CN114438003A - 具有提高的产生疏水性物质的能力的重组微生物和用于制备的细胞膜工程化方法 - Google Patents

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Abstract

公开了一种用于产生疏水性物质的重组微生物，所述重组微生物经历细胞膜工程化，以便赋予细胞膜面积增加、外膜囊泡的形成和分泌增加、内膜囊泡的形成增加中的至少一种特征；以及用于制备所述疏水性物质的细胞膜工程化方法，由此可以高效产生不溶性疏水性物质，用于高效产生类胡萝卜素或紫色杆菌素类似物的重组微生物可用于产生天然色素、抗氧化剂、抗生素、化妆品添加剂、抗癌剂、食品添加剂或营养补充剂，并且本文开发的天然色素产生技术实现了产生能力的很大提高。因此，本发明在制备用于高效产生多种工业和医学上有用的代谢物的重组菌株和建立高效的制备方法方面是有效的。

Description

具有提高的产生疏水性物质的能力的重组微生物和用于制备 的细胞膜工程化方法
发明背景
技术领域
本发明涉及一种具有提高的产生疏水性物质的能力的重组微生物和一种用于制备所述疏水性物质的细胞膜工程化方法，并且更具体地涉及用于产生疏水性物质的重组微生物，所述重组微生物经历细胞膜工程化以便赋予细胞膜面积增加、外膜囊泡的形成和分泌增加以及内膜囊泡的形成增加中的至少一种特征；以及一种用于制备所述疏水性物质的细胞膜工程化方法。
背景技术
由于全球环境问题、不可再生资源的耗竭以及对生态环境友好型能源的需求，对基于再生生物构建细胞工厂的关注逐渐增加。这种细胞工厂可以通过工程化用于产生目标代谢物(生物能、生态环境友好型化学品、新药等)的细胞内代谢网络来制造，这需要各种分子生物学技术。基于石油化学品产生的各种物质可以分为各种类别，并且代表性分类标准之一是亲水性与疏水性。疏水性物质的代表性组包括疏水性色素(诸如类胡萝卜素和紫色杆菌素(viortein))。色素广泛使用于包括食品添加剂、染料、化妆品、涂料等的行业中，并且与日常生活密不可分。由于色素在摄入或施用至皮肤时直接影响人体，因此对天然色素(其被认为比有问题的基于石油的合成色素更安全)的兴趣和需求随着现代社会中对健康关注的增加而迅速增加。还已知基于石油的合成色素在染色纺织物时引起严重的环境问题。源自自然界的天然色素通常除了多种颜色外还具有各种药物特性，如抗癌、抗生素、抗菌和免疫抑制活性，因此它们可能在日常生活中变得越来越有用。目前，许多色素是基于石油化学品产生的，并且天然色素在所用色素中仅占很小比例。这导致了健康问题和环境问题，并且特别是有基于石油化学品的色素广泛用于儿童用产品中的问题。并且，基于石油化学品的色素在纺织物染色过程中引起严重的水污染。
因此，已经努力以环境友好的方式使用微生物细胞工厂产生大量的天然色素，其中已经报道了尝试通过扩大细胞膜的面积来增加在细胞膜上积聚的疏水性色素的产生(T.Wu等人,Membrane engineering-A novel strategy to enhance the production andaccumulation of beta-carotene in Escherichia coli.Metab.Eng.43,85-91(2017))，并且已进行尝试以通过细胞内脂质的溶解来增加疏水性色素的产生(T.Ma等人,Lipidengineering combined with systematic metabolic engineering of Saccharomycescerevisiae for high-yield production of lycopene.Metab.Eng.52,134-142(2019))。
针对该背景，诸位发明人作出很大努力以通过细胞膜工程化修饰微生物产生疏水性物质的固有特性来提高产生疏水性物质的能力，并且由此确定当通过对细胞形态相关基因、外膜囊泡相关基因或内膜囊泡相关基因的抑制、引入或过表达来对产生作为天然色素的类胡萝卜素和紫色杆菌素类似物的大肠杆菌进行细胞膜工程化时，天然亲脂性色素物质可以积聚的空间由于细胞膜面积增加、外膜囊泡的形成和分泌增加和内膜囊泡的形成增加而扩大，从而显著增加所产生的天然色素的量，并且测试单独要素的协同效应并验证，从而最终实现本发明。
背景技术部分中所述的信息仅为改进对本发明的背景的理解，并且其不应被解释为包括形成本发明所属领域中技术人员已知的相关技术的信息。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过细胞膜工程化具有提高的产生疏水性物质的能力的重组微生物和一种制备所述疏水性物质的方法。
本发明的另一目的是提供一种通过培养所述重组微生物产生疏水性物质的方法。
本发明的再另一目的是提供一种使用经历细胞膜工程化的重组微生物文库来筛选具有高的产生特定疏水性物质的能力的重组微生物的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种用于产生疏水性物质的重组微生物，所述重组微生物经历细胞膜工程化，以便赋予以下中的至少一种特征：细胞膜面积增加、外膜囊泡的形成和分泌增加以及内膜囊泡的形成增加。
此外，本发明提供了一种制备用于产生疏水性物质的重组微生物的方法，所述方法包括在用于产生疏水性物质的所述重组微生物中抑制细胞形态相关基因和外膜囊泡相关基因中的至少一种基因的表达、和/或在用于产生疏水性物质的所述重组微生物中引入或过表达内膜囊泡相关基因。
此外，本发明提供了一种制备疏水性物质的方法，所述方法包括通过培养经历细胞膜工程化的用于产生疏水性物质的所述重组微生物来产生疏水性物质；并且获得所产生的疏水性物质。
此外，本发明提供了一种筛选经历细胞膜工程化的、具有提高的产生特定疏水性物质的能力的重组微生物的方法，所述方法包括(a)通过在用于产生疏水性物质的微生物中通过以下中的至少一种进行细胞膜工程化来构建用于产生疏水性物质的微生物文库：对细胞形态相关基因表达的抑制、对外膜囊泡相关基因表达的抑制和对内膜囊泡相关基因的引入或过表达；并且(b)通过培养用于产生疏水性物质的所述微生物来选择具有高的产生特定疏水性物质的能力的重组微生物。
附图说明
根据结合附图的下文详细描述，将更清楚地理解本发明的上述和其他目的、特征和其他优点，在附图中：
图1示意性地示出了用于细胞膜空间扩张的细胞膜工程化策略以及类胡萝卜素和紫色杆菌素类似物的生物合成途径，其中可以通过使用合成sRNA***抑制相关基因的表达来改变细胞形态，并且外膜囊泡也可以以同样的方式形成，而内膜囊泡可以通过外来基因如cav1等的表达形成，并且其中弯曲箭头和T模型分别指示启动子和转录终止子，实线和虚线分别指示单一响应和多个响应，并且缩写如下：G3P表示3-磷酸甘油醛，E4P表示4-磷酸赤藓糖，PEP表示磷酸烯醇式丙酮酸，PYR表示丙酮酸，DXP表示5-磷酸1-脱氧-D-木酮糖，SKM表示莽草酸，FPP表示法尼基二磷酸，GGPP表示香叶基香叶基焦磷酸，TRP表示色氨酸，IPA表示吲哚丙酮酸并且Sp.表示自发的；
图2A至图2J示出了类胡萝卜素产生菌株的构建结果和所构建的菌株的培养结果，图2A示意性地示出了pLYC、pBTC、pZEA和pATX文库的质粒，弯曲箭头、半球和T模型分别指示启动子、5'UTR和转录终止子，图2B示出了LYC菌株的初步筛选结果，图2C示出了在选择显眼的红色菌落且然后试管培养之后，良好菌株的另外烧瓶培养结果，图2D至图2F分别示出了BTC、ZEA和ATX菌株的试管培养结果，图2G示出了图2F的50个良好菌株样品的HPLC分析结果，其中每个样品的对应于虾青素的峰的面积值绘制在y轴上，图2H、图2I和图2J分别示出了从试管培养结果中选择出的BTC、ZEA和ATX菌株的烧瓶培养结果，误差条表示平均值±标准偏差(n＝3)，**P<0.01、***P<0.001、NS(不显著)、P≥0.05是由双尾学生t检验确定；
图3A至图3G示出了紫色杆菌素类似物产生菌株的构建结果和所构建的菌株的培养结果，图3A示意性地示出了为产生紫色杆菌素类似物而构建的质粒，图3B示出了使用葡萄糖或甘油作为单一碳源产生的紫色杆菌素的量的比较结果，图3C示出了使用甘油在PDVIO和PVIO菌株中产生脱氧紫色杆菌素前体和紫色杆菌素前体的结果，图3D示出了使用甘油在DVIO和VIO菌株中产生脱氧紫色杆菌素和紫色杆菌素的结果，图3E和3F示出了分别从大肠杆菌菌株产生的脱氧紫色杆菌素前体和紫色杆菌素前体的LC-MS色谱图和光谱，并且图3G示出了类胡萝卜素和紫色杆菌素类似物在350至750nm波长范围内的吸收光谱，其中图3G的图中的每个数据点均是从三个独立样品获得的平均值，并且将这些点连接以形成曲线图；
图4A至图4J示出了通过改变细胞形态和形成内膜囊泡来增加类胡萝卜素和紫色杆菌素类似物产生的结果，图4A示出了通过大肠杆菌的细胞形态改变而扩张细胞膜空间的机制，图4B和图4C分别示出了通过引入抑制细胞形态相关基因表达的sRNA而产生β-胡萝卜素和脱氧紫色杆菌素的结果，图4D示出了大肠杆菌中内膜囊泡的形成机制，图4E和图4F分别示出了β-胡萝卜素和脱氧紫色杆菌素的产生结果，并且图4G、图4H、图4I和图4J示出了作为β-胡萝卜素产生对照组的BTC1菌株、表达cav1的β-胡萝卜素产生菌株、作为脱氧紫色杆菌素产生对照组的DVIO菌株、和表达cav1的脱氧紫色杆菌素产生菌株的TEM(上面小图)和SEM(下面小图)图像，产生图中的误差条表示平均值±标准偏差(n＝3)，*P<0.05，**P<0.01、***P<0.001、NS(不显著)、P≥0.05是由双尾学生t检验确定；
图5A和图5B示出了其中细胞形态发生改变的BTC1和DVIO菌株的显微镜图像，图5A示出了BTC1菌株和引入有抑制细胞形态相关基因表达的sRNA的BTC1菌株的显微镜图像，并且图5B示出了DVIO菌株和引入有抑制细胞形态相关基因表达的sRNA的DVIO菌株的显微镜图像，其中在引入有抑制细胞形态相关基因表达的sRNA的菌株中观察到比对照组更长或更短的细胞形态，并且对于每张显微照片，标记了对应的表达抑制靶基因；
图6A至图6J示出了通过外膜囊泡的形成和分泌增加来增加类胡萝卜素和紫色杆菌素类似物产生的结果，图6A示出了大肠杆菌中外膜囊泡的形成机制，图6B和图6C分别示出了β-胡萝卜素和脱氧紫色杆菌素的产生结果，图6D和图6E分别示出了引入有抑制rffD和rfaD表达的sRNA的BTC1菌株和引入有抑制rfaI表达的sRNA的DVIO菌株的TEM(上面小图)和SEM(下面小图)图像，图6F示出了在纯化在引入有抑制rffD和rfaD表达的sRNA的BTC1菌株中形成的外细胞囊泡(上面小图)和在引入有抑制rfaI表达的sRNA的DVIO菌株中形成的外细胞囊泡(下面小图)之后用于分析的SEM图像，图6G示出了当形成内膜囊泡和外膜囊泡两者时β-胡萝卜素的产生结果，图6H示出了当应用细胞形态改变和内膜及外膜囊泡形成的组合时脱氧紫色杆菌素的产生结果，并且图6I和图6J分别示出了引入有抑制rffD和rfaD表达的sRNA并引入有cav1-plsBC的BTC1菌株和引入有抑制rfaI表达的sRNA并引入有cav1的DVIO菌株的TEM(上面小图)和SEM(下面小图)图像；
图7A至图7L示出了通过外膜囊泡分泌到培养基中的类胡萝卜素和紫色杆菌素类似物的定量分析结果，图7A示出了从引入有用于表达外膜囊泡(OMV)的sRNA的BTC1菌株培养液的上清液中提取的β-胡萝卜素，图7B示出了从纯化的外膜囊泡中提取的β-胡萝卜素，其中OMV指示引入有抑制rffD和rfaD表达的sRNA的BTC1菌株并且IMV指示引入有cav1和plsBC的BTC1菌株，图7C示出了从引入有用于表达外膜囊泡的sRNA的DVIO菌株培养液的上清液中提取的脱氧紫色杆菌素，图7D示出了从纯化的外膜囊泡中提取的脱氧紫色杆菌素，其中OMV指示引入有抑制rfaI表达的sRNA的DVIO菌株并且IMV指示引入有cav1的DVIO菌株，图7E示出了在引入有抑制rfaI表达的sRNA的DVIO的烧瓶培养期间在水洗涤后残留的由细胞、外膜囊泡和脱氧紫色杆菌素晶体构成的聚集体的显微镜图像，图7F和图7G分别示出了通过plsBC基因在表达外膜囊泡的β-胡萝卜素和脱氧紫色杆菌素产生菌株中过表达的烧瓶培养结果，并且图7H、图7I、图7J、图7K和图7L分别示出了对应于在表达外膜囊泡或内膜囊泡时玉米黄质、虾青素、脱氧紫色杆菌素前体、紫色杆菌素前体和紫色杆菌素的总产生量(由Tot表示)和分泌产生量(由Sec表示)的结果的图，其中误差条表示平均值±标准差(n＝3)，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、NS(不显著)、P≥0.05是由双尾学生t检验确定；并且
图8A至图8G示出了在使用本发明的重组微生物进行分批补料发酵时随时间产生相应的疏水性物质如虾青素、β-胡萝卜素、玉米黄质、紫色杆菌素前体、脱氧紫色杆菌素前体、紫色杆菌素和脱氧紫色杆菌素的结果。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。通常，本文所用的命名法在本领域中为熟知的并且为典型的。
除非另外指明，否则核酸从左至右以5’→方向列出，并且氨基酸从左至右以N末端→C末端方向列出。说明书内列举的数值范围包括定义范围的数字，包括所定义范围内的每个整数或任何非整数分数。
迄今为止，已进行许多尝试以通过操纵微生物的代谢网络来增加有色天然物质的产量，但由于物质在细胞中积聚的特征，对其施加了一些限制。在本发明中，通过以下方式大幅度增加产生的疏水性色素的量：以各种方式工程化细胞膜以扩大细胞膜面积、通过在细胞内产生结构来扩张细胞膜或将相应物质捕获在囊泡中以将其释放出细胞。
在本发明的一个实施方案中，在大肠杆菌产生天然色素如类胡萝卜素和紫色杆菌素类似物。类胡萝卜素和紫色杆菌素类似物是亲脂性物质，其当在大肠杆菌中产生时在细胞膜中积聚而不是在细胞质中或细胞外积聚。基于此，增加细胞膜面积并且在细胞内外形成囊泡，以便扩张天然亲脂性色素物质能够积聚的空间。具体地，构建产生三种类型的类胡萝卜素和四种类型的紫色杆菌素类似物中的每一种的大肠杆菌菌株，之后观察产生量随细胞膜面积的增加和囊泡的形成的变化。并且，测试并验证了本发明的单独要素在所有物质的产生中的协同效应。本发明研究中使用的策略可以高效地应用于在大肠杆菌中进行天然色素以及多种不同的亲脂性物质如抗氧化剂、抗生素、化妆品添加剂、抗癌剂、食品添加剂和营养补充剂的产生的研究。
在本发明的一个实施方案中，构建了一种能够产生工业中最频繁用的天然色素(如类胡萝卜素和紫色杆菌素)的疏水性物质产生菌株，并且以提高产生疏水性物质的能力为目标，使疏水性物质产生菌株经历细胞膜工程化，以便展现出诸如以下的特征：i)细胞膜面积增加，ii)外膜囊泡的形成和分泌增加，或iii)内膜囊泡的形成增加。为了通过细胞膜工程化将上述特征赋予菌株，筛选细胞形态相关基因和外膜囊泡相关基因，并且当通过用靶向细胞形态相关基因或外膜囊泡相关基因的sRNA处理来抑制相应基因的表达时或者当过表达内膜囊泡相关基因时，证实菌株产生天然色素的能力显著提高，并且基因表达抑制和过表达的组合展现出协同效应。
在本发明的一个实施方案中，已经证实通过抑制大肠杆菌中的细胞形态相关基因造成的细胞膜面积增加、通过抑制外膜囊泡相关基因造成的外膜囊泡的形成和分泌增加、以及通过过表达内膜囊泡相关基因造成的内膜囊泡的形成增加导致产生天然色素的能力显著改善，所述天然色素是在细胞膜中积聚的代表性疏水性物质。一般来讲，很容易理解，疏水性物质在疏水性细胞膜或囊泡的内膜和外膜中积聚，因此可以以与产生天然色素的能力等同的水平产生可以通过微生物产生的除天然色素之外的各种疏水性物质。
因此，本发明涉及一种用于产生疏水性物质的重组微生物，所述重组微生物经历细胞膜工程化，以便赋予以下中的至少一种特征：细胞膜面积增加、外膜囊泡的形成和分泌增加以及内膜囊泡的形成增加。
如本文所用，术语“细胞膜工程化”是指使用基因重组技术等增强或降低细胞的常规细胞膜特征或赋予其新特征的技术。在本发明中，细胞膜工程化利用对基因的抑制、过表达和/或引入进行，并且旨在赋予以下特征：增加细胞膜面积、增加外膜囊泡的形成和分泌和/或增加内膜囊泡的形成。
在本发明的一个实施方案中，通过在用于产生疏水性物质的重组微生物中通过基因的表达抑制、引入或过表达进行细胞膜工程化来赋予以上述特征。
因此，本发明的一个方面涉及一种用于产生疏水性物质的重组微生物，其中细胞形态相关基因和外膜囊泡相关基因中的至少一种基因被抑制和/或其中内膜囊泡相关基因被过表达或引入。
在本发明中，通过进行对细胞形态相关基因和外膜囊泡相关基因中的至少一种基因的抑制和/或对内膜囊泡相关基因的过表达或引入来工程化重组微生物，以便赋予重组微生物以下中的至少一种特征：i)细胞膜面积增加，ii)外膜囊泡的形成和分泌增加，和iii)内膜囊泡的形成增加。
在本发明中，疏水性物质的特征可以在于在细胞膜中积聚。疏水性物质的例子可以包括但不限于天然色素、抗氧化剂、抗生素、化妆品添加剂、抗癌剂、食品添加剂和营养补充剂。
在本发明中，天然色素是非人工合成但可从自然界中获得的色素或其类似物，其例子可以包括类胡萝卜素、紫色杆菌素等，并且其具体例子可以包括但不限于番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄质、虾青素、紫色杆菌素前体(PVIO)、脱氧紫色杆菌素前体(PDVIO)、脱氧紫色杆菌素(DVIO)、紫色杆菌素(VIO)等。
抗氧化剂物质的例子可以包括但不限于槲皮素、二氢槲皮素、山奈酚、二氢山奈酚、虾青素、白藜芦醇、生育酚、生育三烯酚、辅酶Q10、芹菜素等。
化妆品添加剂的例子可以包括但不限于芦荟苦素、维生素A、神经酰胺、泛酸酯、泛醇、羽扇豆醇、角鲨烯、桉树脑、瓦伦烯等。
食品添加剂的例子可以包括但不限于胭脂红酸、β-胡萝卜素、番茄红素等。
营养补充剂的例子可以包括但不限于水飞蓟素、叶黄素、维生素、辅酶-Q10、白藜芦醇、ω-3多不饱和脂肪酸、泛醌、葡糖胺、木犀草素等。
在本发明中，疏水性物质优选地选自虾青素、β-胡萝卜素、玉米黄质、紫色杆菌素前体、脱氧紫色杆菌素前体、脱氧紫色杆菌素和紫色杆菌素。
如本文所用，术语“细胞形态相关基因”是指参与维持细胞形态的基因，并且在本发明的一个实施方案中，细胞形态相关基因的表达被抑制以便通过使丝状重组细胞形态更不规则或更加呈球形增加疏水性物质积聚在其中的细胞膜的面积。在本发明中，可以包括但不限于任何细胞形态相关基因，只要其是在抑制其表达时能够通过改变细胞形态来增加细胞面积的基因。根据所使用的重组微生物的类型，本领域技术人员可以容易地选择这种基因，并且所述基因优选地选自形成、维持或改变重组微生物的固有细胞形态所需的基因，但是本发明不限于此。
在本发明中，细胞形态相关基因可以例如是参与细胞***的基因或参与细胞骨架/细胞壁的合成或维持的基因，但不限于此。
在本发明中，参与细胞***的基因可以是编码参与细胞***的原核生物来源酶组的基因，所述原核生物来源酶组包括例如细胞***蛋白(例如Fts蛋白等)和细胞***抑制剂(例如MinC、MinD等)，但不限于此。
在本发明中，参与细胞骨架/细胞壁的合成或维持的基因可以是编码原核生物来源酶组的基因，所述原核生物来源酶组包括例如青霉素结合蛋白(PBP)、细胞形状决定蛋白(MreB、MreC等)、肽聚糖D,D-转肽酶(MrdA、PbpA等)、肽聚糖糖基转移酶(MrdB等)、细胞骨架蛋白(RodZ等)等，但不限于此。
在本发明的一个实施方案中，在制备表达天然色素的重组大肠杆菌之后，通过抑制16种类型的筛选出的细胞形态相关基因(表4)的表达进行细胞膜工程化。例如，当重组微生物为大肠杆菌时，细胞形态相关基因可以选自rodZ(细胞骨架蛋白)、ftsA(细胞***蛋白)、ftsB(细胞***蛋白)、ftsI(肽聚糖D,D-转肽酶)、ftsL(细胞***蛋白)、ftsQ(细胞***蛋白)、ftsW(可能的肽聚糖糖基转移酶)、ftsZ(细胞***蛋白)、minD(隔膜位点决定蛋白)、mrdA(肽聚糖D,D-转肽酶)、mrdB(肽聚糖糖基转移酶)、mreB(细胞形状决定蛋白)、mreC(细胞形状决定蛋白)、zipA(细胞***蛋白)、murE(UDP-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酸-2,6-二氨基庚二酸连接酶)、pbpC(青霉素结合蛋白1C)及其组合，但不限于此。
更优选地，例如，脱氧紫色杆菌素产生重组大肠杆菌的特征在于作为细胞形态相关基因的mrdB基因的表达被抑制。
在本发明中，细胞形态相关基因可以适当地改变为或选自与本发明的实施方案中抑制的大肠杆菌细胞形态相关基因相对应的基因或执行基本相同功能的基因，这取决于所使用的微生物和要产生的疏水性物质。
如本文所用，术语“外膜囊泡相关基因”是指参与外膜囊泡的形成或分泌的基因。在本发明中，外膜囊泡相关基因可以是微生物的内源基因。在本发明的一个实施方案中，当通过抑制在维持细胞的外膜与内膜之间的连接或细胞的肽聚糖层中起作用的基因(其是外膜囊泡相关基因)的表达释放细胞中通过外膜囊泡积聚的疏水性物质时，产生疏水性物质的能力显著改善。在本发明中，可以非限制性地包括任何外膜囊泡相关基因，只要其是在被抑制表达时能够改善外膜囊泡的形成和分泌的基因。这种基因可以根据所使用的重组微生物的类型容易地选择，并且优选地是参与维持细胞的外膜与内膜之间的连接或细胞的肽聚糖层的基因，但不限于此。
在本发明中，外膜囊泡相关基因可以是外膜/肽聚糖结构维持相关基因、外膜蛋白表达基因或细胞膜代谢网络相关基因，但不限于此。
在本发明中，外膜/肽聚糖结构维持相关基因可以是编码有助于维持外膜/肽聚糖结构的原核生物来源酶组的基因，所述原核生物来源酶组如脂蛋白(Lpp)、Tol-Pal***蛋白(TolB、Pal、TolA、TolR等)、脂多糖核心生物合成蛋白、脂多糖核心庚糖基转移酶、脂质A生物合成月桂酰转移酶等，但不限于此。
在本发明中，外膜蛋白表达基因可以是编码有助于外膜蛋白表达的原核生物来源酶组的基因，所述原核生物来源酶组如外膜蛋白A(OmpA)、外膜蛋白C(OmpC)、外膜蛋白F(OmpF)、OprF(OmpA同源物)、包膜蛋白(RagA、RagB等)等，但不限于此。
在本发明中，细胞膜代谢网络相关基因可以与抗σ因子的表达相关。
在本发明中，细胞膜代谢网络相关基因可以是编码原核生物来源的细胞膜代谢网络酶组的基因，所述细胞膜代谢网络酶组如喹诺酮信号(PQS)、抗σ-E因子、σ因子H(AlgU)、分子伴侣蛋白酶(DegP)等，但不限于此。
在本发明的一个实施方案中，在制备表达天然色素的重组大肠杆菌之后，通过抑制26种筛选出的外膜囊泡相关基因(表7)的表达进行细胞膜工程化。例如，当重组微生物为大肠杆菌时，外膜囊泡相关基因可以选自rseA(抗σ-E因子)、rseB(σ-E因子调节蛋白)、rffD(UDP-N-乙酰-D-甘露糖胺脱氢酶)、rffC(dTDP-岩藻糖胺乙酰转移酶)、rffA(dTDP-4-氨基-4,6-二脱氧半乳糖转氨酶)、ompR(DNA结合双转录调节因子)、gmhB(D-甘油-β-D-甘露糖-庚醣-1,7-二磷酸7-磷酸酶)、lpxL(脂质A生物合成月桂酰转移酶)、lpxM(脂质A生物合成肉豆蔻酰转移酶)、ompA(外膜蛋白)、ompC(外膜蛋白)、rfaB(脂多糖1,6-半乳糖基转移酶)、rfaC(脂多糖庚糖基转移酶1)、rfaD(ADP-L-甘油-D-甘露糖-庚糖-6-差向异构酶)、rfaE(双功能蛋白HldE)、rfaG(脂多糖核心生物合成蛋白)、rfaI(脂多糖1,3-半乳糖基转移酶)、rfaJ(脂多糖1,2-葡糖基转移酶)、rfaK(脂多糖1,2-N-乙酰葡糖胺转移酶)、rfaP(脂多糖核心庚糖(I)激酶)、rfaQ(脂多糖核心庚糖基转移酶)、rfaY(脂多糖核心庚糖(II)激酶)、rfbA(葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶1)、rffH(葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶2)、wzxE(ECA多糖链长调节蛋白)、pnp(多核糖核苷酸核苷酸基转移酶)、tolA(大肠菌素输入膜蛋白)、tolB(Tol-Pal***周质蛋白)、tolC(外膜蛋白)、tolR(生物聚合物转运蛋白)、nlpI(脂蛋白)、nlpD(胞壁质水解酶激活因子)、ompF(外膜孔蛋白)、pal(肽聚糖相关外膜脂蛋白)、degS(丝氨酸内切蛋白酶)、degP(丝氨酸内切蛋白酶)、tatC(sec独立性蛋白转位酶蛋白)、lpp(胞壁质脂蛋白)及其组合，但不限于此。
例如，在产生类胡萝卜素(如虾青素、β-胡萝卜素或玉米黄质)的重组大肠杆菌中，可以抑制选自rfaD、rffD和rfaQ中的至少一种基因的表达，并且优选地，已经抑制rffD和rfaD基因的表达。
在另一个例子中，在产生紫色杆菌素及其类似物(如紫色杆菌素、脱氧紫色杆菌素前体、紫色杆菌素前体或脱氧紫色杆菌素)的重组大肠杆菌中，可以抑制rfaI或rfaQ基因的表达，并且优选地，可以抑制rfaI基因的表达。
在本发明中，外膜囊泡相关基因可以适当地改变为或选自与本发明的实施方案中抑制的外膜囊泡相关基因相对应的基因或执行基本相同功能的基因，这取决于所使用的微生物和要产生的疏水性物质。
如本文所用，术语“内膜囊泡相关基因”是指参与内膜囊泡形成的基因，并且在本发明的一个实施方案中，由于使用了大肠杆菌(其是没有内膜囊泡***的原核生物)，进行细胞膜工程化以便通过引入真核生物来源的内膜囊泡***的人类来源小窝基因而形成内膜。在本发明中，可以非限制性地选择和使用任何内膜囊泡相关基因，只要其是能够改善内膜囊泡的形成的基因。在本发明中，当用于产生疏水性物质的重组微生物是不具有内膜囊泡***的微生物时，可以引入形成内膜的真核生物或原核生物来源的另一种内膜囊泡***基因。在本发明中，当用于产生疏水性物质的重组细胞固有地包括内膜囊泡***时，可以过表达细胞本身的内膜囊泡基因，或者可以另外地引入真核生物或原核生物来源的另一种内膜囊泡***基因。
在本发明中，内膜囊泡相关基因可以是真核细胞来源的小窝***基因或网格蛋白-epsin***基因，或者可以是原核细胞来源的mgs-dgs***基因，并且可以更具体地选自cav1(小窝蛋白-1)、cav2(小窝蛋白-2)、cav3(小窝蛋白-3)、EPN1(epsin1)、CLINT1(epsinR)、CLTC(网格蛋白重链1)、CLTCL1(网格蛋白重链2)、CLTA(网格蛋白轻链A)、CLTB(网格蛋白轻链B)、AP180、AP2、almgs(1,2-二酰基甘油3-葡糖基转移酶)、aldgs(产生二葡糖基二酰基甘油的1,2-二酰基甘油-3-葡萄糖(1-2)-葡糖基转移酶)及其组合，但不限于此。
本发明中，在产生类胡萝卜素(如虾青素、β-胡萝卜素、玉米黄质)的重组大肠杆菌中，可以引入或过表达cav1基因。
在本发明中，在产生紫色杆菌素或其类似物(紫色杆菌素前体、脱氧紫色杆菌素前体和脱氧紫色杆菌素)的重组大肠杆菌中，可以引入或过表达cav1基因。
在本发明中，可以根据所使用的微生物和要产生的疏水性物质适当地改变或选择内膜囊泡相关基因。
在本发明的一个实施方案中，已经证实对细胞形态相关基因表达的抑制、对外膜囊泡相关基因表达的抑制和对内膜囊泡相关基因的引入的组合显示出协同效应，从而导致产生量的更大增加。
在本发明中，可以通过细胞膜工程化一起展现出诸如细胞膜面积增加、外膜囊泡的形成和分泌增加、内膜囊泡的形成增加等的特征，这取决于重组微生物的类型以及所产生的疏水性物质的类型、量、表达条件等。
在本发明中，可以根据重组微生物的类型以及要产生的疏水性物质的类型、量、表达条件等将对细胞形态相关基因表达的抑制、对外膜囊泡相关基因表达的抑制和对内膜囊泡相关基因的引入或过表达进行组合，并且可以组合属于单独相关基因的基因。
在本发明中，重组微生物的特征在于：i)抑制或敲低选自mrdB、rffD、rfaD和rfaI的至少一种基因，和/或ii)已经引入或过表达cav1基因。
在本发明的实施方案中证实的对于产生每种疏水性物质在重组微生物中显示出最大产生能力的基因抑制和引入/过表达的组合如下：
虾青素：rffD和rfaD敲低(OMV)；
β-胡萝卜素：rffD和rfaD敲低(OMV)；
玉米黄质：rffD和rfaD敲低(OMV)；
紫色杆菌素前体：rfaI敲低和cav1过表达(OMV和IMV)；
脱氧紫色杆菌素前体：rfaI敲低(OMV)；
紫色杆菌素：rfaI敲低和cav1过表达(OMV和IMV)；以及
脱氧紫色杆菌素：rfaI敲低和cav1过表达(OMV和IMV)。
因此，在本发明中，在产生类胡萝卜素色素组的重组微生物中，最优选的是同时抑制rfaD和rffD的表达，但本发明不限于此。
在本发明中，在产生紫色杆菌素及其类似物的重组微生物中，最优选的是抑制rfaI的表达并同时引入cav1基因或诱导其过表达，但本发明不限于此。
根据本发明的用于产生疏水性物质的重组菌株可以被赋予以下中的至少一种特征：细胞膜面积增加、外膜囊泡的形成和分泌增加以及内膜囊泡的形成增加。
在本发明的一个实施方案中，作为脂质合酶基因的plsBC基因的表达被扩增以便促进响应于细胞膜面积增加、外膜囊泡的形成和分泌增加以及内膜囊泡的形成增加的脂质供应。因此，证实了产生类胡萝卜素色素的能力明显提高。
在本发明中，用于产生疏水性物质的重组微生物的另外特征在于过表达脂质合酶基因。
例如，当微生物是大肠杆菌时，脂质合酶基因的过表达可以是plsBC基因的过表达。
如本文所用，术语“基因表达的抑制”是指抑制或调节待抑制基因的转录或翻译，从而降低或阻断编码蛋白的表达或阻止蛋白质正确发挥作用，由此失去基因的功能。在本发明中，术语“抑制”可以与“敲低”互换使用。在本发明中，可以抑制细胞形态相关基因的表达，以便增加细胞膜面积，并且为了增加外膜囊泡的形成和分泌，可以抑制外膜/肽聚糖结构维持相关基因、外膜蛋白表达基因或细胞膜代谢网络相关基因的表达。在本发明中，基因表达的抑制可以通过多种常规已知的方法进行。例如，可以通过以下方式来抑制基因表达：使用限制性酶、ZFN、TALEN或CRISPR/Cas的基因编辑，反义寡核苷酸(Nature Reviews DrugDiscovery 11(2):125-40)，核酶(Human Molecular Genetics,7(10):1649-1653)，使用siRNA、miRNA、shRNA等合成的调节性sRNA的RNA干扰技术(Na等人,Nat.Biotechnol.2013,31(2):170-174)等，但本发明不限于此。
如本文所用，术语“基因引入”是指将新的靶基因或包含所述新的靶基因的载体引入至靶细胞或微生物中。在本发明的一个实施方案中，对于基因引入，使用质粒载体将编码天然色素的基因引入至大肠杆菌中以构建天然色素产生菌株，以及使用质粒载体将内膜囊泡相关基因引入至重组微生物中以便促进内膜囊泡的形成。在本发明中，可以通过相关领域中已知的各种方法中的任一种将基因引入至重组微生物中。在本发明中，引入优选地是使用载体引入至微生物中，但本发明不限于此。在本发明中，基因可以直接引入至宿主细胞的基因组中，且因此可以作为染色体因子存在。对于本发明所属领域的技术人员清楚的是，即使当将基因***宿主细胞的基因组染色体中时，可以展现出与当将重组载体引入至宿主细胞中时的相同的作用。
如本文所用，术语基因的“过表达”意指与未经修饰的微生物相比所述基因的表达增加，从而导致与未经修饰的微生物相比核糖核酸、蛋白质或酶的细胞内浓度增加。本领域技术人员可以非限制性地选择和进行多种常规已知的基因过表达方法。
常规已知的过表达技术的例子如下：
-增加微生物中的基因拷贝数，其中基因在染色体上或染色体外编码，并且当基因位于染色体上时，可以通过本领域技术人员已知的重组方法(包括基因置换)将基因的若干个拷贝引入在染色体上，而当基因位于染色体外时，它可以由各种类型的质粒携带，所述质粒不同之处在于在细胞中的复制起点及其拷贝数，这些质粒以1至5个拷贝、约20个拷贝或最多500个拷贝存在于微生物中，这取决于质粒的特性：具有密集复制的低拷贝数质粒(pSC101、RK2)、低拷贝数质粒(pACYC、pRSF1010)或高拷贝数质粒(pSK bluescript II)；
-使用导致高基因表达的启动子，其中可以广泛使用启动子，例如Ptrc、Ptac、Plac或λ启动子PR和PL，但本发明不限于此，所述启动子是通过某些化合物或在某些外部条件如温度或光照下“可诱导的”，并且所述启动子是同源的或异源的；
-减弱基因的特异性或非特异性转录阻遏物的活性或表达；
-使用稳定相应信使RNA的元件(Carrier和Keasling,1999)或稳定蛋白质的元件(例如GST标签，GE Healthcare)；以及
-改变5'非翻译区(5'UTR)的序列，但本发明不限于此。
如本文所用，术语“载体”是指这样的核酸分子，所述核酸分子含有与能够在合适宿主中表达基因的合适表达控制序列可操作地连接的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、或潜在的基因组***物。在转化至适当的宿主中后，载体可以独立于宿主基因组复制和发挥作用，或者在一些情况下可以整合到基因组本身中。由于质粒是目前最常用的载体形式，因此“质粒”和“载体”有时在本发明的上下文中可互换使用。然而，本发明包括其他形式的载体，其功能等同于本领域已知的或正变得已知的那些载体。大肠杆菌中使用的蛋白质表达载体的例子可以包括可从Novagen(美国)获得的pET系列、pCDF系列、pRSF系列、pACYC系列和pCOLA系列；可从Invitrogen(美国)获得的pBAD系列；可从Takara(日本)获得的pHCE或pCOLD；可从Xenofocus(韩国)获得的pACE系列；可从KAIST(韩国)获得的pTac15K、pTrc99A、pTacCDFS和pTrcCDFS系列；可用于宽范围的菌株中的pBBR1MCS系列等。在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中，可以通过将靶基因***至基因组的某一部分来实现蛋白质表达，或者可以使用可从MoBiTech(德国)等获得的pHT载体。在霉菌或酵母中，可以使用基因组***或自我复制载体表达蛋白质。可以使用T-DNA***如根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)来使用植物蛋白表达载体。用于哺乳动物细胞培养物表达的典型表达载体可以是基于例如pRK5(EP307,247)、pSV16B(WO 91/08291)和pVL1392(Pharmingen)。
表述“表达控制序列”是指在某一宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。这种控制序列包括用于转录的启动子、用于调节这种转录的任意操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及用于调节转录和翻译终止的序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子、任意操纵子序列和核糖体结合位点。真核细胞包括启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。最影响质粒中基因的表达水平的因子是启动子。用于高表达的启动子的优选例子包括SRα启动子和巨细胞病毒来源的启动子。
为了表达本发明的DNA序列，可以在载体中使用各种表达控制序列中的任一种。除了以上所述的启动子之外，有用的表达控制序列的例子还包括SV40或腺病毒的早期和晚期启动子、lac***、trp***、TAC或TRC***、T3和T7启动子、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域、fd编码蛋白的控制区域、用于3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、磷酸酶的启动子(如Pho5)、酵母α-交配***的启动子以及已知控制原核或真核细胞或其病毒中基因的表达的其他组成型和诱导型启动子序列、及其各种组合。T7 RNA聚合酶启动子Φ可用于在大肠杆菌中表达蛋白质。
自然而然地应当理解的是，并非所有载体和表达控制序列在表达本发明的DNA序列时都等同地发挥作用。同样，并非所有宿主在同一表达***都等同地发挥作用。然而，本领域技术人员可以在不脱离本发明的范围的情况下从各种载体、表达控制序列和宿主中作出适当的选择而无需过多的实验负担。例如，在选择载体时，必须考虑宿主。这是因为载体必须在其中复制。还必须考虑载体的拷贝数、其控制拷贝数的能力以及由载体编码的其他蛋白质(例如抗生素标记物)的表达。在选择表达控制序列时，必须考虑各种因素。例如，特别是关于可能的二级结构，应考虑序列的相对强度、其控制的可能性以及与本发明的DNA序列的相容性等。应鉴于以下因素选择单细胞宿主：如所选的载体、由本发明的DNA序列编码的产物的毒性、分泌特性、正确折叠蛋白质的能力、培养和发酵要求、以及从宿主中纯化由本发明的DNA序列编码的产物的容易性。在这些因素的范围内，本领域技术人员可以选择能够在发酵或大型动物培养中表达本发明的DNA序列的载体、表达控制序列和宿主的各种组合。作为用于通过表达克隆而克隆cDNA的筛选方法，可以应用结合方法、淘选方法、膜乳液方法等。
在此类载体中，当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，所述核酸可称为是“可操作地连接的”。它可以是基因和一种或多种控制序列以这样的方式连接，所述方式使得适当的分子(例如转录激活蛋白)在与一种或多种控制序列结合时允许基因表达。例如，前序列或分泌性前导序列的DNA当作为参与多肽分泌的前蛋白表达时与多肽的DNA可操作地连接；启动子或增强子当影响编码序列的转录时与所述序列可操作地连接；核糖体结合位点当影响编码序列的转录时与所述序列可操作地连接；或者核糖体结合位点当定位以促进翻译时与编码序列可操作地连接。一般来讲，“可操作地连接”是指连接的DNA序列与其接触，并且还指分泌性前导序列与其接触并存在于阅读框中。然而，增强子不需要与其接触。这些序列的连接通过在便利的限制性酶切位点处的连接实现。当不存在这种位点时，根据典型方法使用合成寡核苷酸衔接子或接头。
可以使用诸如转化或转染的方法将重组载体引入至宿主细胞中。如本文所用，术语“转化”是指将DNA引入至宿主中，使得DNA变得可作为染色体外因子或通过染色体整合进行复制。如本文所用，术语“转染”是指表达载体被宿主细胞接受，而不论是否实际表达了任何编码序列。
如本领域熟知的，为了增加转染基因在重组细胞中的表达水平，相应的基因必须与在选择的表达宿主中发挥作用的转录和翻译表达控制序列可操作地连接。优选地，表达控制序列和相应的基因包含在包括细菌选择标记物和复制起点两者的单一表达载体中。当表达宿主是真核细胞时，表达载体还可以包括在真核表达宿主中有用的表达标记物。
在本发明中，作为用于产生疏水性物质的微生物，已经广泛使用原核细胞如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，所述原核细胞可以在短时间内以高浓度培养、易于遗传操纵且具有熟知的遗传和生理特征。除了原核细胞，最近，还可以使用单细胞真核细胞，如酵母(巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)等)、丝状真菌、昆虫细胞、植物细胞、诸如哺乳动物等的高等生物的细胞等作为用于产生重组蛋白的宿主细胞，以便解决蛋白质的翻译后修饰、分泌过程、活性三维结构和蛋白质活性状态的问题。不仅在实施例中举例说明的大肠杆菌或重组微生物的使用，而且其他宿主细胞的使用对于本领域技术人员将是容易清楚的。例如，CHO细胞系、HEK细胞系等可以用作用于表达的宿主细胞，但本发明不限于此。
在本发明中，可以使用各种各样的微生物/宿主细胞和载体组合。用于真核宿主的表达载体包括例如源自SV40、牛***瘤病毒、腺病毒、腺相关病毒、巨细胞病毒和逆转录病毒的表达控制序列。可用于细菌宿主中的表达载体包括细菌质粒，例如从大肠杆菌获得的那些(如pBluescript、pGEX2T、pUC载体、col E1、pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物)，广宿主范围细菌质粒(如pBBR1MCS及其衍生物)，诸如pET、pCDF、pRSF、pACYC、pCOLA、pBAD、pHCE、pCOLD、pACE、pTac15K、pTrc99A、pTacCDFS、pTrcCDFS及其衍生物的细菌质粒，可用于广泛宿主范围的质粒(如RP4)；噬菌体DNA，例如各种噬菌体λ衍生物(如λ和λNM989)和其他DNA噬菌体(如M13和丝状单链DNA噬菌体)。可用于酵母细胞的表达载体是2μ质粒及其衍生物。可用于昆虫细胞的载体是pVL 941。
在本发明中，用于产生疏水性物质的重组微生物是包含编码疏水性物质的内源或外源基因并因此具有表达疏水性物质的能力的微生物。当编码疏水性物质的基因是外源基因时，可以使通过引入至表达细胞中而赋予产生能力的表达微生物或重组表达微生物经历细胞膜工程化。将外源基因引入至微生物中的各种方法是相关领域已知的，其非限制性例子包括转化、转导等，并且可以由本领域技术人员选择适当的方法来制备产生疏水性物质的微生物。
在本发明中，重组微生物优选地选自大肠杆菌、根瘤菌属(Rhizobium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、红球菌属(Rhodococcus)、假丝酵母属(Candida)、欧文氏菌属(Erwinia)、肠杆菌属(Enterobacter)、巴氏杆菌属(Pasteurella)、曼氏杆菌属(Mannheimia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、聚集杆菌属(Aggregatibacter)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、弧菌属(Vibrio)、假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮菌属(Azotobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、红杆菌属(Rhodobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、蓝细菌(Cyanobacterium)和圆杆菌属(Cyclobacterium)，但不限于此。
如本文所用，术语“内源基因”意指基因在任何遗传修饰之前存在于微生物中。内源基因可以通过以下方式而过表达：除了内源调节元件之外还引入或代替内源调节元件引入异源序列，或将基因的一个或多个互补拷贝引入至染色体或质粒中。还可以修饰内源基因以调节与其对应的所编码蛋白质的表达和活性。例如，可以将突变引入至编码序列中以修饰基因产物，或者可以除了内源调节元件之外还引入或代替内源调节元件引入异源序列。内源基因的调节可以导致基因产物活性的上调和/或增强，或者可替代地，可以下调和/或降低内源基因产物的活性。
调节表达的另一种方式是用更强或更弱的启动子交换基因的内源启动子(例如野生型启动子)以上调或下调内源基因的表达。这些启动子可以是同源的或异源的。选择适当的启动子完全在本领域技术人员的能力之内。
相反，术语“外源基因”意指通过本领域技术人员熟知的手段将基因引入至微生物中并且该基因不是天然存在于微生物中的。外源基因可以整合到宿主染色体中，或者可以通过质粒或载体在染色体外表达。不同之处在于细胞中的复制起点及拷贝数的多种质粒是本领域熟知的。这些基因可以是同源的。
如本文所用，术语“同源基因”不限于指定具有理论上共同遗传祖先的基因，而是包括尽管在遗传上无关但已进化为编码执行相似功能和/或具有相似结构的蛋白质的基因。因此，出于本发明的目的，术语“功能同源物”涉及这样的事实，即某些酶活性不仅可以由具有确定氨基酸序列的特定蛋白质提供，还可以由来自其他(非)相关微生物的具有相似序列的蛋白质提供。
使用GenBank中关于已知基因给出的参考，本领域技术人员可以确定其他生物、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等效基因。该常规工作有利地使用共有序列进行，所述共有序列可以通过与源自其他微生物的基因进行序列比对并设计简并探针以在另一生物中克隆相应基因来确定。分子生物学的这些常规方法是本领域技术人员熟知的。
本发明的另一方面涉及一种制备用于产生疏水性物质的重组微生物的方法，所述方法包括通过以下中的至少一种进行细胞膜工程化：对细胞形态相关基因和外膜囊泡相关基因中的至少一种基因的抑制、以及对内膜囊泡相关基因的过表达或引入。
在本发明中，细胞膜工程化步骤的另外特征在于脂质合酶基因表达的增加。
例如，当微生物是大肠杆菌时，脂质合酶基因表达的增加可以是plsBC基因的额外过表达。
在本发明中，使用以上所述方法制备的重组微生物可以展现出以下中的至少一种特征：细胞表面积增加、外膜囊泡的形成和分泌增加以及内膜囊泡的形成增加。
使用本发明方法制备的重组微生物具有以下中的至少一种特征：细胞表面积增加、外膜囊泡的形成和分泌增加、以及内膜囊泡的形成增加，从而大大提高重组微生物产生在细胞膜中积聚的疏水性物质的能力。
在本发明中，细胞形态相关基因可以例如是参与细胞***的基因或参与细胞骨架/细胞壁的合成或维持的基因，但不限于此。
在本发明中，参与细胞***的基因可以是编码参与细胞***的原核生物来源酶组的基因，所述原核生物来源酶组包括例如细胞***蛋白(例如Fts蛋白等)和细胞***抑制剂(例如MinC、MinD等)，但不限于此。
在本发明中，参与细胞骨架/细胞壁的合成或维持的基因可以是编码原核生物来源酶组的基因，所述原核生物来源酶组包括例如青霉素结合蛋白(PBP)、细胞形状决定蛋白(MreB、MreC等)、肽聚糖D,D-转肽酶(MrdA、PbpA等)、肽聚糖糖基转移酶(MrdB等)、细胞骨架蛋白(RodZ等)等，但不限于此。
例如，当重组微生物为大肠杆菌时，细胞形态相关基因可以选自rodZ(细胞骨架蛋白)、ftsA(细胞***蛋白)、ftsB(细胞***蛋白)、ftsI(肽聚糖D,D-转肽酶)、ftsL(细胞***蛋白)、ftsQ(细胞***蛋白)、ftsW(可能的肽聚糖糖基转移酶)、ftsZ(细胞***蛋白)、minD(隔膜位点决定蛋白)、mrdA(肽聚糖D,D-转肽酶)、mrdB(肽聚糖糖基转移酶)、mreB(细胞形状决定蛋白)、mreC(细胞形状决定蛋白)、zipA(细胞***蛋白)、murE(UDP-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酸-2,6-二氨基庚二酸连接酶)、pbpC(青霉素结合蛋白1C)及其组合，但不限于此。在本发明中，当产生脱氧紫色杆菌素时，最优选的是抑制mrdB基因的表达。
在本发明中，可以非限制性地包括任何外膜囊泡相关基因，只要其是在被抑制时能够增强外膜囊泡的形成和分泌的基因，并且所述任何外膜囊泡相关基因可以根据所使用的重组微生物的类型容易地选择。
在本发明中，外膜囊泡相关基因可以是外膜/肽聚糖结构维持相关基因、外膜蛋白表达基因或细胞膜代谢网络相关基因，但不限于此。
在本发明中，外膜/肽聚糖结构维持相关基因可以是编码有助于维持外膜/肽聚糖结构的原核生物来源酶组的基因，所述原核生物来源酶组如脂蛋白(Lpp)、Tol-Pal***蛋白(TolB、Pal、TolA、TolR等)、脂多糖核心生物合成蛋白、脂多糖核心庚糖基转移酶、脂质A生物合成月桂酰转移酶等，但不限于此。
在本发明中，外膜蛋白表达基因可以是编码有助于外膜蛋白表达的原核生物来源酶组的基因，所述原核生物来源酶组如外膜蛋白A(OmpA)、外膜蛋白C(OmpC)、外膜蛋白F(OmpF)、OprF(OmpA同源物)、包膜蛋白(RagA、RagB等)等，但不限于此。
在本发明中，细胞膜代谢网络相关基因可以是编码原核生物来源的细胞膜代谢网络酶组的基因，所述细胞膜代谢网络酶组如喹诺酮信号(PQS)、抗σ-E因子、σ因子H(AlgU)、分子伴侣蛋白酶(DegP)等，但不限于此。
在本发明的一个实施方案中，在制备表达天然色素的重组大肠杆菌之后，通过抑制26种筛选出的外膜囊泡相关基因(表7)的表达进行细胞膜工程化。在本发明中，当重组微生物为大肠杆菌时，外膜囊泡相关基因可以选自rseA(抗σ-E因子)、rseB(σ-E因子调节蛋白)、rffD(UDP-N-乙酰-D-甘露糖胺脱氢酶)、rffC(dTDP-岩藻糖胺乙酰转移酶)、rffA(dTDP-4-氨基-4,6-二脱氧半乳糖转氨酶)、ompR(DNA结合双转录调节因子)、gmhB(D-甘油-β-D-甘露糖-庚醣-1,7-二磷酸7-磷酸酶)、lpxL(脂质A生物合成月桂酰转移酶)、lpxM(脂质A生物合成肉豆蔻酰转移酶)、ompA(外膜蛋白)、ompC(外膜蛋白)、rfaB(脂多糖1,6-半乳糖基转移酶)、rfaC(脂多糖庚糖基转移酶1)、rfaD(ADP-L-甘油-D-甘露糖-庚糖-6-差向异构酶)、rfaE(双功能蛋白HldE)、rfaG(脂多糖核心生物合成蛋白)、rfaI(脂多糖1,3-半乳糖基转移酶)、rfaJ(脂多糖1,2-葡糖基转移酶)、rfaK(脂多糖1,2-N-乙酰葡糖胺转移酶)、rfaP(脂多糖核心庚糖(I)激酶)、rfaQ(脂多糖核心庚糖基转移酶)、rfaY(脂多糖核心庚糖(II)激酶)、rfbA(葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶1)、rffH(葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶2)、wzxE(ECA多糖链长调节蛋白)、pnp(多核糖核苷酸核苷酸基转移酶)、tolA(大肠菌素输入膜蛋白)、tolB(Tol-Pal***周质蛋白)、tolC(外膜蛋白)、tolR(生物聚合物转运蛋白)、nlpI(脂蛋白)、nlpD(胞壁质水解酶激活因子)、ompF(外膜孔蛋白)、pal(肽聚糖相关外膜脂蛋白)、degS(丝氨酸内切蛋白酶)、degP(丝氨酸内切蛋白酶)、tatC(sec独立性蛋白转位酶蛋白)、lpp(胞壁质脂蛋白)及其组合，但不限于此。
在本发明中，当用于产生疏水性物质的重组微生物是不具有内膜囊泡***的微生物时，可以引入形成内膜的真核生物或原核生物来源的另一种内膜囊泡***基因。在本发明中，当用于产生疏水性物质的重组细胞固有地包括内膜囊泡***时，可以过表达细胞本身的内膜囊泡基因，或者可以另外地引入真核生物或原核生物来源的另一种内膜囊泡***基因。在本发明中，内膜囊泡相关基因可以是真核细胞来源的小窝***基因或网格蛋白-epsin***基因，或者可以是原核细胞来源的mgs-dgs***基因，并且更具体地可以选自cav1(小窝蛋白-1)、cav2(小窝蛋白-2)、cav3(小窝蛋白-3)、EPN1(epsin1)、CLINT1(epsinR)、CLTC(网格蛋白重链1)、CLTCL1(网格蛋白重链2)、CLTA(网格蛋白轻链A)、CLTB(网格蛋白轻链B)、AP180、AP2、almgs(1,2-二酰基甘油3-葡糖基转移酶)、aldgs(产生二葡糖基二酰基甘油的1,2-二酰基甘油-3-葡萄糖(1-2)-葡糖基转移酶)及其组合，但不限于此。
在本发明中，重组微生物可以选自大肠杆菌、根瘤菌属、双歧杆菌属、红球菌属、假丝酵母属、欧文氏菌属、肠杆菌属、巴氏杆菌属、曼氏杆菌属、放线杆菌属、聚集杆菌属、黄单胞菌属、弧菌属、假单胞菌属、固氮菌属、不动杆菌属、罗尔斯通氏菌属、土壤杆菌属、红杆菌属、发酵单胞菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、乳球菌属、链球菌属、乳杆菌属、梭菌属、棒杆菌属、链霉菌属、双歧杆菌属、蓝细菌和圆杆菌属。
本发明的还另一方面涉及一种制备疏水性物质的方法，所述方法包括通过培养根据本发明的用于产生疏水性物质的重组微生物或使用以上所述方法制备的用于产生疏水性物质的重组微生物来产生疏水性物质；并且获得所产生的疏水性物质。
在本发明中，通过培养用于产生疏水性物质的重组微生物来产生疏水性物质的步骤可以非限制性地通过多种常规已知的微生物培养方法进行，并且培养可以通过适当地选择培养基、培养条件(温度、时间、物理条件)等进行，这取决于菌株、要产生的物质等。
如本文所用，术语“培养”意指培养微生物以获得所需功效，并且本发明中的所需功效是产生疏水性物质。培养通常可以在培养箱中进行，所述培养箱具有适当培养基，所述适当培养基适于所使用的微生物并且含有至少一种简单碳源以及必要时的共底物。
在本发明中，在通过微生物培养产生疏水性物质的意义上，术语“培养”可以与“发酵”互换使用。
在本发明中，通过培养重组微生物来产生疏水性物质的步骤可以通过分批补料发酵来进行。
如本文所用，术语“分批补料培养”和“分批补料发酵”是指通过间歇地另外供应培养基以控制培养液浓度的培养/发酵。
“适当培养基”可以包括碳源、碳底物、氮源(如蛋白胨)、葡萄糖、甘油、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或磷酸铵、磷源(如磷酸二氢钾或磷酸氢二钾)、微量元素(例如金属盐)(如镁盐、钴盐和/或锰盐)、生长因子如氨基酸和维生素(其是维持和/或生长细胞必需或有益的营养素)、酵母提取物、抗生素等。本发明中，为了产生疏水性物质，可以在适当的温度范围(例如30℃至40℃，并且优选地35至38℃)内进行培养，但本发明不限于此，并且培养条件可以根据宿主微生物的种类、要表达的物质等而变化。
本发明旨在通过由进行细胞膜工程化导致的细胞膜面积增加、外膜囊泡的形成和分泌增加、或内膜囊泡的形成增加来提高产生在细胞膜中积聚的疏水性物质的能力。在本发明的一个实施方案中，已经证实通过抑制大肠杆菌中的细胞形态相关基因的表达造成的细胞膜面积增加、通过抑制外膜囊泡相关基因的表达造成的外膜囊泡的形成和分泌增加、以及通过过表达内膜囊泡相关基因造成的内膜囊泡的形成增加导致产生天然色素的能力大大提高，所述天然色素是在细胞膜中积聚的代表性疏水性物质。总体上，由于疏水性物质在疏水性细胞膜或囊泡的内膜和外膜中积聚，因此很明显，可以展现出改善的产生能够由微生物产生的除了天然色素之外还有各种疏水性物质的能力。
因此，通过根据本发明的重组微生物产生的疏水性物质的特征在于在细胞膜中积聚。疏水性物质的例子可以是但不限于天然色素、抗氧化剂、抗生素、化妆品添加剂、抗癌剂、食品添加剂和营养补充剂。
在本发明中，天然色素是非人工合成但可从自然界中获得的色素或其类似物，其例子可以包括类胡萝卜素、紫色杆菌素等，并且其具体例子可以包括但不限于番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄质、虾青素、紫色杆菌素前体(PVIO)、脱氧紫色杆菌素前体(PDVIO)、脱氧紫色杆菌素(DVIO)、紫色杆菌素(VIO)等。
抗氧化剂物质的例子可以包括但不限于槲皮素、二氢槲皮素、山奈酚、二氢山奈酚、虾青素、白藜芦醇、生育酚、生育三烯酚、辅酶Q10、芹菜素等。
化妆品添加剂的例子可以包括但不限于芦荟苦素、维生素A、神经酰胺、泛酸酯、泛醇、羽扇豆醇、角鲨烯、桉树脑、瓦伦烯等。
食品添加剂的例子可以包括但不限于胭脂红酸、β-胡萝卜素、番茄红素等。
营养补充剂的例子可以包括但不限于水飞蓟素、叶黄素、维生素、辅酶-Q10、白藜芦醇、ω-3多不饱和脂肪酸、泛醌、葡糖胺、木犀草素等。
在本发明的一个实施方案中，证实了通过进行如上所述的各种基因的抑制、引入或过表达，制备了根据本发明的用于产生疏水性物质的重组微生物，并且其产生疏水性物质的总体能力得以维持或显著改善，但显示出增强产生能力的最明显效果的基因组合的细胞膜工程化根据要产生的疏水性物质而不同。
由于疏水性物质在细胞膜中展现出聚积现象即是疏水性的，因此经历细胞膜工程化以增加细胞膜面积、增加外膜囊泡的形成和分泌以及增加内膜囊泡的形成的本发明的重组微生物可以展现出提高的产生疏水性物质的能力。
因此，可以将本发明的经历细胞膜工程化的用于产生疏水性物质的微生物通过对各种基因组合的抑制、引入或过表达构建成文库，并且从选择和开发具有提高的产生疏水性物质的能力的重组菌株的成本、程序和时间方面来看，使用文库筛选显示出高的产生特定疏水性物质的能力的菌株是有用的。
因此，本发明的又另一方面涉及一种用于产生疏水性物质的微生物文库，所述微生物文库通过在用于产生疏水性物质的微生物中通过以下中的至少一种进行细胞膜工程化而获得：对细胞形态相关基因表达的抑制、对外膜囊泡相关基因表达的抑制以及对内膜囊泡相关基因的引入或过表达。
本发明的再又另一方面涉及一种筛选经历细胞膜工程化的、具有提高的产生特定疏水性物质的能力的重组微生物的方法，所述方法包括(a)通过在用于产生疏水性物质的微生物中通过以下中的至少一种进行细胞膜工程化来构建用于产生疏水性物质的微生物文库：对细胞形态相关基因表达的抑制、对外膜囊泡相关基因表达的抑制和对内膜囊泡相关基因的引入或过表达；并且(b)通过培养用于产生疏水性物质的所述微生物来选择具有高的产生特定疏水性物质的能力的重组微生物。
在本发明中，具有诸如细胞膜面积增加、外膜囊泡的形成和分泌增加和/或内膜囊泡的形成增加的特征的用于产生疏水性物质的微生物文库可以通过以下方式产生：利用疏水性物质在细胞膜中积聚的现象，通过对相关基因组的抑制或过表达进行细胞膜工程化；并且基于此，可以筛选具有提高的产生特定疏水性物质的能力的重组菌株。
在本发明中，“用于产生疏水性物质的微生物文库”可以通过以下方式获得：单独地或以任何组合进行以下：对细胞形态相关基因表达的抑制、对外膜囊泡相关基因表达的抑制以及对内膜囊泡相关基因的引入或过表达。
在本发明中，步骤(a)中的细胞膜工程化的另外特征可以在于在用于产生疏水性物质的微生物文库中增加脂质合酶基因的表达。
在本发明中，文库可以包括所有的其中细胞形态相关基因的表达单独地或以任何组合被抑制的重组微生物。
在本发明中，细胞形态相关基因可以包括任何参与维持细胞形态的基因。
在本发明中，可以非限制性地包括任何细胞形态相关基因，只要其是在抑制其表达时能够通过改变细胞形态来增加细胞面积的基因，并且该基因可以由本领域技术人员根据所使用的重组微生物的类型容易地选择。
在本发明中，细胞形态相关基因可以例如是参与细胞***的基因或参与细胞骨架/细胞壁的合成或维持的基因，但不限于此。
在本发明中，参与细胞***的基因可以是编码原核生物来源酶组的内源基因，所述原核生物来源酶组如细胞***蛋白(例如Fts蛋白等)或细胞***抑制剂(例如MinC、MinD等)，但不限于此。
在本发明中，参与细胞骨架/细胞壁的合成或维持的基因可以是编码原核生物来源酶组的内源基因，所述原核生物来源酶组如青霉素结合蛋白(PBP)、细胞形状决定蛋白(MreB、MreC等)、肽聚糖D,D-转肽酶(MrdA、PbpA等)、肽聚糖糖基转移酶(MrdB等)、细胞骨架蛋白(RodZ等)等，但不限于此。
在本发明中，例如当用于制备文库的重组微生物为大肠杆菌时，细胞形态相关基因可以选自rodZ(细胞骨架蛋白)、ftsA(细胞***蛋白)、ftsB(细胞***蛋白)、ftsI(肽聚糖D,D-转肽酶)、ftsL(细胞***蛋白)、ftsQ(细胞***蛋白)、ftsW(可能的肽聚糖糖基转移酶)、ftsZ(细胞***蛋白)、minD(隔膜位点决定蛋白)、mrdA(肽聚糖D,D-转肽酶)、mrdB(肽聚糖糖基转移酶)、mreB(细胞形状决定蛋白)、mreC(细胞形状决定蛋白)、zipA(细胞***蛋白)、murE(UDP-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酸-2,6-二氨基庚二酸连接酶)、pbpC(青霉素结合蛋白1C)及其组合，但不限于此。
在本发明中，文库可以包括所有的其中外膜囊泡相关基因的表达单独地或以任何组合被抑制的重组微生物。
在本发明中，可以非限制性地包括任何外膜囊泡相关基因，只要其是参与外膜囊泡的形成或分泌的基因。
在本发明中，外膜囊泡相关基因可以是在维持细胞的外膜与内膜之间的连接或细胞的肽聚糖层中起作用的基因。
在本发明中，外膜囊泡相关基因可以是外膜/肽聚糖结构维持相关基因、外膜蛋白表达基因或细胞膜代谢网络相关基因，但不限于此。
在本发明中，外膜/肽聚糖结构维持相关基因可以是编码有助于维持外膜/肽聚糖结构的原核生物来源酶组的基因，所述原核生物来源酶组如脂蛋白(Lpp)、Tol-Pal***蛋白(TolB、Pal、TolA、TolR等)、脂多糖核心生物合成蛋白、脂多糖核心庚糖基转移酶、脂质A生物合成月桂酰转移酶等，但不限于此。
在本发明中，外膜蛋白表达基因可以是编码有助于外膜蛋白表达的原核生物来源酶组的基因，所述原核生物来源酶组如外膜蛋白A(OmpA)、外膜蛋白C(OmpC)、外膜蛋白F(OmpF)、OprF(OmpA同源物)、包膜蛋白(RagA、RagB等)等，但不限于此。
在本发明中，细胞膜代谢网络相关基因可以是编码原核生物来源的细胞膜代谢网络酶组的基因，所述细胞膜代谢网络酶组如喹诺酮信号(PQS)、抗σ-E因子、σ因子H(AlgU)、分子伴侣蛋白酶(DegP)等，但不限于此。
在本发明中，例如，当重组微生物为大肠杆菌时，外膜囊泡相关基因可以选自rseA(抗σ-E因子)、rseB(σ-E因子调节蛋白)、rffD(UDP-N-乙酰-D-甘露糖胺脱氢酶)、rffC(dTDP-岩藻糖胺乙酰转移酶)、rffA(dTDP-4-氨基-4,6-二脱氧半乳糖转氨酶)、ompR(DNA结合双转录调节因子)、gmhB(D-甘油-β-D-甘露糖-庚醣-1,7-二磷酸7-磷酸酶)、lpxL(脂质A生物合成月桂酰转移酶)、lpxM(脂质A生物合成肉豆蔻酰转移酶)、ompA(外膜蛋白)、ompC(外膜蛋白)、rfaB(脂多糖1,6-半乳糖基转移酶)、rfaC(脂多糖庚糖基转移酶1)、rfaD(ADP-L-甘油-D-甘露糖-庚糖-6-差向异构酶)、rfaE(双功能蛋白HldE)、rfaG(脂多糖核心生物合成蛋白)、rfaI(脂多糖1,3-半乳糖基转移酶)、rfaJ(脂多糖1,2-葡糖基转移酶)、rfaK(脂多糖1,2-N-乙酰葡糖胺转移酶)、rfaP(脂多糖核心庚糖(I)激酶)、rfaQ(脂多糖核心庚糖基转移酶)、rfaY(脂多糖核心庚糖(II)激酶)、rfbA(葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶1)、rffH(葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶2)、wzxE(ECA多糖链长调节蛋白)、pnp(多核糖核苷酸核苷酸基转移酶)、tolA(大肠菌素输入膜蛋白)、tolB(Tol-Pal***周质蛋白)、tolC(外膜蛋白)、tolR(生物聚合物转运蛋白)、nlpI(脂蛋白)、nlpD(胞壁质水解酶激活因子)、ompF(外膜孔蛋白)、pal(肽聚糖相关外膜脂蛋白)、degS(丝氨酸内切蛋白酶)、degP(丝氨酸内切蛋白酶)、tatC(sec独立性蛋白转位酶蛋白)、lpp(胞壁质脂蛋白)及其组合，但不限于此。
在本发明中，文库可以包括所有的其中内膜囊泡相关基因的表达单独地或以任何组合被抑制的重组微生物。
在本发明中，可以非限制性地包括任何内膜囊泡相关基因，只要其是参与内膜囊泡的形成的基因。
在本发明中，可以非限制性地选择和使用任何内膜囊泡相关基因，只要其是能够改善内膜囊泡的形成的基因。在本发明中，当用于产生疏水性物质的重组微生物是不具有内膜囊泡***的微生物时，可以引入形成内膜的真核生物或原核生物来源的另一种内膜囊泡***基因以提供文库。
在本发明中，当用于产生疏水性物质的重组微生物固有地包括内膜囊泡***时，可以过表达内膜囊泡相关基因，或者可以另外地引入真核或原核生物来源的另一种内膜囊泡***基因。
在本发明中，内膜囊泡相关基因可以是真核细胞来源的小窝***基因或网格蛋白-epsin***基因，或者可以是原核细胞来源的mgs-dgs***基因，并且可以更具体地选自cav1(小窝蛋白-1)、cav2(小窝蛋白-2)、cav3(小窝蛋白-3)、EPN1(epsin1)、CLINT1(epsinR)、CLTC(网格蛋白重链1)、CLTCL1(网格蛋白重链2)、CLTA(网格蛋白轻链A)、CLTB(网格蛋白轻链B)、AP180、AP2、almgs(1,2-二酰基甘油3-葡糖基转移酶)、aldgs(产生二葡糖基二酰基甘油的1,2-二酰基甘油-3-葡萄糖(1-2)-葡糖基转移酶)及其组合，但不限于此。
在本发明中，用于产生疏水性物质的微生物文库可以包括重组微生物，其中选自细胞形态相关基因、外膜囊泡相关基因和内膜囊泡相关基因的任何一种基因或这些基因的任何组合被抑制、引入或过表达。
在本发明中，用于产生疏水性物质的微生物文库可以包括单一属或单一物种的微生物，并且可以包括其与不同属或物种微生物的混合物。
在本发明中，用于产生疏水性物质的微生物文库可以包括选自大肠杆菌、根瘤菌属、双歧杆菌属、红球菌属、假丝酵母属、欧文氏菌属、肠杆菌属、巴氏杆菌属、曼氏杆菌属、放线杆菌属、聚集杆菌属、黄单胞菌属、弧菌属、假单胞菌属、固氮菌属、不动杆菌属、罗尔斯通氏菌属、土壤杆菌属、红杆菌属、发酵单胞菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、乳球菌属、链球菌属、乳杆菌属、梭菌属、棒杆菌属、链霉菌属、双歧杆菌属、蓝细菌、圆杆菌属及其组合的任何微生物。
在本发明中，用于产生疏水性物质的微生物文库可以被赋予以下中的至少一种特征：细胞膜面积增加、外膜囊泡的形成和分泌增加以及内膜囊泡的形成增加。
实施例
通过以下实施例可以更好地理解本发明。然而，这些实施例不应被解释为限制本发明，并且对于本领域技术人员清楚的是，在本发明的精神和范围内可以进行各种修改或改变。
实施例1：天然色素产生菌株的构建
实施例1-1：类胡萝卜素产生菌株的构建
类胡萝卜素造成可见光谱中的红色、橙色和黄色。代表性的类胡萝卜素是分别具有橙色、黄色和红色的β-胡萝卜素、玉米黄质和虾青素。在构建产生三种类型的类胡萝卜素的大肠杆菌之前，首先构建产生作为它们的前体的番茄红素的菌株。由于大肠杆菌能够通过1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸产生途径产生法尼基二磷酸，因此需要引入三种基因，即crtE、crtB和crtI，以便产生位于类胡萝卜素合成途径的上游的番茄红素(图1)。为了防止不必要的前体积聚并平衡代谢流，筛选了单独基因的表达水平的各种组合。通过改变5'非翻译区(5'UTR)的序列来调节表达水平(图2A)。使用UTR文库设计程序为每种基因构建由总共16种5'UTR序列构成的5'UTR序列文库。将融合16种不同的5'UTR序列的单独基因组合并引入至pTac15K质粒中以构建pLYC文库。为了构建pLYC文库，首先使用[SEQ ID NO:1]和[SEQ IDNO:2]的引物通过PCR扩增使pTac15K质粒线性化。接着，在pCar184质粒中分别使用[SEQ IDNO:3]和[SEQ ID NO:4]、[SEQ ID NO:5]和[SEQ ID NO:6]以及[SEQ ID NO:7]和[SEQ IDNO:8]的引物对crtE、crtB和crtI基因进行PCR扩增(Choi等人,Appl.Environ.Microbiol.2010,76(10):3097-3105)，且然后通过Gibson组装克隆到线性化的pTac15k质粒中。
[表1]
用于构建番茄红素产生菌株的引物
Figure BDA0003331558180000281
Figure BDA0003331558180000291
将所构建的pLYC文库引入至由本研究团队在先前研究中开发的大肠杆菌WLGB-RPP菌株中，之后从10倍于pLYC文库大小的菌落中选择出200个颜色特别深的菌落且然后进行试管培养，之后提取产生的番茄红素，测量474nm处的吸光度，并且比较其结果。其中，将前10个菌株在烧瓶中进一步培养，并且番茄红素在LYC79菌株中的最大产生量为23.90mg/L。
基于所选择的LYC79菌株，以同样的方式构建产生β-胡萝卜素、玉米黄质和虾青素的菌株。首先，另外需要用于从番茄红素产生β-胡萝卜素的crtY基因、用于从β-胡萝卜素产生玉米黄质的crtZ和用于从玉米黄质产生虾青素的BKT。对于这些基因中的每一种，构建由16种不同的5'UTR序列构成的5'UTR文库并将其融合至基因的5'端。
为了构建pBTC文库，首先，使用[SEQ ID NO:9]和[SEQ ID NO:10]的引物通过PCR扩增使pTrcCDFS质粒线性化。另外，将从pCar184质粒使用[SEQ ID NO:11]和[SEQ ID NO:12]的引物经PCR扩增的crtY通过Gibson组装克隆至线性化的pTrcCDFS中。为了构建pZEA文库，将从pCar184使用[SEQ ID NO:11]和[SEQ ID NO:13]的引物以及[SEQ ID NO:14]和[SEQ ID NO:15]的引物经PCR扩增的crtY和crtZ通过Gibson组装克隆到线性化的pTrcCDFS中。为了构建pATX文库，将pAX1质粒中使用[SEQ ID NO:16]和[SEQ ID NO:17]的引物经PCR扩增的trCrBKT(Park等人,Metab.Eng.2018,49:105-115)***至pZEA的SalI/HindIII位点中。
[表2]
用于构建产生β-胡萝卜素、玉米黄质和虾青素的菌株的引物
Figure BDA0003331558180000292
Figure BDA0003331558180000301
将所构建的pBTC、pZEA和pATX文库中的每一种分别引入至LYC79菌株中，并且通过外观检查选出20、40、200个菌落且然后在试管中培养。将产生的β-胡萝卜素、玉米黄质、虾青素用丙酮提取，在473、452、475nm波长处测量吸光度，并且比较产生浓度。在此，由于虾青素的颜色与作为其前体的角黄素的颜色无法用肉眼或通过吸光度测量区分，因此基于吸光度测量结果对前50个菌株另外进行HPLC分析。对在试管培养时以最大量产生β-胡萝卜素、玉米黄质和虾青素的3、5和10个菌株进行烧瓶培养。BTC1、ZEA20和ATX68菌株分别显示出最高的β-胡萝卜素(18.65mg/L)、玉米黄质(12.67mg/L)和虾青素(14.49mg/L)产生，并且被选择为最终菌株(图2A至图2J)。
1-2.紫色杆菌素类似物产生菌株的构建
除了类胡萝卜素，为了完成可见光谱，本研究团队还产生了紫色杆菌素类似物。紫色杆菌素类似物被归类为双吲哚色素，由诸如青紫色素杆菌(Chromobacteriumviolaceum)、蓝黑紫色杆菌(Janthinobacterium lividum)的细菌产生，并且已知具有各种药理作用，如抗癌作用。因此，本研究团队构建了生物合成途径来产生四种类型的紫色杆菌素类似物，即脱氧紫色杆菌素前体、紫色杆菌素前体、脱氧紫色杆菌素和紫色杆菌素(图1和图3A)，并且观察由此产生的物质的颜色(图3G)。由于本研究团队已经通过先前研究构建了过度产生作为紫色杆菌素类似物的常见前体的色氨酸的菌株(含有pTacGEL的IND5)，转化将基于pTacCDFS载体的紫色杆菌素类似物生物合成途径引入至相应菌株的质粒，从而制备产生紫色杆菌素类似物的基础菌株。
首先，使用pTacCDFS质粒作为基础载体，使用[SEQ ID NO:18]和[SE Q ID NO:19]的引物进行反向PCR反应，以使质粒线性化。此后，将vioAB基因分成两个基因片段并扩增。使用[SEQ ID NO:20]和[SEQ ID NO:21]扩增第一片段，并且使用[SEQ ID NO:22]和[SEQID NO:23]扩增第二片段。使用线性化质粒和Gibson组装克隆两个DNA片段以制备pTacCDFS-vioA B质粒。另外，使用相同的方法构建pTacCDFS-vioC、pTacCDFS-vioD、pTacCDFS-vioCD和pTacCDFS-vioE质粒。使用对应的引物对[SEQ ID NO:24]和[SEQ ID NO:25]、[SEQ ID NO:26]和[SEQ ID NO:27]、[SEQ ID NO:24]和[SEQ ID NO:27]以及[SEQ IDNO:28]和[SEQ ID NO:29]对vio C、vioD、vioCD和vioE基因进行PCR扩增。用于产生脱氧紫色杆菌素前体(PDVIO)的pPDVIO(pTacCDFS-vioABE)质粒如下构建。使用pTacCDFS-vi oE质粒作为模板，使用[SEQ ID NO:30]和[SEQ ID NO:31]的引物扩增vi oE基因片段，且然后***至pTacCDFS-vioAB质粒中的SacI位点中。分别用于产生紫色杆菌素前体(PVIO)、脱氧紫色杆菌素(DVIO)和紫色杆菌素(VIO)的pPVIO(pTacCDFS-vioABDE)、pDVIO(pTacCDFS-vioABCE)和pVIO(pTacCDFS-vioABCDE)质粒如下构建。分别使用pTacCDFS-vioC、pTacCDFS-vioD和pTacCDFS-vioCD质粒作为模板，使用[SEQ ID NO:32]和[SEQ ID NO:31]的共同引物扩增基因片段vioC、vioD和vioCD。将扩增的基因***至pTacCDFS-vioABE质粒的SacI位点中，从而完成pDVIO(pTacC DFS-vioABCE)、pPVIO(pTacCDFS-vioABDE)和pVIO(pTacCDFS-vioAB CDE)质粒。
[表3]
用于构建紫色杆菌素类似物产生菌株的引物
Figure BDA0003331558180000311
Figure BDA0003331558180000321
对于使用葡萄糖或甘油作为碳源对紫色杆菌素产生菌株的烧瓶培养，当使用甘油作为碳源时，产生更高浓度的紫色杆菌素，如图3B中所示。因此，所有紫色杆菌素类似物都利用甘油作为碳源。从如上构建的菌株中，当引入vioABCE生物合成基因簇(BGC)时产生1.09g/L的脱氧紫色杆菌素，并且当引入vioABCDE BGC时产生1.36g/L的紫色杆菌素和0.13g/L的脱氧紫色杆菌素(图3D)。当引入vioABE BGC时，产生脱氧紫色杆菌素前体，并且当引入vioABDE BGC时，产生紫色杆菌素前体。由于不存在紫色杆菌素前体和脱氧紫色杆菌素前体的标准物质，因此将它们通过附接至HPLC的级分收集器进行纯化，并且基于HPLC校准表计算其浓度。
烧瓶培养条件如下。对于类胡萝卜素产生菌株，将菌落接种至补充有适当浓度的抗生素的3mL TB(极品肉汤(terrific broth)；每升20g胰蛋白胨、24g酵母提取物、4mL甘油、0.017M KH2PO4和0.072M K2HPO4)培养基中，之后在30℃下培养。当培养液的OD600达到1-2时，将1mL培养液在含有20mL TB培养基的250mL圆底烧瓶中传代培养，并且继续培养直至OD600达到1-2。对于紫色杆菌素类似物，将菌落接种至10mL补充有适当浓度抗生素的LB培养基中，之后在37℃下培养过夜。此后，将制备的类胡萝卜素或紫色杆菌素类似物培养液转移至含有补充有3g/L酵母提取物和20g/L甘油(对于紫色杆菌素类似物还添加3g/L(NH4)2SO4)的50mL R/2培养基的250mL挡板烧瓶中，之后在30℃和200rpm下培养。R/2培养基(pH 6.8)具有以下组成(每升)：2g(NH4)2HPO4、6.75g KH2PO4、0.85g柠檬酸、0.7g MgSO4·7H2O和5ml痕量金属溶液(TMS)[10gFeSO4·7H2O、2.25g ZnSO4·7H2O、1gCuSO4·5H2O、0.5g MnSO4·5H2O、0.23g Na2B4O7·10H2O、2g CaCl2·2H2O和0.1g(NH4)6Mo7O24/升5M HCl]。当培养液的OD600达到0.6-0.8时，添加1mM异丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)以诱导外来基因的表达。诱导后，将培养针对类胡萝卜素进行36小时，并且针对紫色杆菌素类似物进行48小时。
培养后，在以下条件下分析产生量。对于类胡萝卜素，通过离心1mL培养液来收集细胞，去除上清液，添加1mL丙酮，并且通过在55℃和1,500rpm下剧烈涡旋提取细胞内的物质。使用离心机过滤提取物中的细胞碎片，由此获得上清液的类胡萝卜素提取物。对于紫色杆菌素类似物，将50μL培养液(添加的培养液体积可以根据估计的浓度范围适当调整；对添加的DMSO量进行调整，使得总体积为1mL)与950μL二甲基亚砜(DMSO)混合，之后在40℃和1,500rpm下剧烈涡旋，从而提取细胞内外的物质。此后，以与以上相同的方式使用离心机过滤提取物中的细胞碎片，由此获得上清液的紫色杆菌素类似物提取物。使用HPLC对每种提取物进行定量分析。在紫色杆菌素类似物的情况下，由于不存在标准物质，因此进行了LC-MS(图3E至图3F)。
实施例2.通过细胞形态工程化增加彩虹色素的产生
具有长碳链的类胡萝卜素和具有疏水碳环的紫色杆菌素类似物是疏水性的。由于这些特性，当类胡萝卜素和紫色杆菌素类似物在大肠杆菌中产生时，它们在细胞内、特别是在细胞膜中积聚，而不是从细胞中释放出来。因此，已进行尝试以通过增加细胞膜面积来提高容纳能力，以便大量产生相应的物质。为此，进行尝试以抑制负责细胞膜相关代谢网络的基因的表达。为了抑制靶基因的表达，利用了合成的调节性sRNA工具(Na等人,Nat.Biotechnol.2013,31(2):170-174)。作为表达抑制靶标，选择了16种参与细胞***和细胞形态维持的基因(表4)。根据两个标准选择表达抑制靶基因，第一个标准是参与细胞***的基因(ftsABILQWZ、minD、zipA)。预期对细胞***的抑制会改变细胞长度(图4A)。第二个标准是参与细胞壁合成或维持的基因(rodZ、mrdAB、mreBCE、murE)。由于细胞壁决定了大肠杆菌的杆状形态，预期抑制细胞壁相关基因的表达将细胞形态改变为更加呈球形和更加不规则(图4A)。在本实施例中，基于以上两个标准选择被认为最有效的基因靶标，但本发明的范围不一定限于此，并且也可以利用与以上两个标准相对应的其他基因作为靶标。
[表4]
16种类型的细胞形态相关基因靶标
Figure BDA0003331558180000341
*E，在基本培养基中培养时对大肠杆菌细胞生长必不可少的基因；NE，在基本培养基中培养时对大肠杆菌细胞生长不是必需的基因。
大多数靶基因是必需基因，因此需要sRNA技术。在该实验中，典型地使用β-胡萝卜素产生菌株和脱氧紫色杆菌素产生菌株进行测试，并且其结果示于图4B和图4C中。
如图4A至图4J、图5A和图5B中所见，在β-胡萝卜素产生菌株中，当抑制细胞膜相关基因的表达时，观察到细胞形态的变化，但产生量减少。另一方面，在脱氧紫色杆菌素产生菌株中，当抑制mrdB基因的表达时，产生量显著增加，并且达到1.37g/L(产生增加25％)。当抑制mrdB的表达时，正如预期的，细胞长度缩短并且细胞显示出更加呈球形的形状，导致细胞膜面积减少。
实施例3.通过形成内膜囊泡增加彩虹色素的产生
为了进一步增加产生的彩虹色素的量，本研究团队试图引入真核细胞***中存在的内膜囊泡，由此进行尝试以通过在保持细胞本身的体积的同时扩大细胞内的膜面积来增加膜中积聚的物质的产生(图4D)。在真核内膜囊泡***中，从小窝借用引入的内膜囊泡基因，小窝负责高尔基体或囊泡的折皱形状。首先，将cav1、cav2或cav3基因引入至pTrc99A质粒中，且然后引入至β-胡萝卜素和脱氧紫色杆菌素产生菌株中的每一种中，之后进行烧瓶培养。虽然本实施例中借用了真核生物的小窝***，但形成内膜的真核或原核生物来源的其他***(真核网格蛋白-epsin***、原核mgs-dgs***等)也落入本发明的范围内。
在源自智人的基因序列的大肠杆菌密码子优化之后利用cav1[SEQ ID NO:36]、cav2[SEQ ID NO:37]和cav3[SEQ ID NO:38]基因中的每一种。为了构建pTrc99A-cav1质粒，将cav1基因***至pTrc99A质粒的EcoRI和BamHI位点中。为了构建pTrc99A-cav2和pTrc99A-cav3，分别将cav2和cav3基因***至pTrc99A质粒的NcoI和BamHI位点中。为了构建pTrc99A-cav12质粒(含有cav1和cav2两者)，使用[SEQ ID NO:33]和[SEQ ID NO:34]的引物扩增cav2基因，且然后***至pTrc99A-cav1质粒的BamHI和PstI位点中。为了构建pTrc99A-cav23和pTrc99A-cav13，使用[SEQ ID NO:35]和[SEQ ID NO:34]的引物扩增cav3基因，且然后***至pTrc99A-cav2和pTrc99A-cav1质粒中的每一个的PstI位点中。为了构建pTrc99A-cav123质粒，将扩增的cav3基因***至pTrc99A-cav12质粒的PstI位点中。
[表5]
引入的内膜囊泡相关基因和引物序列
Figure BDA0003331558180000351
Figure BDA0003331558180000361
扩增大肠杆菌的plsBC基因以便进一步供应细胞膜脂质，其量可能由于内膜结构的形成而不足。为此，首先构建pTrc99A-plsBC质粒。因此，分别使用[SEQ ID NO:39]和[SEQID NO:40]的引物和[SEQ ID NO:41]和[SEQ ID NO:42]的引物从大肠杆菌的基因组DNA扩增plsB和plsC基因，且然后使用Gibson组装***至pTrc99A质粒的PstI和HindIII位点中。在使用PstI和HindIII限制性酶切割构建的质粒之后，将plsBC基因片段分离并***至pTrc99A-cav1质粒的PstI和HindIII位点中，从而构建pTrc99A-cav1-plsBC质粒。
[表6]
用于细胞膜脂质合酶基因扩增的引物
Figure BDA0003331558180000362
Figure BDA0003331558180000371
基于其结果，当β-胡萝卜素和脱氧紫色杆菌属两者的产生菌株表达cav1基因时，从而将产生量分别大大增加至21.89mg/L和1.28g/L。特别是在脱氧紫色杆菌素产生菌株中，发现当cav1、cav2和cav3中的两种或三种一起表达时，产生量大幅度降低(图4E和图4F)。基于观察在对照组(图4G和图4I)和cav1过表达菌株(图4H和图4J)中是否诱导内膜囊泡的形成的结果，TEM(每个图的顶部)和SEM(每个图的底部)显示内膜囊泡在cav1过表达菌株中成功形成，而相对于对照组没有细胞形态的巨大差异。
实施例4.通过外膜囊泡的形成和分泌增加来增加彩虹色素的产生
为了进一步增加所产生的彩虹色素的量，本研究团队试图通过增加微生物的固有外膜囊泡形成基因的表达来通过囊泡释放细胞中积聚的彩虹色素(图6A)。据报道，对于外膜囊泡的表达，重要的不是表达特定基因，而是抑制在维持细胞的外膜与内膜之间的连接或细胞的肽聚糖层中起作用的基因的表达。因此，本研究团队还试图使用基于sRNA的靶基因表达抑制***来抑制总共26种靶基因的表达强度。选择的26种表达抑制基因靶标如下：rseA、rseB、rffD、rffC、rffA、ompR、gmhB、lpxL、ompA、ompC、rfaB、rfaC、rfaD、rfaE、rfaG、rfaI、rfaJ、rfaK、rfaP、rfaQ、rfaY、rfbA、rffH、wzxE和pnp(表7)。在此，(1)参与维持外膜/肽聚糖结构的基因靶标是rfaG、rffA、rffC、rffD、rffH等，(2)对应于外膜蛋白表达的基因靶标是ompR、ompC等，并且(3)参与细胞膜代谢网络中抗σ因子的表达的基因靶标是rseA、rseB等。在本实施例中，基于以上三个标准选择被认为最有效的基因靶标，但本发明的范围不一定限于此，并且也可以利用与以上三个标准相对应的其他基因作为靶标。当抑制相应基因靶标的表达时产生的β-胡萝卜素和脱氧紫色杆菌素的量的测量结果示于图6B和图6C中。当抑制rfaD、rffD和rfaQ的表达时，产生的β-胡萝卜素的量分别有效增加至26.43、24.21和20.29mg/L。特别地，当抑制rfaI和rfaQ的表达时，产生的脱氧紫色杆菌素的量大大增加。在rfaI表达被抑制的菌株中，脱氧紫色杆菌素的产生量为1.74g/L。
基于引入有抑制rffD和rfaD表达的sRNA的BTC1菌株和引入有抑制rfaI表达的sRNA的DVIO菌株的SEM和TEM结果，观察到外膜囊泡的形成和分泌显著增加(图6D至图6F)。特别地，当培养引入有抑制rfaI表达的sRNA的DVIO菌株时，发现外膜囊泡、脱氧紫色杆菌素和细胞碎片聚集在烧瓶壁上。其显微照片示于图7E中。
[表7]
用于增加外膜囊泡的形成和分泌的参与外膜囊泡的26种基因靶标
靶基因 蛋白质功能 重要性* NCBI ID
rseA σE抑制剂 NE 947053
rseB σE抑制剂 E 947054
rffD 参与ECA途径的基因 E 948977
rffC 参与ECA途径的基因 NE 948298
rffA 参与ECA途径的基因 NE 948296
ompR ompC和ompF的响应调节子 NE 947913
gmhB 参与LPS途径的基因 NE 944879
lpxL 参与LPS途径的基因 NE 946216
lpxM 参与LPS途径的基因 NE 945143
ompA 外膜蛋白A NE 945571
ompC 外膜蛋白 NE 946716
rfaB 参与LPS途径的基因 E 948144
rfaC 参与LPS途径的基因 NE 948136
rfaD 参与LPS途径的基因 NE 948134
rfaE 参与LPS途径的基因 NE 947548
rfaG LPS核心生物合成；葡糖基转移酶 NE 948149
rfaI 参与LPS途径的基因 NE 948143
rfaJ 参与LPS途径的基因 E 948142
rfaK 参与LPS途径的基因 E 948147
rfaP 参与LPS途径的基因 E 948150
rfaQ 参与LPS途径的基因 E 948155
rfaY 参与LPS途径的基因 E 948145
rfbA 参与ECA途径的基因 NE 945154
rffH 参与ECA途径的基因 E 948299
wzxE ECA组分的内膜转位酶 NE 948294
pnp 多核苷酸磷酸化酶 NE 947672
*E，在基本培养基中培养时对大肠杆菌细胞生长必不可少的基因；NE，在基本培养基中培养时对大肠杆菌细胞生长不是必需的基因
实施例5.细胞形态改变和囊泡形成的协同效应的证实
基于以上结果，通过对每个类别中具有最佳效果的基因工程化靶标的组合来评价协同效应。
用于同时敲低多种靶基因的sRNA质粒克隆如下进行。使用[SEQ ID NO:43]和[SEQID NO:44]的引物PCR扩增第一sRNA片段，并且使用[SEQ ID NO:45]和[SEQ ID NO:46]的引物通过反向PCR将含有第二sRNA片段的质粒线性化。使用Gibson组装将由此获得的两个含sRNA的片段组合以完成用于双重敲低的sRNA质粒。为了将大肠杆菌plsBC***至含sRNA的质粒中，使用pTrc99A-plsBC质粒作为模板，使用[SEQ ID NO:47]和[SEQ ID NO:48]的引物PCR扩增plsBC基因，且然后***至含sRNA的质粒的SphI位点中。为了将cav1基因***至含sRNA的质粒中，使用[SEQ ID NO:47]和[SEQ ID NO:49]的引物并使用pTrc99A-cav1质粒作为模板将基因***至含sRNA的质粒的SphI位点中。
[表8]
用于细胞膜脂质合酶基因扩增的引物
Figure BDA0003331558180000391
Figure BDA0003331558180000401
在β-胡萝卜素产生菌株中，当抑制实施例2的细胞膜代谢网络相关基因的表达时，未证实到产生量的增加，因此应用了对实施例3的内膜囊泡表达基因(cav1)的过表达和对实施例4的外膜囊泡表达靶基因(rfaD、rffD、rfaD)表达的抑制的组合。首先，抑制三种外膜囊泡表达靶基因的不同组合的表达。当同时抑制rfaD和rffD的表达，产生的β-胡萝卜素的量大大增加至34.2mg/L(图6B)。尽管cav1基因在相应菌株中另外过表达以形成内膜囊泡，但产生量降低(图6G)。
在脱氧紫色杆菌素产生菌株中，表达了实施例2的细胞膜代谢网络靶基因(mrdB)、实施例3的内膜囊泡表达基因(cav1)和实施例4的外膜囊泡表达靶基因(rfaI)中的两种或三种的组合，并且观察到产生的脱氧紫色杆菌素的量。基于其结果，在抑制rfaI表达且过表达cav1的菌株中，脱氧紫色杆菌素的产生量为1.9g/L，其被评价为最大的(图6H)。
基于引入有抑制rffD和rfaD表达的sRNA并引入有cav1-plsBC的BTC1菌株以及引入有抑制rfaI表达的sRNA并引入有cav1的DVIO菌株的SEM和TEM结果，同时观察到外膜囊泡的形成和分泌增加和内膜囊泡的形成增加(图6I和图6J)。
实施例6.细胞膜扩张策略在不同彩虹色素产生中的应用
将以上实施例中使用的策略应用于其他疏水性色素以便显示出本发明的多功能性。因此，将对于增加β-胡萝卜素(其是代表性的类胡萝卜素化合物)和脱氧紫色杆菌素(其是代表性的紫色杆菌素类似化合物)的产生最有效的细胞膜工程化策略应用于每个类别中剩余的彩虹色素。在增加β-胡萝卜素的产生中，通过同时过表达cav1和plsBC基因造成的内膜囊泡形成和通过抑制rffD和rfaD基因表达造成的外膜囊泡形成得到有效改善，且因此将该策略应用于作为产生玉米黄质和虾青素的菌株的ZEA20和ATX68。根据其测试结果，内膜囊泡的形成降低了玉米黄质的产生，但略微增加了虾青素的产生。另一方面，外膜囊泡的形成增加了玉米黄质和虾青素两者的产生(分别为图7H中的18.38mg/L和图7I中的22.69mg/L)。对于紫色杆菌素类似物，内膜囊泡和外膜囊泡的同时表达导致最高的脱氧紫色杆菌素产生，因此通过分别或同时表达内膜囊泡和外膜囊泡来评价其效应。因此，测试三种策略：(1)rfaI敲低以用于过表达外膜囊泡，(2)cav1过表达以用于过表达内膜囊泡以及(3)rfaI敲低和cav1过表达两者。当内膜囊泡和外膜囊泡同时表达时，产生最大量的紫色杆菌素前体和紫色杆菌素(图7K中的402mg/L和图7L中的2.84g/L)。然而，当仅表达外膜囊泡时，产生最大量的脱氧紫色杆菌素前体(图7J中的341mg/L)。在此，无法购买用于紫色杆菌素前体和脱氧紫色杆菌素前体的可商购的试剂，因此对相应的物质进行纯化且然后使用连接至HPLC装置的级分收集器进行定量。
实施例7.用于高效产生彩虹色素的分批补料发酵工艺的开发
使用以上实施例中构建的重组大肠杆菌菌株在6.6L发酵罐中进行分批补料发酵。在以下条件下进行分批补料发酵。将类胡萝卜素产生菌株在6.6L发酵罐(BioFlo 320，Eppendorf)中培养，所述发酵罐补充有含有30g/L葡萄糖或甘油、3g/L酵母提取物和抗生素的1.6L R/2培养基(pH 6.95)。将紫色杆菌素类似物产生菌株在6.6L发酵罐(BioFlo 320，Eppendorf)中培养，所述发酵罐补充有含有20g/L葡萄糖或甘油、3g/L酵母提取物、3g/L(NH4)2SO4和抗生素的1.95L R/2培养基(pH 6.8)。对于类胡萝卜素产生菌株，将菌落接种至3mL含有适当浓度的抗生素的TB培养基中，之后在30℃下进行培养。对于紫色杆菌素类似物，将菌落接种至10mL补充有适当浓度抗生素的LB培养基中，之后在37℃下培养过夜。此后，将制备的类胡萝卜素或紫色杆菌素类似物培养液转移至含有补充有3g/L酵母提取物和20g/L甘油或葡萄糖(对于紫色杆菌素类似物还添加3g/L(NH4)2SO4)的50mL R/2培养基的250mL挡板烧瓶中，之后在30℃和200rpm下培养。在此，继续培养直至OD600达到3-4，并且在发酵罐中接种培养液。使用28％(v/v)氨水溶液将pH保持在6.8下，并且将温度保持在30℃下。通过以下方式将溶解氧(DO)值保持在40％下：以2L/min提供空气，自动将搅拌速度调整至1,000rpm，并且增加氧气流量。使用pH稳态策略进行营养供应，并且当pH值对于类胡萝卜素超过7并且对于紫色杆菌素衍生物超过6.85时，将自动允许进料流动。用于产生类胡萝卜素的进料溶液每1L具有以下组分：800g葡萄糖或817g甘油、6mL痕量金属溶液和12gMgSO4·7H2O。用于产生紫色杆菌素衍生物的进料溶液每1L具有以下组分：650g葡萄糖或800g甘油、6mL痕量金属溶液、85g(NH4)2SO4和8g MgSO4·7H2O。接种后，当OD600达到20-30时，使用1mM IPTG诱导外来蛋白质的表达。
通过重组大肠杆菌(其对于每种色素显示出最大产生能力)的分批补料培养获得的每种色素的浓度如下：
i)虾青素产生重组微生物ATX68(pWAS、rffD、rfaD表达抑制)：322mg/L(图8A)；
ii)β-胡萝卜素产生重组微生物BTC1(pWAS、rffD、rfaD表达抑制)：343mg/L(图8B)；
iii)玉米黄质产生重组微生物ZEA20(pWAS、rffD、rfaD表达抑制)：218mg/L(图8C)；
iv)紫色杆菌素前体产生重组微生物PVIO(pWAS、rfaI表达抑制和cav1过表达)：1.3g/L(图8D)；
v)脱氧紫色杆菌素前体产生重组微生物PDVIO(pWAS、rfaI表达抑制)：0.855g/L(图8E)；
vi)紫色杆菌素产生重组微生物VIO(pWAS、rfaI表达抑制和cav1过表达：产生6.69g/L紫色杆菌素(也产生1.39g/L脱氧紫色杆菌素)(图8F)；以及
vii)脱氧紫色杆菌素产生重组微生物DVIO(pWAS、rfaI表达抑制和cav1过表达)：11.3g/L(图8G)。
所有七种疏水性色素都能够使用根据本发明开发的大肠杆菌菌株以高浓度产生，这表明本发明对于疏水性物质的高效产生是有效的。
实用性
根据本发明，细胞膜工程化方法大致分为三种方法：首先，通过抑制参与细胞***的基因的表达来改变细胞形态；其次，通过引入或过表达参与内膜囊泡表达的基因来扩大内膜结构；以及第三，通过抑制参与细胞膜代谢的靶基因的表达以便表达外膜囊泡来过度产生外膜囊泡。
这三种方法单独或组合使用时展现出协同效应，其可用于高效产生不溶性疏水性物质。通过根据本发明的筛选具有高的产生疏水性物质的能力的重组微生物的方法开发的用于高效产生类胡萝卜素或紫色杆菌素类似物的重组微生物可用作用于产生天然色素的微生物。并且，本发明中开发的天然色素产生技术实现了产生能力的明显提高。因此，本发明可以有效地应用于制备用于高效产生多种工业和医学上有用的代谢物的重组菌株和建立高效的制备方法。
尽管已如上所述详细公开了本发明的具体实施方案，但对于本领域中的技术人员清楚的是，描述仅为优选的示例性实施方案且不应解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物定义。
序列表
<110> 韩国科学技术院
<120> 具有提高的产生疏水性物质的能力的重组微生物和用于制备的细胞膜工程化方法
<130> PF-B2656
<150> KR 10-2020-0144521
<151> 2020-11-02
<160> 49
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pTac15K质粒引物-正向(pTac15K plasmid primer-Forward)
<400> 1
cttggctgtt ttggcggatg 20
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pTac15K质粒引物-反向(pTac15K plasmid primer-reverse)
<400> 2
tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctc 29
<210> 3
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> crtE引物-正向
<400> 3
ataacaattt cacacaggaa acacgytcmg cggaaagrag catcgwccat gtatccgttt 60
ataaggaca 69
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> crtE引物-反向
<400> 4
ttaactgacg gcagcgagtt 20
<210> 5
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> crtB引物-正向
<400> 5
cgctgccgtc agttaaarcc ttgttcaaag gmsyatctag gatgaataat ccgtcgttac 60
t 61
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> crtB引物-反向
<400> 6
ttcgaacggt tcttagagcg ggcgctgcca 30
<210> 7
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> crtI引物-正向
<400> 7
gctctaagaa ccgttcgaaw gsagcrtmca agatgaaacc aactacggta at 52
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> crtI引物-反向
<400> 8
cgccaaaaca gccaagttaa atcagatcct ccagc 35
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pTrcCDFS质粒引物-正向
<400> 9
tctagagtcg acctgcag 18
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pTrcCDFS 质粒引物-反向
<400> 10
tctgtttcct gtgtgaaatt 20
<210> 11
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> crtY引物-正向
<400> 11
caatttcaca caggaaacag accttcctcc awaagragca tcmastatgg gagcggctat 60
g 61
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> crtY引物1-反向
<400> 12
gcaggtcgac tctagattaa cgatgagtcg tcataa 36
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> crtY引物2-反向
<400> 13
ttaacgatga gtcgtcataa 20
<210> 14
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> crtZ引物-正向
<400> 14
cattatgacg actcatcgtt aaagtacatc cgammgsagc atccttkatg ttgtggattt 60
ggaatgc 67
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> crtZ引物-反向
<400> 15
gcaggtcgac tctagattac ttcccggatg c 31
<210> 16
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> trCrBKT引物-正向
<400> 16
agacaggtcg ackccacccc gcaaaggags atcgkcratg ggtccgggca tc 52
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> trCrBKT引物-反向
<400> 17
agacagaagc ttttacgcca gcgccgc 27
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pTacCDFS质粒引物-正向
<400> 18
tggaattcga gctcggtacc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pTacCDFS 质粒引物-反向
<400> 19
ttcacacagg aaacagacca 20
<210> 20
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> vioAB引物-正向
<400> 20
cacacaggaa acagaccaat gaagcattct tccgatatct gc 42
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> vioAB mid引物-反向
<400> 21
gccaggcttc ggaatcgaat g 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> vioAB mid引物-正向
<400> 22
cattcgattc cgaagcctgg c 21
<210> 23
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> vioAB引物-反向
<400> 23
ggtaccgagc tcgaattcca ttatcaggcc tctctagaaa gctttcc 47
<210> 24
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> vioC引物-正向
<400> 24
cacacaggaa acagaccaat gaaaagagca atcatagtcg g 41
<210> 25
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> vioC引物-反向
<400> 25
ggtaccgagc tcgaattcca ttatcagttg accctcccta tcttg 45
<210> 26
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> vioD引物-正向
<400> 26
cacacaggaa acagaccaat gaagattctg gtcatcggc 39
<210> 27
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> vioD引物-反向
<400> 27
ggtaccgagc tcgaattcca ttatcagcgt tgcagcgcgt ag 42
<210> 28
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> vioE引物-正向
<400> 28
cacacaggaa acagaccaat ggaaaaccgg gaaccgcc 38
<210> 29
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> vioE引物-反向
<400> 29
ggtaccgagc tcgaattcca ttactagcgc ttggcggcga ag 42
<210> 30
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> vioE_frag引物-正向
<400> 30
cctgataatg gaattcgagc tgactgcacg gtgcaccaat g 41
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> vioE_frag引物-反向
<400> 31
caggtcgact ctagaggatc c 21
<210> 32
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> vio_frag引物-正向
<400> 32
gctagtaatg gaattcgagc tgactgcacg gtgcaccaat g 41
<210> 33
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> cav2引物-正向
<400> 33
ttaactggat cctttcacac aggaaacaga ccatggggct tgagactgag aag 53
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> cav引物-反向
<400> 34
catccgccaa aacagccaag cttg 24
<210> 35
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> cav3引物-正向
<400> 35
ttaactctgc agtttcacac aggaaacaga ccatgatggc cgaagagcat acc 53
<210> 36
<211> 537
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> cav1 gene
<400> 36
atgtctgggg gcaaatacgt agactcggag ggacatctct acaccgttcc catccgggaa 60
cagggcaaca tctacaagcc caacaacaag gccatggcag acgagctgag cgagaagcaa 120
gtgtacgacg cgcacaccaa ggagatcgac ctggtcaacc gcgaccctaa acacctcaac 180
gatgacgtgg tcaagattga ctttgaagat gtgattgcag aaccagaagg gacacacagt 240
tttcacggca tttggaaggc cagcttcacc accttcactg tgacgaaata ctggttttac 300
cgcttgctgt ctgccctctt tggcatcccg atggcactca tctggggcat ttacttcgcc 360
attctctctt tcctgcacat ctgggcagtt gtaccatgca ttaagagctt cctgattgag 420
attcagtgca ccagccgtgt ctattccatc tacgtccaca ccgtctgtga cccactcttt 480
gaagctgttg ggaaaatatt cagcaatgtc cgcatcaact tgcagaaaga aatataa 537
<210> 37
<211> 489
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> cav2 gene
<400> 37
atggggcttg agactgagaa ggcagatgtc caactgttca tggatgatga ttcttactca 60
catcactcag gactggaata tgcagatcca gaaaagtttg cggactccga ccaggatcgt 120
gacccccacc gcttaaatag tcacttaaaa ctgggctttg aagatgtgat cgcggagcct 180
gtcacaactc atagtttcga taaggtttgg atttgctcac acgcattatt tgaaatttca 240
aagtacgtta tgtataagtt ccttactgta tttttggcca tccctcttgc ctttatcgca 300
ggaatcctgt tcgctacctt gagttgtctg cacatttgga ttcttatgcc attcgtaaag 360
acatgcctta tggtgttgcc atcagtgcaa accatctgga agtccgtcac tgatgtaatt 420
attgcccctt tgtgtacatc tgtgggccgc tgcttttcga gcgtctcact tcaattgtcg 480
caggattaa 489
<210> 38
<211> 456
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> cav3 gene
<400> 38
atgatggccg aagagcatac cgatcttgaa gctcaaattg taaaggatat tcattgtaag 60
gaaattgact tggttaatcg tgatcctaag aacatcaacg aggatatcgt taaggtagac 120
ttcgaggatg ttattgcaga acctgttgga acatacagtt tcgacggtgt ctggaaggtg 180
tcgtacacta cgtttaccgt tagtaagtat tggtgctatc gcttactgtc cactctgttg 240
ggtgtccccc ttgctttgct ttggggattc ctgttcgcgt gtatctcttt ttgccatatt 300
tgggctgtcg ttccatgtat taaatcgtac ttaattgaga ttcaatgtat ctctcatatt 360
tatagtcttt gtatccgcac gttctgtaat cccctttttg cggccttggg gcaggtgtgc 420
tcaagtatta aggttgtact tcgtaaggag gtctaa 456
<210> 39
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> plsB引物-正向
<400> 39
ctagagtcga cctgcagttt cacacaggaa acagaccatg tccggctggc cacga 55
<210> 40
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> plsB引物-反向
<400> 40
tctgtttcct gtgtgaaatt acccttcgcc ctgcgtc 37
<210> 41
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> plsC引物-正向
<400> 41
gaagggtaat ttcacacagg aaacagacca tgctatatat ctttcgtctt attattacc 59
<210> 42
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> plsC引物1-反向
<400> 42
ccgccaaaac agccaagctt ttaaactttt ccggcggc 38
<210> 43
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sRNA primer 1-Forward
<400> 43
cactagatct caaatgtgct ggaattctaa caccgtgcgt g 41
<210> 44
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sRNA引物1-反向
<400> 44
ccttataaat caaacatgtg cggcgaattg ggtacctata aac 43
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sRNA primer 2-Forward
<400> 45
gcacatgttt gatttataag gg 22
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sRNA引物2-反向
<400> 46
cagcacattt gagatctagt gg 22
<210> 47
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ptrc引物-正向
<400> 47
atgtgacagc ttatcgcatg cttgacaatt aatcatccgg 40
<210> 48
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> plsC引物-反向
<400> 48
cctgggttta cctaggcatg cttaaacttt tccggcggct tc 42
<210> 49
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> cav1引物-反向
<400> 49
cctgggttta cctaggcatg cttatatttc tttctgcaag ttg 43

Claims (18)

1.一种重组微生物，所述重组微生物通过以下方式进行工程化：进行对细胞形态相关基因和外膜囊泡相关基因中的至少一种基因的抑制；和/或对内膜囊泡相关基因的过表达或引入，
其中所述重组体具有以下特征中的至少一种：
i)细胞膜面积增加；
ii)外膜囊泡的形成和分泌增加；以及
iii)内膜囊泡的形成增加。
2.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述细胞形态相关基因选自参与细胞***的基因、参与细胞壁合成的基因和参与细胞壁维持的基因。
3.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述细胞形态相关基因选自rodZ(细胞骨架蛋白)、ftsA(细胞***蛋白)、ftsB(细胞***蛋白)、ftsI(肽聚糖D,D-转肽酶)、ftsL(细胞***蛋白)、ftsQ(细胞***蛋白)、ftsW(可能的肽聚糖糖基转移酶)、ftsZ(细胞***蛋白)、minD(隔膜位点决定蛋白)、mrdA(肽聚糖D,D-转肽酶)、mrdB(肽聚糖糖基转移酶)、mreB(细胞形状决定蛋白)、mreC(细胞形状决定蛋白)、zipA(细胞***蛋白)、murE(UDP-N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酸-2,6-二氨基庚二酸连接酶)、pbpC(青霉素结合蛋白1C)及其组合。
4.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述外膜囊泡相关基因选自细胞外膜/肽聚糖结构维持相关基因、细胞外膜蛋白表达基因、细胞膜代谢相关基因。
5.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述外膜囊泡相关基因选自rseA(抗σ-E因子)、rseB(σ-E因子调节蛋白)、rffD(UDP-N-乙酰-D-甘露糖胺脱氢酶)、rffC(dTDP-岩藻糖胺乙酰转移酶)、rffA(dTDP-4-氨基-4,6-二脱氧半乳糖转氨酶)、ompR(DNA结合双转录调节因子)、gmhB(D-甘油-β-D-甘露糖-庚醣-1,7-二磷酸7-磷酸酶)、lpxL(脂质A生物合成月桂酰转移酶)、lpxM(脂质A生物合成肉豆蔻酰转移酶)、ompA(外膜蛋白)、ompC(外膜蛋白)、rfaB(脂多糖1,6-半乳糖基转移酶)、rfaC(脂多糖庚糖基转移酶1)、rfaD(ADP-L-甘油-D-甘露糖-庚糖-6-差向异构酶)、rfaE(双功能蛋白HldE)、rfaG(脂多糖核心生物合成蛋白)、rfaI(脂多糖1,3-半乳糖基转移酶)、rfaJ(脂多糖1,2-葡糖基转移酶)、rfaK(脂多糖1,2-N-乙酰葡糖胺转移酶)、rfaP(脂多糖核心庚糖(I)激酶)、rfaQ(脂多糖核心庚糖基转移酶)、rfaY(脂多糖核心庚糖(II)激酶)、rfbA(葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶1)、rffH(葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶2)、wzxE(ECA多糖链长调节蛋白)、pnp(多核糖核苷酸核苷酸基转移酶)、tolA(大肠菌素输入膜蛋白)、tolB(Tol-Pal***周质蛋白)、tolC(外膜蛋白)、tolR(生物聚合物转运蛋白)、nlpI(脂蛋白)、nlpD(胞壁质水解酶激活因子)、ompF(外膜孔蛋白)、pal(肽聚糖相关外膜脂蛋白)、degS(丝氨酸内切蛋白酶)、degP(丝氨酸内切蛋白酶)、tatC(sec独立性蛋白转位酶蛋白)、lpp(胞壁质脂蛋白)及其组合。
6.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述内膜囊泡相关基因选自cav1(小窝蛋白-1)、cav2(小窝蛋白-2)、cav3(小窝蛋白-3)、EPN1(epsin1)、CLINT1(epsinR)、CLTC(网格蛋白重链1)、CLTCL1(网格蛋白重链2)、CLTA(网格蛋白轻链A)、CLTB(网格蛋白轻链B)、AP180、AP2、almgs(1,2-二酰基甘油3-葡糖基转移酶)、aldgs(产生二葡糖基二酰基甘油的1,2-二酰基甘油-3-葡萄糖(1-2)-葡糖基转移酶)及其组合。
7.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述特征还包括细胞膜脂质合酶基因表达的改善。
8.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物选自大肠杆菌、根瘤菌属、双歧杆菌属、红球菌属、假丝酵母属、欧文氏菌属、肠杆菌属、巴氏杆菌属、曼氏杆菌属、放线杆菌属、聚集杆菌属、黄单胞菌属、弧菌属、假单胞菌属、固氮菌属、不动杆菌属、罗尔斯通氏菌属、土壤杆菌属、红杆菌属、发酵单胞菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、乳球菌属、链球菌属、乳杆菌属、梭菌属、棒杆菌属、链霉菌属、双歧杆菌属、蓝细菌和圆杆菌属。
9.根据权利要求1所述的重组微生物，其中，在所述重组微生物中，i)抑制选自mrdB、rffD、rfaD和rfaI的至少一种基因，和/或ii)引入或过表达cav1基因。
10.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述重组微生物是用于产生疏水性物质的重组微生物。
11.根据权利要求10所述的重组微生物，其中所述疏水性物质在细胞膜中积聚。
12.根据权利要求10所述的重组微生物，其中所述疏水性物质选自天然色素、抗氧化剂、抗生素、化妆品添加剂、抗癌剂、食品添加剂和营养补充剂。
13.根据权利要求10所述的重组微生物，其中所述疏水性物质选自虾青素、β-胡萝卜素、玉米黄质、紫色杆菌素前体、脱氧紫色杆菌素前体、脱氧紫色杆菌素和紫色杆菌素。
14.根据权利要求10所述的重组微生物，其中所述疏水性物质是类胡萝卜素色素，并且rffD和rfaD基因的表达在所述重组微生物中已经被抑制。
15.根据权利要求10所述的重组微生物，其中所述疏水性物质是紫色杆菌素或其类似物，并且rfaI基因的表达在所述重组微生物中已经被抑制。
16.根据权利要求15所述的重组微生物，其中在所述重组微生物中已经引入或过表达cav1基因。
17.一种制备疏水性物质的方法，所述方法包括：
通过培养根据权利要求1至16中任一项所述的重组微生物来产生疏水性物质；并且
回收所产生的疏水性物质。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述培养以分批补料培养来进行。
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