CN114437041B - 一类具有抗肿瘤活性的4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

一类具有抗肿瘤活性的4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114437041B
CN114437041B CN202210178919.4A CN202210178919A CN114437041B CN 114437041 B CN114437041 B CN 114437041B CN 202210178919 A CN202210178919 A CN 202210178919A CN 114437041 B CN114437041 B CN 114437041B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
tetrazolyl
substituted
derivative
dihydroquinazoline
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210178919.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114437041A (zh
Inventor
熊俊
朱海丽
谢敏
刘玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hubei University of Science and Technology
Original Assignee
Hubei University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hubei University of Science and Technology filed Critical Hubei University of Science and Technology
Priority to CN202210178919.4A priority Critical patent/CN114437041B/zh
Publication of CN114437041A publication Critical patent/CN114437041A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114437041B publication Critical patent/CN114437041B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/14—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for lactation disorders, e.g. galactorrhoea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及一类具有抗肿瘤活性的4‑四唑基取代‑3，4‑二氢喹唑啉衍生物及其制备方法和应用。本发明通过一锅法合成出一类结构新颖的多取代氮杂环化合物，即4‑四唑基取代‑3，4‑二氢喹唑啉衍生物，其对乳腺癌细胞及胶质瘤细胞具有较强的抗肿瘤活性，具体结构式如下：

Description

一类具有抗肿瘤活性的4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生 物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一类具有抗肿瘤活性的4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
四唑衍生物作为一类广泛存在的氮杂环化合物，具备良好的药用价值和优越的生物活性。被广泛应用于抗癌药物、PDE3抑制剂、抗炎药以及抗高血压药物。值得注意的是，近年来，各种四唑类药物受到了极大的关注，例如缬沙坦、氯沙坦和吡米罗司特已被广泛用于临床治疗。3,4-二氢喹唑啉环是天然产物、合成药物、农药和药物中常见的关键结构，具有良好的生物活性，包括TryR抑制剂、抗过敏、抗真菌和抗癌活性。例如，Vasicine是一种广为人知的天然生物碱，表现出优异的生物活性，4-羧基取代的3,4-二氢喹唑啉类化合物由于其抑制乙型肝炎病毒(HBV)的活性最近受到了极大的关注。因此，在过去的二十年里，已经建立了多种构建3,4-二氢喹唑啉骨架的策略。尽管这些方法有很多优点，但仍然存在一些缺点，如产率低、操作步骤多、反应条件苛刻等等。因此，在温和条件下合成3,4-二氢喹唑啉衍生物的新方法具有重要科学意义。此外，3,4-二氢喹唑啉在C4碳上与四唑基连接的杂环目前还没有被报道，由于四唑类化合物和3,4-二氢喹唑啉结构都属于高生物活性骨架，这种活性拼接骨架可能具有潜在的优异的药物活性。
乳腺癌已成为当前女性癌症死亡的主因，占所有癌症死亡的 14.3％，传统化疗药物的副作用显著，因此，开发分子靶向药物更有利于提高患者的生存质量。胶质瘤是最常见的颅内原发肿瘤，占恶性肿瘤的81％。虽然相对罕见，但它们会造成严重的死亡率和发病率。胶质瘤是起源于神经胶质祖细胞的固有脑肿瘤。传统治疗，包括手术、化疗和放射治疗，在胶质瘤患者的预后方面取得了有效的改善。免疫疗法是癌症治疗的一次革命，自从中枢神经******被发现以来，免疫疗法已经成为一种具有穿透血脑屏障能力的有希望的策略。当前的临床试验对胶质瘤的疗效有效。因此，有必要对胶质瘤治疗的新方法进行新的研究。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一类具有抗肿瘤活性的4- 四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物及其制备方法和应用，利用简单易得的原料，通过一锅法合成出一类结构新颖的多取代氮杂环化合物，即4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物，并对其进行了体外肿瘤细胞抑制活性测试，结果显示其对乳腺癌细胞及胶质瘤细胞具有较强的抗肿瘤活性。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一类具有抗肿瘤活性的4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物，其结构式如下：
其中，R1为H、4-Cl和5-CH3中的任意一种；
R2为C6H4、4-ClC6H4、4-BrC6H4、4-CH3C6H4、4-CH3OC6H4、2-ClC6H4、2,4-dimethyl-C6H、n-Bu、i-Pr和t-Bu中的任意一种；
R3为t-Bu、n-Bu、c-C6H11和1-adamantyl中的任意一种；
R4为t-Bu、c-C6H11、4-CH3OC6H4和4-ClC6H4中的任意一种。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
本发明的另一目的是提供上述4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物制备方法。
具体的技术方案如下：
一类具有抗肿瘤活性的4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物的制备方法，所述4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物的合成路线如下：
进一步，所述4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物的制备方法，包括以下步骤：
1)将2mmol邻叠氮基苯甲醛1溶解于10ml甲醇中，搅拌溶解后依次加入2mmol胺2、2mmol三甲基叠氮硅烷和2mmol异腈3，常温发生Ugi 反应，TCL监测直至原料反应完全脱去溶剂得到中间体4；
2)将中间体4溶于5ml四氢呋喃中，再加入0.2mmolPd(PPh3)4、3mmol 异腈5，升温至60℃反应完全，将反应液减压浓缩除去溶剂，将残余物经柱层析分离得到目标产物6，即4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物。
优选的，步骤2)中，柱层析分离采用体积比为1:10-1:6的乙酸乙酯/石油醚洗脱溶剂。
进一步，步骤2)中，合成的目标产物6如下：
进一步，化合物6c[3-(4-溴苯基)-N-(叔丁基)-4-(1-环己基-1H-四唑-5- 基)-3,4-二氢喹唑啉-2-胺]的结构式如下：
本发明的最后目的是提供上述4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物的应用。
具体的技术方案如下：
一类具有抗肿瘤活性的4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物在制备乳腺癌和胶质瘤防治药物中的应用。
本发明的有益效果是：
1)本发明利用简单易得的原料，通过一锅法合成出一类结构新颖的多取代氮杂环化合物，即4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物，其在本领域和现有文献中尚未被报道。
2)本发明通过1H-NMR和13C-NMR等表征手段确定了上述4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物的结构，并证实了所陈述的方法能成功制备目标产物，即4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物。
3)本发明提供了一种制备4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物的方法，通过一锅煮的方式，将Ugi反应应用到合成杂环化合物的合成中，合成路线简单、条件温和、产率高，较现有合成3,4-二氢喹唑啉衍生物的方法具有显著的进步。
4)本发明通过体外肿瘤细胞抑制活性测试，结果显示4-四唑基取代-3， 4-二氢喹唑啉衍生物6c对乳腺癌细胞及胶质瘤细胞具有较强的抗肿瘤活性。
附图说明
图1为本发明实施例1中化合物6c的1H-NMR图谱；
图2为本发明实施例1中化合物6c的13C-NMR图谱；
图3为本发明实施例2中大鼠乳腺癌细胞的活性检测各组细胞平均OD 值统计图，数据表示为平均值±标准差(n＝3)；
图4为本发明实施例2中化合物6c对乳腺癌细胞平板克隆能力的影响： (A)各组细胞结晶紫染色图，(B)各组平板克隆细胞数目统计图，数据表示为平均值±标准差(n＝3)，与对照组(Control)相比，*p<0.05；
图5为本发明实施例2中免疫荧光法观察化合物6c对EdU阳性细胞率的影响：(A)EdU和Hoechest的荧光染色图，(B)EdU阳性细胞率统计图，数据表示为平均值±标准差(n＝3)，与对照组(Control)相比，*p<0.05；
图6为本发明实施例2中免疫印迹检测化合物6c对凋亡因子activated caspase-3蛋白表达的影响：(A)各组细胞Activated caspase-3蛋白免疫印迹条带图，(B)各组细胞Activated caspase-3蛋白水平统计图，免疫印迹灰度值使用imageJ软件进行统计，数据表示为平均值±标准差(n＝3)，与对照组(Control)相比，*p<0.05；
图7为本发明实施例3中大鼠胶质瘤细胞的活性检测各组细胞平均OD 值统计图，数据表示为平均值±标准差(n＝3)；
图8为本发明实施例3中化合物6c对胶质瘤细胞平板克隆能力的影响： (A)各组细胞结晶紫染色图；(B)各组平板克隆细胞数目统计图，数据表示为平均值±标准差(n＝3)，与对照组(Control)相比，*p<0.05；
图9为本发明实施例3中免疫荧光法观察化合物6c对EdU阳性细胞率的影响：(A)EdU和Hoechest的荧光染色图，(B)Edu阳性细胞率统计图，数据表示为平均值±标准差(n＝3)，与对照组(Control)相比，*p<0.05；
图10为本发明实施例3中化合物6c对胶质瘤细胞迁移能力的影响：(A) 光学显微镜下各组划痕的细胞单层愈合0、24h的图像，(B)各组迁移细胞总数统计图，数据表示为平均值±标准差(n＝3)，与对照组(Control)相比， *p<0.05；
图11为本发明实施例3中免疫印迹检测化合物6c对凋亡因子BAX蛋白表达的影响：(A)各组细胞BAX蛋白免疫印迹条带图，(B)各组细胞 BAX蛋白水平统计图，免疫印迹灰度值使用imageJ软件进行统计，数据表示为平均值±标准差(n＝3)，与对照组(Control)相比，*p<0.05。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
除非另有说明，本发明采用的原料及设备为本技术领域常规原料及设备 (常规市售品)，皆可于市场购得。
实施例1
具有如下结构式的4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物的制备：
其中，R1为H、4-Cl和5-CH3中的任意一种；
R2为C6H4、4-ClC6H4、4-BrC6H4、4-CH3C6H4、4-CH3OC6H4、2-ClC6H4、 2,4-dimethyl-C6H、n-Bu、i-Pr和t-Bu中的任意一种；
R3为t-Bu、n-Bu、c-C6H11和1-adamantyl中的任意一种；
R4为t-Bu、c-C6H11、4-CH3OC6H4和4-ClC6H4中的任意一种。
所述4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物的合成路线如下：
具体而言，包括以下步骤：
1)在50mL的圆底烧瓶中加入2mmol邻叠氮基苯甲醛1溶解于10ml 甲醇中，搅拌溶解后依次加入2mmol胺2、2mmol三甲基叠氮硅烷和2mmol 异腈3，常温发生Ugi反应，TCL监测直至原料反应完全脱去溶剂得到中间体4。
2)将中间体4溶于5ml四氢呋喃中，再加入0.2mmolPd(PPh3)4、3mmol 异腈5，升温至60℃反应完全，将反应液减压浓缩除去溶剂，将残余物经柱层析分离得到目标产物6，即4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物。
所合成的目标产物6如下：
其中，化合物6c[3-(4-溴苯基)-N-(叔丁基)-4-(1-环己基-1H-四唑-5- 基)-3,4-二氢喹唑啉-2-胺]的结构式如下：
如图1和图2所示，化合物6c表征：
3-(4-溴苯基)-N-(叔丁基)-4-(1-环己基-1H-四唑-5-基)-3,4-二氢喹唑啉-2-胺(6c).Yellow solid(yield 0.895g,88％),purified by column chromatography withpetroleum ether/EtOAc(6:1)as the eluent.Mp 175-177℃；1H NMR (CDCl3,400MHz)δ(ppm)7.48-7.46(m,2H),7.24-7.14(m,2H),6.99-6.97(m, 2H),6.88-6.79(m,2H),6.40(s,1H),4.45-4.37(m,1H),2.14-1.86(m,3H), 1.65-1.48(m,3H),1.41(s,9H),1.19-0.86(m,4H)；13C{1H}NMR(CDCl3,100 MHz)δ(ppm)154.8,148.0,143.5,141.2,133.2,129.8,128.3,125.8,123.8, 122.2,121.1,117.8,58.3,56.6,52.0,33.2,32.8,29.4,25.3,25.2,24.8.LCMS (ESI)m/z[M+H]+:508.Anal.Calcd for C25H30BrN7:C,59.05；H,5.95；N,19.28；Found:C,59.31；H,6.28；N,19.55。
实施例2
对实施例1制得的化合物6c[3-(4-溴苯基)-N-(叔丁基)-4-(1-环己基-1H- 四唑-5-基)-3,4-二氢喹唑啉-2-胺]进行抑制乳腺癌细胞测试。
1.方法
1.1细胞培养
大鼠乳腺癌细胞MRMT-1使用含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的 RPMI-1640(Gibco，NewYork，NY,USA)培养基进行传代培养，置于恒温 37℃，5％CO2培养箱中培养，隔天更换培养基，并保持一定的湿度，取生长状态良好的细胞进行细胞实验。
1.2细胞活力检测
用CCK8法检测化合物6c对乳腺癌细胞的杀伤作用，取对数生长期的乳腺癌细胞接种于96孔板，每孔接种100μL细胞悬液并将细胞密度调整为 1×104个细胞/孔，放置培养箱中过夜培养观察细胞贴壁状况。第二天用化合物6c处理细胞，药物浓度设置为0、1、3、10、30、100、300μmol/L，每个滴度设6个复孔，不加药的细胞孔作为对照孔，放置培养箱中继续培养48h。取出培养板，每孔加入100μL检测液(按CCK8溶液：DMEM培养基＝1：9 配制)，37℃避光孵育2h后使用酶标仪在450nm处测定其吸光度值(OD)值，并根据OD值绘制细胞生长曲线。OD值越小，细胞毒性越大。细胞增殖率＝实验孔OD值/对照孔OD值×100％，实验重复3次。CCK-8(C0037)试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司。
1.3平板克隆形成实验
取对数生长期的乳腺癌细胞接种于6孔板，每孔接种1mL细胞悬液并将细胞密度调整至500个/mL，充分摇匀后过夜培养，24h后给药，浓度设为0、0.3、1μmol/L，培养14天后用4％多聚甲醛溶液固定30min，PBS清洗3遍，再用1％结晶紫染色，拍照计数。克隆率＝克隆形成数目/接种细胞数目×100％，每次实验重复3次。
1.4 EdU细胞增殖实验
在24孔板中铺设14mm细胞爬片，将对数期生长的MRMT-1以每孔 1×104个细胞的密度接种于盖玻片上中，调整细胞至适宜密度后计数，待细胞贴壁后加化合物6c，浓度设为0、0.3、1μmol/L，培养24h后每孔加入100μL 50μmo/LEdU的培养基37℃孵育2h，之后在4％多聚甲醛中室温固定细胞30min，PBS洗3遍，加入通透液室温孵育20分钟，PBS洗两遍，加入配置好的Click反应液室温避光孵育30分钟，PBS洗一遍，用Hoechest33342 进行核染色，荧光显微镜(奥林巴斯IX73，奥林巴斯，东京，日本)观察细胞发光情况，红色荧光为增殖细胞，蓝色荧光为细胞核染色。EdU-488细胞增殖检测试剂盒(C0071S)购于上海碧云天生物技术有限公司。
1.5 Westernblot检测蛋白表达
分别加入0、0.3、1μmol/L浓度的6c处理24h后用含有PMSF的RIPA 蛋白裂解液裂解各组乳腺癌细胞，待细胞充***解后，放入4℃预冷的离心机12000×r/min离心15min提取上清液，获得总蛋白，将蛋白和蛋白上样缓冲液混匀后加热100℃变性10min，用BCA分析试剂盒(Beyotime Bio-tech，中国上海)进行定量，蛋白定量后配平蛋白浓度，随后进行SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，使用5％BSA对0.22μmPVDF膜进行封闭，一抗4℃孵育过夜， TBST洗10min/3次，加二抗孵育2h，TBST洗10min/3次，随即使用iBright 1500成像***(美国纽约州Invitrogen)用于检测免疫反应带，设定对照组蛋白表达水平为1，β-actin为已知浓度标准蛋白对照。蛋白酶抑制剂、加强型RIPAbuffer、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司,主要抗体来自ABclonal Technology(中国)，一抗：anti-caspase-3(A19654)和anti-β-actin(AC026)。二抗如下： HRP标记山羊抗兔IgG购自于ABclonal，用ImageJ软件分析条带的灰度值。
1.6统计分析
所有统计分析均使用SPSS 21.0软件包进行，所有数据均采用one-way ANOVA(单因素方差分析)进行评估，并以平均值±标准差表示，显著性描述为p<0.05。
2.结果
2.1化合物6c对乳腺癌细胞的杀伤作用
为确定6c对乳腺癌细胞是否有杀伤作用，采用CCK8法进行细胞毒性试验，如图3所示，6c浓度为0、1、3、10、30、100和300μM时，其细胞活力值分别为100±4.5、99.35±6.3、96.5±5.2、99.32±6.8、85.66±7.6、75.23±7.3 和36.8±9.2。该结果表示6c浓度在30μM以下，没有细胞毒性(p>0.05)。从而为后期的细胞实验提供了药物浓度依据。
2.2化合物6c处理明显降低乳腺癌细胞平板克隆形成能力
为检测化合物6c对乳腺癌细胞增殖能力的影响，用不同浓度的6c(0、 0.3和1μM)处理乳腺癌细胞，采用平板克隆形成法检测各组细胞增殖情况。实验结果显示(图4)：对照组克隆细胞数目为127±5；0.3μMA药处理组克隆细胞数目为85±7(p<0.05)；1μM A药处理组克隆细胞数目57±3 (p<0.05)。即化合物6c处理后显著降低了乳腺癌细胞的增殖水平，呈浓度依赖性下降。
2.3 6c处理明显抑制乳腺癌细胞增殖
采用EdU法检测6c处理后的乳腺癌细胞增殖，用不同浓度的6c(0、 0.3和1μM)处理乳腺癌细胞，结果显示(图5)：对照组EdU阳性细胞率为0.83±0.09；0.3μMA药处理细胞EdU阳性细胞率为0.29±0.04(p<0.05)； 1μM 6c处理组细胞EdU阳性细胞率为0.12±0.01(p<0.05)。该结果可看出，随着6c浓度的增加，乳腺癌EdU阳性细胞数逐渐减少，即表示6c可明显抑制乳腺癌细胞增殖。
2.4 6c处理明显促进乳腺癌细胞凋亡
为探讨6c在乳腺癌细胞凋亡中的作用，用不同浓度的6c(0、0.3和1μM) 处理乳腺癌细胞24h，使用免疫印迹分析凋亡因子activated caspase-3表达量的变化。结果如图6所示，与对照组相比，0.3和1μM 6c处理组的activated caspase-3/β-actin比值分别为1.46±0.04(p<0.05)和1.81±0.06(p<0.05)。该结果表示经6c处理后，乳腺癌细胞凋亡因子表达量呈剂量依赖性上调。
以上结果表明化合物6c浓度在30μM以下，没有细胞毒性，且对乳腺癌细胞具有一定抑制活性。
实施例3
对实施例1制得的化合物6c[3-(4-溴苯基)-N-(叔丁基)-4-(1-环己基-1H- 四唑-5-基)-3,4-二氢喹唑啉-2-胺]进行抑制胶质瘤细胞测试。
1.方法
1.1细胞培养
大鼠神经胶质瘤细胞C6使用含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的 DMEM(Gibco，NewYork，NY,USA)培养基进行传代培养，置于恒温37℃， 5％CO2培养箱中培养，隔天更换培养基，并保持一定的湿度，取生长状态良好的细胞进行细胞实验。
1.2细胞活力检测
用CCK8法检测6c对胶质瘤细胞的杀伤作用，取对数生长期的胶质瘤细胞接种于96孔板，每孔接种100μL细胞悬液并将细胞密度调整为1×104个细胞/孔，放置培养箱中过夜培养观察细胞贴壁状况。第二天用6c处理细胞，药物浓度设置为0、1、3、10、30、100、300μmol/L，每个滴度设6个复孔，不加药的细胞孔作为对照孔，放置培养箱中继续培养48h。取出培养板，每孔加入100μL检测液(按CCK8溶液：DMEM培养基＝1：9配制)， 37℃避光孵育2h后使用酶标仪在450nm处测定其吸光度值(OD)值，并根据 OD值绘制细胞生长曲线。OD值越小，细胞毒性越大。细胞增殖率＝实验孔 OD值/对照孔OD值×100％，实验重复3次。CCK-8(C0037)试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司。
1.3平板克隆形成实验
取对数生长期的胶质瘤细胞接种于6孔板，每孔接种1mL细胞悬液并将细胞密度调整至500个/mL，充分摇匀后过夜培养，24h后给药，浓度设为0、0.3、1μmol/L，培养14天后用4％多聚甲醛溶液固定30min，PBS清洗3遍，再用1％结晶紫染色，拍照计数。克隆率＝克隆形成数目/接种细胞数目×100％，每次实验重复3次。
1.4 EDU细胞增殖实验
在24孔板中铺设14mm细胞爬片，将对数期生长的胶质瘤细胞C6以每孔1×104个细胞的密度接种于细胞爬片上中，调整细胞至适宜密度后计数，待细胞贴壁后加6c，浓度设为0、0.3、1μmol/L，培养24h后每孔加入100μL 50μmo/LEdU的培养基37℃孵育2h，之后在4％多聚甲醛中室温固定细胞 30min，PBS洗3遍，加入通透液室温孵育20分钟，PBS洗两遍，加入配置好的Click反应液，室温避光孵育30分钟，PBS洗一遍，用Hoechest33342 进行核染色，荧光显微镜(奥林巴斯IX73，奥林巴斯，东京，日本)观察细胞发光情况，红色荧光为增殖细胞，蓝色荧光为细胞核染色。EdU-488细胞增殖检测试剂盒(C0071S)购于上海碧云天生物技术有限公司。
1.5划痕实验检测各组细胞迁移能力
用划痕法测定6c处理后胶质瘤细胞的迁移能力的变化。将胶质瘤细胞接种在6孔板上，细胞达到90％融合度时，通过无菌塑料移液管尖端轻轻刮擦附着的细胞产生单个划痕。然后用无血清培养基洗涤细胞，使划痕的细胞单层愈合24h。光学显微镜下获取愈合0、24h的图像。实验重复3次。
1.6 Westernblot检测蛋白表达
分别加入0、0.3、1μmol/L浓度的6c处理24h后用含有PMSF的RIPA 蛋白裂解液裂解各组胶质瘤细胞，待细胞充***解后，放入4℃预冷的离心机12000×r/min离心15min提取上清液，获得总蛋白，将蛋白和蛋白上样缓冲液混匀后加热100℃变性10min，用BCA分析试剂盒进行定量，蛋白定量后配平蛋白浓度，随后进行SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，使用5％BSA对 0.22μmPVDF膜进行封闭，一抗4℃孵育过夜，TBST洗10min/3次，加二抗孵育2h，TBST洗10min/3次，随即使用iBright 1500成像***(Invitrogen，美国)用于检测免疫反应带，设定对照组蛋白表达水平为1，β-actin为已知浓度标准蛋白对照。蛋白酶抑制剂、加强型RIPA(Radio ImmunoprecipitationAssay)buffer、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒、 BCA蛋白浓度测定试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司,主要抗体来自ABclonal Technology(中国)，一抗：anti-BAX(A19684)和anti-β-actin (AC026)。二抗：HRP标记山羊抗兔IgG购自于ABclonal，用ImageJ软件分析条带的灰度值。
1.7统计分析
所有统计分析均使用SPSS 21.0软件包进行，所有数据均采用one-way ANOVA(单因素方差分析)进行评估，并以平均值±标准差表示，显著性描述为p<0.05。
2.结果
2.1化合物6c对胶质瘤细胞的杀伤作用
为确定6c对胶质瘤细胞是否有杀伤作用，采用CCK8法进行细胞毒性试验，如图7所示，6c浓度为0、1、3、10、30、100和300μM时，其细胞活力值分别为100±3.5、108.62±8.9、105.48±13.3、103.76±6.9、98.05±5.2、 82.01±8.9和42.87±10.6。该结果表示6c浓度在30μM以下，没有细胞毒性 (p>0.05)。从而为后期的细胞实验提供了药物浓度依据。
2.2 A药处理明显降低胶质瘤细胞平板克隆形成能力
为检测6c对胶质瘤细胞增殖能力的影响，用不同浓度的6c(0、0.3和 1μM)处理胶质瘤细胞，采用平板克隆形成法检测各组细胞增殖情况。实验结果显示(图8)：对照组克隆细胞数目为108.3±3.5；0.3μM 6c处理组克隆细胞数目为77.3±3.1(p<0.05)；1μM 6c处理组克隆细胞数目55.7±4.5 (p<0.05)。即6c处理后显著降低了胶质瘤细胞的增殖水平，呈浓度依赖性下降。
2.3 6c处理明显抑制胶质瘤细胞增殖
采用EdU法检测6c处理后的胶质瘤细胞增殖，用不同浓度的6c(0、 0.3和1μM)处理胶质瘤细胞，结果显示(图9)：对照组EdU阳性细胞率为0.53±0.04；0.3μM 6c处理细胞EdU阳性细胞率为0.32±0.03(p<0.05)； 1μM 6c处理组细胞EdU阳性细胞率为0.18±0.01(p<0.05)。该结果可看出，随着6c浓度的增加，胶质瘤EdU阳性细胞数逐渐减少，表示6c可明显抑制胶质瘤细胞增殖。
2.4 6c显著抑制胶质瘤细胞迁移
细胞划痕实验分析6c对胶质瘤细胞迁移能力的影响，如图10所示，0.3 和1μM 6c处理组迁移细胞总数分别为0.68±0.11和0.38±0.13。与对照组相比，实验组中迁移的细胞总数减少，划痕处细胞闭合时间延长(p<0.05)，表示6c可显著抑制胶质瘤细胞迁移。
2.5 6c处理明显促进胶质瘤细胞凋亡
为探讨6c在胶质瘤细胞凋亡中的作用，用不同浓度的6c(0、0.3和1μM) 处理胶质瘤细胞24h，使用免疫印迹分析凋亡因子BAX表达量的变化。结果如图11所示，与对照组相比，0.3和1μMA药处理组的BAX/β-actin比值分别为3.87±0.18(p<0.05)和5.07±0.17(p<0.05)。该结果表示经6c处理后，胶质瘤细胞凋亡因子表达量呈剂量依赖性上调。
以上结果表明化合物6c浓度在30μM以下，没有细胞毒性，且对胶质瘤细胞具有一定抑制活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一类具有抗肿瘤活性的4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物，其特征在于，其结构式如下：
其中，R1为H、4-Cl和5-CH3中的任意一种；
R2为4-ClC6H4、4-BrC6H4、4-CH3C6H4、4-CH3OC6H4和2-ClC6H4中的任意一种；
R3为c-C6H11；
R4为t-Bu。
2.权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物的制备方法，其特征在于，所述4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物的合成路线如下：
3.根据权利要求2所述的具有抗肿瘤活性的4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将2mmol邻叠氮基苯甲醛1溶解于10ml甲醇中，搅拌溶解后依次加入2mmol胺2、2mmol三甲基叠氮硅烷和2mmol异腈3，常温发生Ugi反应，TCL监测直至原料反应完全脱去溶剂得到中间体4；
2)将中间体4溶于5ml四氢呋喃中，再加入0.2mmolPd(PPh3)4、3mmol异腈5，升温至60℃反应完全，将反应液减压浓缩除去溶剂，将残余物经柱层析分离得到目标产物6，即4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物。
4.根据权利要求3所述的具有抗肿瘤活性的4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物的制备方法，其特征在于，步骤2)中，柱层析分离采用体积比为1:10-1:6的乙酸乙酯/石油醚洗脱溶剂。
5.根据权利要求2或3所述的具有抗肿瘤活性的4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物的制备方法，其特征在于，步骤2)中，合成的目标产物6如下：
Compound R1 R2 R3 R4 Yield[a](％) 6c H 4-BrC6H4 c-C6H11 t-Bu 88 6i H 4-CH3C6H4 c-C6H11 t-Bu 73
。
6.根据权利要求5所述的具有抗肿瘤活性的4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物的制备方法，其特征在于，化合物6c[3-(4-溴苯基)-N-(叔丁基)-4-(1-环己基-1H-四唑-5-基)-3,4-二氢喹唑啉-2-胺]的结构式如下：
7.权利要求1所述的4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物在制备乳腺癌和胶质瘤防治药物中的应用。
CN202210178919.4A 2022-02-25 2022-02-25 一类具有抗肿瘤活性的4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物及其制备方法和应用 Active CN114437041B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210178919.4A CN114437041B (zh) 2022-02-25 2022-02-25 一类具有抗肿瘤活性的4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210178919.4A CN114437041B (zh) 2022-02-25 2022-02-25 一类具有抗肿瘤活性的4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114437041A CN114437041A (zh) 2022-05-06
CN114437041B true CN114437041B (zh) 2023-11-10

Family

ID=81373008

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210178919.4A Active CN114437041B (zh) 2022-02-25 2022-02-25 一类具有抗肿瘤活性的4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114437041B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101094839A (zh) * 2004-11-04 2007-12-26 欧洲分子生物学实验室 喹唑啉衍生物、其制备方法及其作为抗有丝***剂的用途以及包含所述衍生物的药物组合物
CN101878203A (zh) * 2007-10-29 2010-11-03 纳科法尔马有限公司 作为抗癌剂的新的4-(四唑-5-基)喹唑啉衍生物
WO2012120423A1 (fr) * 2011-03-04 2012-09-13 Biocodex Composition pharmaceutique destinée a la prévention ou au traitement des cancers
CN105541825A (zh) * 2015-12-28 2016-05-04 中国药科大学 三氮唑衍生物制备方法及其作为药物的用途
CN109776501A (zh) * 2019-02-27 2019-05-21 湖北科技学院 一种3,4-二氢喹唑啉-2(1h)-硫酮衍生物及其合成方法
CN111138419A (zh) * 2020-01-31 2020-05-12 湖北科技学院 一种4-四唑基取代-苯并噁嗪衍生物及其合成方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014154762A1 (en) * 2013-03-27 2014-10-02 Boehringer Ingelheim International Gmbh Dihydroquinazolinone analogues as brd4 inhibitors

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101094839A (zh) * 2004-11-04 2007-12-26 欧洲分子生物学实验室 喹唑啉衍生物、其制备方法及其作为抗有丝***剂的用途以及包含所述衍生物的药物组合物
CN101878203A (zh) * 2007-10-29 2010-11-03 纳科法尔马有限公司 作为抗癌剂的新的4-(四唑-5-基)喹唑啉衍生物
WO2012120423A1 (fr) * 2011-03-04 2012-09-13 Biocodex Composition pharmaceutique destinée a la prévention ou au traitement des cancers
CN105541825A (zh) * 2015-12-28 2016-05-04 中国药科大学 三氮唑衍生物制备方法及其作为药物的用途
CN109776501A (zh) * 2019-02-27 2019-05-21 湖北科技学院 一种3,4-二氢喹唑啉-2(1h)-硫酮衍生物及其合成方法
CN111138419A (zh) * 2020-01-31 2020-05-12 湖北科技学院 一种4-四唑基取代-苯并噁嗪衍生物及其合成方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114437041A (zh) 2022-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2014350729B2 (en) N-benzyl tryptanthrin derivative, and preparation method and application thereof
CN110372669B (zh) 一种基于crbn配体诱导egfr降解的化合物及其制备方法、药物组合物和应用
US8598344B2 (en) CDKI pathway inhibitors and uses thereof
Su et al. Design, synthesis and biological evaluation of new quinoline derivatives as potential antitumor agents
JP2016535788A5 (zh)
CN110563703B (zh) 基于crbn配体诱导parp-1降解的化合物及制备方法和应用
US9409873B2 (en) CDKI pathway inhibitors and uses thereof
CN112656795A (zh) 防己诺林碱在抗结膜黑色素瘤中的作用机制及应用
WO2018068665A1 (zh) 微管蛋白抑制剂
TW201609683A (zh) 阿可拉定化合物的晶型、含有該晶型的藥物及用途
AU2019241625A1 (en) Therapeutic agent for hepatocellular carcinoma
CN114437041B (zh) 一类具有抗肿瘤活性的4-四唑基取代-3，4-二氢喹唑啉衍生物及其制备方法和应用
CN106632409B (zh) 一种阿扑棉酚衍生物及其制备方法和抗肿瘤和免疫调节的应用
Urade et al. A fluorene derivative inhibits human hepatocellular carcinoma cells by ROS-mediated apoptosis, anoikis and autophagy
CN117230132A (zh) 一种口山酮类化合物Austocystin R的培养方法及制药用途
US9518038B2 (en) Condensation product of theanine derivative and carboxylic acid coumarin derivative, its intermediate, preparation method and use thereof
Sangthong et al. Anthracene-9, 10-dione derivatives induced apoptosis in human cervical cancer cell line (CaSki) by interfering with HPV E6 expression
CN115317493A (zh) 一种硼酸类小分子化合物在制备增强免疫检查点抑制剂疗效及治疗白血病药物中的应用
CN113444074B (zh) 一种具有EGFR和Wnt双重抑制作用的化合物及其制备方法和应用
CN114409636A (zh) 一种喹唑啉酮化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用
Zhao et al. The ester derivatives obtained by C‐ring modification of podophyllotoxin‐induced apoptosis and inhibited proliferation in Hemangioma Endothelial Cells via downregulation of PI3K/Akt signaling pathway
CN111108083B (zh) 氨基亚甲基环己烷1,3-二酮化合物的用途
CN111356454A (zh) 含有双环铂的组合产品、其制备方法及其用途
CN115340538B (zh) 8-苯亚胺基甲基小檗碱型衍生物及其制备药物的应用
CN111875606B (zh) 一种基于虚拟对接获得的嘌呤类化合物及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant