CN114469953B - 一种具有协同作用的抗肿瘤药物组合物、纳米制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有协同作用的抗肿瘤药物组合物、纳米制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种具有协同作用的抗肿瘤药物组合物、纳米制剂及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域，具体涉及一种阳离子药物阿贝西利和米托蒽醌形成的药物组合物、纳米制剂及其制备方法和应用。所述的纳米制剂由阿贝西利、米托蒽醌和聚阴离子材料按照比例自组装形成。该药物组合物通过药物间的协同作用减少单一药物的用量，达到1+1>2的效果。该纳米制剂能显著地在肿瘤部位累积，逆转免疫抑制微环境，降低毒副作用并提高药物疗效。此外，纳米制剂中的药物具有协同抗转移的功能，为临床肿瘤患者的治疗提供新的策略。

Description

一种具有协同作用的抗肿瘤药物组合物、纳米制剂及其制备 方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有协同作用的抗肿瘤药物组合物、包含该药物组合物的纳米制剂及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤(Tumor)，为控制细胞***增殖机制的失常而引起的疾病。癌细胞除了***失控外，还会局部侵入周围正常组织甚至经由体内循环***或淋巴***转移到身体其他部分。根据2020全球癌症统计报告(Global Cancer Statistics 2020)，全球新增确诊癌症病例约1930万例，癌症死亡人数预计可达1000万人。
肿瘤转移是指肿瘤细胞从原发肿瘤部位扩散，在原发肿瘤以外的器官定居和生长的过程。在肿瘤患者中，约90％的死亡与转移有关。肿瘤细胞首先脱离原发肿瘤，经过迁移、侵袭，通过血液和***到达不同的部位，随后粘附并生长。与原发肿瘤相比，肿瘤转移分布广泛，体积小，不均匀性高，难以手术切除。因此，人们亟需找到一种有效、安全的转移靶向治疗策略，以提高患者的生存率，减少化疗药物的副作用。
近年来，随着生物医学技术的不断发展，分子靶向治疗和免疫治疗等新兴疗法也不断进入临床成为肿瘤治疗新策略。但由于肿瘤病理机制复杂，无论是传统化药还是新型生物药，仅依靠单一抗肿瘤机制的单药治疗很难在临床上取得实际可观的获益。基于肿瘤病理复杂性，抗肿瘤药物联合使用已逐渐成为临床上新的治疗趋势。
联合用药，即同时给予两种或多种药物，对于实现长期预后和减少不良副作用变得至关重要。联合治疗可以调节肿瘤细胞中的不同信号通路，引起协同效应、累加效应和增强效应，极大地增强治疗效果。截至2020年底，有近6000项肿瘤联合试验在Clinicaltrials.gov注册，可见抗肿瘤联合用药在临床上已逐步得到重视并逐渐发展成为主流治疗方案。
随着纳米医学的快速发展，纳米药物递送***被寄望于改善现有抗肿瘤多药联用递送策略的不足，提升治疗效果。相关研究的深入为多种药物的共递送提供了更多新的可能，基于纳米药物递送***的肿瘤多药联用策略与传统“鸡尾酒”疗法相比具有更多元化的功能性，且已显示出更佳的治疗效果。
中性粒细胞是人体中最丰富的循环白细胞，是抵御感染的重要免疫细胞。然而，最近的研究发现，中性粒细胞是形成癌症转移的主要驱动力之一，参与了癌症转移的整个过程，在转移过程中发挥了多种促转移作用。随着肿瘤转移的进展，循环中的中性粒细胞数量增加，可以优先并大量地被招募到转移部位。鉴于中性粒细胞自发、大量地被招募至转移部位并发挥多种功能，人们意识到中性粒细胞可以作为递送药物的载体以提高治疗效果。
阿贝西利(Abemaciclib，ABE)，是一种细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)4和6的抑制剂，已成为治疗乳腺癌的有效药物。一些研究表明，ABE可能影响肿瘤微环境中的多种免疫细胞，包括抑制Treg细胞的增殖和增强肿瘤浸润性T细胞(TILs)的激活。然而，ABE对某些肿瘤的有效率较低，可能与缺乏TILs浸润和“免疫冷”的肿瘤微环境有关，因此联合治疗的策略可能会提高ABE的抗肿瘤效果。米托蒽醌可以诱导免疫原性细胞死亡(immunogenic celldeath，ICD)，增加免疫反应，通过招募TILs克服“免疫冷”的肿瘤微环境。它与ABE协同作用，有望进一步提高治疗效果。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种具有协同作用的抗肿瘤药物组合物，并制备其纳米制剂。所述药物组合物和纳米制剂能够利用联合用药引起的协同效应、累加效应和增强效应，有效地改善肿瘤和肿瘤转移部位的免疫抑制微环境和全身免疫大环境，提高药物疗效。
本发明的再一目的是，提供所述药物组合物、纳米制剂在制备抗实体瘤及***转移药物方面的应用。
所述的实体瘤包括口腔癌、胃肠道癌、结肠癌、胃癌、肺道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、子宫癌、子宫内膜癌、***、膀胱癌、胰腺癌、骨癌、肝癌、胆囊癌、肾癌、皮肤癌和睾丸癌、黑素瘤和肉瘤。所述肿瘤转移器官为肺脏、另一侧肺、肝脏、淋巴、骨、脑、肾上腺。
为了实现上述目的，采用如下技术方案：
一种具有协同作用的抗肿瘤药物组合物，由阿贝西利、米托蒽醌组成。其中，阿贝西利和米托蒽醌的质量比为(8:1)～(1:6)，优选(4:1)～(1:2)。
所述药物组合物中阿贝西利的浓度为0.1mg·mL-1-50mg·mL-1，优选为1mg·mL-1-40mg·mL-1；米托蒽醌的浓度为0.1mg·mL-1-20mg·mL-1，优选为0.5mg·mL-1-15mg·mL-1。所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料和载体。
所述的药物组合物用于协同地抑制肿瘤细胞生长和改善免疫抑制微环境和免疫大环境。
本发明还提供一种所述药物组合物的剂型，包括固体制剂、液体制剂、半固体制剂中的任何一种。进一步的所述剂型为纳米制剂，包括聚离子复合物、磷脂复合物、脂质体、纳米粒、纳米囊以及聚合物胶束。
在一定条件下，荷电相反的聚电解质相互作用能够形成聚电解质复合物，又称为聚离子复合物(Polyionic complex,PIC)。能够参加反应的聚电解质包括聚合物形式的酸、碱与盐类等，甚至包括某些生物大分子和离子型表面活性剂。
聚离子复合物在药物传递这一应用上的显著特点是其核心可以充当带电化合物(如基因、酶与药物等)的微量储库，从而调节其固有特性，如稳定性，溶解性与反应性。
本发明所述的聚离子复合物是指聚阴离子材料修饰的阿贝西利和米托蒽醌共载(即所述药物组合物)的平均粒径在纳米级别的复合物。
其中，所述的聚阴离子材料和所述药物组合物的质量比为(1:2)～(30:1)，优选(1:1)～(10:1)。所述的聚阴离子材料为聚唾液酸、透明质酸、海藻酸、聚谷氨酸、肝素、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖和琥珀酰明胶中的任一种。所述的聚唾液酸聚合度为2～1000，优选20～400；所述的透明质酸聚合度为10～5000，优选50～500；所述的海藻酸聚合度为300～1000，优选600～800；所述的聚谷氨酸聚合度为1000～15000，优选2000～5000。
唾液酸(Sialic acid，SA)又称糖酸，是一类九碳单糖，它主要以短链残基的形式通过α-糖苷键连接于糖蛋白、糖脂与寡糖的末端，普遍存在于哺乳动物的细胞膜表面。另外，许多病原体利用SA“装扮”自身，以掩蔽自身抗原表位，抑制补体的旁路激活途径，降低免疫原性进而成功逃脱宿主免疫***的攻击。聚唾液酸(Polysialic acid，PSA)是多个SA单体以α-2,8与/或α-2,9连接的同聚物。PSA的结构类似于人体细胞表面脂多糖、脂蛋白等末端的糖链信号分子结构，而且在人体中具有非免疫原性。在高等生物中PSA主要以与其它分子如神经细胞粘附分子、乳糖、蛋白或脂类形成复合物的形式存在，聚唾液酸独特的性质和生物学功能使其在食品保健、医药、化妆品等领域的应用愈加广泛，作为一种高附加值材料，它的研究和应用价值也日益凸显。
本发明还提供了所述聚离子复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将药物组合物用纯水溶解，得溶液A，浓度为0.1mg·mL-1～10mg·mL-1；所述药物组合物中阿贝西利和米托蒽醌的质量比为(8:1)～(1:6)，优选(4:1)～(1:2)；
(2)将聚阴离子材料溶于纯水，得溶液B，浓度为0.1mg·mL-1～100mg·mL-1；
(3)将溶液A与溶液B混合，得到聚离子复合物。其中，聚阴离子材料和药物组合物的质量比为(1:2)～(30:1)，优选(1:1)～(10:1)，进一步优选为2:1。
根据具体情况，可以采用葡萄糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、甘油，调节渗透压，达到符合注射要求。也可进行冷冻干燥或者喷雾干燥，冻干保护剂可以采用甘露醇、海藻糖、山梨醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、右旋糖酐，获得固体产品。
处方中还可以加入其它辅料，如EDTA(二钠盐、钙钠盐)、人血清白蛋白、泊洛沙姆、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、多糖类物质(如人参多糖、黄芪多糖、香菇多糖)与pH调节剂。
在由阿贝西利和米托蒽醌的药物组合物制备的制剂中，根据不同的制剂形式和制剂规格，制剂使用的辅料以不与药物组合物发生反应或不影响本发明药物的疗效为前提。
本发明首次将阿贝西利和米托蒽醌联合应用，阿贝西利与米托蒽醌在本发明所述药物组合物中复配具有协同增效作用，在低浓度下获得较高的抗肿瘤活性，具有高效低毒的优点。利用米托蒽醌增加免疫反应，通过招募TILs克服“免疫冷”的肿瘤微环境，与阿贝西利的抑制Treg细胞的增殖和增强肿瘤浸润性T细胞(TILs)的激活产生协同作用。同时制备阿贝西利和米托蒽醌共载的平均粒径在纳米级别的复合物，其粒径为100nm左右，进一步制备肿瘤靶向纳米注射液，4T1乳腺癌肺转移小鼠注射后呈现出极佳的抗肿瘤效果。该纳米级别的复合物还有如下特点：1.制备过程不需要特定的合成条件或额外的试剂，具有良好的生物相容性、生物可降解性、无毒，无免疫原性。制备方法简便，适于大规模生产；2.利用自身中性粒细胞迁移来靶向肺部转移灶，将劣势转化为优势；3.逆转免疫抑制微环境，影响全身肿瘤大环境，完全消除转移灶。本发明的纳米级别的复合物的药效远优于药物组合物溶液、单药制剂、同时或序贯给药。
最为重要的是，聚阴离子材料修饰的阿贝西利和米托蒽醌共载聚离子复合物扩大了肿瘤治疗谱，从实体瘤如原位肺癌、原位乳腺癌等扩大到肺、肝脏、淋巴、骨、脑、肾上腺等器官的肿瘤及转移肿瘤。
本发明中的药物组合物的给药剂量、给药途径或药物的制剂形式不同，可以进行适当的变化，但以保证该药物组合物在体内能够达到有效的药效为前提。
本发明的有益效果：
本发明的药物组合物具有协同增效作用，通过纳米制剂和中性粒细胞的靶向性，可应用于制备预防和/或治疗实体瘤及肿瘤转移。本发明提供的药物组合物、纳米制剂还可以在炎性疾病、自身免疫性疾病方面有所应用，为药物联用和纳米药物递送***的发展提供了技术指导。
附图说明
图1为纳米复合物的图片及透射电子显微镜(TEM)成像图；A：阿贝西利-聚唾液酸纳米复合物B：米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物C：阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物；
图2为不同物质与纳米复合物的红外光谱图；
图3为纳米复合物的体外释放过程；
图4为流式细胞术检测中性粒细胞的纯度；
图5为中性粒细胞膜上L-选择素的表达量；
图6为中性粒细胞对纳米复合物的摄取情况考察；A：共聚焦显微成像技术B：流式细胞技术；
图7为CCK8法检测纳米复合物对中性粒细胞活力的影响；
图8为MTT法检测纳米复合物对4T1肿瘤细胞活力的影响；
图9为肿瘤肺转移模型建立后，在肺部中性粒细胞的量随时间的变化；
图10为纳米复合物在4T1乳腺癌肺转移BALB/c鼠体内荧光成像；A：肺转移小鼠在体荧光呈像B：离体脏器荧光成像；
图11为纳米复合物在4T1乳腺癌肺转移BALB/c鼠肺部组织分布情况；
图12为4T1乳腺癌肺转移BALB/c鼠肺部照片；
图13为4T1乳腺癌肺转移BALB/c鼠肺组织切片；
图14为4T1乳腺癌肺转移BALB/c鼠肺转移结节数量；
图15为4T1乳腺癌肺转移BALB/c鼠生存曲线；
图16为4T1乳腺癌肺转移BALB/c鼠体重变化；
图17为4T1乳腺癌肺转移BALB/c鼠肺部重量；
图18为4T1乳腺癌肺转移BALB/c鼠转移抑制指数；
图19为4T1乳腺癌肺转移BALB/c鼠重要组织切片；
图20为4T1乳腺癌肺转移BALB/c鼠肺部CD4+T，CD8+T细胞变化；A：流式细胞术结果B：CD4+T细胞C：CD8+T细胞；
图21为4T1乳腺癌肺转移BALB/c鼠肺部Treg细胞变化；A：流式细胞术结果B：调节性T细胞；
图22为4T1乳腺癌肺转移BALB/c鼠肺部细胞因子的变化。
具体实施方式
本发明中采用的主要试药、仪器设备和动物：
仪器：BS124s电子分析天平(德国赛多利斯公司)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市英峪予华仪器厂)；PB-10型pH计(德国赛多利斯公司)；TDL-80-2S离心机(上海安亭科学仪器厂)；UV1801型紫外-可见分光光度计(北京瑞利分析仪器有限公司)；ThermoScientific Forma CO2二氧化碳培养箱(上海赛默飞世尔科技有限公司)；TM-4动态灭菌器(沈阳天美达科学仪器有限公司)；SCIENTZ-30F冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；BALB/c小鼠(18～22g，♀，沈阳药科大学实验动物中心)；0.45μm聚偏乙烯微孔滤膜(上海摩速科学器材有限公司)。
试药：本发明中，所用PSA的聚合度分别为2、3、4、5、6、10、16、32、100、130～170、200，270，对应分子量分别为644.50，957.73，1270.97，1584.21，1897.45以及平均分子量为3000，5000，16000，30000，4～5万与6～8万道尔顿。聚合度为2、3、4、5、6的PSA购买自美国Nacalai公司；聚合度为7至10的PSA购买自Nacalaitesque，日本；PSA(平均分子量11.0kDa，多分散系数(p.d.)1.17；平均分子量22.7kDa，多分散指数(p.d.)1.34；平均分子量39.0kDa，多分散系数(p.d.)1.40)，来自Camida，爱尔兰；平均分子量30kDa购自英国Carbosynth公司(卡博森斯化学科技(苏州)有限公司)；其余分子量的PSA自制。阿贝西利原料药(ABE，北京华奉联博科技有限公司，纯度≥99％)；米托蒽醌原料药(MIT，北京华奉联博科技有限公司，纯度≥99％)；无水乙醇(分析纯，天津科密欧化学试剂开发中心)；5％葡萄糖注射液(5％Glu，辰欣药业股份有限公司)；50％葡萄糖注射液(50％Glu，天津药业集团新郑股份有限公司)；灭菌注射用水(石家庄四药有限公司)。
实施例1
细胞活性实验
本研究应用了乳腺癌细胞株4T1，将细胞在5％CO2、95％空气，饱和湿度及37℃的条件下，培养于对应的培养液中，并加入10％新生小牛血清。在每次实验中，细胞的接种密度为5×104/mL。
1.将4T1细胞悬液100μL(约5×104/mL个细胞)加入到96孔板(边缘孔用无菌水或PBS填充)。设置空白孔(有培养基，无细胞)与对照孔(培养基不加药，有细胞)，每组设定3复孔。
2.置37℃，5％CO2孵育0.5h，倒置显微镜下观察。
3.每孔加入10μL待检测不同浓度药物稀释介质，37℃孵育。
4.每孔加入10μLCCK-8溶液，37℃孵育4h。
5.于450nm测定各孔的吸光度值(SoftMax Pro 7.1)。
6.结果分析：将各测试孔的OD值减去调零孔OD值或对照孔OD值。各重复孔的OD值取平均数。细胞活力％＝(加药细胞OD-空白OD)/(对照细胞OD-空白OD)×100％
通过周特氏创立的联合指数法分析阿贝西利和米托蒽醌联合是否具有协同作用、相加作用或者拮抗作用。
实验结果显示单用ABE和MIT溶液对4T1肿瘤细胞的增殖均有抑制作用，并且随着药物浓度的增加，对细胞生长的抑制作用也逐渐增强，并存在剂量依赖关系。在两种药物联合后，相比于同等剂量下的单独药物，抑制率显著增强。对于4T1细胞，二者的协同作用比范围为(4:1)～(1:2)。
表1两种药液单独作用及非等比例联合对4T1细胞的抑制作用
Figure BDA0003503351940000061
Figure BDA0003503351940000071
以Median-effect Principle(中效原理或Chou-Talalay联合指数法)为评价基础，应用CompuSyn统计软件绘制不同效应下的合用指数曲线，从两药合用的效应与合用指数的关系定量评价两药之间是否存在协同效应。合用指数CI＝D1/DX1+D2/DX2+αD1D2/DX1DX2，其中D1、D2为两药单用时产生X效应时两药各自的浓度，DX1、DX2为两药合用时产生X效应时两药各自的浓度。因ABE与MIT作用机制不同，故本实验中取α＝0。当CI＜1时，两药合用效应为协同，且数值越小，表明协同效应越强；CI＝1时，两药合用效应为相加；CI＞1时，两药合用效应为拮抗。经过计算，ABE与MIT在不同质量比时合用指数CI值均小于1，当ABE与MIT的质量比为4:1时，CI＝0.82；当ABE与MIT的质量比为2:1时，CI＝0.53；ABE与MIT的质量比为1:2时，CI＝0.78，表明ABE和MIT具有较好的协同效应，且在质量比为2:1时协同效应最强。
实施例2
阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸(平均分子量30000道尔顿，聚合度为100)聚离子复合物(阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物)的制备
为了增强阿贝西利和米托蒽醌在质量比(4:1)～(1:2)比例下的药物联合应用效果，利用电荷作用力和聚阴离子材料制备了聚离子复合物，以聚唾液酸为例。
精密称取20mg盐酸阿贝西利(ABE)溶于10mL灭菌注射用水中，即得2mg·mL-1的盐酸阿贝西利溶液(ABE-S)；精密称取10mg盐酸米托蒽醌(MIT)溶于10mL灭菌注射用水中，即得1mg·mL-1的盐酸米托蒽醌溶液(MIT-S)；精密称取60mg PSA溶于20mL灭菌注射用水中，即得3mg·mL-1的聚唾液酸溶液(PSA-S)。将ABE-S和MIT-S的药物混合溶液置于磁力搅拌器上，搅拌转速保持100rpm，然后将PSA-S逐滴加入该药物混合溶液中，孵育30min，即得阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸聚离子复合物。最后，采用50％葡萄糖注射液调节至等渗，其中阿贝西利终浓度为1mg·mL-1，米托蒽醌终浓度为0.5mg·mL-1。处方筛选与优化结果见表1，电子显微镜图见附图1，红外光谱图见附图2。
实验结果表明聚唾液酸/阳离子药物(阿贝西利-米托蒽醌的药物组合物)质量比为1/2时，大量游离的阳离子药物未能被包裹，除去游离药物后无法满足给药剂量。当聚唾液酸/阳离子药物质量比提高到2/1时，该组纳米制剂具有较高的装载效率，平均粒径和多分散系数较好。随着聚唾液酸用量的进一步增加，虽然复合效率变高，但平均粒径变大，纳米制剂出现明显的乳光。基于上述结果，我们优选聚唾液酸/阳离子药物质量比为2/1，以保证纳米制剂平均粒径合适，不出现明显乳光且粒径均匀分布。
表2聚离子复合物处方筛选与优化
Figure BDA0003503351940000081
当聚唾液酸/阳离子药物质量比为2/1时，采用平均分子量为644.50，957.73，1270，1585，1900，3000，5000，10000，20000，30000，4～5万与6～8万道尔顿的PSA制备阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸聚离子复合物，结果表明，当平均分子量小于3000时，制剂稳定性小于1个月(平均粒径大于230nm，难以采用过滤除菌)；当平均分子量为3000～10000时，制剂稳定性小于5个月(平均粒径大于200nm)；当平均分子量为10000～80000道尔顿时，其平均粒径为60-200nm，制剂稳定性大于6个月；当平均分子量为20000～50000道尔顿时，其平均粒径为80-160nm，制剂稳定性大于6个月。因此，选择PSA分子量为10000～80000道尔顿，优选为20000～50000道尔顿。
实施例3
聚唾液酸纳米复合物的体外释放考察
通过透析袋法对聚唾液酸纳米复合物的药物释放进行分析。将聚唾液酸纳米复合物转移至处理过的透析袋中，置于磷酸盐缓冲液，并在37℃±2℃下避光恒温透析。在特定时间点收集2mL透析液并补加等体积的空白释放介质。用流动相稀释样品，并使用紫外分光光度计在296和658nm处分别分析释放的药物量，按照下列公式计算药物的累计释放量Rn％。
Figure BDA0003503351940000082
其中，V0为释放介质体积，Cn为第n次取样时浓度，V为取样体积，Mt为总的药物浓度，i≥1的整数。
从结果中分析可知，ABE-S和MIT-S在pH7.4(37℃)时迅速释放，这可能是由游离药物分子迅速通过透析膜扩散所致。纳米复合物组的药物释放速率明显慢于游离药物，这表明纳米复合物可以有效地延迟药物在体内循环中的释放。(图3)。
实施例4
密度梯度离心富集外周血中性粒细胞及纯度检测。
中性粒细胞采用天津市灏洋生物制品科技有限责任公司的小鼠中性粒细胞分离液试剂盒(LZS1100)进行分离纯化，全过程样本、试剂及实验环境均在20±2℃的条件下进行。
1.制备抗凝血液，肝素加入量为10IU·mL-1全血。
2.取一支离心管，先加入分离液I(外购)3mL，后加入80％浓度分离液溶液II(分离液I:样本稀释液＝4:1的混合液)：1.5mL，形成梯度界面。
3.制备血液样本：抗凝血液与红细胞沉降液按1:1比例混匀后，小心加于分离液梯度界面之上，800g离心20min。
4.离心后，血浆层下出现两层白色环状细胞层，取下层白色环状中性粒细胞层(会有少量红细胞混杂)，加3-5倍体积的清洗液混匀，400g离心10min。
5.离心后弃上清，即得中性粒细胞。
为了进一步定量确证中性粒细胞的纯度，我们采用Biolegend公司的FITC偶联单克隆抗小鼠Ly-6G/Ly-6C抗体特异性标记中性粒细胞。将分离纯化的小鼠中性粒细胞，用PBS洗一遍，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基轻轻吹打细胞，使之成为细胞悬液(1×106个/mL)，转移至细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养0.5h。取出培养瓶后，加入FITC偶联单克隆抗小鼠Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)抗体(250ng·mL-1)，在5％CO2、37℃的培养箱中培养0.5h，收集细胞，5000rpm离心3min，去除上清液。加入PBS清洗细胞，5000rpm离心3min，弃去上清，加入200μLPBS重悬细胞，在流式细胞仪上检测样品的荧光强度，每个样品收集1×104个细胞，采用FITC通道检测细胞荧光强度，用FlowJo 10.4(macOSMonterey12.2)软件分析数据，中性粒细胞纯度为95.3％。(见图4)
实施例5
Westernblot法检测中性粒细胞膜上L-选择素的表达量
从正常小鼠和转移小鼠中分离出PBNs，然后在6孔板中培养(每孔2×105个细胞)1h，使用RIPA裂解缓冲液辅以蛋白酶抑制剂在冰上裂解细胞5min。裂解液以12,000rpm离心10min后，上清液用增强型BCA蛋白检测试剂盒来量化总蛋白。蛋白质被加载到相同浓度的SDS-PAGE上，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用脱脂牛奶进行阻断。用CD62L和β-肌动蛋白一抗在4℃下过夜，用HRP结合的二抗在室温下孵育1h，最后在胶片上显像。
炎症期间，L-选择素在中性粒细胞膜上高度表达，而中性粒细胞选择性吞噬聚唾液酸纳米复合物由L-选择素介导。与正常小鼠相比，肿瘤肺转移小鼠的中性粒细胞膜上高度表达L-选择素。结果见图5。
实施例6
中性粒细胞对聚唾液酸纳米复合物的摄取量考察
荧光探针DiR标记的纳米复合物组是以确定的重量比(DiR:PSA＝1:2)制备的。将DiR溶于乙醇，然后蒸发至接近干燥。在搅拌下将PSA水溶液加入到DiR的乙醇溶液中，搅拌20min。制备完成后，在室温下，在真空中进一步除去乙醇。
用不含胎牛血清的RPMI-1640培养基轻轻吹打分离纯化的中性粒细胞，使之成为细胞悬液，配制成浓度为5×105个/mL的细胞悬液，以1×106/孔的密度接种到6孔培养板中，每孔加2mL培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中培养0.5h。取出培养板后，更换含有无菌荧光探针DiR溶液、PSA-DiR纳米复合物的培养液100μL，于5％CO2、37℃的培养箱中培养0.5h，收集细胞，5000rpm离心3min，去除上清液。加入PBS重悬细胞清洗，5000rpm离心3min，弃去上清。在流式细胞仪上检测样品的荧光强度，用FlowJo 10.4(macOSMonterey 12.2)软件分析数据。同时，另一组中性粒细胞用FITC-Ly6G/Ly6C抗体(250ng·mL-1)标记细胞膜，并使用细胞核染料DAPI进行细胞核复染。染色结束后用冷的PBS清洗三次。轻轻甩干爬片，将抗荧光淬灭封片剂滴于载玻片上，从培养板中取出盖玻片，附着有细胞的一面向下扣在载玻片上，排除气泡，吸干溢出的封片剂，封边，最后爬片置于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
采用竞争性抑制实验证明聚唾液酸修饰的纳米复合物能够通过受体-配体特异性识别增强中性粒细胞对药物的摄取。首先使用过量聚唾液酸溶液(10.0mg·mL-1)与中性粒细胞，竞争性抑制细胞表面的受体识别功能，然后通过离心去除上清液并收集细胞。小鼠中性粒细胞继续与聚唾液酸修饰纳米复合物在37℃下共孵育2h(称为竞争性抑制组)。离心去除上清液并收集细胞，加入4％多聚甲醛固定细胞后，使用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜进行检测，结果见图6。
激光共聚焦显微镜结果显示，与溶液组相比，聚唾液酸纳米复合物显著增强了中性粒细胞中的DiR荧光信号。表明聚唾液酸能够有效地促进了中性粒细胞对纳米复合物的摄取，这对于药物发挥体内免疫治疗作用至关重要。
流式细胞术结果进一步显示，与溶液组相比，聚唾液酸纳米复合物在中性粒细胞中显现出更强的荧光信号，提示细胞对制剂的摄取量显著增加。在竞争性抑制实验中，聚唾液酸溶液预孵育后显著抑制了中性粒细胞对聚唾液酸纳米复合物的摄取。该结果与激光共聚焦显微镜一致，表明游离的聚唾液酸可以作为竞争性抑制剂与细胞表面上的聚唾液酸受体结合，阻断了聚唾液酸纳米复合物与中性粒细胞受体结合的能力，导致更低的细胞摄取量。
实施例7
CCK8法检测纳米复合物对中性粒细胞活力的影响
为了考察纳米复合物对中性粒细胞活力的影响，又考虑到中性粒细胞的存活时间为6-8h，无法使用MTT法(显色过程12h)测定，因此，我们采用只需要4h即可显色的CCK8法进行测定。
1.将中性粒细胞悬液100μL(约5×104/mL个细胞)加入到96孔板(边缘孔用无菌水或PBS填充)。设置空白孔(有培养基，无细胞)与对照孔(培养基不加药，有细胞)，每组设定3复孔。
2.置37℃，5％CO2孵育0.5h，倒置显微镜下观察。
3.每孔加入10μL待检测不同浓度聚唾液酸纳米复合物，37℃孵育。
4.每孔加入10μLCCK-8溶液，37℃孵育4h。
5.于450nm测定各孔的吸光度值(SoftMax Pro 7.1)。
6.结果分析：将各测试孔的OD值减去调零孔OD值或对照孔OD值。各重复孔的OD值取平均数。细胞活力％＝(加药细胞OD-空白OD)/(对照细胞OD-空白OD)×100％
CCK8实验结果显示，阿贝西利和米托蒽醌浓度在0.01-10μg·mL-1范围内，溶液组细胞活力均显著低于聚唾液酸纳米复合物组。在5μg·mL-1的阿贝西利和2.5μg·mL-1的米托蒽醌浓度下孵育细胞时，阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组的中性粒细胞活力仍超过75％，因此，可以认为我们在进行后续试验时(阿贝西利浓度为5μg·mL-1，米托蒽醌浓度为2.5μg·mL-1)，中性粒细胞活力不受影响。结果见图7。
实施例8
中性粒细胞摄取纳米复合物后的释放行为考察
采用MTT法测定中性粒细胞释放的药物对4T1小鼠肿瘤细胞的细胞毒性，实验方法如下
①将中性粒细胞(1×106个细胞/毫升)与不同浓度的药物或聚唾液酸纳米复合物共同培养30分钟，然后通过离心分离并重新悬浮于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中。
②将4T1肿瘤细胞悬液加入到96孔板(边缘孔用无菌水或PBS填充)，细胞密度为每孔1×105个。设置空白孔(有培养基，无细胞)与对照孔(培养基不加药，有细胞)，每组设定3复孔。
③将上述获得的中性粒细胞再培养8h，然后离心。用中性粒细胞释放的上清液替换4T1细胞的培养基，再培养48h，在倒置显微镜下观察。
④每孔加入10μL待检测不同浓度药物及聚唾液酸纳米复合物，37℃孵育48h。
⑤每孔加入10μL MTT溶液，37℃孵育4h。
⑥每孔加入三联液过夜溶解活细胞产生的甲瓒。
⑦在570nm波长下测定各孔的吸光值。
结果分析：将各测试孔的OD值减去调零孔OD值或对照孔OD值。各重复孔的OD值取平均数。细胞活力％＝(加药细胞OD-空白OD)/(对照细胞OD-空白OD)×100％，并计算细胞的半数抑制浓度(IC50)。
由细胞毒性分析结果可知，随着中性粒细胞培养基中药物浓度的增加，4T1肿瘤细胞的存活率下降，表明中性粒细胞释放的聚唾液酸纳米复合物仍然保留了它们的生物活性。药物溶液对4T1肿瘤细胞仅有微弱的生长抑制效果，可能是由于药物溶液在一定程度上影响了中性粒细胞的活性，而中性粒细胞对聚唾液酸纳米复合物的摄取效率更高。该结果表明，中性粒细胞可以吞噬聚唾液酸纳米复合物，并将制剂递送至肿瘤、炎症等部位。结果见图8。
实施例9
肿瘤肺转移模型建立后，肺部中性粒细胞的量随时间的变化
从液氮中取出保存的小鼠乳腺癌4T1细胞冻存管，迅速置于37℃水中复苏。将复苏的4T1细胞悬液进行体外培养，在倒置显微镜下计数，当肿瘤细胞活度大于95％时加生理盐水稀释成细胞悬液并调整稀释倍数。采用75％酒精消毒，将4T1细胞混悬液尾静脉注射于小鼠体内。在小鼠尾静脉注射4T1肿瘤细胞0、3、6、9、12和15天后，在碘酒消毒后切开麻醉小鼠的颈部皮肤。用镊子钝性分离唾液腺和肌肉以暴露气管。在气管下缝合，在气管中间的软骨环上切开一个V形切口，将灌洗针***气管内约0.5厘米，确保不伤害肺部，结扎并固定。将1mL PBS缓慢注入小鼠的肺部，重复3次。收集大约1.5mL肺灌洗液，离心3min。用PBS清洗细胞沉淀物3次并重新悬浮在多聚甲醛中。最后，加入中性粒细胞标记物FITC标记的anti-Ly6G/Ly6C抗体，在4℃黑暗环境中孵育20min，标记中性粒细胞。加入4％多聚甲醛固定细胞后，在流式细胞仪上通过FITC通道检测样品的荧光强度，并用FlowJo 10.4(macOSMonterey12.2)软件对实验数据进行分析。
之前的研究表明，与其他免疫细胞相比，中性粒细胞在原发肿瘤微环境中的数量并不多，但中性粒细胞是在转移性肺部增加的主要免疫细胞。为了研究转移过程中被招募到肺部的中性粒细胞数量的变化，我们用流式细胞技术分析了小鼠的乳腺癌肺转移建立后不同时间点的肺灌洗液。与空白小鼠的肺相比，转移小鼠的肺中Ly6G+Ly6C+中性粒细胞数目大幅增加，在第12天达到峰值，随后保持稳定。鉴于中性粒细胞在小鼠体内仅存活18h，这表明肿瘤转移可导致中性粒细胞不断迁移到肺部。结果见图9。
实施例10
纳米复合物在4T1乳腺癌肺转移BALB/c鼠体内荧光成像
从液氮中取出保存的小鼠乳腺癌4T1细胞冻存管，迅速置于37℃水中复苏。将复苏的4T1细胞悬液进行体外培养，在倒置显微镜下计数，当肿瘤细胞活度大于95％时加生理盐水稀释成细胞混悬液并调整稀释倍数。用75％酒精消毒，将4T1细胞混悬液尾静脉注射于小鼠体内。接种后第7天将小鼠随机分成2组，即荧光探针DiR溶液组和荧光探针DiR聚唾液酸纳米复合物组，每组8只。以1mg·kg-1剂量尾静脉注射荧光探针DiR溶液和荧光探针DiR聚唾液酸纳米复合物，分别于1、4、8和24h进行活体荧光成像，测量各组小鼠在体肿瘤组织荧光强度。在24h之后脱颈处死小鼠，分离肿瘤与其他主要器官进行离体器官成像，并测量每个脏器的平均荧光强度。
实验结果表明，随着时间的延长，小鼠肺部逐渐检测到纳米探针的荧光，两组荧光强度均在24h达到峰值。相反，荧光探针DiR溶液组的荧光信号主要分布在肝脏，而肺部的信号很弱。这些结果表明，聚唾液酸修饰的纳米复合物可以增加血液循环中中性粒细胞的摄取，吞噬了纳米制剂的循环中性粒细胞在肿瘤慢性炎症的驱动下，携带着药物跨过血管壁进入肺部，从而导致更多的药物滞留在肺中。在制剂注射24h后，收集肿瘤和其他主要器官，检测制剂在小鼠中的生物分布。在乳腺癌肺转移小鼠组织中，聚唾液酸纳米复合物展现出更强的肺转移靶向能力。结果见图10。
实施例11
纳米复合物在4T1乳腺癌肺转移BALB/c鼠肺部组织分布情况
为了进一步证明聚唾液酸可有效提高小鼠体内中性粒细胞对药物的吞噬作用，将肺转移小鼠分为四组，首先分为阻断中性粒细胞组和未阻断中性粒细胞组。然后分别注射荧光探针DiR溶液或荧光探针DiR聚唾液酸纳米复合物，使用中性粒细胞标记物Ly6G/Ly6C对肺转移组织中的中性粒细胞进行标记，观察肿瘤相关中性粒细胞对药物的摄取。
冰冻切片制作
①组织固定：
新鲜肿瘤组织用固定液固定24h以上，取出用手术刀将目标部位组织修平整。
②脱水：
将修切好的组织放于15％的蔗糖溶液内4℃冰箱脱水沉底后转入30％的蔗糖溶液内4℃冰箱脱水沉底。
③OCT包埋：
将脱好水的组织取出将表面水稍吸干后切面朝上放于包埋台上，组织周围滴上OCT包埋剂，将包埋台放在冰冻切片机上速冻包埋，OCT变白***后即可进行切片。新鲜组织直接冰冻切片则不需要固定脱水，直接用手术刀将目的部位组织修平整后用OCT包埋剂包埋切片。
④切片：
将包埋台固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚度为8-10μm，将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片。片子写好标签后于-20℃保存备用。
⑤免疫荧光染色：
将肿瘤切片与一抗在4℃下孵育8h，然后在室温下与荧光素缀合的二抗孵育1h。
⑥染核：
玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上避光晃动洗涤3次，每次5min。切片甩干后滴加DAPI染液室温避光染核10min。
⑦封片：
玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上避光晃动洗涤3次，每次5min。切片甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
⑧镜检拍照：
于荧光显微镜下观察切片并采集图像。
根据肺部切片的免疫荧光实验结果可知，与荧光探针DiR溶液组相比，在聚唾液酸纳米复合物组Ly6G/Ly6C标记的中性粒细胞中展现出更强的荧光共定位信号。这些结果表明，聚唾液酸能够有效提高中性粒细胞对纳米复合物的摄取，该结果与体外细胞摄取结果一致。为了进一步验证聚唾液酸纳米复合物在肺部的积累是由中性粒细胞介导的，我们将anti-Ly6G抗体静脉注射到患有肿瘤肺部转移的小鼠体内，建立一个中性粒细胞耗竭模型。在耗竭中性粒细胞后，聚唾液酸纳米复合物的靶向性几乎完全消失，荧光信号与荧光探针DiR溶液组相似。结果见图11。
实施例12
聚唾液酸纳米复合物对对4T1荷瘤小鼠抗肿瘤研究
从液氮中取出保存的小鼠乳腺癌4T1细胞冻存管，迅速置于37℃水中复苏。将复苏的4T1细胞悬液进行体外培养，在倒置显微镜下计数，当肿瘤细胞活度大于95％时加生理盐水稀释成细胞混悬液并调整稀释倍数。采用75％酒精消毒，将4T1细胞混悬液接种于小鼠第三对***垫上，每只小鼠接种0.1mL，共接种56只，将小鼠随机分成7组，即对照组、阿贝西利溶液组、米托蒽醌溶液组、阿贝西利-米托蒽醌的药物组合物溶液组、阿贝西利-聚唾液酸纳米复合物组、米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组和阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组，每组8只。各组小鼠均于接种后第3天开始给药，每2天1次，共给药3次(接种后第3、5、7天)，阿贝西利剂量为5mg·kg-1，米托蒽醌剂量为2.5mg·kg-1，对照组给予5％葡萄糖注射液。在整个药效学试验期间，记录体质量、死亡事件等数据。
抗肿瘤实验结果显示，抑瘤率依次为：阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组>米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组>阿贝西利-聚唾液酸纳米复合物组>阿贝西利-米托蒽醌的药物组合物溶液组>米托蒽醌溶液组>阿贝西利溶液组>对照组。阿贝西利溶液组和米托蒽醌溶液组实验期间肿瘤体积持续增长。而阿贝西利-米托蒽醌的药物组合物溶液组的抑瘤效果较好，这可以解释为，药物溶液生物利用度较低，但阿贝西利和米托蒽醌发挥协同作用，激发了全身和肿瘤微环境的免疫反应，从而增强了抗肿瘤作用。纳米复合物组能够显著抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长，并延长小鼠的存活时间。值得注意的是，阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组小鼠的肿瘤体积被明显抑制，在26天时，该组平均抑瘤率为72.45％，显著高于阿贝西利-聚唾液酸纳米复合物组和米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组。除此之外，对于原位三阴乳腺癌4T1模型而言，由于肿瘤位于小鼠乳腺，EPR效应较弱，导致较差的临床治疗效果。课题组之前的实验结果表明，PEG化阿霉素脂质体对4T1荷瘤小鼠的抑瘤率低于40％，远不及阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组。同时，在解剖小鼠后可以观察到，阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组小鼠的肺部重量远远小于对照组小鼠的肺部重量，接近于空白组小鼠肺部重量。
实施例13
聚唾液酸纳米复合物对4T1乳腺癌肺转移BALB/c鼠抗肿瘤转移的药效学评价
从液氮中取出保存的小鼠乳腺癌4T1细胞冻存管，迅速置于37℃水中复苏。将复苏的4T1细胞悬液进行体外培养，在倒置显微镜下计数，当肿瘤细胞活度大于95％时加生理盐水稀释成细胞混悬液并调整稀释倍数。采用75％酒精消毒，将4T1细胞混悬液尾静脉注射于小鼠体内。荷瘤后第3天，将小鼠随机分成7组，即对照组、阿贝西利溶液组、米托蒽醌溶液组、阿贝西利-米托蒽醌的药物组合物溶液组、阿贝西利-聚唾液酸纳米复合物组、米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组和阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组，每组8只。各组小鼠均于接种后第3天开始给药，每2天1次，共给药3次(接种后第3、5、7天)，阿贝西利剂量为5mg·kg-1，米托蒽醌剂量为2.5mg·kg-1，对照组给予5％葡萄糖注射液。在整个药效学试验期间，记录体质量、死亡事件等数据。在肿瘤细胞接种的第18天，对所有组的肺部标本进行切除和拍照，同时检查肺部重量和转移灶的数量，以评估对肺部转移的抑制作用。肺部标本用苏木精和伊红(H&E)染色，用反转显微镜观察。以同样的方式处理用于生存研究的小鼠。
我们分析了小鼠肺部照片和肺部HE染色的转移性结节(深色染色的核团)。除阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物外，所有组别都能清楚地发现转移灶，表明聚唾液酸纳米复合物具有明显的抗转移能力。结果见图12和图13。
与对照组相比，溶液组可以轻微抑制乳腺癌肺转移，阿贝西利-聚唾液酸纳米复合物组和米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组发挥了中等程度的抗转移作用。阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组每个肺的平均转移结节数为11个，分别是对照组、阿贝西利溶液组、米托蒽醌溶液组、阿贝西利-米托蒽醌的药物组合物溶液组、阿贝西利-聚唾液酸纳米复合物组和米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组的10.3％、12.4％、13.7％、15.1％、29.3％和28.8％。结果见图14。
通过长达40天的实验来评估乳腺癌肺转移小鼠的长期存活率。与所有其他组相比，阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组的生存率最高，且几乎可以完全消除转移。结果见图15。
在试验期间对小鼠的体重变化进行了分析，研究了纳米复合物的安全性。在注射纳米复合物的组别中，体重没有发生较大变化。特别是，阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组的小鼠体重稳步上升，而对照组和米托蒽醌溶液组的体重下降，这可能与肺转移灶对小鼠生存质量的影响或米托蒽醌的毒性有关。结果见图16。
成年小鼠的肺部重量是一个恒定值，与转移灶的重量相关。用溶液(阿贝西利溶液组：0.62±0.06g；米托蒽醌溶液组：0.35±0.06g)或单药制剂(阿贝西利-聚唾液酸纳米复合物组：0.29±0.02g；米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组：0.28±0.04g)治疗的小鼠的肺部平均重量明显低于对照组的小鼠(0.91±0.02g)。在所有治疗组中，用阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物治疗的小鼠的肺部重量最低(0.18±0.01g)，最接近于空白组小鼠肺部重量(0.18±0.04g)。结果见图17。
脾指数(Spleen index)为脾脏质量(mg)与体质量(g)的比值，在一定程度上可反映机体免疫功能。脾脏为外周免疫器官，是T、B淋巴细胞定居的场所，也是免疫细胞执行免疫应答功能的场所，可以分泌生物活性介质(如细胞因子等)。文献中常用小鼠的脾指数来评价药物对免疫***的影响。但通过观察脾指数公式发现，脾质量/体质量的单位为mg/g，单位不统一，无法从数据中直观地得到脾脏和体重的数据，只是作为衡量标准单纯地与对照组进行比较。
成年小鼠的肺部重量是一个定值，而在肺部发生病变时(如肺癌，肿瘤肺转移，慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)，肺纤维化，肺水肿，急性肺损伤，肺结核)，肺部会变重。这些病变会导致肿瘤生长，肺泡壁和细支气管的破坏，肺组织渗出、及其他增殖性反应。以脾指数为例，我们提出了肺癌抑制指数，肺转移抑制指数，慢性阻塞性肺病治疗指数，肺纤维化抑制指数，肺水肿抑制指数，肺损伤治疗指数，肺结核抑制指数等相关指数概念。此外，通过研究人群中的肺部重量的变化，可以得到一定地区或者一定职业人群的生存质量状况，如尘肺病。
为了区分与肺部疾病相关的指数，我们将具有特殊应用价值的肺指数命名为“肺病变指数(Lung Diseaseindex,LDindex)”(公式为：LDindex＝body weight(g)/lung weight(g))和“肺重指数(Lungweightindex,LWindex)”(公式为：LWindex＝Lung weight in thecontrol and treatment groups(g)/Lung weight in the blank groups(g))。以上肺部发生病变的指数都可以用这两个指数来代替。
通过将肿瘤转移后的肺重与肺部照片做比较，可以发现肿瘤转移越多越严重的小鼠，其肺部质量越大。我们可以将结节数量与肺重做比值，来验证这一发现。结节的数量与肺的重量成正相关，所以我们可以认为测量肺重可以推测出结节的数量，获得更加准确的数据。
虽然肺重和体重一直被视为抗转移实验的经典参数，但在评价抗转移效果和毒性时，它们是相互独立的指标。在此，我们提出了“转移抑制指数(Metastasis inhibitionindex,MIindex)”作为评价抗转移效果和毒性的综合参数。
转移抑制指数的公式如下：
MIindex＝body weight(g)/lung weight(g).
转移抑制指数还可以反映无法直接观察到的小的和肺内的转移，以获得更准确的数值。用阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物治疗的小鼠的转移抑制指数明显大于其他组，说明阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物的毒性最低，抗转移效果最好。然而，在所有治疗组中，阿贝西利溶液组和米托蒽醌溶液组的转移抑制指数最小，与对照组几乎相同。这些数据表明，阿贝西利溶液组和米托蒽醌溶液组的毒性导致生存质量(Quality oflife，QOL)最低。总的来说，转移抑制指数提供了一个新的评价指标，能更明显地反映治疗组之间的疗效差异，以提高抗转移评估的准确性并促进基础研究的临床转化。结果见图18和表3
表3不同聚唾液酸纳米复合物抗4T1肿瘤转移实验结果
组别 转移抑制指数
对照组 16.7±0.38
阿贝西利溶液组 24.1±0.46
米托蒽醌溶液组 48.0±7.38
阿贝西利-米托蒽醌的药物组合物溶液组 57.2±2.84
阿贝西利-聚唾液酸纳米复合物组 71.8±13.9
米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组 73.4±8.35
阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组 108.6±7.48
空白组 125.1±5.68
PSA的受体在多种白细胞表面高表达，其中包括在肿瘤和肿瘤转移介导的慢性炎症反应中大量增加的外周血中性粒细胞(Peripheral blood neutrophils，PBN)。通过与中性粒细胞等细胞表面上的Selectin、Siglec结合，利用中性粒细胞独特的变形穿过血管壁功能，在组织中释放药物，实现靶向递送药物目的，提高疗效。
小鼠呼吸实验
一般而言，患有肿瘤肺转移的小鼠肺容量会变小，导致呼吸不畅，小鼠呼吸次数增多。因此采用：“小鼠呼吸实验”研究相关的肿瘤转移指标。
在实验组中，记录1min内小鼠呼吸的次数，结果显示对照组小鼠平均1min的呼吸次数为276次，远远大于空白组的163次，说明肿瘤肺转移会影响小鼠的呼吸次数。与之相比，阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组的小鼠平均1分钟呼吸次数为180次，表明聚唾液酸纳米复合物可以有效抑制转移，对小鼠肺容量影响很小。
实施例14
4T1乳腺癌肺转移小鼠重要组织切片
为了考察各纳米复合物对小鼠主要器官的影响，在4T1乳腺癌肺转移小鼠抗肿瘤转移实验结束后，收集各组荷瘤小鼠的心、肝、脾、肾，用于HE病理切片。
石蜡切片制作
①组织固定
将新鲜剥离的心、肝、脾、肺、肾组织用PBS(pH7.4)洗净后用4％多聚甲醛固定24h以上，固定结束后将组织从固定液取出，在通风橱内用手术刀将组织修平整。
②冲洗
将修整好的组织块放入包埋盒，将包埋盒置于蒸馏水下，用较低的流水速度冲洗组织，冲洗12～24h。
③脱水
将包埋盒放进吊篮里，置于脱水机内，用不同梯度的乙醇进行脱水，依次用75％乙醇作用4h，85％乙醇、90％乙醇各作用2h，95％乙醇作用1h，再用无水乙醇作用2次进行脱水。
④透明与浸蜡
将各组织转移至密闭容器内，二甲苯：乙醇(1:1，v/v)作用5～10min，二甲苯I作用5～10min，二甲苯II作用5～10min。透明结束后将各组织块浸没在完全融化的石蜡中(60℃恒温箱)1h，再将组织块转移到新的石蜡液中进行二次浸蜡1h。
⑤包埋
将浸好蜡的组织置于包埋机中进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，在蜡凝固之前，将组织从脱水盒内取出，按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。在-20℃冻台冷却，待蜡凝固后，将蜡块从包埋框中取出并对蜡块进行修整。
⑥切片
将蜡块置于石蜡切片机上连续切片，片厚5μm，将切片漂浮于摊片机上，于40℃温水将组织展平，用防脱载玻片将组织捞起，并于60℃烘箱内烤片。待水烤干、蜡烤化后，将载玻片取出，常温保存备用。
⑦HE染色
⑧石蜡切片脱蜡至水
将组织切片放入二甲苯I、二甲苯II溶液中各浸泡20min，100％乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇各浸泡5min，最后用蒸馏水冲洗10min。
⑨染核
切片放入苏木素染液染8min，用蒸馏水冲洗去浮色，再用1％的盐酸酒精分化数20s，最后用蒸馏水冲洗返蓝。
⑩染质
切片放入伊红染液中染色3min，再用蒸馏水冲洗20s。
Figure BDA0003503351940000191
脱水封片
将切片依次用95％酒精I、95％酒精II各浸泡5min，再用无水乙醇I、无水乙醇II各浸泡5min，然后在二甲苯I、二甲苯II中各浸泡5min脱水透明，最后将切片从二甲苯中拿出晾干，用中性树胶封片。
Figure BDA0003503351940000192
镜检拍照
待封片干燥完毕后，将载玻片置于倒置显微镜下观察。
对各脏器切片进行观察可知，各纳米复合物组小鼠心肌细胞完整且没有观察到心肌断裂现象。对于肝脏病理切片，肝细胞核完整没有受到破坏，肝细胞和肝窦上皮细胞的形态正常，肝窦无充血现象。此外，肾小球和肾小管上皮细胞完整，肾小囊正常，并且所有小鼠肾脏切片均未观察到出血或炎性浸润。小鼠脾脏切片中，各制剂组中均未显示出组织病理学异常、病变或退化。上述结果表明，经过3次药物治疗后，包括心脏、肝、脾和肾在内的小鼠器官未显示出组织病理学异常、病变或退化，证明各纳米复合物可安全用于小鼠肿瘤治疗。结果见图19。
实施例15
4T1乳腺癌肺转移小鼠肺部免疫细胞变化
为考察各治疗方案对抗肿瘤免疫反应的触发情况，采用流式细胞术测定各治疗组小鼠肺组织中的T细胞浸润情况。从液氮中取出保存的小鼠乳腺癌4T1细胞冻存管，迅速置于37℃水中复苏。将复苏的4T1细胞悬液进行体外培养，在倒置显微镜下计数，当肿瘤细胞活度大于95％时加生理盐水稀释成细胞混悬液并调整稀释倍数。采用75％酒精消毒，将4T1细胞混悬液尾静脉注射于小鼠体内。荷瘤后第3天，将小鼠随机分成7组，即对照组、阿贝西利溶液组、米托蒽醌溶液组、阿贝西利-米托蒽醌的药物组合物溶液组、阿贝西利-聚唾液酸纳米复合物组、米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组和阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组，每组8只。各组小鼠均于接种后第3天开始给药，每2天1次，共给药3次(接种后第3、5、7天)，阿贝西利剂量为5mg·kg-1，米托蒽醌剂量为2.5mg·kg-1，对照组给予5％葡萄糖注射液。在整个药效学试验期间，记录体质量、死亡事件等数据。在肿瘤细胞接种的第18天，处死小鼠并收集肿瘤组织。将肿瘤组织剪成约2×2mm3的小碎块置于新配置的消化液(含0.5mg·mL-1胶原酶IV和0.2mg·mL-1DNase I)中，于37℃孵育1h。使用70-μm尼龙筛网过滤未消化的组织块，离心收集单细胞悬液。将得到的肿瘤细胞1200rpm离心5min，重悬于红细胞裂解液以消除红细胞。用新鲜PBS清洗细胞后，加入抗CD3-FITC、抗CD8-APC、抗CD4-PerCP、抗CD25-APC和抗Foxp3-PE抗体于4℃染色30min，以标记T细胞，并用流式细胞仪检测。
结果显示，肺部形成的免疫抑制性微环境阻碍了阿贝西利对效应性T细胞功能的改善，而米托蒽醌则促进了转移部位的免疫原性效应，释放出引发免疫反应的信号，从而提供了使免疫“冷”肿瘤变“热”的机会。阿贝西利与米托蒽醌协同作用，实现了癌症免疫治疗的最佳免疫反应。流式细胞术结果显示，阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物将CD8+T细胞的比率提高到12.6％±1.0％。阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组的CD4+和CD8+T细胞的比率分别是对照组的7.9倍和4.6倍。调节性T细胞是抑制性免疫细胞，通过诱导和维持对自我抗原的耐受来抑制全身性免疫反应。与对照组相比，阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组的调节性T细胞比率下降到7.2％±1.0％。与其他组相比，阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组的调节性T细胞比率最低。结果见图20、21。
实施例16
4T1乳腺癌肺转移小鼠肺部细胞因子的变化
为考察各治疗方案中肺转移小鼠肺部细胞因子的变化，采用ELISA测定各治疗组小鼠肺组织中细胞因子的变化。从液氮中取出保存的小鼠乳腺癌4T1细胞冻存管，迅速置于37℃水中复苏。将复苏的4T1细胞悬液进行体外培养，在倒置显微镜下计数，当肿瘤细胞活度大于95％时加生理盐水稀释成细胞混悬液并调整稀释倍数。采用75％酒精消毒，将4T1细胞混悬液尾静脉注射于小鼠中。荷瘤后第3天，将小鼠随机分成7组，即对照组、阿贝西利溶液组、米托蒽醌溶液组、阿贝西利-米托蒽醌的药物组合物溶液组、阿贝西利-聚唾液酸纳米复合物组、米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组和阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组，每组8只。各组小鼠均于接种后第3天开始给药，每2天1次，共给药3次(接种后第3、5、7天)，阿贝西利剂量为5mg·kg-1，米托蒽醌剂量为2.5mg·kg-1，对照组给予5％葡萄糖注射液。在整个药效学试验期间，记录体质量、死亡事件等数据。在肿瘤细胞接种的第18天，处死小鼠并收集肿瘤组织。用组织匀浆机充分研磨肺组织后，10000rpm离心10min。按照各ELISA试剂盒的说明书，测定上清液中细胞因子IL-10，TGF-β，IFN-γ和TNF-α的浓度。
调节性T细胞(Treg细胞)是抗原特异性抑制细胞，主要是通过释放IL-10或TGF-β发挥免疫抑制作用。ELISA测定的肺部免疫细胞因子水平显示如下，在各组中，阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组中的IL-10和TGF-β的水平最低，表明阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物可以明显抑制适应性调节性T细胞，改善免疫抑制性环境。炎症介质TNF-α和IFN-γ在抗肿瘤免疫中起重要作用，并可促进CD8+T细胞的增殖分化，增强细胞抗肿瘤的活性。与其他组相比，阿贝西利-米托蒽醌-聚唾液酸纳米复合物组明显增强了炎症介质的释放，逆转了免疫抑制性微环境，实现了癌症免疫治疗的最佳免疫反应。结果见图22。
实施例17
其他聚离子复合物的制备
精密称取20mg盐酸阿贝西利溶于10mL灭菌注射用水中，即得2mg·mL-1的盐酸阿贝西利溶液；精密称取10mg盐酸米托蒽醌溶于10mL灭菌注射用水中，即得1mg·mL-1的盐酸米托蒽醌溶液；精密称取60mg聚阴离子材料(聚唾液酸、透明质酸、聚丙烯酸、海藻酸、羧甲基纤维素、卡拉胶、聚谷氨酸、聚衣康酸、肝素、明胶、聚甜菜碱、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯磺酸、琥珀酸和人血白蛋白)溶于20mL灭菌注射用水中，即得3mg·mL-1的聚阴离子溶液。将阿贝西利和米托蒽醌的药物组合物溶液置于磁力搅拌器上，搅拌转速保持100rpm，然后将聚阴离子溶液逐滴加入药物溶液中，孵育30min，即得阿贝西利-米托蒽醌-聚离子复合物。
结果显示，羧甲基纤维素无法与阳离子药物复合获得聚离子复合物；使用聚丙烯酸、卡拉胶、聚衣康酸、明胶、聚甜菜碱、聚甲基丙烯酸甲酯与阳离子药物复合制成的聚离子复合物不稳定；使用人血白蛋白制成的纳米复合物的药效预实验效果不佳，推测可能的原因是小鼠血液中含有大量的蛋白，会干扰纳米复合物的靶向作用，无法使纳米粒子在肿瘤和肿瘤转移部位积累；使用琥珀酸制成的纳米复合物在体外的稳定性尚可，但在注射入体内后可能会发生解离，其药效与溶液组相似。其中在注射卡拉胶复合物后，小鼠出现炎症，说明一定量的卡拉胶会诱导炎症，不适合作为药物载体；
实施例18
其他聚离子复合物抗4T1乳腺癌及肺转移药效学评价
在阿贝西利和米托蒽醌的质量比利(4:1)～(1:2)范围内，选择聚阴离子材料为透明质酸(聚合度为200)、海藻酸(聚合度为600)、聚谷氨酸(聚合度为3000)、肝素、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖和琥珀酰明胶进行配伍给药。阿贝西利的给药剂量为5mg·kg-1，米托蒽醌的给药剂量为2.5mg·kg-1。精密称取20mg盐酸阿贝西利溶于10mL灭菌注射用水中，即得2mg·mL-1的盐酸阿贝西利溶液；精密称取10mg盐酸米托蒽醌溶于10mL灭菌注射用水中，即得1mg·mL-1的盐酸米托蒽醌溶液；精密称取60mg聚阴离子化合物溶于20mL灭菌注射用水中，即得3mg·mL-1的聚阴离子溶液。将药物组合物溶液置于磁力搅拌器上，搅拌转速保持100rpm，然后将聚阴离子溶液逐滴加入药物溶液中，孵育30min，即得阿贝西利-米托蒽醌-聚离子复合物。最后，采用50％葡萄糖注射液调节至等渗，其中阿贝西利终浓度为1mg·mL-1，米托蒽醌终浓度为0.5mg·mL-1。
从液氮中取出保存的小鼠乳腺癌4T1细胞冻存管，迅速置于37℃水中复苏。将复苏的4T1细胞悬液进行体外培养，在倒置显微镜下计数，当肿瘤细胞活度大于95％时加生理盐水稀释成细胞混悬液并调整稀释倍数。采用75％酒精消毒，将4T1细胞混悬液尾静脉注射于小鼠中。荷瘤后第3天，将小鼠随机分成24组，每组8只。各组小鼠均于接种后第3天开始给药，每2天1次，共给药3次(接种后第3、5、7天)，阿贝西利剂量为5mg·kg-1，米托蒽醌剂量为2.5mg·kg-1，对照组给予5％葡萄糖注射液。在整个药效学试验期间，记录体质量、死亡事件等数据。结果见表4。
表4不同聚阴离子聚合物修饰的复合物抗4T1实验结果
组别 转移抑制指数
溶液组 16.7±0.38
透明质酸 102.1±8.21
海藻酸 85.2±4.72
聚谷氨酸 93.6±2.83
肝素 22.9±7.10
硫酸软骨素 88±8.42
硫酸葡聚糖 73±9.42
琥珀酰明胶 86±10.41
在注射肝素复合物后，小鼠出现出血和死亡现象，其死亡率比对照组高。该研究证明肝素因其具有抗凝血作用，会导致小鼠出血，不适合与阳离子药物复合作为药物载体。

Claims (3)

1.一种具有协同作用的抗肿瘤药物组合物的纳米制剂，其特征在于，所述具有协同作用的抗肿瘤药物组合物由阿贝西利、米托蒽醌组成，所述纳米制剂剂型为聚离子复合物，所述聚离子复合物由聚阴离子材料和具有协同作用的抗肿瘤药物组合物组成；
其中，所述的聚阴离子材料和所述具有协同作用的抗肿瘤药物组合物的质量比为（1:2）～（30:1）；所述的聚阴离子材料为聚唾液酸、透明质酸、海藻酸、聚谷氨酸、肝素、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖和琥珀酰明胶中的任一种；所述的聚唾液酸聚合度为2～1000；所述的透明质酸聚合度为10～5000；所述的海藻酸聚合度为300～1000；所述的聚谷氨酸聚合度为1000～15000。
2.一种权利要求1所述具有协同作用的抗肿瘤药物组合物的纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将药物组合物用纯水溶解，得溶液A，浓度为0.1mg·mL-1～10mg·mL-1；所述药物组合物中阿贝西利和米托蒽醌的质量比为（8:1）～（1:6）；
(2)将聚阴离子材料溶于纯水，得溶液B，浓度为0.1mg·mL-1～100mg·mL-1；
(3)将溶液A与溶液B混合，得到聚离子复合物；其中，聚阴离子材料和药物组合物的质量比为（1:2）～（30:1）。
3.一种权利要求1所述具有协同作用的抗肿瘤药物组合物的纳米制剂在制备治疗乳腺癌肺转移药物中的应用。
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