CN114431486A - 一种超声辅助碱法提取柑橘果皮中膳食纤维的方法 - Google Patents

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CN114431486A CN202210196221.5A CN202210196221A CN114431486A CN 114431486 A CN114431486 A CN 114431486A CN 202210196221 A CN202210196221 A CN 202210196221A CN 114431486 A CN114431486 A CN 114431486A
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郦萍
周青青
高欣
周涛
陈琳
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Abstract

本发明公开了一种超声辅助碱法提取柑橘果皮中膳食纤维的方法，包括以下步骤：将柑橘果皮烘干后粉碎，称取橘皮粉末加入质量浓度为0.5～2.5％的氢氧化钠溶液充分混匀，超声后离心，分别得上清液和下层固体；在上清液中加入无水乙醇沉淀，离心后冷冻干燥，得到可溶性膳食纤维；下层固体用去离子水离心洗涤后冷冻干燥，得到非可溶性膳食纤维。本发明还同时公开了上述膳食纤维的用途：调节肠道微生态，促进短链脂肪酸的产生。

Description

一种超声辅助碱法提取柑橘果皮中膳食纤维的方法
技术领域
本发明涉及膳食纤维提取技术领域，特别涉及到一种超声辅助碱法提高温州蜜柑可溶性膳食纤维提取率的方法。
背景技术
橘皮是柑橘产品加工过程中产生的一种食物垃圾，不仅造成资源浪费，科学处理柑橘产品副产物提高其利用价值变得至关重要。橘皮副产物中含有半纤维素、淀粉、纤维素、木质素、果胶、可溶性糖、脂肪、灰分、蛋白质和类黄酮等成分。柑橘纤维是一种植物多糖，在柑橘副产物中占比最多，开发潜力巨大。然而，我国在柑橘副产物的开发利用方面研究较少，尚不能充分实现柑橘副产物的高值化利用。
目前，柑橘膳食纤维的提取方法主要包括有水提法、酸提法、碱提法、酶提法、微波辅助提取法、超声辅助提取法等。超声辅助碱法提取是一种新的提取方法，结合了超声提取和碱法提取的优点，比传统的碱法提取效率更高。超声辅助提取法是利用超声波诱导细胞壁附近的空化气泡破裂，使溶剂进入细胞的强度增强，传质强度增强。与传统的加热水提的方法相比，超声辅助提取法能够缩短处理时间、减少溶剂使用量、提高产量。超声辅助提取技术已成功应用于多糖、油脂和蛋白质等成分的提取。
膳食纤维是一类不易被人体内源酶消化但可以被肠道内菌群利用的物质。膳食纤维是一依据在水中溶解性的不同，膳食纤维分为可溶性膳食纤维(SDF)和不溶性膳食纤维(IDF)。膳食纤维具有极强的水合性质，有利于控制肥胖；能够吸附葡萄糖分子，进而延缓和抑制对糖的吸收；能降低人体对脂质吸收，进而起到调节血脂的作用。SDF和IDF在不同的方面表现出不同程度的功效。研究膳食纤维不同成分的功能特性，更加全面的探究膳食纤维功能具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种高提取率的超声辅助碱法提取温州蜜柑果皮中可溶性膳食纤维的方法。
为了解决上述问题，本发明提供一种超声辅助碱法提取柑橘果皮中膳食纤维的方法(超声辅助碱法提取柑橘果皮中膳食纤维的方法)，包括以下步骤：
(1)将柑橘果皮烘干后粉碎，制成橘皮粉末；
(2)称取橘皮粉末(1g)，按照10～30mL/g的液料比，加入质量浓度为0.5～2.5％的氢氧化钠溶液，充分混匀，得混合液；
(3)将步骤(2)所得的混合液进行超声，超声提取的功率为195±20W，超声时间10～30min，离心，分别得上清液和下层固体；
(4)在步骤(3)所得的上清液中加入6±0.5倍体积的无水乙醇沉淀1±0.1小时，离心后冷冻干燥，得到可溶性膳食纤维；
(5)将步骤(3)所得的下层固体用去离子水离心洗涤后冷冻干燥，得到非可溶性膳食纤维。
作为本发明的超声辅助碱法提取柑橘果皮中膳食纤维的方法的改进：步骤(1)中所述柑橘果皮经50℃干燥48小时，然后用粉碎机进行粉碎，过40目筛，得柑橘皮粉。
作为本发明的超声辅助碱法提取柑橘果皮中膳食纤维的方法的进一步改进：步骤(2)中所述液料比为24mL/g，氢氧化钠溶液质量浓度为0.9％。
作为本发明的超声辅助碱法提取柑橘果皮中膳食纤维的方法的进一步改进：步骤(3)中所述超声提取的功率为195W，超声时间15min。
作为本发明的超声辅助碱法提取柑橘果皮中膳食纤维的方法的进一步改进：步骤(3)(4)(5)中所述离心转速10000±1000r/min，室温离心15±5min。
作为本发明的超声辅助碱法提取柑橘果皮中膳食纤维的方法的进一步改进：步骤(4)(5)中冷冻干燥为真空冷冻干燥；
所述真空冷冻干燥条件为：先于主冻干隔板温度-5℃、真空度0.1mbar冻干14h，再于主冻干隔板温度5℃、真空度为0.01mbar解析干燥10h。
作为本发明的超声辅助碱法提取柑橘果皮中膳食纤维的方法的进一步改进：在步骤(5)中所述的去离子水用量为每克橘皮粉末产生的下层固体加入20±5mL的去离子水。
作为本发明的超声辅助碱法提取柑橘果皮中膳食纤维的方法的进一步改进：所述柑橘为温州蜜柑。
本发明还同时提供了利用上述任一方法提取得到的膳食纤维的用途：调节肠道微生态，促进短链脂肪酸的产生。膳食纤维包含可溶性和非可溶性膳食纤维。
本发明的技术优势在于：
采用本发明方法提取柑橘果皮(例如温州蜜柑果皮)中的膳食纤维，结合超声提取法和碱法提取的优势，相比于传统的提取方法，提取时间大大缩短，可溶性膳食纤维提取率有所提高。本发明提出的一种超声辅助碱法提高温州蜜柑可溶性膳食纤维提取率的方法，在该提取条件下，超声处理15min时温州蜜柑可溶性膳食纤维的提取率为105.6mg/g。
此外，本发明方法所得的膳食纤维提取物，能与肠道菌群高效发酵，提高肠道微生物多样性，提高肠道中考拉杆菌属(Phascolarctobacteriu)等有益菌属的相对丰度，降低肠道中普雷沃氏菌属(Prevotella)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、沙门氏菌属(Salmonella)等有害菌属的相对丰度。并增加肠道微生物代谢的短链脂肪酸含量，特别是丙酸、丁酸含量显著提高，有利于维持宿主肠道健康稳态。
综上所述，本发明优化了超声辅助碱法提取工艺参数，提取温州蜜柑果皮中的膳食纤维，实现了膳食纤维的高效提取，为柑橘加工副产物实现高值化利用以及深入研究柑橘果皮膳食纤维的功能特性奠定理论基础。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是不同单因素对温州蜜柑可溶性膳食纤维提取率影响的试验结果图；
图1中：
A为本发明实施不同液料比对温州蜜柑可溶性膳食纤维提取率影响的试验结果图；
B为本发明实施不同提取时间对温州蜜柑可溶性膳食纤维提取率影响的试验结果图；
C为本发明实施不同碱液浓度对温州蜜柑可溶性膳食纤维提取率影响的试验结果图。
图2是粪便样本发酵前后菌群的相对丰度(门水平)；
图2中：
Ori代表为未经发酵的原始粪便样品组；
Starch代表以淀粉为碳源的对照组；
SDF、IDF和DF分别代表温州蜜柑果皮中可溶性膳食纤维、非可溶性膳食纤维和膳食纤维在志愿者提供的肠道菌群发酵后的样品，其中DF组中的膳食纤维是指4份IDF和1份SDF组成的混合物；
Ori、SDF、DF从下至上依次为：Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Fusobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Verrucomicrobia、Chloroflexi、Nitrospirae、Other；
Starch从下至上依次为：Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Fusobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Verrucomicrobia、Chloroflexi、Other；
IDF从下至上依次为：Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Fusobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi。
图3是粪便样本发酵前后菌群相对丰度(属水平)；
图3中：
Ori代表为未经发酵的原始粪便样品组；
Starch代表以淀粉为碳源的对照组；
SDF、IDF和DF分别代表温州蜜柑果皮中可溶性膳食纤维、非可溶性膳食纤维和膳食纤维在志愿者提供的肠道菌群发酵后的样品，其中DF组中的膳食纤维是指4份IDF和1份SDF组成的混合物；
Ori、Starch、SDF、IDF从下至上依次为：Bacteroides、Megamonas、Prevotella、Klebsiella、Parabacteroides、Faecalibacterium、Bifidobacterium、Escherichia、Sutterella、Phascolarctobacterium、Megasphaera、Citrobacter、Roseburia、Salmonella、Enterobacter、Lachnospira、Blautia、Dialister、Collinsella、[Ruminococcus]、Gemmiger、Dorea、Oscillospira、Lachnospiraceae_Clostridium、Coprococcus、Paraprevotella、Alistipes、Fusobacterium、Acidaminococcus、Ruminococcaceae_Ruminococcus、Other；
DF从下至上依次为：Bacteroides、Megamonas、Prevotella、Klebsiella、Parabacteroides、Faecalibacterium、Bifidobacterium、Escherichia、Sutterella、Phascolarctobacterium、Megasphaera、Citrobacter、Roseburia、Enterobacter、Lachnospira、Blautia、Dialister、Collinsella、[Ruminococcus]、Gemmiger、Dorea、Oscillospira、Lachnospiraceae_Clostridium、Coprococcus、Paraprevotella、Alistipes、Fusobacterium、Acidaminococcus、Ruminococcaceae_Ruminococcus、Other。
图4是发酵前后各组微生物菌落结构丰度(属水平)的LefSe(Line DiscriminantAnalysis effect size)线性判别分析；
图4中：
A为进化分支图，圆环由内到外分别代表门、纲、目、科、属、种的物种差异，圆点代表该水平下的一个分类，淡黄色节点表示对组间差异无显著影响的微生物类群，其他颜色圆点表示在对应组别中显著富集，且对组间差异存在显著影响的微生物类群；
A图中：a、b、i属于DF组；h属于SDF组；c、d、e、f、g、j属于Starch组；
B为LDA值分布柱状图，展示了LDA Score大于3.0的物种，柱状图的长度代表差异物种的影响大小；
DF组为添加温州蜜柑果皮膳食纤维发酵的试验组，SDF组为添加温州蜜柑果皮可溶性膳食纤维发酵的试验组，Starch组代表以淀粉为碳源发酵的对照组，其中DF组中的膳食纤维是指4份IDF和1份SDF组成的混合物；
B图中：柱形图从下到上依次为DF、SDF、Starch。
图5是粪便样本体外发酵前后短链脂肪酸的含量变化；
图5中：
A为粪便样本体外发酵前后短链脂肪酸总酸含量；
B为粪便样本体外发酵前后丙酸的含量；
C为粪便样本体外发酵前后丁酸的含量；
Ori代表为未经发酵的原始粪便样品组；
Starch代表以淀粉为碳源的对照组；
SDF、IDF和DF分别代表温州蜜柑果皮中可溶性膳食纤维、非可溶性膳食纤维和膳食纤维在志愿者提供的肠道菌群发酵后的样品，其中DF组中的膳食纤维是指4份IDF和1份SDF组成的混合物。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，对本发明做进一步的说明。本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：超声辅助碱法提取温州蜜柑果皮膳食纤维，依次进行以下步骤：
(1)将温州蜜柑果皮经50℃烘干48h，粉碎过40目筛，得柑橘皮粉。
(2)在100mL的离心管中称取步骤(1)所得的干燥后的柑橘皮粉1g，以24:1(mL:g)的液料比加入0.9％(质量％)的氢氧化钠溶液24mL，进行超声辅助提取：功率195W，超声时间15min。
(3)提取结束后以转速10000r/min离心15min，分别得上清液和下层固体。
(4)在步骤(3)所得的上清液中加入6倍体积无水乙醇沉淀1小时，10000r/min离心15min后弃上清，所得下层固体经真空冷冻干燥，得到可溶性膳食纤维105.6mg；
(5)在步骤(3)所得的下层固体中加入去离子水20mL，10000r/min离心15min后弃上清，经真空冷冻干燥，得到非可溶性膳食纤维475.8mg。
上述步骤(4)、步骤(5)的真空冷冻干燥条件均为：先于主冻干隔板温度-5℃、真空度0.1mbar冻干14h，再于主冻干隔板温度5℃、真空度为0.01mbar解析干燥10h。
本发明在发明过程中，为了充分考虑不同因素的提取条件对温州蜜柑果皮可溶性膳食纤维提取率的影响，因此进行了如下实验：
(1)试验设计：
①不同料液比：分别称取过40目筛的温州蜜柑果皮粉末1g，分别加入10、15、20、25、30倍量1.0％的氢氧化钠溶液，进行超声辅助提取，超声为功率195W，超声时间15min。提取结束后以转速10000r/min离心15min，得上清液和下层固体。在上清液中加入6倍体积的无水乙醇沉淀1小时，经50℃干燥48h得到可溶性膳食纤维。每个重复3次试验，收集并测量可溶性膳食纤维重量，计算提取率，从而筛选出提取的最佳料液比。
②不同提取时间：分别称取过40目筛的温州蜜柑果皮粉末1g，加入20倍量1.0％的氢氧化钠溶液，进行超声辅助提取，超声为功率195W，超声时间分别为10、15、20、25、30min。提取结束后以转速10000r/min离心15min，得上清液和下层固体。在上清液中加入6倍体积的无水乙醇沉淀1小时，经50℃干燥48h得到可溶性膳食纤维。每个重复3次试验，收集并测量可溶性膳食纤维重量，计算提取率，从而筛选出提取的最佳提取时间。
③不同碱液浓度：分别称取过40目筛的温州蜜柑果皮粉末1g，分别加入20倍量0.5、1.0、1.5、2.0、2.5％的氢氧化钠溶液，进行超声辅助提取，超声为功率195W，超声时间分别为15min。提取结束后以转速10000r/min离心15min，得上清液和下层固体。在上清液中加入6倍体积的无水乙醇沉淀1小时，经50℃干燥48h得到可溶性膳食纤维。每个重复3次试验，收集并测量可溶性膳食纤维重量，计算提取率，从而筛选出提取的最佳碱液浓度。
上述①～③的温州蜜柑果皮可溶性膳食纤维提取率结果如图1所示。
如图A所示，当液料比在20倍时，温州蜜柑果皮可溶性膳食纤维的提取率高，加液量过低不利于物质的溶出，加液量过大超声作用可能会被减弱；
如图B所示，当提取时间大于15min时，温州蜜柑果皮可溶性膳食纤维的提取率趋于降低，这可能是因为长时间的超声破碎的导致局部温度增加，部分物质被分解；
如图C所示，随着碱液浓度增加，温州蜜柑果皮可溶性膳食纤维提取率急剧下降，这可能是因为碱液浓度过高不利于有效成分的溶出；
从图A～图C中可以看出，不同液料比、提取时间、碱液浓度对温州蜜柑果皮可溶性膳食纤维提取率都具有显著性影响。
将实施例1所得的温州蜜柑果皮膳食纤维分别进行肠道微生态实验。
(1)不同碳源培养基、粪便悬液的配制
微量元素溶液成分：MgSO4·7H2O 3g/L，CaCl2·2H2O 0.1g/L，MnCl2·4H2O 0.32g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，CoSO4·7H2O 0.18g/L，ZnSO4·7H2O 0.18g/L，CuSO4·5H2O 0.01g/L，NiCl2·6H2O 0.092g/L)
VI培养基配制：准确称取胰蛋白胨3g，蛋白胨3g，酵母提取物4.5g，粘液素0.5g，L-半胱氨酸盐酸盐0.8g，3#胆盐0.4g，NaCl 4.5g，KCl 2.5g，MgCl2·6H2O 4.5g，CaCl2·6H2O0.2g，KH2PO4 0.4g，刃天青0.1g，血红素0.05g，吐温80 1mL，微量元素溶液2mL溶于1L超纯水中。
VI+淀粉：量筒量取100mL配制好的VI培养基，加入0.8g淀粉使最终浓度为8g/L，调节pH至6.8。将培养基分装至250mL锥形瓶中，121℃20min高压灭菌。待培养基冷却至50℃左右，在超净工作台中，将培养基分装至无菌的10mL西林瓶，每个西林瓶中加5mL培养基，充入氮气进行厌氧预处理，然后压盖密封。
VI+SDF：量筒量取100mL配制好的VI培养基，加入0.8g SDF使最终浓度为8g/L，调节pH至6.8。将培养基分装至250mL锥形瓶中，121℃20min高压灭菌。待培养基冷却至50℃左右，在超净工作台中，将培养基分装至无菌的10mL西林瓶，每个西林瓶中加5mL培养基，充入氮气进行厌氧预处理，然后压盖密封。
VI+IDF：每瓶西林瓶中加入0.04g IDF样品，放入超净工作台待用。量筒量取100mL配制好的VI培养基，调节pH至6.8。在超净工作台中分装至10mL西林瓶中，每个西林瓶中加5mL培养基，充入氮气进行厌氧预处理，然后压盖密封。
VI+DF(IDF:SDF＝4:1)：每瓶西林瓶中加入.032g IDF样品，放入超净工作台待用。量筒量取100mL配制好的VI培养基，加入0.16g SDF使最终浓度为1.6g/L，调节pH至6.8。在超净工作台中分装至10mL西林瓶中，每个西林瓶中加5mL培养基，充入氮气进行厌氧预处理，然后压盖密封。
粪便悬浊液：选取5名志愿者，其中女性2名男性3名，近一年内居住于中国浙江杭州，年龄在20～40岁之间。志愿者均符合中国传统饮食习惯，身体健康，无糖尿病、高血压、结肠炎等慢性疾病，采样前至少三个月内未服用过抗生素、益生元等药物制剂。
对所取的5人晨起粪便分别进行如下处理：置于灭菌后的粪便采样管中，称取0.8g于10mL无菌离心管中，加入8mL 1×PBS缓冲液，利用涡旋震荡器混匀，制成10％(wt/vol)粪便悬浊液，经过0.24mm滤网过滤至10mL离心管中备用。
(2)人体粪便悬浮液分组发酵
1mL注射器吸取0.5mL粪便悬浊液依次接种至步骤(1)中配制的5mL不同碳源培养基，剩余粪便悬浊液分装至2mL灭菌离心管中，于-80℃冰箱保存，作为16S rDNA高通量测序和短链脂肪酸检测的原始样品。将接种后的培养基放入厌氧箱，在37℃条件下发酵培养24h，取2份1.5mL发酵悬液(5个实验组，每个样本各取2份1.5mL发酵悬液)，于-80℃冰箱保存。
分为Ori、Starch、SDF、IDF、DF五个组，每组中5个重复样本，对应5位志愿者提供的样本，每个样本3组平行。
Ori代表未经发酵的原始粪便样品组。
Starch代表对照组：0.5mL的粪便悬浊液，添加5mL的“VI+淀粉”后进行发酵培养；
SDF：0.5mL的粪便悬浊液，添加5mL的“VI+SDF”后进行发酵培养；
IDF：0.5mL的粪便悬浊液，添加5mL的“VI+IDF”后进行发酵培养；
DF：0.5mL的粪便悬浊液，添加5mL的VI+DF后进行发酵培养；
(3)粪便悬浮液发酵样品DNA提取及16S rDNA测序分析
采用凯杰的QI Aamp Power Fecal DNA Kit试剂盒对粪便原样和粪便发酵液样品进行DNA提取。
16S rDNA V3-V4区高通量测序采用Illumina NovaSeq平台，扩增上游引物为341F(CCTAYGGGRBGCASCAG)，下游引物为806R(GGACTACNNGGGTATCTAAT)。扩增16S rDNA某个可变区，采用高通量测序仪Miseq或Hiseq对其进行测序，通过生物信息学分析可以获得特定实验样品中细菌或古菌物种组成、物种丰度等诸多信息。
图2列出了发酵前后样品在“门”水平上相对丰度排名靠前的10位，其中，以变形菌门(Proteobacteria)拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)为主要类群。发酵前样品中变形菌门占比较小，经过体外发酵后占比增大。发酵后，变形菌门(Proteobacteria)相对丰度在对照组Starch(28.11％)中占比较小，在试验组中SDF组(39.25％)、IDF组(37.13％)和DF组(44.69％)中占比较大，说明温州蜜柑果皮膳食纤维可促进变形菌门(Proteobacteria)菌群的生长。
图3列出了各志愿者粪便样本发酵前后“属”水平上相对丰度排名靠前的30位，其优势菌属为拟杆菌属(Bacteroides)，在原始粪便样本Ori组中的相对丰度占28.11％，在对照组Starch占比略有下降为26.49％，在实验组中其相对丰度增加，SDF组占比30.94％、IDF组占比36.26％和DF组占比35.58％。
粪便样本添加温州蜜柑果皮膳食纤维发酵后，与对照组相比，实验组的副拟杆菌属(Parabacteroides)、考拉杆菌属(Phascolarctobacteriu)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)占比有所上升。三种菌属在DF组中占比最高(9.68％、4.52％、0.93％)，相比对照组，副杆菌属(Parabacteroides)高出7.08％，考拉杆菌属(Phascolarctobacteriu)高出4.13％，氨基酸球菌属(Acidaminococcus)高出0.83％。与对照组相比，实验组中的普雷沃氏菌属(Prevotella)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、沙门氏菌属(Salmonella)相对丰度占比有所下降。普雷沃氏菌属(Prevotella)和沙门氏菌属(Salmonella)在DF组占比最少(6.37％、0.00％)，相比对照组分别下降8.09％和8.57％，粪杆菌属(Faecalibacterium)在IDF占比最少(0.71％)，相比对照组分别下降5.93％。
综上，温州蜜柑果皮膳食纤维对参加试验的志愿者的肠道菌群具有一定的调节作用，可以提高肠道中考拉杆菌属(Phascolarctobacteriu)等有益菌属的相对丰度，降低肠道中普雷沃氏菌属(Prevotella)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、沙门氏菌属(Salmonella)等有害菌属的相对丰度。
通过LefSe(Line Discriminant Analysis(LDA)effect size)线性判别分析对发酵前后各组微生物菌落结构丰度进行比较，如图4所示，经LefSe分析后，Starch组、SDF组、DF组存在显著差异菌属，从“目”水平分析，Starch组样本杆菌目(Bacilli)起显著差异作用，其他组在该水平上差异不显著；“属”水平上，Starch组样本存在显著差异的是瘤胃球菌属(Ruminococcaceae)，DF组样本存在显著差异的是紫单胞菌属(Porphyromonadaceae)；“种”水平上，SDF组样本存在显著差异的是巨球型菌(Megasphaera)，DF组样本存在显著差异的副杆菌(Parabacteroides)，Starch组样本存在显著差异的是布拉氏菌(Blautia)、毛螺菌(Lachnospira)、粪杆菌(Faecalibacterium)、沙门氏菌(Salmonella)。
(4)气相色谱检测粪便悬浮液发酵样品中短链脂肪酸
短链脂肪酸含量是人体肠道内微生物通过代谢生成的产物，是衡量肠道菌群生长及代谢情况的一个重要指标，包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等。
取适量样品(步骤2实验组的每个样本)与500μL水混合，加300μL浓度为50％硫酸，再加50μ浓度为500mg/L的环己酮内标溶液和1mL***混合均匀，在4℃、12000rpm条件下离心10min，取上清上机测试。
色谱***：Agilent DB-WAX毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：高纯氦气；流速：1.0mL/min；进样口温度：220℃；进样量：1μL；不分流进样，溶剂延迟时间2.5min；质谱***：电子轰击离子源(EI)，离子源温度230℃，接口温度220℃；升温程序为：60℃，1min；210℃，3min。
5名志愿者粪便样本体外发酵后总酸的含量，试验组总酸含量均值普遍高于Starch组(图5A)，说明温州蜜柑果皮膳食纤维可以显著促进短链脂肪酸的产生。发现在丙酸中SDF组与对照组之间差异极显著(图5B)，IDF、DF组与对照组之间差异显著，分析原因可能与考拉杆菌属(Phascolarctobacteriu)和氨基酸球菌属(Acidaminococcus)相对丰度有关。考拉杆菌属通常是一种有益的菌，此菌与减肥有一定关联。氨基酸球菌属发酵氨基酸特别是谷氨酸，有时伴有其他脂肪酸，它们的产生取决于所利用的氨基酸。发现在丁酸中SDF组与对照组之间存在显著性差异(图5C)，分析原因可能与巨球型菌(Megasphaera)相对丰度有关。丁酸有助于有益菌的生长，一致有害菌的生长。
对比例1：超声辅助碱法提取温州蜜柑果皮膳食纤维，依次进行以下步骤：
(1)将温州蜜柑果皮经50℃烘干48h，粉碎过40目筛，得柑橘皮粉。
(2)在100mL的离心管中称取步骤(1)所得的干燥后的柑橘皮粉1g，以15:1(mL:g)的料液比加入1.5％(质量％)的氢氧化钠溶液15mL，进行超声辅助提取：功率195W，超声时间15min。
(3)提取结束后以转速10000r/min离心15min，得上清液和下层固体。
(4)在步骤(3)所得的上清液中加入6倍体积的无水乙醇沉淀1小时，10000r/min离心15min后弃上清，所得下层固体经真空冷冻干燥，得到可溶性膳食纤维。
(5)在步骤(3)所得的下层固体中加入去离子水20mL，10000r/min离心15min后弃上清，经真空冷冻干燥得到非可溶性膳食纤维。
对比例2：超声辅助碱法提取温州蜜柑果皮膳食纤维，依次进行以下步骤：
(1)将温州蜜柑果皮经50℃烘干48h，粉碎过40目筛，得柑橘皮粉。
(2)在100mL的离心管中称取步骤(1)所得的干燥后的柑橘皮粉1g，以25:1(mL:g)的料液比加入1.5％(质量％)的氢氧化钠浓度25mL，进行超声辅助提取：功率195W，超声时间15min。
(3)提取结束后以转速10000r/min离心15min，得上清液和下层固体。
(4)在步骤(3)所得的上清液中加入6倍体积的无水乙醇沉淀1小时，10000r/min离心15min后弃上清，所得下层固体经真空冷冻干燥，得到可溶性膳食纤维。
(5)在步骤(3)所得的下层固体中加入去离子水20mL，10000r/min离心15min后弃上清，经真空冷冻干燥得到非可溶性膳食纤维。
对比例3：超声辅助碱法提取温州蜜柑果皮膳食纤维，依次进行以下步骤：
(1)将温州蜜柑果皮经50℃烘干48h，粉碎过40目筛，得柑橘皮粉。
(2)在100mL的离心管中称取步骤(1)所得的干燥后的柑橘皮粉1g，以20:1(mL:g)的料液比加入0.5％(质量％)的氢氧化钠浓度20mL，进行超声辅助提取：功率195W，超声时间10min。
(3)提取结束后以转速10000r/min离心15min，得上清液和下层固体。
(4)在步骤(3)所得的上清液中加入6倍体积的无水乙醇沉淀1小时，10000r/min离心15min后弃上清，所得下层固体经真空冷冻干燥，得到可溶性膳食纤维。
(5)在步骤(3)所得的下层固体中加入去离子水20mL，10000r/min离心15min后弃上清，经真空冷冻干燥得到非可溶性膳食纤维。
对比例4：超声辅助碱法提取温州蜜柑果皮膳食纤维，依次进行以下步骤：
(1)将温州蜜柑果皮经50℃烘干48h，粉碎过40目筛，得柑橘皮粉。
(2)在100mL的离心管中称取步骤(1)所得的干燥后的柑橘皮粉1g，以20:1(mL:g)的料液比加入1.5％(质量％)的氢氧化钠浓度20mL，进行超声辅助提取：功率195W，超声时间10min。
(3)提取结束后以转速10000r/min离心15min，得上清液和下层固体。
(4)在步骤(3)所得的上清液中加入6倍体积的无水乙醇沉淀1小时，10000r/min离心15min后弃上清，所得下层固体经真空冷冻干燥，得到可溶性膳食纤维。
(5)在步骤(3)所得的下层固体中加入去离子水20mL，10000r/min离心15min后弃上清，经真空冷冻干燥得到非可溶性膳食纤维。
上述对比例的真空冷冻干燥条件同实施例1。
上述对比例所得可溶性膳食纤维含量和膳食纤维肠道调节能力与本发明的数据对比如下表1：
表1
Figure BDA0003527200280000111
Figure BDA0003527200280000121
可溶性膳食纤维含量＝可溶性膳食纤维固体质量(mg)/柑橘粉末质量(g)。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (9)

1.超声辅助碱法提取柑橘果皮中膳食纤维的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将柑橘果皮烘干后粉碎，制成橘皮粉末；
(2)称取橘皮粉末，按照10～30mL/g的液料比，加入质量浓度为0.5～2.5％的氢氧化钠溶液，充分混匀，得混合液；
(3)将步骤(2)所得的混合液进行超声，超声提取的功率为195±20W，超声时间10～30min，离心，分别得上清液和下层固体；
(4)在步骤(3)所得的上清液中加入6±0.5倍体积的无水乙醇沉淀1±0.1小时，离心后冷冻干燥，得到可溶性膳食纤维；
(5)将步骤(3)所得的下层固体用去离子水离心洗涤后冷冻干燥，得到非可溶性膳食纤维。
2.根据权利要求1所述的超声辅助碱法提取柑橘果皮中膳食纤维的方法，其特征在于：步骤(1)中所述柑橘果皮经50℃干燥48小时，然后用粉碎机进行粉碎，过40目筛，得柑橘皮粉。
3.根据权利要求2所述的超声辅助碱法提取柑橘果皮中膳食纤维的方法，其特征在于：步骤(2)中所述液料比为24mL/g，氢氧化钠溶液质量浓度为0.9％。
4.根据权利要求3所述的超声辅助碱法提取柑橘果皮中膳食纤维的方法，其特征在于：步骤(3)中所述超声提取的功率为195W，超声时间15min。
5.根据权利要求4所述的超声辅助碱法提取柑橘果皮中膳食纤维的方法，其特征在于：步骤(3)(4)(5)中所述离心转速10000±1000r/min，室温离心15±5min。
6.根据权利要求5所述的超声辅助碱法提取柑橘果皮中膳食纤维的方法，其特征在于：步骤(4)(5)中冷冻干燥为真空冷冻干燥；
所述真空冷冻干燥条件为：先于主冻干隔板温度-5℃、真空度0.1mbar冻干14h，再于主冻干隔板温度5℃、真空度为0.01mbar解析干燥10h。
7.根据权利要求6所述的超声辅助碱法提取柑橘果皮中膳食纤维的方法，其特征在于，在步骤(5)中所述的去离子水用量为每克橘皮粉末产生的下层固体加入20±5mL的去离子水。
8.根据权利要求1～7任一所述的超声辅助碱法提取柑橘果皮中膳食纤维的方法，其特征在于：所述柑橘为温州蜜柑。
9.如权利要求1～8任一方法提取得到的膳食纤维的用途：调节肠道微生态，促进短链脂肪酸的产生。
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