CN114457115A - 一种表达新型鹅星状病毒衣壳蛋白orf2的重组杆状病毒的构建方法 - Google Patents

一种表达新型鹅星状病毒衣壳蛋白orf2的重组杆状病毒的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种表达新型鹅星状病毒衣壳蛋白ORF2的重组杆状病毒的构建方法，包括以下步骤：（1）构建GAstV‑ORF2基因重组杆状病毒表达载体：（2）表达重组GAstV‑ORF2蛋白的杆状病毒包装和传代：（3）将携带有GAstV‑ORF2基因的杆状病毒质粒转染进Sf9细胞，并在27℃无CO2培养箱中培养5‑7天，每天观察细胞病变情况；当细胞病变达到70%时收集细胞上清，放入‑80℃保存；进行病毒的传代，传至第3代时，作为种毒保存并扩大培养，得到表达新型鹅星状病毒衣壳蛋白ORF2的重组杆状病毒。本发明的原理是通过扩增鹅星状病毒衣壳蛋白ORF2全长片段，构建杆状病毒重组载体，转染Sf9细胞，获得能够表达衣壳蛋白ORF2的杆状病毒。

Description

一种表达新型鹅星状病毒衣壳蛋白ORF2的重组杆状病毒的构 建方法
技术领域
本发明涉及一种表达新型鹅星状病毒衣壳蛋白ORF2的重组杆状病毒的构建 方法，属于生物技术领域。
背景技术
鹅星状病毒(Goose Astrovirus,GAstV)属于星状病毒科,禽星状病毒属。 GAstV可以导致以肝脏、脾脏和肾脏等内脏器官表面以及关节腔有大量的尿酸盐 沉积的鹅痛风症状，对雏鹅的致病力较强，致死率较高。随着我国养鹅业的迅速 发展，鹅星状病毒的爆发给养鹅业造成了严重的经济损失。但是目前尚无快速特 异检测GAstV的血清学方法商品化GAstV疫苗，为了减少GAstV给我国养鹅业 带来的损失，进一步研究建立诊断方法和生产GAstV-ORF2亚单位疫苗是很有必 要的。本发明通过构建含GAstV-ORF2蛋白的重组杆状病毒载体，并利用杆状病 毒表达***成功在昆虫细胞中表达ORF2蛋白，为新型鹅星状病毒检测方法的建 立及ORF2基因功能研究奠定了基础。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的问题，提供一种表达新型鹅星状病毒衣 壳蛋白ORF2的重组杆状病毒的构建方法。
本发明是通过以下技术方案实现：一种表达新型鹅星状病毒衣壳蛋白ORF2 的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建GAstV-ORF2基因重组杆状病毒表达载体：
设计引物分别扩增GAstV的ORF2基因与pFastBacHTA线性化载体，并连 接转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞并涂于加有Amp+的LB琼脂平板，过夜培 养，菌落PCR鉴定阳性克隆，构建重组供体pFastBacHTA-GAstV-ORF2；
(2)表达重组GAstV-ORF2蛋白的杆状病毒包装和传代：
将构建成功的pFastBacHTA-GAstV-ORF2质粒转化进DH10Bac感受态细胞， 利用蓝白斑筛选技术获得重组的阳性克隆；挑取阳性的单克隆，37℃过夜扩大培 养后，提取质粒，同时取不含目的片段的杆状病毒转移载体质粒作为阴性对照， 利用pUC/M13 Forward和pUC/M13 Reverse引物，PCR扩增验证阳性克隆为成 功携带ORF2基因的杆状病毒质粒；
(3)将携带有GAstV-ORF2基因的杆状病毒质粒转染进Sf9细胞，并在27℃ 无CO2培养箱中培养5-7天，每天观察细胞病变情况；当细胞病变达到70％时收 集细胞上清，放入-80℃保存；进行病毒的传代，传至第3代时，作为种毒保存 并扩大培养，得到表达新型鹅星状病毒衣壳蛋白ORF2的重组杆状病毒。
步骤(1)中，PCR扩增线性化pFast-Bac-HTA线性化载体的的引物为：
上游引物：TAAGAATCTAGAGCCTGCAGTCTCGAG；
下游引物：CATGTAGGCCTTTGAATTCCGCGCGCTTCG；
PCR扩增鹅星状病毒ORF2基因的的引物为：
上游引物：AAGGCCTACGTCGACGAATGGCAGACAGGGCGGTGGCC；
下游引物：
GGCCGCACTAGTTGAGCTTACTCATGTCCGCCCTTCTCAAAG。
步骤(1)中，利用一步克隆法将ORF2基因克隆到pFastBacHTA载体上， 获得pFastBacHTA-GAstV-ORF2。
步骤(2)中，将构建的pFastBacHTA-GAstV-ORF2质粒转化进DH10Bac， 获得携带ORF2基因的杆状病毒质粒。
步骤(3)中，将构建的pFastBacHTA-GAstV-ORF2质粒转化进DH10Bac， 获得携带ORF2基因的杆状病毒质粒。
本发明方法先进科学，通过本发明，本发明的目的是提供一种表达新型鹅星 状病毒衣壳蛋白ORF2的重组杆状病毒的构建方法。本发明的原理是通过扩增鹅 星状病毒衣壳蛋白ORF2全长片段，构建杆状病毒重组载体，转染Sf9细胞，获 得能够表达衣壳蛋白ORF2的杆状病毒。间接免疫荧光试验(IFA)和免疫印迹 试验(Western Blot)结果显示，Sf9细胞表达的ORF2蛋白能够与ORF2的单克 隆抗体发生特异性反应。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
(1)设计引物分别扩增鹅星状病毒ORF2基因以及pFastBacHTA线性化载 体，具体引物序列见表1，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
(2)利用一步克隆法将ORF2基因克隆到pFastBacHTA载体上；
(3)将上述步骤得到的质粒转化入DH10Bac感受态细胞中，制备重组穿梭 质粒(rBacmid-GAstV-ORF2)；
(4)将rBacmid-GAstV-ORF2转染入昆虫细胞，得到表达鹅星状病毒ORF2 基因的重组杆状病毒，表达重组蛋白。
(5)通过Western-blot以及IFA方法对病毒表达的重组蛋白进行免疫反应 性鉴定。
本发明所述的杆状病毒表达的产物与抗His蛋白的单克隆抗体存在免疫学 反应。同时因为利用的该杆状病毒载体表达水平高，且含有His标签，可以方便 后期的纯化步骤，可以制备成鹅星状病毒ORF2亚单位疫苗，也可以作为建立 GAstV-ORF2酶联免疫吸附试剂制备研发中的包被用抗原。
发明原理描述：
杆状病毒表达***是利用体外重组技术，重新包装的携带外源基因的杆状病 毒，感染Sf9细胞，使得外源基因在Sf9细胞内表达，并且分泌到细胞外面，表 达于上清中，借助标签蛋白，纯化外源蛋白。该***表达的外源蛋白具有天然的 构象，纯化后能获得高纯度和高浓度蛋白。
所以本发明选择鹅星状病毒的ORF2作为表达对象，以期获得天然构象的 ORF2蛋白，作为预防GAstV-ORF2感染的候选疫苗和检测GAstV-ORF2的抗体 的抗原物质。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益技术效果：
(1)基于昆虫杆状病毒表达***优于原核表达***的优点，表达外源蛋白 时具有完备的翻译后加工修饰能力，在昆虫细胞上表达GAstV-ORF2蛋白，其具 有天然构象，具有较好的模拟GAstV的免疫原作用；
(2)利用杆状病毒表达***制备的重组蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达量高， 易于纯化。
综上，本发明利用杆状病毒表达***构建了含ORF2基因的重组杆状病毒穿 梭载体，将其转染Sf9细胞后获得重组杆状病毒rBacmid-GastV-ORF2，通过间 接免疫荧光试验(IFA)和免疫印迹试验(Western Blot)鉴定重组蛋白ORF2 的表达。本发明将提供一种表达新型鹅星状病毒衣壳蛋白ORF2的重组杆状病毒 的构建方法，其在Sf9昆虫细胞中蛋白表达量高，易于纯化，具有良好的免疫原 性和反应原性，为新型鹅星状病毒检测方法的建立及ORF2基因功能研究奠定了 基础。
附图说明
图1为ORF2基因扩增图。
图2为引物M13F和M13R检测目的基因在杆状病毒中的重组；其中：M为 Super DNAMarker；1为rBacmid-GAstV-ORF2；2为rBacmid-HTA control；3为 rBacmid-DNA control。
图3为重组杆状病毒rBacmid-GAstV-ORF2感染Sf9细胞Western blot表达 鉴定图；其中：M为Protein Marker；1为rBacmid-GAstV-ORF2感染；2为 rBacmid-HTA control；3为Sf9 control。
图4为重组杆状病毒rBacmid-GAstV-ORF2感染Sf9细胞间接免疫荧光检 测；A为rBacmid-DNA control；B为rBacmid-HTA control；C为 rBacmid-GAstV-ORF2。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。
1材料
1.1菌种、质粒、细胞
GAstV-GD毒株为本实验室分离鉴定。DH5α感受态细胞、DH10Bac感受态 细胞、以及Sf9昆虫细胞均由本实验室保存，pFastBacHTA质粒购自Invitrogen 公司。
1.2主要试剂
抗ORF2蛋白的单克隆抗体由实验室制备保存；RNA提取试剂盒、RNA反 转录试剂、Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶、Gene 1Kb Super Marker、2×Taq Master Mix以及ExnaseTMII连接酶购自南京诺唯赞公司；质粒小提试剂盒购自 AxyPrep公司；凝胶回收DNA试剂盒购自QIAGEN公司；LipofectamineTM 3000 转染试剂、FBS胎牛血清购自Gibco公司；羊抗鼠FITC标记的IgG购自SIGMA 公司；Western-blot曝光液购自南京菲尔特生物技术公司；庆大霉素(GEN)、卡 那霉素(Kan)、四环素(TET)、X-gal购自上海生工生物公司。
1.3主要培养基
LB液体培养基、含Amp的LB液体培养基、含Amp的LB固体培养基、 SOC培养基、选择性LB液体培养基、选择性LB固体培养基由本实验室自行配 制。SF900培养基购自Gbico公司。
1.4引物的设计和合成
根据GAstV-ORF2序列登录号碱基序列设计用于扩增出含pFastBacHTA线 性化载体与GAstV-ORF2鹅星状病毒ORF2蛋白基因片段的引物。由苏州金唯智 生物科技有限公司合成。具体引物序列见表1：
表1.PCR扩增线性化pFast-Bac-HTA及鹅星状病毒ORF2基因引物
Figure BDA0003537459140000051
2.方法
2.1目的基因的扩增
首先按照RNA提取试剂盒说明书步骤提取鹅星状病毒RNA,并溶于30μL无 RNA酶的超纯水中；将制备好的RNA按照RNA反转录说明书进行反转录，获 得的cDNA置-20℃备用。取2μL鹅星状病毒cDNA作为模板进行衣壳蛋白基因 ORF2的PCR扩增，采用50μL的PCR体系。反应条件为：灭菌超纯水31μL， 5×Buffer10μL，dNTP Mix 2μL，引物各2μL，高保真酶1μL，cDNA模板2μL。 反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54.3℃退火30s，72℃延伸1.5min， 共32个循环；72℃延伸7min。同时以pFastBacHTA载体质粒为模板，PCR扩 增线性化的pFastBacHTA载体。PCR反应体系、条件与程序与PCR扩增ORF2 基因一致。PCR产物经1％琼脂糖凝胶进行电泳，电压为90V，电泳时间为60min； 如图1所示，在2000bp左右出现单一条带，证明获得所需的目的基因片段。
2.2重组供体质粒pFastBacHTA-GAstV-ORF2的构建克隆载体与鉴定
将步骤2.1扩增得到的目的片段与pFastBacHTA线性化载体进行胶回收并于 室温连接30min，随后将连接产物转化至DH5α感受态细胞并进行涂板，倒置平 板于37℃的恒温培养箱培养14-16h。挑取平板上的单菌落进行PCR鉴定，PCR 为阳性即得到了克隆载体pFastBacHTA-GAstV-ORF2，将验证为阳性的菌液提取 质粒并送擎科生物科技有限公司测序验证正确。
2.3重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-GAstV-ORF2的构建与鉴定
将验证结果正确的重组供体质粒转化入DH10Bac感受态细胞轻轻吹打混匀， 冰浴30min后加入SOC培养基，于37℃，225rpm震荡培养4h，用SOC培养基 依次将培养物稀释成三个浓度梯度，分别取200μL均匀涂布于含卡那霉素(50 μg/mL)、四环素(10μg/mL)、庆大霉素(7μg/mL)、IPTG(100mM)和Bluo-gal 的LA-Bac平板上，37℃培养72h，直至菌落完全出现。进行蓝白斑筛选，挑选 阳性白色克隆在新鲜LA-Bac选择性固体培养基上进行纯化，37℃培养48h-72h； 连续纯化3代，直到不再出现蓝色菌落，挑取单菌落，进行菌落PCR鉴定，获 得鉴定正确的阳性菌。采用改良碱裂解法提取得到的阳性菌的重组质粒，使用 M13F/M13R进行PCR鉴定，结果如图2所示，扩增目的片段大小约5133bp， 证明目的基因已转座成功，重组质粒rBacmid-GAstV-ORF2构建成功。
2.4重组质粒在昆虫细胞中的表达
将SF900培养基、重组杆状质粒、P3000以及SF900培养基、重组杆状质粒、LipofectamineTM 3000分别混合孵育5min，随后将两组混合在一起，轻轻吹打 混匀，室温静置30min；将混合物加入长至80％-90％的单层细胞中并于27℃培 养箱培养7d；收集培养上清液即为P0代重组杆状病毒rBacmid-GAstV-ORF2， 将其作为种毒，传至第3代，收集培养上清液及细胞沉淀，对细胞沉淀进行 Western-Blot分析其表达产物，出现特异性条带时，将对应上清液分装冻存于-80℃ 作为种毒。
2.5表达产物的鉴定
1)Western Blot鉴定
细胞经10000rpm/min离心5min，收集细胞沉淀并加入600μL细胞裂解液 和6μL蛋白酶抑制剂，混匀后立即冰浴30min。取60μL加入4×蛋白Loading Buffer 20μL混匀后放置于恒温金属浴98℃煮10min至无黏稠状，随即将样品经 SDS-PAGE电泳分离并用转印仪将蛋白转到NC硝酸纤维素膜上进行Western Blot分析。转印后的NC膜用5％脱脂乳室温封闭2h，用1：1000稀释的抗ORF2 蛋白单抗做为一抗，4℃孵育过夜，次日用PBST洗膜3次，5min/次；随后室 温孵育1:10000稀释的商品化的羊抗鼠HRP标记的二抗，1h，用PBST洗膜3 次，5min/次；最后用ECL发光液显色后，于化学发光成像***中拍照。如图3 所示，在转染了rBacmid-GAstV-ORF2的Sf9细胞裂解物在蛋白质分子量在 78KDa处出现了ORF2特异性蛋白条带，而在转染pFAST-Bac载体的对照细胞 中未出现特异性条带。
2)IFA鉴定
在48孔板上，将转染第3代重组病毒且维持培养2天的细胞用预冷的丙酮： 乙醇(3：2)固定液固定6min后，用PBS清洗一遍风干至无固定液气味后，用 抗ORF2蛋白单抗为一抗，1:400稀释，每孔200μL，37℃作用45min；弃去一 抗，用PBS清洗3遍后加入1:150稀释的羊抗鼠FITC标记的二抗200μL，37℃ 作用45min，弃去二抗，用PBS清洗3遍后，置于倒置荧光显微镜观察并拍照。 结果如图4所示，在转染了重组rBacmid-GAstV-ORF2的Sf9细胞中均可见特异 性的亮绿色荧光，而转染rBacmid-HTA的野生型杆状病毒的对照细胞中未见特 异性的亮绿色荧光。
Western blot以及IFA均证明该重组病毒能够成功表达重组蛋白。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种表达新型鹅星状病毒衣壳蛋白ORF2的重组杆状病毒的构建方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taagaatcta gagcctgcag tctcgag 27
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catgtaggcc tttgaattcc gcgcgcttcg 30
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaggcctacg tcgacgaatg gcagacaggg cggtggcc 38
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggccgcacta gttgagctta ctcatgtccg cccttctcaa ag 42

Claims (5)

1.一种表达新型鹅星状病毒衣壳蛋白ORF2的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）构建GAstV-ORF2基因重组杆状病毒表达载体：
设计引物分别扩增GAstV的ORF2基因与pFastBacHTA线性化载体，并连接转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞并涂于加有Amp+的LB琼脂平板，过夜培养，菌落PCR鉴定阳性克隆，构建重组供体pFastBacHTA- GAstV-ORF2；
（2）表达重组GAstV-ORF2蛋白的杆状病毒包装和传代：
将构建成功的pFastBacHTA- GAstV-ORF2质粒转化进DH10Bac感受态细胞，利用蓝白斑筛选技术获得重组的阳性克隆；挑取阳性的单克隆，37℃过夜扩大培养后，提取质粒，同时取不含目的片段的杆状病毒转移载体质粒作为阴性对照，利用pUC/M13 Forward和pUC/M13Reverse引物，PCR扩增验证阳性克隆为成功携带ORF2基因的杆状病毒质粒；
（3）将携带有GAstV-ORF2基因的杆状病毒质粒转染进Sf9细胞，并在27℃无CO2培养箱中培养5-7天，每天观察细胞病变情况；当细胞病变达到70%时收集细胞上清，放入-80℃保存；进行病毒的传代，传至第3代时，作为种毒保存并扩大培养，得到表达新型鹅星状病毒衣壳蛋白ORF2的重组杆状病毒。
2.根据权利要求1所述的一种表达新型鹅星状病毒衣壳蛋白ORF2的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，PCR扩增线性化pFast-Bac-HTA线性化载体的的引物为：
上游引物：TAAGAATCTAGAGCCTGCAGTCTCGAG；
下游引物：CATGTAGGCCTTTGAATTCCGCGCGCTTCG；
PCR扩增鹅星状病毒ORF2基因的的引物为：
上游引物：AAGGCCTACGTCGACGAATGGCAGACAGGGCGGTGGCC；
下游引物：
GGCCGCACTAGTTGAGCTTACTCATGTCCGCCCTTCTCAAAG。
3. 根据权利要求1所述的一种表达新型鹅星状病毒衣壳蛋白ORF2的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，利用一步克隆法将ORF2基因克隆到pFastBacHTA载体上，获得pFastBacHTA- GAstV-ORF2。
4. 根据权利要求1所述的一种表达新型鹅星状病毒衣壳蛋白ORF2的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，将构建的pFastBacHTA- GAstV-ORF2质粒转化进DH10Bac，获得携带ORF2基因的杆状病毒质粒。
5.根据权利要求1所述的一种表达新型鹅星状病毒衣壳蛋白ORF2的重组杆状病毒的构建方法，其特征在于，步骤（3）中，将携带有GAstV-ORF2基因的杆状病毒质粒转染进Sf9细胞，获得表达新型鹅星状病毒衣壳蛋白ORF2的重组杆状病毒。
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