CN114468074A - 植物乳杆菌a4在藏茶生产中的应用及藏茶制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物乳杆菌A4在藏茶生产中的应用及藏茶制备方法。其中，藏茶的制备方法，包括以下步骤：萎凋，将一芽三叶的鲜叶均匀摊晾在通风网架上进行自然萎凋；杀青，采用杀青机对萎凋后的茶叶进行杀青；揉捻，采用揉捻机对杀青后的茶叶进行揉捻；脱水，采用动态脱水机对揉捻后的茶叶进行脱水；加菌渥堆，将植物乳杆菌A4菌液逐层喷洒在脱水后的茶叶中，并翻堆至菌液分布均匀；水洗除菌，发酵结束后采用水洗、蒸汽冲洗、再次水洗的方法除去茶叶中的微生物；二次渥堆，将水洗后的茶叶进行第二次渥堆发酵并翻堆；制成品，二次渥堆后的茶叶经炒干、蒸、压砖制成藏茶。植物乳杆菌A4可使藏茶的氟含量降低70%，同时对藏茶的理化成分和风味并无显著影响。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及植物乳杆菌A4在藏茶生产中的应用及藏茶制备方法。
背景技术
由于茶树对土壤中的氟吸收能力极强，导致茶叶中氟含量偏高，氟在人体内积累过多会引起很多身体健康问题。近年来少数民族地区饮茶型氟中毒现象越来越广泛，已成为中国西部地区较为严重的公共卫生问题。
藏茶作为藏族同胞的民生之茶，在藏族人民的生活中不可或缺。在西南地区，藏茶企业和茶户共多达数万家。随着藏茶被大众熟知，越来越多的人喜爱品尝藏茶。藏茶受众的增多，藏茶氟含量偏高的问题亟待解决。
目前，国家食品***门对黑茶氟含量进行了实时监控。2019年，国家食品***门将黑茶氟含量作为食品监督抽查项目并进行了全面管控，而藏茶恰好属于黑茶中氟含量偏高的一类茶。因此，降低藏茶产品中氟离子的含量非常有必要。
现有降低茶叶中氟含量的方法主要有：(1)培育对氟离子低吸收的茶树品种；(2)调控栽培措施，调节生态环境，减少茶树由环境中摄入氟离子的途径；(3)提高原料等级；(4)在茶叶冲泡过程中添加降氟剂，利用降氟剂的结构特性，有效吸附与交换茶汤中的氟离子；(5)在茶叶加工过程中，通过高氟茶原料与低氟茶原料的合理拼配，来达到降氟的目的；(6)加工过程中进行水处理降低氟含量。
但是，以上这些降氟方法，存在很多不足之处，例如：降氟效果差，茶叶品质受损，消费者不能接受，茶叶加工企业生产难度大、生产成本高。
发明内容
本申请为了解决上述技术问题提供应用植物乳杆菌A4来降低藏茶中的氟含量。
本申请通过下述技术方案实现：
植物乳杆菌A4在藏茶生产中的应用。
优选地，所述应用为降低藏茶中的氟含量。
本申请还提供一种藏茶制备方法，包括以下步骤：萎凋；杀青；揉捻；脱水；加菌渥堆，将植物乳杆菌A4菌液逐层喷洒在脱水后的茶叶中，并翻堆至菌液分布均匀；水洗除菌；二次渥堆；制成品。
进一步的，所述萎凋为将一芽三叶的鲜叶均匀摊晾在通风网架上进行自然萎凋，摊晾厚度为3-5cm，摊晾时间为12h。
进一步的，所述杀青为采用杀青机对萎凋后的茶叶进行杀青，杀青温度为280℃，杀青时间为10min。
进一步的，所述揉捻为采用揉捻机对杀青后的茶叶进行揉捻，揉捻机的转速为45rpm，揉捻时间为15min。
进一步的，所述脱水为采用动态脱水机对揉捻后的茶叶进行脱水，脱水至茶叶中水分含量约30％，脱水温度为280℃。
进一步的，所述加菌渥堆中，喷洒植物乳杆菌A4菌液至茶叶的水分含量为40％，植物乳杆菌A4菌液的质量浓度为0.1-0.4％，加菌渥堆的发酵时间为1-3d。
优选地，植物乳杆菌A4菌液的质量浓度为0.2％，加菌渥堆的发酵时间为2d。
进一步的，所述二次渥堆为将水洗除菌后的茶叶进行第二次渥堆发酵并翻堆，温度超过70℃时进行翻堆，二次渥堆的发酵时间为60d。
与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
本发明采用在藏茶生产中，通过在加菌渥堆发酵中加入植物乳杆菌A4，使得藏茶产品的氟含量降低了70％，同时植物乳杆菌A4的加入对藏茶产品的理化成分和风味并无显著影响。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请实施方式的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施方式的限定。
图1是应用植物乳杆菌A4生产藏茶的流程框图；
图2是藏茶产品品质检验流程框图。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将结合实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。
实施例一
1.菌株分离和菌株种属确定
将结束发酵的藏茶用超纯水进行浸泡2h，然后将浸提液转移到添加了氟元素的MRS固体培养基上培养，一段时间后挑选出平板上生命力最旺盛的菌株，再利用MRS琼脂平板对其进行纯化两次，然后把一部分菌种分离到甘油中并保存在-20℃冰柜，一部分菌种拿来检测确定种属。
挑取单菌落溶于100μL超纯水中，在沸水中煮10min以裂解菌体，吸取1μL裂解后的菌液作为PCR反应的模板，扩增16S rDNA基因；PCR扩增引物为27F_PRIMER/1492R，50μL PCR反应体系为PCR反应体系为(50μL)：上、下游引物1μL(20μmol/L)；模板DNA 1μL；Premix Taq25μL；超纯水22μL。PCR扩增过程：95℃预变性5min，95℃后持续变性30s、55℃退火30s、72℃2min进行35次循环，最后72℃延伸10min，4℃保温。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后测序。
将测序结果进行BLAST比对，将所得序列与NCBI的Genbank数据库中已知序列进行比对，确定菌种类型。
表1菌株16s rDNA***发育分析
| 乳酸菌种类 | 乳酸菌编号 | 同源性 |
| 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) | A4 | 98.35％ |
根据对比结果，该菌株与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)A4同源率达98％以上，具有同源性，可以确定该乳酸菌为植物乳杆菌A4。
2.植物乳杆菌A4富氟功能验证
(1)不同发酵天数下植物乳杆菌A4的富氟功能
①菌株培养与菌液分离
验证实验分为空白组和实验组，空白组不添加植物乳杆菌A4，实验组添加植物乳杆菌A4，分别培养1d、2d、3d、4d和5d，各组别均设置三小组平行实验。
实验组：将活化好的植物乳杆菌A4菌液以3％的接种量接种到氟添加量(以氟化钠含量计)为25μg/mL MRS液体培养基中，37℃分别培养1d、2d、3d、4d和5d，离心取上清液，使用离心机在8000r/min速率下高速离心1min，取上清液进行测定。
对照组：将氟添加量(以氟化钠含量计)为25μg/mL MRS液体培养基在37℃分别培养1d、2d、3d、4d和5d，离心取上清液，使用离心机在8000r/min速率下高速离心1min，取上清液进行测定。
②菌液中氟含量测定结果
利用氟离子选择电极法对上清液中的氟含量进行测定，测定结果如表2所示，表中每个数值均表示为各组别三小组平行实验的平均值±标准差(SD)(P<0.05)。
表2不同培养时间下培养液中氟含量(μg/mL)
| 组别 | 1d | 2d | 3d | 4d | 5d |
| 实验组 | 10.48±0.66 | 7.3±0.28 | 11.57±0.61 | 12.42±0.14 | 17.45±0.45 |
| 对照组 | 24.98±0.01 | 24.95±0.06 | 24.94±0.06 | 24.92±0.05 | 24.97±0.01 |
结果显示，相比较空白组，实验组上清液中氟含量显著下降，说明添加植物乳杆菌A4能起到降低环境中氟含量的作用。不同培养时间下，培养时间为2d的实验组中上清液氟含量最低，优于其他培养时间的实验组，说明培养时间为2d时植物乳杆菌A4的富氟作用最明显。其次，在培养至4d和5d后，菌液中部分植物乳杆菌A4开始死亡，被其吸收的氟离子又被释放了出来。
(2)不同加菌量下植物乳杆菌A4的富氟功能
①利用氟离子选择电极法对鲜叶中氟含量进行测定，然后将50kg一芽三叶的鲜叶进行摊晾，鲜叶均匀散放在通风网架上自然萎调，厚度3-5cm，摊晾12h；
②采用茶叶杀青机进行杀青，温度280℃，时间10min；
③将杀青后的茶叶在揉捻机内揉捻，转速45rpm，时间15min；
④采用茶叶动态脱水机脱水，温度280℃，脱水至茶叶中水分含量约30％；
⑤将茶叶等分为16份小茶堆，其中1份为对照组，不喷洒菌液，其余15份为实验组，其中每3份小茶堆为三小组平行实验，五组实验组分别将0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％的植物乳杆菌A4菌液(w/v)，逐层喷洒在小茶堆中，使小茶堆水分含量约40％，并翻堆至植物乳杆菌A4菌液分布均匀，放置于保温箱中渥堆发酵2d；
⑥发酵结束后采用水洗、蒸汽冲洗、再次水洗的方法除去茶叶中富氟微生物；
⑦随后进行二次渥堆，发酵10d后将茶叶从保温箱中取出并烘干，然后测量茶叶中氟含量。
各组别氟含量测定结果如下表所示，表中每个数值均表示为各组别三小组平行实验的平均值±标准差(SD)(P<0.05)。
表3不同菌液用量下茶叶中的氟含量
结果表明，相比较空白组，添加菌液实验组中茶叶成品的氟含量明显下降，说明添加植物乳杆菌A4能降低环境中的氟含量。不同加菌量下，菌液用量(w/v)为0.2％的实验组中，茶叶成品氟含量最低，优于其他加菌量的实验组，说明菌液用量(w/v)为0.2％时植物乳杆菌A4的富氟作用最明显。但是，当菌液用量(w/v)＞0.4％后，植物乳杆菌会大量产酸，降低藏茶产品的口感。
3.植物乳杆菌A4对藏茶的降氟作用
(1)实验步骤
①采用自然萎调的方法将5000kg一芽三叶的鲜叶进行摊晾，鲜叶均匀散放在通风网架上，厚度3-5cm，摊晾12h；
②采用茶叶杀青机进行杀青，温度280℃，时间10min；
③将杀青后的茶叶在揉捻机内揉捻，转速45rpm，时间15min；
④采用茶叶动态脱水机脱水，温度280℃，脱水至茶叶中水分含量约30％；
⑤将0.2％的植物乳杆菌A4菌液(w/v)逐层喷洒在茶堆中，使茶堆的水分含量约40％，并翻堆至植物乳杆菌A4菌液分布均匀，自然渥堆发酵2d；
⑥发酵结束后采用水洗、蒸汽冲洗、再次水洗的方法除去茶叶中富氟微生物。
⑦随后进行第二次渥堆发酵，实时监控渥堆的堆芯温度，温度超过70℃时进行翻堆，发酵60d；
⑧经过炒干、蒸、压砖等步骤制成藏茶成品。
(2)藏茶产品品质检验
①藏茶降氟效果检验
如图2所示，鲜叶采摘处理后，先利用氟离子选择电极法进行氟含量测定，然后将原料均分成对照组和实验组，每个组别均设置三小组平行实验。
从鲜叶到脱水阶段，实验组和对照组的处理方式完全一致。在渥堆发酵阶段，对照组采用传统工艺渥堆处理茶叶；实验组则采用加植物乳杆菌A4渥堆发酵、水洗除菌、二次渥堆的方式处理茶叶，渥堆条件同对照组一致。
渥堆阶段结束后，利用氟离子选择电极法测定茶堆的氟含量，比较对照组与实验组茶堆的氟含量差异，实验结果见表4，表中每个数值均表示为各组别三小组平行实验的平均值±标准差(SD)(P<0.05)。
表4不同组别茶堆的氟含量变化
由表4可知，从鲜叶到渥堆发酵阶段结束，添加植物乳杆菌A4的实验组的茶堆中，氟含量显著低于对照组，说明采用添加植物乳杆菌A4降低藏茶中氟含量的方法是行之有效的，降氟率可达70％。
②感官评审
参照《茶叶感官评审方法》(GB/T 23776-2018)，由10名训练有素的专家对茶叶的外形、汤色、香气、滋味和叶底进行评价。审评得分采用百分制，计算方法为：审评得分＝外形×20％+汤色×15％+香气×25％+滋味×30％+叶底×10％。感官评价结果见表6，表中每个数值均表示为十位评审测试的平均值±标准差(SD)(P<0.05)。
表5藏茶品质评语和品质因子评分表
表6不同组别藏茶品质因子评分结果
从表中可以看出，实验组的各项评分因子均与对照组的各项评分因子基本相同，是否添加植物乳杆菌A4对于藏茶产品的感官品质因子影响不显著。
③理化指标测定
理化指标测定藏茶中水分含量、总灰分、茶梗含量、非茶类夹杂物含量以及水浸出物含量测定，具体方法及标准值参考《紧压茶第4部分：康砖茶》(GB/T 9833.4-2013)。
表7不同组别藏茶的理化指标对照表
结果显示，实验组与对照组的各理化成分含量基本相同，且均低于《紧压茶第4部分：康砖茶》(GB/T 9833.4-2013)中的标准限值。
④主要成分测定
检测内容包括：可溶性蛋白含量、茶多酚含量、游离氨基酸含量、可溶性多糖含量、咖啡碱含量，采用考马斯亮蓝比色法测定可溶性蛋白含量、采用福林酚比色法测定茶多酚含量、采用茚三酮比色法测定游离氨基酸含量、采用黄酮比色法测定可溶性多糖含量、参考《茶咖啡碱测定》(GB/T 8312-2013)测定咖啡碱含量。
检测结果如表8所示，表中每个数值均表示为各组别三小组平行实验的平均值±标准差(SD)(P<0.05)。结果显示，实验组中藏茶的主要成分与对照组相比并无显著差异。
表8不同组别藏茶中主要成分占比(％)
| 组别 | 可溶性蛋白 | 茶多酚 | 游离氨基酸 | 可溶性多糖 | 咖啡碱 |
| 实验组 | 15.49±0.25 | 16.65±0.53 | 2.45±0.16 | 1.65±0.01 | 2.84±0.03 |
| 对照组 | 15.67±0.28 | 16.38±0.12 | 2.45±0.34 | 1.62±0.06 | 2.86±0.08 |
综上所述，在藏茶生产过程中加入植物乳杆菌A4可有效降低藏茶产品的氟含量，其次，植物乳杆菌A4的添加对藏茶产品的理化成分和风味不会造成显著影响。
以上的具体实施方式，对本申请的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.植物乳杆菌A4在藏茶生产中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用为降低藏茶中的氟含量。
3.一种藏茶制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
萎凋；
杀青；
揉捻；
脱水；
加菌渥堆，将植物乳杆菌A4菌液逐层喷洒在脱水后的茶叶中，并翻堆至菌液分布均匀；
水洗除菌；
二次渥堆；
制成品。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述萎凋为将一芽三叶的鲜叶均匀摊晾在通风网架上进行自然萎凋，摊晾厚度为3-5cm，摊晾时间为12h。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述杀青为采用杀青机对萎凋后的茶叶进行杀青，杀青温度为280℃，杀青时间为10min。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述揉捻为采用揉捻机对杀青后的茶叶进行揉捻，揉捻机的转速为45rpm，揉捻时间为15min。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述脱水为采用动态脱水机对揉捻后的茶叶进行脱水，脱水至茶叶中水分含量约30%，脱水温度为280℃。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法，其特征在于：所述加菌渥堆中，喷洒植物乳杆菌A4菌液至茶叶的水分含量为40%，植物乳杆菌A4菌液的质量浓度为0.1-0.4%，加菌渥堆的发酵时间为1-3d。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：植物乳杆菌A4菌液的质量浓度为0.2%，加菌渥堆的发酵时间为2d。
10.根据权利要求3或9所述的方法，其特征在于：所述二次渥堆为将水洗除菌后的茶叶进行第二次渥堆发酵并翻堆，温度超过70℃时进行翻堆，二次渥堆的发酵时间为60d。
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