CN114452386B - 金铜双金属纳米酶复合材料的制备方法和应用 - Google Patents

金铜双金属纳米酶复合材料的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于纳米材料技术领域，公开了金铜双金属纳米酶复合材料的制备方法和应用。本发明在溶菌酶纤维溶液，加入氯金酸和氯化铜混合溶液，静置使之充分混合后，加入新鲜配置的硼氢化钠溶液作为还原剂，即得到金铜双金属纳米酶复合材料。所述金铜双金属纳米酶复合材料中，溶菌酶纤维大小均匀，小尺寸的金铜纳米颗粒均匀的高密度分布在溶菌酶纤维表面，在近红外光辐射下，能够显著增强类过氧化物酶催化活性，达到高效杀菌的目的。

Description

金铜双金属纳米酶复合材料的制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，涉及一种金铜双金属纳米酶复合材料及其催化/光热抗菌的应用，特指以金铜双金属复合纳米颗粒(Au@Cu)为催化剂，在近红外光(NIR)照射下，通过增强过氧化物酶活性提高催化过氧化氢效率，从而达到高效抗菌的方法。
背景技术
纳米酶是一种具有类似酶活性的纳米材料，作为天然酶的替代品，因其比天然酶明显的优点引起人们极大的兴趣，如合成简单、催化活性可调、在恶劣环境下稳定性好等。纳米材料功能的多样性赋予了纳米酶的多种功能，使得其在生物医学领域得到广泛的研究，主要应用于生物分子检测、生物传感器、抗菌、免疫分析、癌症诊断和治疗以及环境监测等。通常，过氧化物酶模拟物，可以特异性地催化过氧化氢转化为剧毒的活性氧(ROS)例如羟基自由基(·OH)，攻击弱酸性感染部位的微生物的细胞膜。以纳米酶为核心的纳米生物催化***具有多种氧化还原酶类活性,能够根据pH等条件调节ROS的水平,因此基于这种原理可以快速杀死多种超级耐药病菌并清除生物膜。
与天然酶相似，纳米酶的活性可以通过多种因素进行调节，如pH、温度、周围环境和金属离子。此外，纳米酶的活性也可以通过改变其理化性质和结构来调节，典型的纳米尺度因素，如大小、形貌、表面修饰和价态、活性中心的组成和构型等显著影响着纳米酶的活性。因此，研究开发一种新的纳米酶材料，使其既具有较好的细菌结合能力，又具有增强的催化活性，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中金基纳米酶催化效率不高、与细菌相互作用弱的缺陷，提供一种以溶菌酶为模板的金铜纳米颗粒复合材料并将其用于催化抗菌；本发明所合成的金铜纳米颗粒复合材料用量少，光热增强催化效率高，与细菌相互作用强，可高效杀死细菌。本发明通过溶菌酶纤维作为模板调控了金铜纳米颗粒的尺寸和分布，有效提高了催化效率，具有与细菌很好的相互作用，能够达到高效杀菌的目的。
本发明的技术方案如下：
本发明首先提供一种生物大分子溶菌酶纤维(LNFs)作为模板，同时可以调控金属颗粒在纤维上的高密度分布，得到较小尺寸的金属纳米颗粒，双金属纳米颗粒可以均匀修饰在溶菌酶纤维表面。具体制备方法如下：
取合成好的溶菌酶纤维溶液，加入一定比例的氯金酸和氯化铜混合溶液，静置30min以上使之充分混合后，加入新鲜配置的硼氢化钠溶液作为还原剂，即得到金铜双金属纳米酶复合材料，即LNFs@Au/Cu复合材料。
其中，溶菌酶纤维溶液，氯金酸和氯化铜混合溶液和硼氢化钠溶液体积比为1：1：1，其中，所述溶菌酶纤维溶液的浓度为5mg/mL，氯金酸和氯化铜混合溶液中金属离子的总浓度为0.15mM，硼氢化钠溶液的浓度为0.01mM。
进一步的，试验所述的溶菌酶纤维制备方法如下：
配置浓度为1M的盐酸溶液10mL，加入0.015g甘氨酸，制备得A溶液；配置浓度为1mM的冰乙酸溶液1mL，加入氯化胆碱0.1396g，制得B溶液；取0.01g溶菌酶，加入4750μLA溶液和250μL B溶液溶解，在油浴锅中70℃搅拌反应5h，反应完成后12000rpm离心超纯水洗涤两次，每次20min。
本发明制备的金铜双金属纳米酶复合材料中，溶菌酶纤维大小均匀，小尺寸的金铜纳米颗粒均匀的高密度分布在溶菌酶纤维表面，在近红外光辐射下，能够显著增强类过氧化物酶催化活性，达到高效杀菌的目的。
本发明还提供一种金铜双金属纳米酶复合材料(LNFs@Au/Cu)催化/光热杀菌的方法，按照下述步骤进行：
(1)LNFs@Au/Cu复合材料溶剂用pH＝5.5，0.1M的醋酸钠-醋酸缓冲溶液置换；
(2)将细菌悬浮液置于步骤(1)处理后的LNFs@Au/Cu复合材料中，加入一定浓度过氧化氢静置一会后，在近红外光照射下，反应一段时间，用磷酸盐缓冲液稀释，取稀释后的悬浮液放到Luria Bertani固体培养基，在37℃培养12h，计算菌落数。
其中，所述的细菌悬浮液与LNFs@Au/Cu复合材料的体积比为1：9；
进一步的，LNFs@Au/Cu复合材料的浓度为70-80μg/ml，细菌悬浮液的浓度为108个/mL。
加入过氧化氢后，过氧化氢的终浓度为200μM。
所述的近红外光照射的条件为：功率为2W，照射10min，近红外光波长为808nm；
所述的稀释为稀释10000倍。
所述细菌为绿脓杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌中的一种。
与现有技术相比较，本发明所具备的有益效果如下：
目前，使用抗生素是常用的杀菌方法，但容易引起细菌耐药。本发明所制备的金铜双金属纳米酶复合材料，金铜纳米颗粒尺寸小且均匀修饰在溶菌酶纤维表面(如附图1所示)，提高了金属活性中心的分布密度，从而增强催化效果。同时，溶菌酶纤维不仅作为一种生物模板，还能够有效粘附细菌，与细菌有强相互作用，能结合在细菌表面(如附图2所示)，LNFs@Au/Cu纳米酶的存在，促进了过氧化氢的类芬顿反应，提高了羟基自由基的生成效率，可以有效杀菌。在近红外光照射下，不仅可以利用光热效应，同时光热温度能够提高催化活性，使用较低浓度的过氧化氢达到较好的杀菌效果(如附图3所示)，不会引起细菌耐药，是一种高效、绿色抗菌的新方法。
附图说明
图1为LNFs@Au/Cu复合材料的TEM图。
图2为LNFs@Au/Cu复合材料与金黄色葡萄球菌作用的TEM图。
图3为不同杀菌方式的LNFs@Au/Cu复合材料杀菌效果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明技术作进一步说明。
实施例1:
溶菌酶纤维的制备：
配置浓度为1M的盐酸溶液10mL，加入0.015g甘氨酸，制备得A溶液。配置浓度为1mM的冰乙酸溶液1mL，加入氯化胆碱0.1396g，制得B溶液。取0.01g溶菌酶，加入4750μLA溶液和250μL B溶液溶解。在油浴锅中70℃搅拌反应5h。反应完成后12000rpm离心超纯水洗涤两次，每次20min。得到最终溶菌酶纤维水溶液8ml。
LNFs@Au/Cu纳米酶复合材料的制备：
取800μL溶菌酶纤维溶液，加入氯金酸和氯化铜溶液共800μL，反应30min，加入新鲜配置的硼氢化钠溶液800μL，迅速还原得到金属纳米颗粒复合材料。
其中，所述溶菌酶纤维的浓度为5mg/mL，金属盐溶液总浓度为0.15mM，硼氢化钠溶液浓度为0.01mM。
LNFs@Au/Cu纳米酶复合材料催化/光热协同杀菌：
将20μL金黄色葡萄球菌悬浮液置于180μL浓度为80μg mL–1的LNFs@Au/Cu中，体系中存在200μM过氧化氢，静置10min，在功率为2W的波长为808nm的近红外光照射下，照射10min后，在继续作用10min，最后用磷酸盐缓冲液稀释10000倍，取100μL稀释后的悬浮液放到Luria Bertani固体培养基，在37℃培养12h，计算菌落数。所得细菌存活率见表1。
实施例2:
同实施例1，仅改变金铜纳米酶复合材料制备步骤中的金铜盐溶液比例，进行LNFs@Au/Cu光热杀菌，所得的细菌存活率见表1。结果表明，与未修饰的金纳米颗粒材料相比，随着铜加入量的增加，LNFs@Au/Cu杀菌效率增加，但进一步增加铜含量，其杀菌效率降低，可归因于较高铜量的加入促使LNFs@Au/Cu金属纳米颗粒尺寸变大，近红外吸收降低，使得光热转换效率降低。
表1不同铜加入量对LNFs@Au/Cu光热杀菌影响
铜加入量(Au与Cu摩尔比) 细菌存活率(％)
1：0 65.13
4：1 28.24
3：1 27.5
2：1 56.21
1：1 76.3
0：1 100
实施例3:
同实施例1，仅改变金铜纳米酶复合材料制备步骤中的金铜盐溶液比例，进行LNFs@Au/Cu催化过氧化氢杀菌，所得的细菌存活率见表2。由此可见，随着铜加入量的增加，LNFs@Au/Cu催化杀菌效率增加，但进一步增加铜含量，其杀菌效率降低，可归因于较高铜量的加入促使LNFs@Au/Cu金属纳米颗粒尺寸变大，催化活性降低。
表2不同铜加入量对LNFs@Au/Cu催化杀菌影响
铜加入量(Au与Cu摩尔比) 细菌存活率(％)
1：0 87.26
4：1 68.13
3：1 61.34
2：1 73.46
1：1 91.74
0：1 100
实施例4:
同实施例1，仅改变LNFs@Au/Cu纳米酶复合材料光热杀菌步骤中近红外光辐射功率，所得的细菌存活率见表3。由此可见，随着近红外光辐射功率的升高，光热杀菌效率逐渐升高，可归因于，较高的辐射功率有利于光热剂产生较高的热。
表3不同近红外光辐射功率对光热杀菌的影响
实施例5:
同实施例1，仅改变LNFs@Au/Cu纳米酶复合材料催化杀菌步骤中过氧化氢浓度，所得的细菌存活率见表4。由此可见，较高的过氧化氢浓度可以提高杀菌效率。
表4不同过氧化氢浓度对催化杀菌的影响
H2O2浓度(μM) 细菌存活率(％)
50 89.12
100 64.05
200 51.75
300 38.48
400 22.41
实施例6:
同实施例1，在最终反应条件下，LNFs@Au/Cu浓度为80μg/ml，过氧化氢浓度为200μM，通过催化、光热协同杀菌方法进行杀菌，所得细菌存活率见表5。由此可见，光热对催化杀菌有着增强作用。
表5不同杀菌类型的杀菌效果
杀菌类型 细菌存活率(％)
光热杀菌 27.8
催化杀菌 60.36
催化/光热协同杀菌 0
实施例7:
同实施例1，仅改变LNFs@Au/Cu纳米酶复合材料协同杀菌步骤中细菌分别为绿脓杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌，所得的细菌存活率见表6。由此可见，在同一条件下，LNFs@CuS均能杀死多种细菌。
细菌类型 细菌存活率(％)
金黄色葡萄球菌 0
绿脓杆菌 0
大肠杆菌 0
沙门氏菌 0
对比实施例1、2和3的结果，改变金铜纳米颗粒的制备参数，对光热和催化杀菌效率具有重要影响。
图1为LNFs@Au/Cu纳米酶的TEM图，说明Au/Cu纳米颗粒大小较为均一，并且比较均匀的负载在溶菌酶纤维上。
图2为LNFs@Au/Cu纳米酶与金黄色葡萄球菌作用的TEM图，说明LNFs@Au/Cu与细菌有良好的相互作用。
图3为LNFs@CuS纳米酶利用光热和催化不同机理进行杀菌的效果，说明光热对催化有一定的增强作用，二者协同，可以高效杀死细菌。

Claims (8)

1.金铜双金属纳米酶复合材料的制备方法，其特征在于，步骤为：
取溶菌酶纤维溶液，加入氯金酸和氯化铜混合溶液，静置使之充分混合后，加入新鲜配置的硼氢化钠溶液作为还原剂，即得到金铜双金属纳米酶复合材料，即LNFs@Au/Cu复合材料；
所述溶菌酶纤维溶液，氯金酸和氯化铜混合溶液和硼氢化钠溶液体积比为1：1：1，
其中，所述溶菌酶纤维溶液的浓度为5mg/mL，
氯金酸和氯化铜混合溶液中金属离子的总浓度为0.15mM，硼氢化钠溶液的浓度为0.01mM。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，静置时间为30min以上。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，溶菌酶纤维的制备方法为：
配置浓度为1M的盐酸溶液10mL，加入0.015g甘氨酸，制备得A溶液；配置浓度为1mM的冰乙酸溶液1mL，加入氯化胆碱0.1396g，制得B溶液；取0.01g溶菌酶，加入4750μL A溶液和250μL B溶液溶解，在油浴锅中70℃搅拌反应5h，反应完成后12000 rpm离心超纯水洗涤两次，每次20min。
4.如权利要求1~3任一项所述制备方法制得的金铜双金属纳米酶复合材料，其特征在于，所述金铜双金属纳米酶复合材料中，溶菌酶纤维大小均匀，金铜纳米颗粒均匀分布在溶菌酶纤维表面。
5.将权利要求4所述的金铜双金属纳米酶复合材料用于制备催化/光热杀菌剂的用途，其特征在于，具体步骤为：
（1）LNFs@Au/Cu复合材料溶剂用pH=5.5，0.1M的醋酸钠-醋酸缓冲溶液置换；
（2）将细菌悬浮液置于步骤（1）处理后的LNFs@Au/Cu复合材料中，加入过氧化氢静置一会后，在近红外光照射下，反应一段时间，用磷酸盐缓冲液稀释，取稀释后的悬浮液放到Luria Bertani固体培养基，在37 ℃培养12 h，计算菌落数。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，步骤（2）中，所述的细菌悬浮液与LNFs@Au/Cu复合材料的体积比为1：9；其中，LNFs@Au/Cu复合材料的浓度为70-80μg/ml，细菌悬浮液的浓度为108个/mL。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，步骤（2）中，加入过氧化氢后，过氧化氢的终浓度为200μM。
8.如权利要求5所述的用途，其特征在于，步骤（2）中，
所述的近红外光照射的条件为：功率为2W，照射10 min，近红外光波长为808 nm；
所述的稀释为稀释10000倍；
所述细菌为绿脓杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌中的一种。
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