYNEKFX7G，其中X4选自Y、G，X5选自D、E，X6选自G、A，X7选自T、Q；
重链CDR3，包括EGDFYANYGRLGFX8Y，其中X8选自A、D；
并且，
轻链CDR1，包括RASQDIX9NYLN，其中X9选自S、T；
轻链CDR2，包括YTSRLX10S，其中X10选自H、Q、S；
轻链CDR3，包括QQGX11X12X13PX14T，其中X11选自D、A，X12选自T、G，X13选自F、R、Y、K、S、E、N，X14选自Y、R。
2.如权利要求1所述的人源化抗人CD47单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述人源化抗人CD47单抗或其片段的CDRs区和/或FR区包括点突变。
3.如权利要求1所述的人源化抗人CD47单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述重链CDR1具有SEQ ID NO:76、77、78或87所示的序列；
所述重链CDR2具有SEQ ID NO:79、80、81、82、83或84所示的序列；
所述重链CDR3具有SEQ ID NO:85或86所示的序列，
任选地，所述轻链CDR1具有SEQ ID NO:46或47所示的序列；
所述轻链CDR2具有SEQ ID NO:50、51或52所示的序列；
所述轻链CDR3具有SEQ ID NO:56、57、58、59、60、61、62、63、64、65或68所示的序列。
4.如权利要求1-3中任一所述人源化抗人CD47单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述的人源化抗人CD47单抗或其片段具有SEQ ID NO:8、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23所示重链可变区，SEQ ID NO:5所示轻链可变区。
5.一种多特异性抗体，其特征在于，所述多特异性抗体至少包括一个针对人CD47的特异性的结合位点，所述针对人CD47的特异性结合位点是由权利要求1-4中任一项所述人源化抗人CD47单抗或其片段提供的。
6.如权利要求5所述多特异性抗体，其特征在于：所述多特异性抗体包括针对人CD47不同表位的多个特异性结合位点，
任选地，所述多特异性抗体还包括针对非人CD47靶向的特异性结合位点，
任选地，所述多特异性抗体为双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体。
7.一种靶向PD-L1和CD47的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括两条重链和两条轻链，其中，第一重链可变区源自抗CD47单克隆抗体的重链可变区、其能够与轻链可变区形成CD47结合位点，第二重链可变区源自抗PD-L1单克隆抗体的重链可变区、其能够与轻链可变区形成PD-L1结合位点；
其中，所述两条轻链的轻链可变区的序列相同，并且，所述轻链可变区是基于抗CD47单克隆抗体的轻链和抗PD-L1单克隆抗体的轻链得到的，且所述轻链可变区与所述第一重链可变区形成的第一可变区结合位点与CD47特意性结合，且所述轻链可变区与所述第二重链可变区相匹配形成的第二可变区结合位点与PD-L1特意性结合，
其中，所述抗CD47单克隆抗体为权利要求1-4任一所述的人源化抗人CD47单抗或其片段。
8.如权利要求7所述靶向PD-L1和CD47的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗PD-L1单克隆抗体包括SEQ ID NO:3所示重链可变区和SEQ ID NO:1所示轻链可变区。
9.如权利要求7所述靶向PD-L1和CD47的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述第二重链可变区具有SEQ ID NO:46所示的CDR1和SEQ ID NO:61、62、63、70、71或72所示的CDR3，
任选地，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:1、24、25、26、27、28、29、30、31、32,、33或34所示的序列。
10.如权利要求7述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述第一重链的Fc段包含H315R突变、所述第二重链的Fc段包括K319E突变，所述Fc段氨基酸突变位点使用Kabat的Eu编号***。
11.一种多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1-4任一所述的人源化抗人CD47单抗或其片段，或权利要求5-6任一项所述的多特异性抗体，或权利要求7-10任一项所述的靶向PD-L1和CD47的双特异性抗体或其抗原结合片段。
12.载体，其特征在于，包括权利要求11所述的多核苷酸。
13.宿主细胞，其特征在于，包括权利要求11所述的多核苷酸或权利要求12所述的载体。
14.一种制备抗体或其抗原结合片段的方法，其包括以下步骤：
(1)在适合表达双特异性抗体或其抗原结合片段的条件下培养权利要求13所述宿主细胞；
(2)从细胞培养物中分离纯化双特异性抗体或其片段。
15.一种组合物，其包含权利要求1-4任一所述的人源化抗人CD47单抗或其片段，或权利要求5-6任一项所述的多特异性抗体，或权利要求7-10任一项所述的靶向PD-L1和CD47的双特异性抗体或其抗原结合片段、权利要求11所述多核苷酸、权利要求12所述载体和权利要求13所述宿主细胞中的至少一种。
16.权利要求1-4任一所述的人源化抗人CD47单抗或其片段，或权利要求5-6任一项所述的多特异性抗体，或权利要求7-10任一项所述的靶向PD-L1和CD47的双特异性抗体或其抗原结合片段、权利要求11所述多核苷酸和权利要求15所述组合物在制备***和/或提高机体免疫应答药物中的用途。
17.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括黑色素瘤、肺癌、肾癌、霍奇金淋巴瘤、头颈鳞癌、尿路上皮癌、急慢性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、直肠癌、***癌、肾癌和多发性骨髓瘤。
18.治疗患有肿瘤的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的组合物，所述组合物为权利要求要求15所述的组合物。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述肿瘤包括黑色素瘤、肺癌、肾癌、霍奇金淋巴瘤、头颈鳞癌、尿路上皮癌、急慢性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、直肠癌、***癌、肾癌和多发性骨髓瘤。
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