CN114450409A - 用于通过基因编辑提高***产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于通过基因组编辑方法提高***植物中花产量的方法。更具体地，该方法包括以下步骤：(a)选择所述***物种的开花途径中涉及的基因；(b)合成或设计对应于沿着***基因组的靶向切割基因座的gRNA表达盒；(c)转化所述***植物细胞以将遗传物质***其中；(d)培养所述***植物细胞；(e)选择在编辑靶区域表达所需突变的所述***细胞，以及(f)从所述转化的植物细胞、植物细胞核或植物组织再生植物。
Description
序列表
本申请包含以ASCII txt.格式以电子形式提交的序列表，其通过引用整体并入本文。所述ASCII副本被命名为序列表2272-C-01-PCT，并且大小为457KB。
技术领域
本发明总体上涉及改善植物性状的领域。更具体地，本发明涉及使用CRISPR/Cas基因组编辑方法提高***植物的花产量。
背景技术
在跟随全球范围内广泛传播的合法化趋势的活动中，***市场正享有空前的激增。据估计，到2025年，仅美国市场将达到至少300亿美元的价值，每年罕见的增长速度达30％。这导致不仅对***产品的总体需求增加，而且特别是对具有非常特定性状的产品的需求增加，无论是药用还是娱乐用途。由于多种不同的原因，那种需求有时会遇到供应不足。为了允许盈利，种植者必须离开环境受控制的室内种植设施，走出来到温室或田地去。在温室和田地条件下，植物性能例如在生长、发育、生物量积累和产量方面取决于植物对多种环境条件、变化和压力的耐受性和适应环境能力。因此，这种从室内到室外的转变对种植者造成了若干障碍，并且这种核心难关是实现持续的高产量。
世界各地的发明家和科学家已经提出了许多途径来尝试提高***产量，包括光声能量(US20180127327A1)、光(强度、波长、方向性；US20160184237A1，CA2958257C)或具有转化的特定性状的转基因植物(US8344205B2)。然而，***栽培界直到最近才开始采用硬科学，并且从传统的栽培方法到现代的以科学为基础的技术的逐步转变仍处于其初期。在那方面最严重的科学缺陷是缺乏充分发展和健全的普通***(Cannabis sativa)遗传学，这一缺点阻碍了遗传增强的种子的可得性和使用。如果不迅速采用遗传工具，***种植者不可能既能满足需求又能赢利，因为商业竞争大大削减了每个种植者的收入，而传统的栽培措施无法提高产量以弥补所述损失。
更进一步，通过传统方法生产的***产品的不稳定性质阻止使用者享受稳定和一致的产品，会符合不同消费者的特殊需求的产品。然而，由于***的法律地位仍不稳固，因此大型农业公司尚未加入***行列。
由于几十年来***栽培一直是非法的，并且仅在最近才部分合法化，因此它仍然主要依赖于传统的园艺技术、方法和传统。这些种植实践严重缺乏科学严谨性，并不适合过渡到大规模的***生产。表征这种不严格的科学方法的最不能忍受的缺漏是缺乏遗传数据和工具。更进一步，科学家和发明家到目前为止一直将他们的注意力集中在提高***素的产量上(WO2018035450A1)，而不是从整体上改良普通***植物的生理参数。作为告诫，总之人们必须承认在提高作物产量的背景下，已经在转基因前沿领域做出了尝试的事实。然而，考虑到***使用者比其他人对其产品的GMO法律地位更厌倦这一事实，以那种方式将外源DNA******植物中可能会使相当大一部分潜在市场对这种转基因产品望而却步。此外，尽管对***素的重视是可预测和可理解的，但忽略整个植物生理学是该行业满足日益增长的市场需求的能力的主要障碍。
鉴于上述情况，本发明的目的是提供一种有效且持续地提高无转基因***植物的产量的新方法。该方法基于在特定核酸序列对***植物基因组进行基因编辑，其产生一组改善开花过程的所需性状。
这里的挑战是使用CRISPR/Cas9体系有效诱导对***植物的开花过程至关重要的精确和可预测的靶点突变。
基因编辑的显著附加值是它没有资格作为基因修饰，所以所得的无转基因植物因此不会被认为是GMO植物/产品，至少在美国是如此。虽然基因修饰的确切和可操作的定义受到激烈地争论和争辩，但普遍同意和接受的是，基因修饰是指以通过进化不会自然产生的方式改变的植物和动物。最清楚和最明显的实例是转基因生物，其基因组现在掺入了来自另一物种的基因，该基因被***以赋予该生物新的性状，如抗虫性。就CRISPR而言，情况则不同，因为它不一定整合到植物基因组中，而是用作允许直接对生物体的遗传密码进行突变的基因编辑工具。因此，长期以来一直需要提供产量得以提高的***品系，而这一需求尚未得到满足。
发明内容
因此，本发明的一个目的是公开一种用于提高选自由普通***(C.sativa)、印度***(C.indica)和莠草***(C.ruderalis)组成的组的***植物产量的方法，其包括以下步骤；
a)选择所述***物种的开花途径中涉及的基因；
b)合成或设计对应于沿着***基因组的靶向切割基因座的gRNA(向导RNA)表达盒；
c)转化所述***植物细胞以将遗传物质***其中；
d)培养所述***植物细胞；
e)选择在编辑靶区域中表达所需突变的所述***细胞，以及
f)从所述转化的植物细胞、植物细胞核或植物组织再生植物。
本发明的另一个目的是公开如上定义的方法，其中所述***物种的开花途径中涉及的基因选自由CsSFT1、CsSFT2、CsSFT3、CsSPGB、CsMultiflora、CsJumonji、CsBif1和CsBif2组成的组；并详见标题为“序列表2272-C-01-PCT”的文件。
本发明的另一个目的是公开如上定义的方法，其中所述gRNA及其相应的前间区序列邻近基序(PAM)选自由CsSFT1、CsSFT2、CsSFT3、CsSPGB、CsMultiflora、CsJumonji、CsBif1和CsBif2组成的组，并详见标题为“序列表2272-C-01-PCT”的文件。
本发明的另一个目的是公开如上定义的方法，其中所述靶结构域(domain)序列选自由以下各项组成的组：(1)编码CsSFT1多肽的核酸序列，(2)包含CsSFT2序列的核酸序列，(3)编码CsSFT3多肽的核酸序列，(4)编码CsSPGB多肽的核酸序列，(5)编码CsMultiflora多肽的核酸序列，(6)编码CsJumonji多肽的核酸序列，(7)编码CsBif1多肽的核酸序列，(8)编码CsBif2多肽的核酸序列，(9)与CsSFT1核酸序列的至少200个相接的核苷酸具有至少80％序列同一性的核酸序列，(10)与CsSFT2核酸序列的至少200个相接的核苷酸具有至少80％序列同一性的核酸序列，(11)与CsSFT3核酸序列的至少200个相接的核苷酸具有至少80％序列同一性的核酸序列，(12)与CsSPGB核酸序列的至少200个相接的核苷酸具有至少80％序列同一性的核酸序列，(13)与CsMultiflora核酸序列的至少200个相接的核苷酸具有至少80％序列同一性的核酸序列，(14)与CsJumonji核酸序列的至少200个相接的核苷酸具有至少80％序列同一性的核酸序列，(15)与CsBif1核酸序列的至少200个相接的核苷酸具有至少80％序列同一性的核酸序列，及(16)与CsBif2核酸序列的至少200个相接的核苷酸具有至少80％序列同一性的核酸序列。
本发明的另一个目的是公开如上定义的方法，其中所述转化使用农杆菌(Agrobacterium)进行以递送表达盒，该表达盒由以下各项组成：a)选择标记，b)编码一个或多个gRNA分子的核苷酸序列，该gRNA分子包含与选自由CsSFT1、CsSFT2、CsSFT3、CsSPGB、CsMultiflora、CsJumonji、CsBif1和CsBif2组成的基因组的靶结构域序列互补的DNA序列，以及c)编码来自但不限于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Cas分子的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是公开如上定义的方法，其中所述方法包括施用(administering)核酸组合物，该核酸组合物包含：a)编码该gRNA分子的第一核苷酸序列和b)编码该Cas分子的第二核苷酸序列。
本发明的另一目的是公开如上定义的方法，其中所述CRISPR/Cas体系通过植物病毒递送至细胞。
本发明的另一目的是公开如上定义的方法，其中所述Cas蛋白选自包含但不限于Cpf1、Cas9、Cas12、Cas13、Cas14、CasX或CasY的组。
本发明的另一目的是公开如上定义的方法，其中提高***产量包括以下步骤：
(a)向***植物或其细胞中引入(i)至少一种包含至少一种核定位信号的RNA引导的核酸内切酶或编码至少一种包含至少一种核定位信号的RNA引导的核酸内切酶的核酸，(ii)至少一种向导RNA或编码至少一种向导RNA的DNA，以及任选地(iii)至少一种供体多核苷酸；以及
(b)培养***植物或其细胞，使得每个向导RNA将RNA引导的核酸内切酶导向染色体序列中的靶向位点，其中所述RNA引导的核酸内切酶在靶向位点引入双链断裂，并且所述双链断裂通过DNA修复过程修复，使得所述染色体序列被修饰，其中所述靶向位点位于CsSFT1、CsSFT2、CsSFT3、CsSPGB、CsMultiflora、CsJumonji、CsBif1和CsBif2基因中，并且所述染色体修饰打断或干扰CsSFT1、CsSFT2、CsSFT3、CsSPGB、CsMultiflora、CsJumonji、CsBif1和CsBif2基因的转录和/或翻译。
本发明的另一个目的是公开如上定义的方法，其中所述RNA引导的核酸内切酶衍生自成簇的规则散布的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)体系。
本发明的另一个目的是公开如上所定义的方法，其中CsSFT1、CsSFT2、CsSFT3、CsSPGB、CsMultiflora、CsJumonji、CsBif1和CsBif2的引入不***外源遗传物质并产生非天然存在的***植物或其细胞。
本发明的另一目的是公开如上定义的方法，其中提高***产量包括；
(a)在***植物或其细胞中的DNA序列内鉴定CsSFT1、CsSFT2、CsSFT3、CsSPGB、CsMultiflora、CsJumonji、CsBif1和CsBif2的至少一个基因座；
(b)在CsSFT1、CsSFT2、CsSFT3、CsSPGB、CsMultiflora、CsJumonji、CsBif1或CsBif2的至少一个基因座内鉴定至少一种定制核酸内切酶识别序列；
(c)向所述***植物或其细胞中引入至少第一定制核酸内切酶，其中所述***植物或其细胞在CsSFT1、CsSFT2、CsSFT3、CsSPGB、CsMultiflora、CsJumonji、CsBif1或CsBif2的基因座中或其附近包含定制核酸内切酶的识别序列，并且所述定制核酸内切酶瞬时或稳定表达；
(d)测定所述***植物或其细胞在构成或侧接(flanking)CsSFT1、CsSFT2、CsSFT3、CsSPGB、CsMultiflora、CsJumonji、CsBif1或CsBif2基因座的DNA中的定制核酸内切酶介导的修饰；以及
(e)鉴定***植物、其细胞或其后代细胞在CsSFT1、CsSFT2、CsSFT3、CsSPGB、CsMultiflora、CsJumonji、CsBif1或CsBif2的基因座中包含修饰。
本发明的另一个目的是公开如上定义的方法，其中提高所述***产量选自由以下各项组成的组：增加花的数目、增加花的大小、增加花的重量、增加芽的数目、增加芽的大小、增加芽的重量及其任何组合。
本发明的另一个目的是公开一种用于提高选自由普通***、印度***和莠草***组成的组的***植物产量的方法，其包括以下步骤；
a)选择所述***物种的开花途径中涉及的基因；
b)提取所述***植物的细胞；
c)编辑所述细胞的开花途径中涉及的所述基因；
d)培养所述细胞；
e)选择在编辑靶区域中表达所需突变的所述细胞，以及
f)从所述细胞、植物细胞核或植物组织再生***植物。
本发明的另一个目的是公开如上定义的方法，其中所述编辑通过选自由以下各项组成的组的方式来执行：CRISPR/Cas，使用锌指核酸酶切割所述细胞的基因组，使用大范围核酸酶(归巢核酸内切酶)切割所述细胞的基因组，使用转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)切割所述细胞的基因组，及其任何组合。
因此，本发明的另一个目的是公开一种通过上述方法生产的***植物。
因此，本发明的另一个目的是公开一种上述植物的***种子。
附图说明
附图被包括以提供对本发明的进一步理解，并且并入本说明书且构成本说明书的一部分，图示了本发明的实施方案，并且与说明部分一起用于解释本发明的原理。
图1描述了使用GUS报道基因的各种***组织的转化过程；
图2描述了转化后两周通过PCR筛选Cas9存在的转化叶组织；以及
图3描述了通过Cas9+gRNA(核糖核蛋白蛋白质复合物，RNP)的体内特异性DNA切割。
具体实施方式
提供下面的描述以及本发明的所有章节，以便使本领域的任何技术人员能够利用本发明，并且阐述发明人所设想的实施本发明的最佳模式。然而，各种修改适应于对于本领域技术人员而言仍是显而易见的，因为本发明的一般原理已被具体限定以提供一种用于提高***植物的花产量的方法。
对本发明公开中使用的术语和解释的介绍：
本文公开的本发明提供了一种生产与相应的野生型植物相比产量提高的植物的方法，其包括在植物或其部分中增加或生成一种或多种活性。本发明提供了具有增强的或改善的基因编辑植物性状的植物细胞，包含此类细胞的植物，衍生自此类植物的后代、种子和花粉，以及此类植物细胞或植物、后代、种子或花粉的制备方法和使用方法。具体地，所述改善的性状表现为增加的产量，优选地通过改善一种或多种产量相关性状，即每株植物花的数目、每株植物花芽的数目、花重、每m2的总花产量。
杂种优势和作物产量
杂种优势(又称杂种活力或远交增强)定义了杂种后代中生物性状的增强的功能(或活力)。如果后代的性状由于其亲本的遗传贡献的混合(孟德尔或非孟德尔)而增强，则该后代是杂种优势的。在作物育种中，这种远交通常意味着在栽培条件下(但不一定在野外)产量更高、植株更健壮。已经提出了两种非互斥但相互竞争的假设来说明远交品系在适应性方面超过两种近交亲本的这种趋势。根据显性假说，增强的活力起源于来自一个亲本的不良隐性等位基因被来自另一个亲本的显性等位基因抑制。显性假设互补，即携带产生相同突变表型的不同纯合隐性突变的植物的两个品系的杂交将产生具有野生型表型的后代。只有当突变在不同基因中，使得品系的基因组将一个品系的突变等位基因与另一品系的野生型等位基因互补(因为突变是隐性的)时，才会发生这种情况。
根据超显性假说，通过杂交两个近交品系可以获得的等位基因的某些组合在杂合子中是有利的。因此，杂合子为纯合子中有害等位基因的存活提供了优势，并且杂合基因型的高适应性有利于等位基因多态性在群体中的持续存在。超显性模型表明在一个或多个杂合基因处的基因座内等位基因相互作用导致活力增加。理论上，超显性只需要单个杂合基因来实现杂种优势。
在显性条件下，与亲本相比，在杂合后代中很少有基因应当是低表达的。此外，对于任何给定的基因，表达应当与在两个亲本中较适应的基因中观察到的表达相当。然而，在超显性条件下，与纯合亲本相比，杂合后代中应当有某些基因的超表达。
Krieger等人(2010)首次记录了在一个基因座的产量超显性的实例，并提出单一杂合突变确实可能提高作物生产率。作者报道了在各种环境条件下，番茄SFT(单花束)基因(开花激素成花素的遗传发源者)的强杂合性，使产量提高了约60％。成花素是植物中向开花过渡的***信号。成花素在叶中产生，并作用于芽和生长端的茎顶分生组织。它可以通过嫁接传播，并且甚至在物种之间起作用。成花素级联途径由编码转录因子CONSTANS(CO)的mRNA的产生启动。黎明后大约12小时产生CO mRNA，然后翻译成CO蛋白。CO蛋白仅在光照下是稳定的，并促进称为开花基因座T(FT)的另一基因的转录。因此，FT只能在长时间内生产。FT然后通过韧皮部输送到茎顶分生组织。在那里，FT与转录因子(FD蛋白)相互作用以激活花特征基因并诱导开花。作者得出的结论是，几种性状以增殖方式多效性地整合以驱动杂种优势，并且这些作用来源于由SP(天然脱枝)基因，SFT的拮抗剂介导的生长终止的抑制。
天然脱枝(SP)基因是成花素的旁系同源基因和开花阻遏因子，其控制在沿着番茄的复合芽合轴生长期间营养－繁殖转换的规律性，并因此调节植物的“确定”(sp/sp)和“不确定”(SP)生长习性。在野生型“不确定”植物中，花序被三个营养节点分开。在对天然脱枝(SP)基因的隐性等位基因纯合的“确定”植物中，由两个连续的花序分开。SP是与拟南芥中的开花基因座T(FT)基因同源的发育调控因子。SP是番茄中由至少六个基因组成的基因家族。G-盒(CACGTG)是植物基因组中发现的普遍存在的顺式作用DNA调控元件。G-盒因子(GBFs)以上下文特定的方式与G-盒结合，从而介导多种基因表达模式。SPGB(天然脱枝G-盒)已经被证明与番茄SP蛋白和SFT蛋白相互作用。
Jumonji-C(JmjC)蛋白在植物生长和发育中起着重要作用，特别是在调节昼夜节律钟和周期长度方面。所表征的第一种植物JmjC基因作为开花激活剂或抑制剂参与开花级联。
分叉花束(bif)是突变的番茄基因，其导致每个花束的分枝数目和花的数目显著增加。在花束发育期间，Bif显示出与暴露于低温的显著相互作用。
基因编辑
突变育种是指许多旨在通过靶生物体中的人工突变快速且有效地诱导所需性状或去除不需要的性状的技术。基因编辑是与基因修饰相比具有显着优势的突变育种工具。基因修饰是涉及将编码所需性状的目标DNA序列***生物体基因组的分子技术。基因编辑是容许精确修饰基因组的突变育种工具。当使用向导RNA将分子剪刀(来自Cas家族的蛋白质复合物)精确导向确切的基因组基因座，然后在该位点切割基因组时，它就会起作用。
使用CRISPR/Cas体系优于基因修饰的一个优点是Cas家族蛋白易于编程以在任何所需的基因座中产生DNA双链断裂(DSB)。最初的切割跟着修复染色体DSB。在那方面，有两种主要的细胞修复途径：非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)。本发明本身涉及NHEJ，其在整个细胞周期中是活跃的并且具有更高的修复能力，因为不需要修复模板(姐妹染色单体或同源物)或大量的DNA合成。NHEJ还在数十分钟内完成大多数类型断裂的修复——比HDR快一个数量级。如果目的是在目标基因中产生无效等位基因(敲除)，则DSB的NHEJ介导的修复是有用的，因为它容易生成***缺失错误。在由NHEJ修复的过程中生成的***缺失错误通常很小(1-10bp)，但异质性极强。因此，有大约三分之二的机会引起移码突变。在某种程度上重要的是，当受到侧翼序列中的序列同一性(微同源)限制时，缺失的异质性可能会较低。
另外，在选择含有所需的编辑事件并且不携带CRISPR/Cas机制的植物后，没有外源DNA残留在植物中。这个显著的优点使得世界上许多(尽管不是全部)法律体系将基因编辑视为无GMO。
近来，在试图通过位点特异性核酸酶[例如锌指核酸酶(ZFNs)、大范围核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)]更有效地靶向和切割基因组DNA方面取得了重大进展。最近，已经引入了RNA引导的核酸内切酶(RGENs)，并且它们通过互补的RNA分子导向它们的靶位点。这些体系具有将核酸酶定位于靶位点的DNA结合结构域。然后用核酸酶切割该位点。这些体系用于诱导靶向诱变，诱导细胞DNA序列的靶向缺失，并促进外源供体DNA多核苷酸在预定基因组基因座内的靶向重组。最显著和成功的RGENs是具有工程化crRNA/tracrRNA的成簇的规则间隔的短回文重复序列/CRISPR相关核酸酶(CRISPR/Cas)。CRISPR/Cas9是在靶DNA上彼此发现的同源物。
CRISPR-Cas9体系已经迅速成为基因编辑的精选工具，因为它比其它可用的RGENs更快、更便宜、更准确且更高效。该体系改编自旨在产生病毒抗性的细菌中天然存在的基因组编辑体系，使得细菌捕获来自入侵病毒的DNA片段并使用它们产生称为CRISPR阵列的DNA片段。CRISPR阵列允许细菌“记忆”病毒(或紧密相关的病毒)。如果病毒再次攻击，则细菌从CRISPR阵列产生RNA片段以靶向病毒的DNA。然后细菌使用Cas9或类似的酶切割DNA，其使病毒失活。在实验室条件下，科学家创造了一小段具有短“向导”序列的RNA(gRNA)，其结合至基因组中DNA的特定靶序列。RNA也与Cas9酶结合。如在细菌中，修饰的RNA用于识别DNA序列，并且Cas9酶在靶向位置切割DNA。尽管Cas9是最常使用的酶，但也可以使用其它酶(例如Cpf1)。一旦DNA被切割，细胞自身的DNA修复机制添加或删除导致突变的遗传物质片段。
核糖核蛋白蛋白质复合物(RNP)
当Cas蛋白与gRNA分子一起孵育，然后转化到细胞中以在细胞中诱导编辑事件时，形成核糖核蛋白蛋白质复合物。RNP可以使用生物弹道技术(biolistics)递送。
生物弹道技术
生物弹道技术是一种通过高速粒子轰击将核酸和/或蛋白质递送至细胞的方法。该技术使用加压枪(基因枪)强制推进由涂有质粒DNA的重金属元素颗粒组成的有效载荷，以转化植物细胞器。在携带DNA的载体被递送后，该DNA被用作转录的模板，有时它整合到植物染色体中(“稳定的”转化)。如果载体也递送选择标记，则可以选择和培养稳定转化的细胞。转化的植物可以变成全能的，甚至表现出新的和可遗传的表型。
骨架生物弹道载体设计不仅包括待***细胞中的所需基因，而且包括启动子序列和终止子序列以及报告基因，其用于使得随后的检测和去除未掺入外源DNA的细胞成为可能。除了DNA，Cas9蛋白和gRNA分子的使用可用于生物弹道递送。使用蛋白质和RNA分子的优点是复合物在到达细胞核时开始编辑：当使用DNA进行编辑时，DNA首先必须在细胞核中转录，但是当使用RNA进行编辑时，RNA已经在细胞质中翻译。这迫使Cas蛋白穿梭回到细胞核，找到相关的向导，然后才能实现编辑。
如本文所用，术语“CRISPR”是指意指DNA序列的成簇的规则间隔的短回文重复的首字母缩略词。CRISPR是一系列重复的DNA序列，在重复序列之间具有独特的DNA序列。从独特的DNA链转录的RNA用作引导切割的向导。CRISPR被用作基因编辑工具。在一个实施方案中，CRISPR结合(但不限于)Cpf1、Cas9、Cas12、Cas13、Cas14、CasX或CasY使用。
如本文所用，术语“转化”是指将遗传物质故意***植物细胞中。在一个实施方案中，使用但不限于细菌和/或病毒进行转化。在另一实施方案中，使用但不限于DNA或RNPs通过生物弹道技术进行转化。
如本文所用，术语“Cas”是指CRISPR相关蛋白，其充当在特定序列处切割基因组的酶。Cas9是指本领域已知的特定蛋白质组。RNA分子引导各类Cas酶切割基因组中发现的某一序列。在一个实施方案中，CRISPR/Cas9体系在已知的DNA序列处切割一条或两条染色体链。在一个实施方案中，两条染色体链中的一条发生突变。在一个实施方案中，两条染色体链中的两条发生突变。
如本文所用，术语“染色体链”是指染色体内的DNA序列。当CRISPR/Cas9体系切割染色体链时，这些链被切割，留下一条或两条链突变的可能性，或者模板链或者编码链。
如本文所用，术语“PAM”(前间区序列邻近基序)是指转化表达盒的靶向组分，其是紧接在CRISPR体系中Cas9核酸酶靶向的DNA序列之后的非常短的(2至6个碱基对)DNA序列。
在本公开的上下文中，核酸内切酶的其它实例包括但不限于Cpf1、Cas9、Cas12、Cas13、Cas14、CasX或CasY。
本发明的特征在于这样的多个实施方案，其中gRNA引导CRISPR/Cas体系切割编码各种基因(CsBif1、CsBif2、CsJumonji、CsMultiflora、CsSFT1、CsSFT2、CsSFT3和CsSPGB)的染色体链。这些各种基因的全基因组序列均记载于序列表文件中，列为如下序列号：序列号：1，序列号：171，序列号：390，序列号：727，序列号：937，序列号：1016，序列号：1107和序列号：1336。
在本发明的另一实施方案中，上述基因的编码序列(CDS)均记载于序列表文件中，列为如下序列号：序列号：2，序列号：172，序列号：391，序列号：728，序列号：938，序列号：1017，序列号：1108和序列号：1337。
在本发明的另一实施方案中，从上述基因翻译的蛋白质的氨基酸(AA)序列均记载于序列表文件中，列为如下序列号：序列号：3，序列号：173，序列号：392，序列号：729，序列号：939，序列号：1018，序列号：1109和序列号：1338。
本发明的特征还在于这样的多个实施方案，其中给定序列的gRNA与特异性互补PAM配对。这些gRNA均完整记载于表1-8中，以及在序列表文件中，列为如下序列号：序列号：4－170(用于CsBif1)，序列号：174－389(用于CsBif2)，序列号：393－726(用于CsJumonji)，序列号：730－936(用于CsMultiflora)，序列号：940－1015(用于CsSFT1)，序列号：1019－1106(用于CsSFT2)，序列号：1110－1335(用于CsSFT3)和序列号：1339－1501(用于Cs SPGB)。
实施例1：用于生成基因组编辑的植物的方法的概括方案
现在参考图1至3，其公开了生成基因组编辑的***植物的方法。使用GUS(β-葡萄糖醛酸酶)报告基因对各种普通***组织([A]辅助芽；[B]成熟叶；[C]愈伤组织；[D]子叶，如图1所示)进行转化。为了实现成功的转化，使用以下协议：
1.设计并合成对应于用于编辑的靶向序列的gRNA。编辑事件应该被设计侧接独特限制性位点序列，以允许更容易地筛选成功的编辑。
2.使用农杆菌或生物弹道技术进行转化。对于使用DNA质粒的农杆菌和生物弹道技术，构建含有选择标记、Cas9基因和相关gRNA的载体。对于使用核糖核蛋白(RNP)复合物的生物弹道技术，通过将Cas9蛋白与相关gRNA混合来产生RNP复合物。
3.组织培养物中的再生。当转化DNA时，使用抗生素选择阳性转化体。
4.阳性转化体的选择。一旦再生的植物出现在组织培养物中，取样叶子，提取DNA并使用侧接编辑区域的引物进行PCR。用识别原始gRNA序列附近的限制性位点的酶消化PCR产物。如果发生编辑事件，限制性位点将被破坏，并且PCR产物将不被切割。编辑事件不会产生切割的PCR产物。
图2描述了转化后两周筛选出的存在Cas9基因的转化叶组织。Cas9基因的PCR产物在转化后两周从四个转化植物中扩增。
图3描述了Cas9+gRNA(RNP)的体内特异性DNA切割。图表示了凝胶，其示出了含有Cas9的核糖核蛋白(RNP)复合物成功消化所得的含有特异性gRNA序列的PCR扩增子。分析包括以下步骤：
1)通过侧接由预先设计的sgRNA靶向的目标基因序列的引物从两种示例性***品系分离扩增子。
2)将RNP复合物与分离的扩增子一起孵育。
3)然后将反应混合物加载到琼脂糖凝胶上以评估靶位点处的Cas9切割活性。
对图3的文字说明：(1)样品1PCR(无DNA消化)产物；(2)样品1PCR产物+RNP(消化的DNA)；(3)样品2PCR(无DNA消化)产物；(4)：样品2PCR产物+RNP(消化的DNA)；(M)标记物。
实例2：本申请中公开的普通***基因的gRNA序列
现在参考下表，这些表呈现了在本申请中公开的普通***基因的gRNA序列的非结合实例，以及它们各自的位置、链和PAM(前间区序列邻近基序)。
表1：CsBif1(在序列表文件中称为序列号：4－170)的gRNA(向导RNA)序列和互补PAM(前间区序列邻近基序)。
| 位置 | 链 | 序列 | PAM |
| 1334 | 1 | TAGATGGTAAAAATAAACAA | AGG |
| 1352 | 1 | AAAGGAAAGCTGTATCTAAT | TGG |
| 1353 | 1 | AAGGAAAGCTGTATCTAATT | GGG |
| 1373 | -1 | TAAAAGAACTTTTGGAACTG | TGG |
| 1381 | -1 | TTTAATGCTAAAAGAACTTT | TGG |
| 1406 | 1 | AGCATTAAATGAAGAAAAAT | TGG |
| 1415 | 1 | TGAAGAAAAATTGGCAAAGA | TGG |
| 1421 | 1 | AAAATTGGCAAAGATGGAAA | AGG |
| 1441 | 1 | AGGTCTCAATAGTTGAAATT | TGG |
| 1510 | -1 | TGCGCTTATTGACAGAGGTA | AGG |
| 1515 | -1 | TCAGATGCGCTTATTGACAG | AGG |
| 1546 | 1 | TGATGAACATGATCTTTGCC | TGG |
| 1553 | -1 | AATAGGAAGCCTTTGTTTCC | AGG |
| 1555 | 1 | TGATCTTTGCCTGGAAACAA | AGG |
| 1570 | -1 | TCTTTATGGAGCTTATGAAT | AGG |
| 1584 | -1 | GTCTGTTGGTTGCATCTTTA | TGG |
| 1598 | -1 | TCAATAGATGTGTGGTCTGT | TGG |
| 1606 | -1 | ATACTGCTTCAATAGATGTG | TGG |
| 1645 | 1 | GAAGAGTTCAACAACAACTC | AGG |
| 1659 | -1 | TGTTGTCACCAGATGGTACA | GGG |
| 1660 | -1 | ATGTTGTCACCAGATGGTAC | AGG |
| 1662 | 1 | CTCAGGAGCCCTGTACCATC | TGG |
| 1666 | -1 | CTGAGTATGTTGTCACCAGA | TGG |
| 1698 | 1 | AGTCATATACTCATTTTCCG | CGG |
| 1701 | 1 | CATATACTCATTTTCCGCGG | TGG |
| 1702 | 1 | ATATACTCATTTTCCGCGGT | GGG |
| 1704 | -1 | TGGTCTTGCTCGTCCCACCG | CGG |
| 1724 | -1 | GATCTTAAAATATGTGATTT | TGG |
| 1757 | 1 | CACAATTCGCATTAAGCAAA | AGG |
| 1764 | 1 | CGCATTAAGCAAAAGGTTGC | TGG |
| 1765 | 1 | GCATTAAGCAAAAGGTTGCT | GGG |
| 1785 | -1 | TTCTGCTAATGTTATACACA | GGG |
| 1786 | -1 | ATTCTGCTAATGTTATACAC | AGG |
| 1822 | -1 | TCTTGTACCAGATTCTTCGA | GGG |
| 1823 | -1 | TTCTTGTACCAGATTCTTCG | AGG |
| 1826 | 1 | ACTTCAACCCTCGAAGAATC | TGG |
| 1890 | -1 | AACTTAATTCTAGCTTTTCA | AGG |
| 1903 | 1 | TTGAAAAGCTAGAATTAAGT | TGG |
| 1915 | -1 | GTCTTTGTTTATTGACTTCA | TGG |
| 1949 | -1 | TTTATCAGAGGAGCATTGTC | AGG |
表2：CsBif2(在序列表文件中称为序列号：174－389)的gRNA(向导RNA)序列和互补PAM(前间区序列邻近基序)。
| 位置 | 链 | 序列 | PAM |
| 8 | -1 | AAATTAAATGAAAAAGTTTT | AGG |
| 113 | 1 | AATATTATCGAATATTTTTT | TGG |
| 221 | 1 | ATATTGATAAAAAGAATATA | TGG |
| 238 | 1 | ATATGGAAACGATCCTTGAA | AGG |
| 239 | 1 | TATGGAAACGATCCTTGAAA | GGG |
| 240 | -1 | TTTTATATTACACCCTTTCA | AGG |
| 311 | -1 | TGTGTGGATTTTTCTTGAAT | TGG |
| 位置 | 链 | 序列 | PAM |
| 1499 | -1 | CAGAATATGTTGTGACTCGC | TGG |
| 1532 | -1 | CGAGAACCAGTAGAGGAAAT | GGG |
| 1533 | -1 | GCGAGAACCAGTAGAGGAAA | TGG |
| 1537 | 1 | GAATTGCCCATTTCCTCTAC | TGG |
| 1539 | -1 | GGTCTAGCGAGAACCAGTAG | AGG |
| 1560 | -1 | GACCTAAAGATATGCGATTT | TGG |
| 1569 | 1 | GACCAAAATCGCATATCTTT | AGG |
| 1590 | 1 | GGTCACAATTAGCATTGACA | AGG |
| 1593 | 1 | CACAATTAGCATTGACAAGG | AGG |
| 1600 | 1 | AGCATTGACAAGGAGGTTCC | CGG |
| 1601 | 1 | GCATTGACAAGGAGGTTCCC | GGG |
| 1607 | -1 | TTCACCGAGACTTGAAGCCC | GGG |
| 1608 | -1 | CTTCACCGAGACTTGAAGCC | CGG |
| 1614 | 1 | GGTTCCCGGGCTTCAAGTCT | CGG |
| 1658 | -1 | CTGTTGTGCAGTTGCTTCGC | GGG |
| 1659 | -1 | ACTGTTGTGCAGTTGCTTCG | CGG |
| 1690 | 1 | AGTGAAACATTCATAAGTAA | TGG |
| 1704 | -1 | CAGTGGATTGATGCAATTTT | CGG |
| 1721 | -1 | CTTTTAAGTACTGTTTTCAG | TGG |
| 1750 | 1 | AAAAGAACTGTAAAACACAC | AGG |
| 1796 | -1 | CTGCAAATACTTTTTATTTC | AGG |
| 1824 | 1 | TTGCAGTGATCACTAGAAAG | CGG |
| 1832 | 1 | ATCACTAGAAAGCGGTTGTG | AGG |
| 1849 | 1 | GTGAGGACTTAATAATTTGA | TGG |
| 1852 | 1 | AGGACTTAATAATTTGATGG | AGG |
| 1871 | -1 | TTATCTGGTTTATGAGCTCA | TGG |
| 1886 | -1 | AACTTTCAAAGATGTTTATC | TGG |
| 1911 | 1 | TTGAAAGTTGCTCTATGAAT | AGG |
| 1934 | -1 | TGAGAATGTGATTGCTTTAA | AGG |
| 1968 | -1 | TGAGGGAGTTGAAGCTTCTT | AGG |
| 1985 | -1 | AGATGCCCTGAGGACTCTGA | GGG |
| 1986 | -1 | TAGATGCCCTGAGGACTCTG | AGG |
| 1990 | 1 | TCAACTCCCTCAGAGTCCTC | AGG |
| 1991 | 1 | CAACTCCCTCAGAGTCCTCA | GGG |
| 1995 | -1 | AGAACCGCGTAGATGCCCTG | AGG |
| 2002 | 1 | GAGTCCTCAGGGCATCTACG | CGG |
| 2063 | -1 | GGTGTGCTCGTCGATCAATA | GGG |
| 2064 | -1 | TGGTGTGCTCGTCGATCAAT | AGG |
| 2084 | 1 | CGACGAGCACACCACGCCAT | AGG |
| 2084 | -1 | AGGGAGAGGTGCCTATGGCG | TGG |
| 位置 | 链 | 序列 | PAM |
| 3141 | 1 | AAAATGAGAAAAATGGAAAC | GGG |
| 3146 | 1 | GAGAAAAATGGAAACGGGTT | TGG |
| 3147 | 1 | AGAAAAATGGAAACGGGTTT | GGG |
| 3148 | 1 | GAAAAATGGAAACGGGTTTG | GGG |
| 3155 | 1 | GGAAACGGGTTTGGGGAGAA | TGG |
| 3156 | 1 | GAAACGGGTTTGGGGAGAAT | GGG |
| 3157 | 1 | AAACGGGTTTGGGGAGAATG | GGG |
| 3161 | 1 | GGGTTTGGGGAGAATGGGGC | AGG |
| 3183 | -1 | GGTAGTGTCATGGGTGGGTT | TGG |
表3：CsJumonji(在序列表文件中称为序列号：393－726)的gRNA(向导RNA)序列和互补PAM(前间区序列邻近基序)。
| 位置 | 链 | 序列 | PAM |
| 2119 | -1 | AGTTTTCAGAAGACTTGTCA | CGG |
| 2158 | -1 | GGAACACTAGCTTTGATGTG | AGG |
| 2179 | -1 | TTTATTTTCTCCAGGTACAT | GGG |
| 2180 | 1 | AGCTAGTGTTCCCATGTACC | TGG |
| 2180 | -1 | ATTTATTTTCTCCAGGTACA | TGG |
| 2187 | -1 | TGCATCTATTTATTTTCTCC | AGG |
| 2244 | 1 | GCACTCTAAATAATTCTGAA | AGG |
| 2279 | 1 | ATACAGAAGTAGCCAACTAA | AGG |
| 2280 | -1 | AGATACAGATCTCCTTTAGT | TGG |
| 2302 | 1 | AGATCTGTATCTTACATTGC | TGG |
| 2303 | 1 | GATCTGTATCTTACATTGCT | GGG |
| 2314 | 1 | TACATTGCTGGGAGTGATTG | CGG |
| 2324 | 1 | GGAGTGATTGCGGCTTCCGT | AGG |
| 2325 | 1 | GAGTGATTGCGGCTTCCGTA | GGG |
| 2329 | -1 | TTCTCTTCCTGTAGACCCTA | CGG |
| 2333 | 1 | GCGGCTTCCGTAGGGTCTAC | AGG |
| 2350 | 1 | TACAGGAAGAGAATGTAGAG | TGG |
| 2356 | 1 | AAGAGAATGTAGAGTGGATG | TGG |
| 2362 | 1 | ATGTAGAGTGGATGTGGTAC | AGG |
| 2385 | -1 | AGTTTAAATTCTGAAATGTT | AGG |
| 2414 | -1 | AGTGCACAGGTGTCAAGTAG | TGG |
| 2427 | -1 | TCATGTTTCGTGTAGTGCAC | AGG |
| 2482 | 1 | TGAGTAGTATCACTAAGTTT | TGG |
| 2483 | 1 | GAGTAGTATCACTAAGTTTT | GGG |
| 2503 | 1 | GGGATCGAGTCAAATTTGAT | CGG |
| 2512 | 1 | TCAAATTTGATCGGACAGTA | AGG |
| 2532 | -1 | GTCACATAAAGTTAAGCAGG | AGG |
| 2535 | -1 | CATGTCACATAAAGTTAAGC | AGG |
| 2557 | 1 | TTATGTGACATGTTTGCTAA | TGG |
| 2589 | -1 | GATTAATCAGCAATCTAATA | GGG |
| 2590 | -1 | AGATTAATCAGCAATCTAAT | AGG |
| 2611 | 1 | TGCTGATTAATCTTCTTTTC | TGG |
| 2631 | -1 | AGCTAGAAAGTTTGAAATGG | AGG |
| 2634 | -1 | TGCAGCTAGAAAGTTTGAAA | TGG |
| 2661 | -1 | AAGGGAGGATATATCAGAAA | TGG |
| 2676 | -1 | CTGTACGCTCTGTTTAAGGG | AGG |
| 2679 | -1 | ACACTGTACGCTCTGTTTAA | GGG |
| 2680 | -1 | GACACTGTACGCTCTGTTTA | AGG |
| 2700 | 1 | GAGCGTACAGTGTCTTCCAC | AGG |
| 2705 | -1 | ACGTCTTTAAATTTTTCCTG | TGG |
| 位置 | 链 | 序列 | PAM |
| 5340 | -1 | TCCCACTTTGTTATTATTAT | TGG |
| 5349 | 1 | AACCAATAATAATAACAAAG | TGG |
| 5350 | 1 | ACCAATAATAATAACAAAGT | GGG |
| 5395 | 1 | TGTGTGTGCGAAAAATAAAA | CGG |
| 5396 | 1 | GTGTGTGCGAAAAATAAAAC | GGG |
| 5436 | 1 | AAATAAAAATTAAAAGAAAA | AGG |
| 5471 | 1 | ACTATTTTTCTTTTTAAATC | AGG |
| 5482 | 1 | TTTTAAATCAGGATAGAGAA | AGG |
| 5500 | -1 | TTGTAGCTTGTTACGAAGCT | TGG |
| 5550 | -1 | AGTGTTCATATCTGTACTTC | AGG |
| 5574 | -1 | ATTTCTAAAGTTAGGCTAAG | AGG |
| 5582 | -1 | AGAGCTACATTTCTAAAGTT | AGG |
| 5618 | 1 | TTATAAAGATAAAGAAATTA | TGG |
| 5667 | -1 | AGAAATTAGGCTTCATCATA | TGG |
| 5680 | -1 | AACCTTTATTACAAGAAATT | AGG |
| 5689 | 1 | AGCCTAATTTCTTGTAATAA | AGG |
| 5708 | 1 | AAGGTTAAATTAATAATATA | AGG |
| 5713 | 1 | TAAATTAATAATATAAGGTG | TGG |
| 5725 | -1 | TGAGTATTTTATGATGAATG | TGG |
| 5753 | -1 | TATTTATAATATAGCAGTAG | TGG |
| 5817 | -1 | AGGCACCATCACATATCAGT | TGG |
| 5823 | 1 | AATGACCAACTGATATGTGA | TGG |
| 5832 | 1 | CTGATATGTGATGGTGCCTC | AGG |
| 5837 | -1 | TAGTTTTCCACATTGTCCTG | AGG |
| 5841 | 1 | GATGGTGCCTCAGGACAATG | TGG |
| 5850 | 1 | TCAGGACAATGTGGAAAACT | AGG |
| 5902 | 1 | TAGATAGCATTTGCTTTTTC | TGG |
| 6041 | -1 | GCTCCAGAAGCTTCTGGATA | TGG |
| 6047 | -1 | AAGATCGCTCCAGAAGCTTC | TGG |
| 6049 | 1 | ATACCATATCCAGAAGCTTC | TGG |
| 6076 | 1 | ATCTTCTGCAAATAAATCAG | AGG |
| 6077 | 1 | TCTTCTGCAAATAAATCAGA | GGG |
| 6090 | -1 | TCCAACAAAAGAGGAGTTTG | AGG |
| 6099 | -1 | TATATATTATCCAACAAAAG | AGG |
| 6100 | 1 | TCCTCAAACTCCTCTTTTGT | TGG |
| 6112 | 1 | TCTTTTGTTGGATAATATAT | AGG |
| 6121 | 1 | GGATAATATATAGGACACTC | AGG |
| 6145 | -1 | TTGACACAAGTGATCTGGAA | TGG |
| 6150 | -1 | TAAGTTTGACACAAGTGATC | TGG |
| 6174 | -1 | TGTTATTTCGAAGCGGAAGG | TGG |
表4：CsMultiflora(在序列表文件中称为序列号：730－936)的gRNA(向导RNA)序列和互补PAM(前间区序列邻近基序)。
| 位置 | 链 | 序列 | PAM |
| 370 | 1 | ATAAGAAGTGATGTTGTGTC | TGG |
| 377 | 1 | GTGATGTTGTGTCTGGCTAG | AGG |
| 391 | -1 | GCTCTTGTTTTTGGTAGTAT | TGG |
| 位置 | 链 | 序列 | PAM |
| 1654 | -1 | GTAGTGGCCGGAGTCCTAGT | CGG |
| 1658 | 1 | GATGACGCCGACTAGGACTC | CGG |
| 1666 | -1 | ACGTTAGACGGAGTAGTGGC | CGG |
| 1670 | -1 | GACGACGTTAGACGGAGTAG | TGG |
| 1678 | -1 | GATGAAACGACGACGTTAGA | CGG |
| 1702 | -1 | GCAGTAGTAGCGTGGTGGTG | AGG |
| 1707 | -1 | TCGTTGCAGTAGTAGCGTGG | TGG |
| 1710 | -1 | TAGTCGTTGCAGTAGTAGCG | TGG |
| 1744 | -1 | ATTTGATTGAGGGGGACAGA | TGG |
| 1752 | -1 | TACCTTGGATTTGATTGAGG | GGG |
| 1753 | -1 | TTACCTTGGATTTGATTGAG | GGG |
| 1754 | -1 | TTTACCTTGGATTTGATTGA | GGG |
| 1755 | -1 | TTTTACCTTGGATTTGATTG | AGG |
| 1761 | 1 | GTCCCCCTCAATCAAATCCA | AGG |
| 1767 | -1 | CATTTTATTTTATTTTACCT | TGG |
| 1789 | 1 | TAAAATAAAATGTTACCACA | TGG |
| 1793 | -1 | TTTTCAGTTACAGTTCCATG | TGG |
| 1820 | 1 | CTGAAAATCGAAATTTTGTT | TGG |
| 1881 | 1 | GTTATATAAAAATTTTAACA | CGG |
| 1882 | 1 | TTATATAAAAATTTTAACAC | GGG |
| 1887 | 1 | TAAAAATTTTAACACGGGAG | AGG |
| 1934 | 1 | ATTTACAAATTATTATACAT | TGG |
| 1946 | 1 | TTATACATTGGTAAAAGATC | AGG |
| 1963 | 1 | ATCAGGACAATATTGTCTAA | TGG |
| 1964 | 1 | TCAGGACAATATTGTCTAAT | GGG |
| 1977 | -1 | TCCATCTACACTCAGATCGC | TGG |
| 1987 | 1 | TCCAGCGATCTGAGTGTAGA | TGG |
| 1999 | 1 | AGTGTAGATGGACGTGTGCA | TGG |
| 2005 | 1 | GATGGACGTGTGCATGGATT | TGG |
| 2008 | 1 | GGACGTGTGCATGGATTTGG | TGG |
| 2014 | 1 | GTGCATGGATTTGGTGGTGT | TGG |
| 2022 | 1 | ATTTGGTGGTGTTGGTCCTT | AGG |
| 2027 | -1 | AATATGAAACAGTCGACCTA | AGG |
| 2052 | 1 | TTTCATATTGATCTTTGTAT | TGG |
| 2053 | 1 | TTCATATTGATCTTTGTATT | GGG |
| 2118 | 1 | TTATTTATGACGAAAGTAAT | AGG |
| 2119 | 1 | TATTTATGACGAAAGTAATA | GGG |
| 2128 | 1 | CGAAAGTAATAGGGTACTAC | TGG |
| 2129 | 1 | GAAAGTAATAGGGTACTACT | GGG |
| 2154 | 1 | TATTTAATTAATAAATTATT | AGG |
| 位置 | 链 | 序列 | PAM |
| 2515 | 1 | GCGCTTTTTACTATCTTATC | TGG |
| 2537 | -1 | ACGTAAATAATGGTGTGAAA | AGG |
| 2547 | -1 | AAAAAGATTTACGTAAATAA | TGG |
| 2579 | 1 | TTATTTGATTATAATATTTG | TGG |
表5：CsSFT1(在序列表文件中称为序列号：940－1015)的gRNA(向导RNA)序列和互补PAM(前间区序列邻近基序)。
| 位置 | 链 | 序列 | PAM |
| 2712 | 1 | TTCAACTGCCAAAAGGAACT | TGG |
| 2718 | 1 | TGCCAAAAGGAACTTGGCTG | TGG |
| 2721 | 1 | CAAAAGGAACTTGGCTGTGG | TGG |
| 2725 | 1 | AGGAACTTGGCTGTGGTGGA | AGG |
| 2728 | 1 | AACTTGGCTGTGGTGGAAGG | AGG |
| 2798 | -1 | GACATATATAGATAGATAGA | TGG |
表6：CsSFT2(在序列表文件中称为序列号：1019－1106)的gRNA(向导RNA)序列和互补PAM(前间区序列邻近基序)。
| 位置 | 链 | 序列 | PAM |
| 1449 | 1 | AAAGGCTGTTCCCGTAGTTG | CGG |
| 1449 | -1 | GACTGATATTCCCGCAACTA | CGG |
| 1450 | 1 | AAGGCTGTTCCCGTAGTTGC | GGG |
| 1473 | -1 | AGTGTATAACTTTTTCAGGT | TGG |
| 1477 | -1 | TTTAAGTGTATAACTTTTTC | AGG |
| 1532 | 1 | ATAAAATTAATAATTATTAG | TGG |
| 1548 | 1 | TTAGTGGCACACACTATTGA | TGG |
| 1562 | -1 | AATATTACTAACGAATGACA | AGG |
| 1612 | -1 | TGTACTTAGTAATATCATTT | CGG |
| 1637 | -1 | ATCTTAAAGAATATTTGCAT | TGG |
| 1652 | 1 | TGCAAATATTCTTTAAGATT | AGG |
| 1661 | 1 | TCTTTAAGATTAGGTTCGCT | AGG |
| 1662 | 1 | CTTTAAGATTAGGTTCGCTA | GGG |
| 1667 | 1 | AGATTAGGTTCGCTAGGGTT | AGG |
| 1692 | -1 | ACTGTTAATGTTGCAGGTTA | TGG |
| 1698 | -1 | ATTAATACTGTTAATGTTGC | AGG |
| 1818 | 1 | CGTATACTTAATTTTATGCT | AGG |
| 1959 | 1 | TATTTGTGCAATTATAAGTT | AGG |
| 1971 | -1 | GTCAAAGACCCACAACAATA | AGG |
| 1973 | 1 | TAAGTTAGGCCTTATTGTTG | TGG |
| 1974 | 1 | AAGTTAGGCCTTATTGTTGT | GGG |
| 2030 | 1 | TTAACAGTGTTAATTTTAAA | CGG |
| 2175 | -1 | TTGGTTTATGAAAAATTAGT | GGG |
| 2176 | -1 | CTTGGTTTATGAAAAATTAG | TGG |
| 2194 | -1 | TGCCTATATAACTAAATTCT | TGG |
| 2203 | 1 | AACCAAGAATTTAGTTATAT | AGG |
| 2253 | -1 | TCTCAGGACTTTCTACACTT | TGG |
| 2269 | -1 | AGATTGGTGGAGATGATCTC | AGG |
| 2282 | -1 | TCACCTAGGGTTGAGATTGG | TGG |
| 2285 | -1 | AACTCACCTAGGGTTGAGAT | TGG |
| 2290 | 1 | TCTCCACCAATCTCAACCCT | AGG |
| 2295 | -1 | TCAAGTTGCTAACTCACCTA | GGG |
| 2296 | -1 | CTCAAGTTGCTAACTCACCT | AGG |
| 2311 | 1 | GGTGAGTTAGCAACTTGAGA | AGG |
| 2318 | 1 | TAGCAACTTGAGAAGGTCTA | AGG |
| 2336 | -1 | GGGATTAGGGCTATTAACAA | TGG |
| 2349 | -1 | AGTATCATATAGTGGGATTA | GGG |
| 2350 | -1 | AAGTATCATATAGTGGGATT | AGG |
| 2356 | -1 | CTCTTAAAGTATCATATAGT | GGG |
| 2357 | -1 | TCTCTTAAAGTATCATATAG | TGG |
表7：CsSFT3(在序列表文件中称为序列号：1110－1335)的gRNA(向导RNA)序列和互补PAM(前间区序列邻近基序)。
| 位置 | 链 | 序列 | PAM |
| 364 | -1 | TTACTCTACCAACCACAAGA | GGG |
| 365 | -1 | ATTACTCTACCAACCACAAG | AGG |
| 367 | 1 | GATAGGGACCCTCTTGTGGT | TGG |
| 379 | 1 | CTTGTGGTTGGTAGAGTAAT | AGG |
| 390 | 1 | TAGAGTAATAGGAGATGTTT | TGG |
| 404 | 1 | ATGTTTTGGATCCTTTTACA | AGG |
| 404 | -1 | AGAGAGACTGACCTTGTAAA | AGG |
| 430 | 1 | GTCTCTCTTAGAGTGAGTTA | TGG |
| 441 | 1 | AGTGAGTTATGGTAATAGAG | AGG |
| 451 | 1 | GGTAATAGAGAGGTCAACAA | TGG |
| 476 | -1 | GGTTGGTTAACAATTTGGGA | AGG |
| 480 | -1 | ACGAGGTTGGTTAACAATTT | GGG |
| 481 | -1 | CACGAGGTTGGTTAACAATT | TGG |
| 493 | -1 | CACCAATATCAACACGAGGT | TGG |
| 497 | -1 | TCACCACCAATATCAACACG | AGG |
| 502 | 1 | AACCAACCTCGTGTTGATAT | TGG |
| 位置 | 链 | 序列 | PAM |
| 2075 | 1 | GTTGGGTTGGGTCTGGAGTC | TGG |
| 2076 | 1 | TTGGGTTGGGTCTGGAGTCT | GGG |
| 2082 | 1 | TGGGTCTGGAGTCTGGGTCT | AGG |
| 2083 | 1 | GGGTCTGGAGTCTGGGTCTA | GGG |
| 2095 | 1 | TGGGTCTAGGGTCCAGATTC | AGG |
| 2096 | -1 | CCTGAACCCGATCCTGAATC | TGG |
| 2100 | 1 | CTAGGGTCCAGATTCAGGAT | CGG |
| 2101 | 1 | TAGGGTCCAGATTCAGGATC | GGG |
| 2107 | 1 | CCAGATTCAGGATCGGGTTC | AGG |
| 2113 | 1 | TCAGGATCGGGTTCAGGTTA | AGG |
| 2131 | 1 | TAAGGTTTGAGTCTGAGTCC | AGG |
| 2137 | 1 | TTGAGTCTGAGTCCAGGTAT | AGG |
| 2138 | -1 | TCCCGACCAGAACCTATACC | TGG |
| 2143 | 1 | CTGAGTCCAGGTATAGGTTC | TGG |
| 2147 | 1 | GTCCAGGTATAGGTTCTGGT | CGG |
| 2148 | 1 | TCCAGGTATAGGTTCTGGTC | GGG |
| 2176 | 1 | AGTTCGAGAGTTTGAATTCA | AGG |
| 2186 | 1 | TTTGAATTCAAGGTCCAATT | TGG |
| 2189 | -1 | GAACTCATCCAACTCCAAAT | TGG |
| 2192 | 1 | TTCAAGGTCCAATTTGGAGT | TGG |
| 2209 | 1 | AGTTGGATGAGTTCATGTCA | TGG |
| 2275 | -1 | TTTAAAATTTTAATAGTGTT | TGG |
| 2391 | 1 | ATTCATAATTTTTAAATTAG | AGG |
| 2392 | 1 | TTCATAATTTTTAAATTAGA | GGG |
| 2408 | -1 | TTATTTTTATCTTACTTATA | GGG |
| 2409 | -1 | ATTATTTTTATCTTACTTAT | AGG |
| 2520 | -1 | TTTACTGTACCGAATATTCA | CGG |
| 2522 | 1 | TTGTAGTTACCGTGAATATT | CGG |
| 2537 | 1 | ATATTCGGTACAGTAAATTA | AGG |
| 2541 | 1 | TCGGTACAGTAAATTAAGGA | TGG |
| 2622 | -1 | ATATATAAAAATATAAATTG | TGG |
| 2653 | 1 | TATATTATTAATCTAGATAA | TGG |
| 2705 | -1 | ATAATTATACTATATATTAT | AGG |
| 2735 | 1 | TTATAATAATTATACATGTT | TGG |
| 2750 | 1 | ATGTTTGGCAATTTCAATTT | AGG |
| 2754 | 1 | TTGGCAATTTCAATTTAGGT | TGG |
| 2770 | 1 | AGGTTGGTGACTGATATTCC | TGG |
| 2777 | -1 | AAGCTTGGCCCGGTAGTTCC | AGG |
| 2779 | 1 | ACTGATATTCCTGGAACTAC | CGG |
| 2780 | 1 | CTGATATTCCTGGAACTACC | GGG |
| 位置 | 链 | 序列 | PAM |
| 3189 | 1 | CCAAAGGGAGACAGGATCTG | GGG |
| 3190 | 1 | CAAAGGGAGACAGGATCTGG | GGG |
| 3194 | 1 | GGGAGACAGGATCTGGGGGA | AGG |
| 3197 | 1 | AGACAGGATCTGGGGGAAGG | AGG |
| 3210 | -1 | ATATATATATGTCTATGTGG | AGG |
| 3213 | -1 | TATATATATATATGTCTATG | TGG |
| 3296 | 1 | GATTCTTAATGATGATATCA | TGG |
| 3322 | -1 | AAAGCTTATTATATTAATAA | TGG |
| 3379 | 1 | AAGATGAAGAAGAAGAAAAC | AGG |
| 3465 | 1 | ATTATTGTACTTAATTCAGC | TGG |
表8：CsSPGB(在序列表文件中称为序列号：1339－1501)的gRNA(向导RNA)序列和互补PAM(前间区序列邻近基序)。
| 位置 | 链 | 序列 | PAM |
| 1445 | 1 | TTGTTGAGTTGTGGTGGTGG | TGG |
| 1448 | 1 | TTGAGTTGTGGTGGTGGTGG | TGG |
| 1514 | -1 | CAAAAGCCATGGAAGAAGTT | TGG |
| 1519 | 1 | ATCTTTCCAAACTTCTTCCA | TGG |
| 1525 | -1 | TCCTTCTACAACAAAAGCCA | TGG |
| 1535 | 1 | TCCATGGCTTTTGTTGTAGA | AGG |
| 1597 | 1 | AAAAGACTTCTTTGAAGAAG | AGG |
| 1620 | -1 | AGCTTAAGCTTACACAACAC | AGG |
| 1657 | 1 | ATTTCTTCTTCTTCTTCTTC | TGG |
| 1713 | -1 | ATACTAATGTCGTCGTCATC | AGG |
| 1735 | 1 | CGACATTAGTATAAGACTGA | TGG |
| 1736 | 1 | GACATTAGTATAAGACTGAT | GGG |
| 1822 | 1 | AGAGATGAGAAGAGTAGAGC | TGG |
| 1850 | 1 | GTAGCTACAGCTATGTATGA | AGG |
| 1888 | 1 | AGAGAGAGAAGAAGAAGAAC | TGG |
| 1914 | 1 | ATATTGTATTGAGCCACGCG | CGG |
| 1916 | -1 | AAACAGTACTCTTCCGCGCG | TGG |
| 1934 | 1 | CGGAAGAGTACTGTTTTTAT | TGG |
| 1935 | 1 | GGAAGAGTACTGTTTTTATT | GGG |
| 1938 | 1 | AGAGTACTGTTTTTATTGGG | AGG |
| 1959 | -1 | CCTATAAGTCTCTTTAATTT | GGG |
| 1960 | -1 | CCCTATAAGTCTCTTTAATT | TGG |
| 1970 | 1 | CCCAAATTAAAGAGACTTAT | AGG |
| 1971 | 1 | CCAAATTAAAGAGACTTATA | GGG |
| 1976 | 1 | TTAAAGAGACTTATAGGGCC | TGG |
| 1983 | -1 | AAGTATACAGTTTACAGGCC | AGG |
| 1988 | -1 | GACTGAAGTATACAGTTTAC | AGG |
| 2010 | -1 | TGTGGAACAGCAGATGAGAT | TGG |
| 2028 | -1 | TTTAGATTCTCATAATGTTG | TGG |
| 2042 | 1 | CAACATTATGAGAATCTAAA | AGG |
| 2062 | -1 | CACTGTTAAAAAGGAGTGGT | GGG |
| 2063 | -1 | GCACTGTTAAAAAGGAGTGG | TGG |
| 2066 | -1 | GTGGCACTGTTAAAAAGGAG | TGG |
| 2071 | -1 | GGTTAGTGGCACTGTTAAAA | AGG |
| 2085 | -1 | ATATATAGGGGGATGGTTAG | TGG |
| 2092 | -1 | CATGTACATATATAGGGGGA | TGG |
| 2096 | -1 | CAAGCATGTACATATATAGG | GGG |
| 2097 | -1 | ACAAGCATGTACATATATAG | GGG |
| 2098 | -1 | TACAAGCATGTACATATATA | GGG |
| 2099 | -1 | CTACAAGCATGTACATATAT | AGG |
Claims (19)
1.一种用于提高选自由普通***、印度***和莠草***组成的组的***植物产量的方法，所述方法包括以下步骤；
a)选择所述***物种的开花途径中涉及的基因；
b)合成或设计对应于沿着***基因组的靶向切割基因座的gRNA表达盒或gRNA与蛋白质的复合物(核糖核蛋白蛋白质复合物)；
c)转化所述***植物细胞以将所述gRNA表达盒或所述核糖核蛋白蛋白质复合物***其中；
d)培养所述***植物细胞；
e)选择在编辑靶区域中表达所需突变的所述***细胞，以及
f)从所述植物细胞、植物细胞核或植物组织再生植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述***物种的开花途径中涉及的基因选自序列号：1、序列号：171、序列号：390、序列号：727、序列号：937、序列号：1016、序列号：1107或序列号：1336，详见标题为“序列表2272-C-01-PCT”的文件。
3.根据权利要求1所述的gRNA及其相应的PAM，其选自由序列号：4－170、序列号：174－389、序列号：393－726、序列号：730－936，序列号：940-1015，序列号：1019-1106，序列号：1110－1335和序列号：1339－1501组成的组，详见标题为“序列表2272-C-01-PCT”的文件。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述靶结构域序列选自由以下各项组成的组：(1)编码序列号：1的多肽的核酸序列，(2)包含序列号：171的序列的核酸序列，(3)编码序列号：390的多肽的核酸序列，(4)编码序列号：727的多肽的核酸序列，(5)编码序列号：937的多肽的核酸序列，(6)编码序列号：1016的多肽的核酸序列，(7)编码序列号：1107的多肽的核酸序列，(8)编码序列号：1336的多肽的核酸序列，(9)与序列号：1的核酸序列的至少200个相接的核苷酸具有至少80％序列同一性的核酸序列，(10)与序列号：171的核酸序列的至少200个相接的核苷酸具有至少80％序列同一性的核酸序列，(11)与序列号：390的核酸序列的至少200个相接的核苷酸具有至少80％序列同一性的核酸序列，(12)与序列号：727的核酸序列的至少200个相接的核苷酸具有至少80％序列同一性的核酸序列，(13)与序列号：937的核酸序列的至少200个相接的核苷酸具有至少80％序列同一性的核酸序列，(14)与序列号：1016的核酸序列的至少200个相接的核苷酸具有至少80％序列同一性的核酸序列，(15)与序列号：1107的核酸序列的至少200个相接的核苷酸具有至少80％序列同一性的核酸序列，及(16)与序列号：1336的核酸序列的至少200个相接的核苷酸具有至少80％序列同一性的核酸序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述转化通过选自由以下各项组成的组的方式来执行：农杆菌介导的转化方法、粒子轰击(生物弹道技术)、注射、病毒转化、原位转化、电穿孔、脂质转染、超声处理、碳化硅纤维介导的基因转移、激光微束(UV)诱导的基因转移、与外植体组织共培养及其任何组合。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述转化使用农杆菌进行以递送表达盒，所述表达盒由以下各项组成：(a)选择标记；(b)编码一个或多个gRNA分子的核苷酸序列，所述gRNA分子包含与选自由序列号：1、序列号：171、序列号：390、序列号：727、序列号：937、序列号：1016、序列号：1107和序列号：1336组成的基因组的靶结构域序列互补的DNA序列，以及(c)编码来自但不限于化脓性链球菌或金黄色葡萄球菌的Cas分子的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法包括施用核酸组合物，所述核酸组合物包含：(a)编码所述gRNA分子的第一核苷酸序列；以及(b)编码所述Cas蛋白的第二核苷酸序列。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述CRISPR/Cas体系通过植物病毒递送至细胞。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述Cas蛋白选自包含但不限于Cpf1、Cas9、Cas12、Cas13、Cas14、CasX或CasY的组。
10.根据权利要求1所述的方法，其中提高***产量包括以下步骤：
(a)向***植物或其细胞中引入(i)至少一种包含至少一种核定位信号的RNA引导的核酸内切酶或编码至少一种包含至少一种核定位信号的RNA引导的核酸内切酶的核酸，(ii)至少一种向导RNA或编码至少一种向导RNA的DNA，以及任选地(iii)至少一种供体多核苷酸；以及
(b)培养所述***植物或其细胞，使得每个向导RNA将RNA引导的核酸内切酶导向所述染色体序列中的靶向位点，其中所述RNA引导的核酸内切酶在所述靶向位点引入双链断裂，并且所述双链断裂通过DNA修复过程修复，使得所述染色体序列被修饰，其中所述靶向位点位于选自序列号：1、序列号：171、序列号：390、序列号：727、序列号：937、序列号：1016、序列号：1107和序列号：1336的基因中，并且所述染色体修饰打断或干扰选自序列号：1、序列号：171、序列号：390、序列号：727、序列号：937、序列号：1016、序列号：1107和序列号：1336的所述基因的转录和/或翻译。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述RNA引导的核酸内切酶衍生自成簇的规则散布的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)体系。
12.根据权利要求10所述的方法，其中序列号：1、序列号：171、序列号：390、序列号：727、序列号：937、序列号：1016、序列号：1107和序列号：1336的引入不***外源遗传物质并产生非天然存在的***植物或其细胞。
13.根据权利要求1所述的方法，其中提高***产量包括：
(a)在***植物或其细胞中的DNA序列内鉴定序列号：1、序列号：171、序列号：390、序列号：727、序列号：937、序列号：1016、序列号：1107和序列号：1336的至少一个基因座；
(b)在序列号：1、序列号：171、序列号：390、序列号：727、序列号：937、序列号：1016、序列号：1107和序列号：1336的所述至少一个基因座内鉴定至少一个定制核酸内切酶识别序列；
(c)向所述***植物或其细胞中引入至少第一定制核酸内切酶，其中所述***植物或其细胞在序列号：1、序列号：171、序列号：390、序列号：727、序列号：937、序列号：1016、序列号：1107和序列号：1336的所述基因座中或其附近包含所述定制核酸内切酶的识别序列，并且所述定制核酸内切酶瞬时或稳定表达；(d)测定所述***植物或其细胞在构成或侧接序列号：1、序列号：171、序列号：390、序列号：727、序列号：937、序列号：1016、序列号：1107和序列号：1336的所述基因座的所述DNA中的定制核酸内切酶介导的修饰，以及
(e)鉴定所述***植物、其细胞或其后代细胞为在序列号：1、序列号：171、序列号：390、序列号：727、序列号：937、序列号：1016、序列号：1107和序列号：1336的所述基因座中包含修饰。
14.根据权利要求13所述的方法，其中提高所述***产量选自由以下各项组成的组：增加花的数目、增加花的大小、增加花的重量、增加芽的数目、增加芽的大小、增加芽的重量及其任何组合。
15.一种用于提高选自由普通***、印度***和莠草***组成的组的***植物产量的方法，所述方法包括以下步骤；
a)选择所述***物种的开花途径中涉及的基因；
b)获得所述***植物的细胞；
c)编辑所述细胞的开花途径中涉及的所述基因；
d)培养所述细胞；
e)选择在编辑靶区域中表达所需突变的所述细胞，以及
f)从所述细胞、植物细胞核或植物组织再生***植物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述编辑通过选自由以下各项组成的组的方式来执行：CRISPR/Cas，使用锌指核酸酶切割所述细胞的基因组，使用大范围核酸酶(归巢核酸内切酶)切割所述细胞的基因组，使用转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)切割所述细胞的基因组，及其任何组合。
17.根据权利要求15所述的方法，其中提高所述***产量选自由以下各项组成的组：增加花的数目、增加花的大小、增加花的重量、增加芽的数目、增加芽的大小、增加芽的重量及其任何组合。
18.一种根据权利要求1和15中任一项生产的***植物。
19.一种根据权利要求18所述的***植物的种子。
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