CN114457178B - 用于预测杨梅果实可溶性固形物的kasp分子标记及其应用 - Google Patents

用于预测杨梅果实可溶性固形物的kasp分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于预测杨梅果实可溶性固形物的KASP分子标记，其SNP位点位于杨梅5号染色体第9,667,472位碱基，利用该单碱基差异设计了KASP引物组合，可用于快速精准地鉴定杨梅该位点的基因分型，选出杨梅果实可溶性固形物更高、口感更好的基因型，从而在种质苗期预测果实可溶性固形物含量，减少时间和人工成本的同时又可以高通量检测多个样品，大大提高检测效率，将在优质品种选育中发挥重要作用。

Description

用于预测杨梅果实可溶性固形物的KASP分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及作物果实性状预测分子标记开发和分子辅助育种技术领域，具体涉及一种 用于预测杨梅果实可溶性固形物的KASP分子标记及其应用。
背景技术
杨梅是我国特有的经济果树，口感独特，营养丰富，富含维生素C、黄酮、多酚类物质，具有降糖、降脂、抑制多种肿瘤活性的功能。据国家***数据，2020年仅浙江省杨 梅栽培面积达135万亩，产值近46亿元，具有显著的经济效益，是促进乡村振兴的优势树种。
果实可溶性固形物含量(The soluble solids,TSS)是指果实中压榨果汁所含溶解于水 的化合物总称，包括糖、酸、维生素、矿物质等，主要是指可溶性糖类，包括单糖、双糖， 多糖等组分，是影响杨梅风味的重要成分，也是衡量果实品质的重要参考标准。TSS测定 主要基于折射法和光谱分析法的原理进行，数据获取方便、快捷，更成为果实成熟度的评 价指标。杨梅成熟果实TSS在7.5-15.0％之间，当TSS＜11％时，口感酸涩；当12％＜TSS时，酸甜适口，口感较好；当果实可溶性固形物差异在2％以上，口感差异明显。
目前，杨梅育种仍以常规芽变育种为主，然而芽变育种性状变异存在不定向性，优良 性状不能聚合，杂交育种可以达到双亲优良性状聚合的目的，但是杂交后代童期长达10年，果实品质性状童期内无法检测，增加了育种工作量，延长了育种周期。果实品质是评价品种特性最重要的指标之一，因此，开发果实品质相关的特异分子标记，进行分子辅助 选择尤为重要。KASP(kompetitive allele specific PCR)是一种一步法的基因型鉴定技术，通 过荧光信号判断目标位点的基因型。由于KASP标记具有省时省力，费用低廉等特点，逐步成为了分子标记辅助育种中常用的标记类型。
因此急需充分挖掘杨梅果实可溶性固形物形成相关的调控基因，开发相应基因功能性 分子标记，为杨梅果实高可溶性固形物含量的分子辅助育种提供有力技术支撑。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于预测杨梅果实可溶性固形物的KASP分子标记，其SNP 位点位于杨梅5号染色体第9,667,472位碱基，利用该单碱基差异设计了KASP引物组合， 可用于快速精准地鉴定杨梅该位点的基因分型，选出杨梅果实可溶性固形物更高、口感更 好的基因型，从而在种质苗期预测果实可溶性固形物含量。
为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种用于预测杨梅果实可溶性固形物的KASP标记，其特征在 于，所述分KASP标记的SNP位点位于杨梅5号染色体第9,667,472位碱基，分子标记多态性 为C/T。
本发明基于前期种质资源调查的基础，对全国杨梅产区的种质资源进行整理，共收集 到173份种质资源，进行了基因组重测序，并测定了其中136份种质资源的果实TSS含量， 将基因组数据与TSS进行全基因组关联分析，在5号染色体的9,667,472bp位置检测到SNP， 并根据SNP位置查找到目标基因为MrChr5G1084。
本发明所获得的KASP标记为杨梅果实可溶性固形物含量构型的基因标记，能用于分 子辅助选育高品质杨梅品种。
另一方面，本发明提供了一种用于检测上述的KASP标记的引物组合，该引物组合包 括：
Ⅰ)两条正向引物为正向引物1和正向引物2，其中正向引物1序列如序列表中SeqID NO.1所示，正向引物2序列如序列表中Seq ID NO.2所示；
Ⅱ)一条共用反向引物，其序列如序列表中Seq ID NO.3所示。
进一步地，所述正向引物1的5’端带有FAM荧光信号标签；正向引物2的5’端带有HEX 荧光信号标签。
再一方面，本发明提供了含有如上所述的引物组合的试剂或试剂盒。
再一方面，本发明提供了采用如上所述的引物组合预测杨梅果实可溶性固形物的方 法，该方法主要包括以下步骤：
1)提取待测杨梅品种基因组DNA；
2)以待测杨梅品种基因组DNA为模板，利用如上所述的引物组合进行KASP反应检测；
3)根据KASP产物荧光信号的差异，鉴别出待测杨梅的基因型。
进一步地，步骤2)中KASP反应体系为：5～10ng/μl杨梅基因组DNA 0.8μl，KASPMaster Mix(KASP主混合物，购自LGC，Biosearch Technologie)0.8μl，KASP Assay Mix(如上所述的引物组合，其中包括正向引物1 0.05μl，正向引物2 0.05μl，反向引物0.05 μl)0.05μl。
进一步地，步骤2)中KASP反应程序为：95℃预变性，15min；95℃变性20s；65℃退火延伸25s，每个循环退火温度降低1℃，共10个循环；95℃变性10s，57℃退火延伸60s， 共30个循环。
进一步地，步骤3)为根据KASP产物荧光信号的差异，利用IntelliQube仪器进行荧光 数据读取和分析，鉴别出待测杨梅的基因型。
主要根据荧光颜色分类，得到基因分型效果图，从而进行杨梅基因型的鉴别。目前共 检测到两种基因型，分别是杂合型CT与纯合型CC，其中杂合型CT为紫色(红色与蓝色荧光混合颜色)，纯合型CC为红色。
由于正向引物1的5’端带有FAM荧光信号标签；正向引物2的5’端带有HEX荧光信号标签，如果检测到的材料是纯合基因型，扩增的时候只会选其中对应的一个正向引物扩增与共用反向引物结合(例如，纯合CC型能与F-FAM和共用反向引物结合，产生红色荧 光)，根据荧光的差异，分辨出所测材料是CC型还是TT型，如果检测的材料是杂合CT型的，扩增时2个引物都会结合，产生的红、蓝两种荧光信号(合成紫色)，不同于纯合 基因型的材料，从而实现区分杂合基因型。
在一些方式中，步骤3)若在SNP位点检测到碱基T，为连接HEX荧光标签序列的 等位基因型，荧光信号显示为蓝色，则判定待测杨梅构型为纯合基因型TT(目前还未检测到)；若检测到碱基C，为连接FAM荧光标签序列的等位基因型，荧光信号显示为红色，则判定待测杨梅构型为纯合基因型CC；若同时检测到碱基T和C，为同时连接FAM荧光 标签序列和HEX荧光标签序列的中间型，荧光信号显示为紫色，则判定待测杨梅构型为 杂合基因型CT。
进一步地，步骤3)鉴别出的杨梅基因型包括CC和CT，其中CC的果实可溶性固形 物含量高于CT。
将基因型与TSS含量进行统计分析(图4)，基因型为CT的种质，TSS中位数为9.55％； 基因型为CC的种质，TSS中位数为11.44％；T-test显示两者间存在极显著性差异(p＝8.87×10-6)，具有统计意义。因此根据鉴定出的基因型，即可预测杨梅果实的TSS含量。
再一方面，本发明提供了一种基因用于作为预测杨梅果实可溶性固形物的目标基因的 用途，所述基因为MrChr5G1084，具有如序列表中Seq ID NO.4所示的序列。
再一方面，本发明提供了一种如上所述的KASP标记或如上所述的引物组合或包含该 引物组合的试剂或试剂盒在预测杨梅果实可溶性固形物含量或辅助育种方面的用途。
本发明提供的KASP分子标记能用于高可溶性固形物种质的分子辅助选择，该标记具 有可靠性和可用性。
大量实验证明，本发明所获得的KASP分子标记能用于分子辅助选育优质杨梅品种。
本发明的有益效果：本发明提供了一种用于预测杨梅果实可溶性固形物的KASP分子 标记，其SNP位点位于杨梅5号染色体第9,667,472位碱基，通过该分子标记中的单碱基差异设计了KASP检测的引物组合，可用于快速精准地鉴定杨梅构型的基因分型，从而预 测杨梅果实可溶性固形物含量，选出杨梅果实可溶性固形物更高、口感更好的基因型，减 少时间和人工成本的同时又可以高通量检测多个样品，大大提高检测效率，将在优质杨梅品种选育中发挥重要作用。
附图说明
图1为实施例1中SNP位点在MrChr5G1084基因中的定位的示意图，其中a为SNP位点在MrChr5G1084基因中的定位的示意图，b为调查表型与SNP位点的匹配度示意图，由1b可见，完全匹配；
图2为实施例1中MrChr5G1084与GeneID:122318644的序列比对结果示意图；
图3为实施例3中KASP-Primer-1084分型结果示意图；
图4为实施例3中对基因型与TSS含量进行统计分析结果示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便 于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。实施例中未注明具体条件者按照常规条件 或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过市售购买获得的常规产品。
实施例1用于预测杨梅果实可溶性固形物的KASP分子标记的开发
1、杨梅果实TSS基因的挖掘
基于前期种质资源调查的基础，对全国杨梅产区的种质资源进行整理，共收集到173 份种质资源，进行了基因组重测序，并测定了其中136份种质资源的果实TSS含量，将基因组数据与TSS进行全基因组关联分析，在5号染色体的9,667,472bp位置检测到SNP， 根据SNP位置查找到目标基因为MrChr5G1084(图1a和b)，目标基因MrChr5G1084具 有如序列表中Seq ID NO.4所示的序列。
2、基因MrChr5G1084功能预测
将MrChr5G1084的CDS序列在NCBI进行Blast比对，发现与前人报道序列号为GeneID:122318644的基因相似度为90％(图2)，为同源基因，MrChr5G1084可能具有调 控品质形成的作用。
实施例2用于KASP检测分子标记的引物组合的设计
本实施例根据实施例1获得的SNP位点，查找5号染色体9,667,472bp位置SNP的上游50bp序列(Seq ID NO.5)、下游50bp序列(Seq ID NO.6)，利用Cereals DB website 网站，设计了编号为KASP-Primer-1084的KASP引物，用于检测不同杨梅果实可溶性固 形物的杨梅基因型。引物序列如表1所示，其中正向引物1的5’端带有FAM荧光信号标 签，正向引物2的5’端带有HEX荧光信号标签。该引物组合序列可与该SNP位点上下 游相应序列特异性结合。
表1 KASP-Primer-1084引物序列
实施例3 KASP分子标记的应用
以78份杨梅种质为试材，测定果实成熟期的TSS含量(表2)。利用CTAB法提取 78份杨梅种质材料DNA。
利用实施例2提供的KASP-Primer-1084引物进行种质基因型检测，反应体系如下：
使用1.6μl PCR反应***，包含0.8μl KASP主混合物(LGC，BiosearchTechnologie)， 0.05μl每个引物(Primer_AlleleFAM、Primer_AlleleHEX、Primer_Common)和0.8μl DNA (5-10ng/μl)，根据IntelliQube仪器(LGC，Biosearch Technologies)使用说明进行PCR 分析，PCR反应程序为：95℃预变性，15min；95℃变性20s；65℃退火延伸25s，每个循 环退火温度降低1℃，共10个循环；95℃变性10s，57℃退火延伸60s，共30个循环。
引物KASP-Primer-1084共检测到两种基因型，分别是CT与CC(图3)。由图3可 见，该基因型是通过检测KASP产物中两种荧光强度判断的，图中每个圆点代表一份待测 材料，检测结果原图为彩色图，考虑到专利申请时只能提交黑白图，因此申请人对图中的 各小圆圈所代表的基因型进行了标注。所有材料被分成了红色区和紫色区，其中红色圆点表示是纯合基因型CC，紫色圆点表示是杂合基因型CT；其中CT基因型有10株，CC基 因型为68株。并对基因型与TSS含量进行统计分析(图4和表2)。
表2供试种质的果实TSS含量与检测基因型
由图4和表2可见，基因型为CT的种质，TSS中位数为9.55％；基因型为CC的种质，TSS中位数为11.44％；基因型为CC的种质的TSS明显高于基因型为CT的种质；T-test 显示两者间存在极显著性差异(p＝8.87×10-6)，具有统计意义。
因此，通过KASP-Primer-1084引物进行KASP分子标记分型，育种科研人员可以从中挑选出需要的纯合基因型CC种质，快速预测杨梅果实可溶性固形物含量，并剔除12.82％的果实TSS含量较低、品质较差的CT基因型种质，明显减少育种工作量，节约成本，提 高育种效率。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发 明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限 定的范围为准。
序列表
Seq ID NO.1
正向引物1：
CAGGATATGATCTAGGAAGTTGTGC
Seq ID NO.2
正向引物2：
CAGGATATGATCTAGGAAGTTGTGT
Seq ID NO.3
反向引物：
TGGCGCAATCACCCCAATTTTAACTGGA
Seq ID NO.4
MrChr5G1084：
ATGTATGAGGAACAATGTAATGCCTTAGGTATGTACAAGAAGCCTTTTACACCTTTCTCTGATACCTATAATCCGGGGTGGCGCAATCACCCCAATTTTAACTGGAAGTCTGAAAACCAGCCGCCTGCACAACTTCCTAGATCATATCCTGCACCATATCATGCACCTTTGTCTTCTAGGAGTCCTTTAGAAGACACTTTG CATGCCTTTATTGAGGCACAGGGTAAGACTAACCAAAAGTTTGAATCGTTGATTACGCAGGTTGTT GAAGAAAACAAGGAGATAAAGAGCCAAGTGTCCAAATTGATGAGCTTCTTGAGTGTGAATGAGCGAGGTAAGTTCCCTTCTCAAGCTCAGTCCGCACCCCATGGTCAACAAATGGTGCAAGAGAATTTGAAGGATGTGAATGCCATCGTGACACAAAGTGGTAAGTCATTACACATTCCAACAACGAACGAATCA GAGGATGCAGAAAAGAATCAAGATAATAGTGATGCCTAG
Seq ID NO.5
SNP位点前50bp序列：
AGAAGACAAAGGTGCATGATATGGTGCAGGATATGATCTAGGAAGTTGTG
Seq ID NO.6
SNP位点后50bp序列：
AGGCGGCTGGTTTTCAGACTTCCAGTTAAAATTGGGGTGATTGCGCCACCC
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 用于预测杨梅果实可溶性固形物的KASP分子标记及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caggatatga tctaggaagt tgtgc 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggatatga tctaggaagt tgtgt 25
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggcgcaatc accccaattt taactgga 28
<210> 4
<211> 501
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgtatgagg aacaatgtaa tgccttaggt atgtacaaga agccttttac acctttctct 60
gatacctata atccggggtg gcgcaatcac cccaatttta actggaagtc tgaaaaccag 120
ccgcctgcac aacttcctag atcatatcct gcaccatatc atgcaccttt gtcttctagg 180
agtcctttag aagacacttt gcatgccttt attgaggcac agggtaagac taaccaaaag 240
tttgaatcgt tgattacgca ggttgttgaa gaaaacaagg agataaagag ccaagtgtcc 300
aaattgatga gcttcttgag tgtgaatgag cgaggtaagt tcccttctca agctcagtcc 360
gcaccccatg gtcaacaaat ggtgcaagag aatttgaagg atgtgaatgc catcgtgaca 420
caaagtggta agtcattaca cattccaaca acgaacgaat cagaggatgc agaaaagaat 480
caagataata gtgatgccta g 501
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agaagacaaa ggtgcatgat atggtgcagg atatgatcta ggaagttgtg 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggcggctgg ttttcagact tccagttaaa attggggtga ttgcgccacc 50

Claims (8)

1.一种用于预测杨梅果实可溶性固形物的KASP标记，其特征在于，所述KASP标记的SNP位点位于杨梅5号染色体第9,667,472位碱基，分子标记多态性为C/T；所述KASP标记的目标基因为MrChr5G1084，具有如序列表中Seq ID NO.4所示的序列；用于检测所述KASP标记的引物组合包括：
Ⅰ）两条正向引物为正向引物1和正向引物2，其中正向引物1序列如序列表中Seq IDNO.1所示，正向引物2序列如序列表中Seq ID NO.2所示；
Ⅱ）一条共用反向引物，其序列如序列表中Seq ID NO.3所示。
2.一种用于检测权利要求1所述的KASP标记的引物组合，其特征在于，包括：
Ⅰ）两条正向引物为正向引物1和正向引物2，其中正向引物1序列如序列表中Seq IDNO.1所示，正向引物2序列如序列表中Seq ID NO.2所示；
Ⅱ）一条共用反向引物，其序列如序列表中Seq ID NO.3所示。
3.如权利要求2所述的引物组合，其特征在于，正向引物1的5’端带有FAM荧光信号标签；正向引物2的5’端带有HEX荧光信号标签。
4.含有权利要求2或3所述的引物组合的试剂或试剂盒。
5.采用如权利要求2或3所述的引物组合预测杨梅果实可溶性固形物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取待测杨梅品种基因组DNA；
2）以待测杨梅品种基因组DNA为模板，利用权利要求2或3所述的引物组合进行KASP反应检测；
3）根据KASP产物荧光信号的差异，鉴别出待测杨梅的基因型；
步骤3）鉴别出的杨梅基因型包括CC和CT，其中CC的果实可溶性固形物含量高于CT。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2）中KASP反应体系为：5~10ng/μl杨梅基因组DNA 0.8μl，KASP Master Mix 0.8μl，KASP Assay Mix 0.05μl。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3）为根据KASP产物荧光信号的差异，利用IntelliQube仪器进行荧光数据读取和分析，鉴别出待测杨梅的基因型。
8.一种如权利要求1所述的KASP标记或权利要求2或3所述的引物组合或权利要求4所述的试剂或试剂盒在预测杨梅果实可溶性固形物含量或辅助育种方面的用途。
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