CN114414713A - 一种基于响应面法优化的茶叶中主要PAEs提取和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于响应面法优化的茶叶中主要PAEs提取和检测方法。邻苯二甲酸酯类(PAEs)主要用作增塑剂，少量作为洗护用品和化妆品的添加剂，作为原料制成的产品数以百万计。其干扰人体内分泌***，有着致畸、致癌、致突变潜能。但其量微，不易检测。本发明通过有机溶剂提取浓缩后，经固相萃取净化，利用GC‑MS检测。本发明基于响应面设计方法的茶叶中主要PAEs的提取条件优化，针对性强、操作简便、准确度高，尤其适用于茶叶中5种PAEs含量的测定，具有良好的精准度，为茶叶的质量控制和安全评价提供科学依据，对监控预防茶叶PAEs污染具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于茶叶中环境污染物检测领域，涉及一种茶叶中5种邻苯二甲酸酯类的提取和检测方法。
背景技术
邻苯二甲酸酯类(phthalic acid esters，PAEs)是一种增强柔韧性的材料助剂，广泛应用于塑料制品，占塑化剂总量的80％。由于PAEs具有致畸、致癌、致突变潜能，因此规定在塑料制品中PAEs最大添加量不得超过30％。因PAEs不以化学键键合到聚合物基质上，因此极易释放至环境中，且难以降解，威胁人类健康。美国环境保护署将邻苯二甲酸二甲酯(Dimethyl phthalate，DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(Diethyl phthalate，DEP)和邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(Di(2-ethyl) hexyl phthalate，DEHP)等6种PAEs列为优先控制的有毒污染物。我国也出台了多个相关标准和规定，加强食品PAEs污染风险防控，保障食品安全。
茶叶作为世界上最受欢迎的无酒精饮品之一，其消费量和生产量仅次于水。而我国茶园面积4700多万亩，茶叶年产量近300万吨，是世界茶叶生产、消费和出口大国，居世界第一、第一、第二位。目前茶产业已成为其主产区农村经济的重要支柱产业和出口创汇的优势产业。随着茶产业的迅速发展，茶叶质量安全成为制约产业发展的重要瓶颈。茶树作为多年生常绿植物，在种植、加工、包装储运过程中会受到多种源头污染，且茶叶吸附活性强、生产和加工过程长等特点，PAEs会在茶叶中不断富集，造成茶叶质量安全隐患。研究发现在茶树鲜叶、绿茶、红茶和黑茶等茶叶产制品中皆检出PAEs，检出率高达100％。而PAEs是一类广泛存在的持久性有机污染物，因此尽快建立和完善茶叶中PAEs检测方法，可为制订相关政策标准和进一步控制食品中PAEs的含量提供理论依据和检测手段，刻不容缓。
近年来随着生活水平的提高和安全意识的增强，茶叶相关标准和规范也日益严格，茶叶质量安全受到我国乃至世界密切关注。目前国内外针对食品领域PAEs 的监查力度逐年加大，在酒类、油脂类食品中均规定了最大残留限量和检测标准，但针对茶叶方面的相关规定则未制订，如何完善茶叶中PAEs的检测方法提高检测的灵敏度和精密度，需要进一步深入研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，基于利用响应面优化法，提供一种提取和检测茶叶中主要邻苯二甲酸酯类的方法。
本发明首先提供了一种基于响应面法优化的茶叶中主要PAEs提取和检测方法，其包括以下步骤：
1)建立茶叶样品PAEs提取流程
所述PAEs提取流程为：以一定料液比向待测茶样中加入正己烷，进行超声萃取，萃取液在一定温度下静置一定时间后利用减压蒸馏进行浓缩，再经固相萃取净化洗脱；所述固相萃取采用的固相萃取柱为石墨化碳黑和氨基混合填料固相萃取玻璃柱；
2)茶叶样品PAEs提取条件响应面优化
设置不同料液比、超声后不同萃取静置时间和超声后不同萃取静置温度三个因素，进行单因素试验；在单因素试验基础上，将料液比(A)，超声后萃取静置温度(B)和超声后萃取静置时间(C)作为响应面试验自变量，茶叶中PAEs 的提取量(R)为响应值，进行Box-Behnken优化处理，通过方差分析和响应等高线图分析，确定茶叶中PAEs的最佳提取条件；
3)茶叶中主要PAEs提取和检测
对于待测茶样，以步骤2)获得的茶叶中PAEs的最佳提取条件，采用步骤 1)的提取流程进行PAEs提取，并通过气相色谱-质谱联用仪进行PAEs检测，再根据各邻苯二甲酸酯化合物的标准工作曲线计算得到检测含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，通过方差分析和响应等高线图分析，确定茶叶中PAEs的最佳提取条件，具体为：
响应面图是茶叶中PAEs提取量与各影响因素所形成的三维空间曲面图，曲线越陡，则该影响因素对茶叶中PAEs提取量影响越大；利用Design-ExertV8.0.6 软件进行多元回归拟合，建立茶叶中PAEs提取量与料液比(A)、超声后萃取静置温度(B)、超声后萃取静置时间(C)的多元回归方程；
根据二次回归方程，得到茶叶中PAEs的最佳提取条件。
作为本发明的优选方案，步骤2)所得茶叶中PAEs的最佳提取条件中，茶样与正己烷的料液比是1:20，料液比的单位是g/ml。
作为本发明的优选方案，步骤2)所得茶叶中PAEs的最佳提取条件中，超声后需40℃下静置12h。
作为本发明的优选方案，步骤1)所述的超声为在40℃下超声3h，之后再进行静置。
作为本发明的优选方案，所述固相萃取柱采用体积比为3:1的乙腈和甲苯混合液进行活化，采用体积比为3:1的乙腈和甲苯混合液进行洗脱。
作为本发明的优选方案，步骤3)中，通过固相萃取净化得到的洗脱液经减压蒸馏至干，冷却，加入正己烷，再进行气相色谱-质谱联用仪检测。
作为本发明的优选方案，气相色谱条件为：色谱柱是HP-5MS石英毛细管柱，尺寸为30.0m×250μm×0.25μm；进样口温度为280℃；不分流进样；进样量为 1μL；载气为高纯氦气，恒定流量，流速为1.0mL/min；升温程序如下：初始温度80℃，保持1min，以6℃/min升至140℃，保持2min，再以2℃/min升至150℃，保持2min，再以5℃/min升至180℃，保持1min，以6℃/min升至250℃，保持 1min，再以3℃/min升至270℃，在270℃保持1min。
作为本发明的优选方案，质谱条件为：电离方式为电子轰击电离源(EI)；电离能量为70eV；传输线温度为280℃；离子源温度为230℃；溶剂延迟5min；检测方式为选择离子扫描(SIM)。
与现有技术相比，本发明为进一步提高茶叶中PAEs的提取率，采用响应面优化分析方法，在不同料液比、不同萃取时间、不同萃取温度三个因素作用下，单因素实验的基础上，进行了多元回归拟合，确证最优提取条件，回归模型预测可靠、稳定。
在净化过程中，本实验采用的是石墨化碳黑和氨基混合填料固相萃取玻璃柱，相比现有技术使用的石墨化碳黑和PSA(N-丙基-乙二胺)柱，PSA和氨基有相似的选择性，但PSA极性比氨基弱，而提取的目标物PAEs是弱极性或极性中等偏下。在净化过程中，根据相似者相溶的原理，相比PSA来说，氨基不太容易保留目标物PAEs，因此相对较易在流出液中，收集流出液，提高提取率。
附图说明
图1为5种邻苯二甲酸酯化合物标准溶液气相色谱-质谱总离子流色谱图 (0.05μg/mL)；
图2为单因素分析超声后不同萃取温度与茶叶中PAEs提取量的关系；
图3为单因素分析超声后不同萃取时间与茶叶中PAEs提取量的关系；
图4为单因素分析不同料液比与茶叶中PAEs提取量的关系；
图5为料液比与超声后萃取时间之间交互作用的三维响应面图；
图6为超声后萃取温度与超声后萃取时间之间交互作用的三维响应面图；
图7为料液比与超声后萃取温度之间交互作用的三维响应面图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和实施例对本发明做进一步说明。
实施例1 5种PAEs标准工作曲线的制作
1.1 PAEs标准溶液制备
混合标准储备液配制：准确吸取DMP、DEP、DIBP、DBP和DEHP标准样品置100mL容量瓶中，用正己烷准确定容至刻度，配制成1μg/mL的混合标准溶液。混合标准储备液-20℃储藏备用。
基质标准工作液配制：取上述混合标准储备液，用空白样品提取液逐级稀释，配制成浓度为0μg/mL、0.001μg/mL、0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.02μg/mL、 0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL的基质标准工作液，用于做标准工作曲线，现用现配。
表1 5种邻苯二甲酸酯化合物信息
1.2气相色谱-质谱联用仪检测参数
仪器为安捷伦GC-MS(Agilent 6890A GC联MSD6975)。色谱柱是HP-5MS 石英毛细管柱(30.0m×250μm×0.25μm)，不分流进样，恒定流量，流量为1.0 mL/min，溶剂延迟5min，进样口温度280℃，升温程序如下：初始温度80℃，保持1min，以6℃/min升至140℃，保持2min，再以2℃/min升至150℃，保持 2min，再以5℃/min升至180℃，保持1min，以6℃/min升至250℃，保持1min，再以3℃/min升至270℃，在270℃保持1min。EI离子源，电离能70eV，使用选择离子扫描，载气为99.999％的高纯氦气，离子源温度230℃。
1.3标准曲线的制作
将标准工作液注入气相色谱-质谱仪(GC-MS)中，测定相应的邻苯二甲酸酯的色谱峰面积，以标准工作液的质量浓度为横坐标，各邻苯二甲酸酯化合物的定量离子的峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。
1.4 5种邻苯二甲酸酯类化合物的质谱信息
选择离子扫描模式(SIM)用于目标物的特征碎片离子进行扫描，确定5种 PAEs化合物的出峰时间，目标分析物的保留时间、定性离子和定量离子如表2 所示，5种PAEs化合物的总离子流色谱图如图1所示。
表2邻苯二甲酸酯类化合物定量和定性的选择离子表
1.5 5种邻苯二甲酸酯类化合物标准物质的检出限、定量限、线性关系和精密度检测结果
分别以10倍信噪比和3倍信噪比计算定量限(LOQ)和检出限(LOD)，5 种PAEs化合物的定量限为2-3μg/kg，检出限为0.6-0.9μg/kg，灵敏度满足检测需要。选取配制好的标准工作液低、中、高3个梯度浓度，进行GC-MS检测，每个梯度平行测定6次，以测得的峰面积计算出相对偏差(RSD)，获得5种PAEs 的精密度(n＝6)。结果表明，5种PAEs的线性范围在0.001-1μg/mL之间(除DBP是0.001-0.5μg/mL)，R2>0.9910，线性良好，RSD为0.6％-5.2％，均小于6％，仪器精密度良好(表3)。
表3 5种邻苯二甲酸酯类化合物的回归方程、相关系数、检出限和定量限
实施例2基于响应面法优化茶叶中PAEs提取方法
2.1茶叶样品PAEs提取方法
取10g茶叶样品经粉碎后置于硬质全玻璃器皿中待用。准确称取2.0g粉碎混匀的茶叶样品(精确至0.0001g)于40mL玻璃离心管中，加入2g氯化钠，加入20mL正己烷，用漩涡振荡器使溶液充分均匀，40℃下超声提取3h，之后 40℃下静置提取12h，用冷冻离心机10℃下3000r/min离心2min，收集上清液。向下层残渣中再加入20mL正己烷，振荡混匀，10℃下3000r/min离心2min，收集上清液，合并两次上清液。将上清液在40℃水浴下减压蒸馏至近干，加入 8mL乙腈：甲苯(3:1)溶液溶解，待SPE柱净化(固相萃取柱型号为CARB/NH2，1000mg/6mL，购自迪马科技公司)。向柱中加入10mL乙腈：甲苯(3:1)溶液活化，弃去流出液；将待净化液加入柱中，收集流出液；向柱中加入22mL乙腈:甲苯(3:1)溶液，收集流出液，合并两次收集的流出液；将收集的流出液在 40℃水浴下减压蒸馏至干，冷却，加入1mL正己烷，混匀，供GC-MS分析。 GC-MS参数设定参照实施例1。
2.2茶叶样品PAEs提取条件响应面优化设计
基于上述提取方法，设置不同料液比(1:10，1:15，1:20，1:25，1:30)、超声后不同萃取时间(3h，6h，9h，12h，18h，24h)和超声后不同萃取温度(20℃， 30℃，40℃，50℃，60℃)三个因素，进行单因素试验，每个试验重复3次。在单因素试验基础上，以料液比(A)，超声后萃取温度(B)和超声后萃取时间(C) 作为响应面试验自变量，茶叶中PAEs的提取量(R)为响应值，利用 Design-ExertV8.0.6进行Box-Behnken优化处理，通过方差分析和响应等高线图分析，确定茶叶中PAEs的最佳提取条件，依此最佳条件作响应预测。
2.3单因素试验结果分析
以超声后不同萃取温度为变量进行单因素试验，如图2所示，随着超声后萃取温度的升高，茶叶中PAEs提取量呈先上升后下降的趋势，在超声后萃取温度 40℃时，检测出的PAEs提取量达到最高。
以超声后不同萃取时间为变量进行单因素试验，如图3所示，随着超声后萃取时间的增加，茶叶中PAEs提取量呈先上升后下降的趋势，在超声后萃取时间 12h时，检测出的PAEs提取量达到最高。
以不同料液比为变量进行单因素试验，如图4所示，在料液比为1:20的条件下，检测出的PAEs提取量达到最高。
2.4响应面优化试验结果分析
2.4.1响应面试验设计与结果
在单因素实验基础上，根据Box-Behnken的中心组合设计原理选择料液比 (A)、超声后萃取温度(B)、超声后萃取时间(C)为自变量，PAEs提取量为响应值，采用3因素3水平响应面分析，重点考察各因素及因素之间的交互作用对茶叶PAEs提取量的影响，响应面试验的设计方案与结果见表4。
表4响应面试验设计与试验结果
2.4.2模型拟合和显著性分析
利用Design-ExertV8.0.6软件对试验模型进行多元回归拟合，茶叶中PAEs 提取量与料液比(A)、超声后萃取温度(B)、超声后萃取时间(C)的多元回归方程为：
Y＝567.92-17.28A+28.44B+107.34C-10.93AB-8.77AC+4.24BC-158.79A2-137.54B2-140.13*C2。
表5回归系数显著性分析和模型的方差分析
回归系数显著性分析和模型的方差分析，如表5所示。该模型P<0.05，失拟项P>0.05，可知该模型回归显著，失拟项不显著，表明无失拟因素存在，可用该回归方程对实验结果进行分析。模型的校正决定系数R2 adj＝0.9202，说明该模型只有7.98％的变异，能由该模型解释。相关系数R2＝0.9651，预测 R2＝0.7364，R2与R2 adj之差<0.1，R2 adj与预测R2之差<0.2，信噪比 AdeqPrecision＝11.872>4，以上参数充分说明模型显著，拟合程度较高，实验预测误差小，数据重复性好，能较好地反应3个因素对PAEs提取的影响。因素C、A2、B2和C2均表现为极显著(P<0.05)。3个因素对提取PAEs含量影响的大小顺序为：C>B>A。
2.4.3各因素交互作用的响应面分析
响应面图是茶叶中PAEs提取量与各影响因素所形成的三维空间曲面图，能够反映出最优取值点及各参数之间的相互作用，曲线越陡，则该因素对茶叶中 PAEs提取量影响越大。料液比、超声后萃取温度、超声后萃取时间的交互作用对茶叶PAEs提取量影响的3D响应图(图5-图7)，可以看出超声后萃取时间对 PAEs的提取影响最大，超声后萃取温度影响次之，料液比影响最小。料液比与超声后萃取温度的交互影响较大，其次是料液比和超声后萃取时间的交互作用，超声后萃取温度与超声后萃取时间的交互影响最不明显。
依据响应面分析结果，计算并预测二次回归方程，则茶叶中PAEs提取最优条件是料液比1:20、超声后萃取温度40℃、超声后萃取时间12h。在此条件下理论预测含量为585.85μg/kg。根据最佳提取条件进行3组平行实验，PAEs 含量均值为574.50μg/kg、相对误差为1.98％，说明回归模型预测比较可靠且稳定。
实施例3方法验证
3.1加标回收试验
根据5种PAEs化合物的线性范围和样品前处理稀释倍数，在茶叶空白样品中，添加低、中、高分别为100、500和1000μg/L的混合标准溶液，每个梯度检测3组平行样品，结果见表5。5种PAEs化合物的回收率为 80.70％-98.68％，5种PAEs化合物的相对标准偏差(RSD)为2.7％～8.1％，均小于10％，方法精密度良好。
3.2基质效应考察
将配制好的混合标准溶液，用正己烷和茶空白基质溶液(实施例2的方法进行前处理)分别稀释成5个梯度浓度的标准工作液，进行GC-MS检测，得到5 种PAEs化合物在正己烷和茶叶空白基质溶液中的标准曲线斜率。采用相对响应值法比较，基质效应Matrix Effect(％)＝B/A×100，其中A为溶剂标曲的斜率，B 为基质标曲的斜率。计算出5种PAEs化合物在茶叶基质中的基质效应(表6)。结果表明，5种PAEs化合物的基质效应为0.4-1.1，基质对化合物的干扰较小。
表6 5种PAEs在茶叶中的加标回收率
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种基于响应面法优化的茶叶中主要PAEs提取和检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1)建立茶叶样品PAEs提取流程
所述PAEs提取流程为：以一定料液比向待测茶样中加入正己烷，进行超声萃取，萃取液在一定温度下静置一定时间后利用减压蒸馏进行浓缩，再经固相萃取净化洗脱；所述固相萃取采用的固相萃取柱为石墨化碳黑和氨基混合填料固相萃取玻璃柱；
2)茶叶样品PAEs提取条件响应面优化
设置不同料液比、超声后不同萃取静置时间和超声后不同萃取静置温度三个因素，进行单因素试验；在单因素试验基础上，将料液比(A)，超声后萃取静置温度(B)和超声后萃取静置时间(C)作为响应面试验自变量，茶叶中PAEs的提取量(R)为响应值，进行Box-Behnken优化处理，通过方差分析和响应等高线图分析，确定茶叶中PAEs的最佳提取条件；
3)茶叶中主要PAEs提取和检测
对于待测茶样，以步骤2)获得的茶叶中PAEs的最佳提取条件，采用步骤1)的提取流程进行PAEs提取，并通过气相色谱-质谱联用仪进行PAEs检测，再根据各邻苯二甲酸酯化合物的标准工作曲线计算得到检测含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，通过方差分析和响应等高线图分析，确定茶叶中PAEs的最佳提取条件，具体为：
响应面图是茶叶中PAEs提取量与各影响因素所形成的三维空间曲面图，曲线越陡，则该影响因素对茶叶中PAEs提取量影响越大；利用Design-ExertV8.0.6软件进行多元回归拟合，建立茶叶中PAEs提取量与料液比(A)、超声后萃取静置温度(B)、超声后萃取静置时间(C)的多元回归方程；
根据二次回归方程，得到茶叶中PAEs的最佳提取条件。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所得茶叶中PAEs的最佳提取条件中，茶样与正己烷的料液比是1:20。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所得茶叶中PAEs的最佳提取条件中，超声后需40℃下静置12h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相萃取柱采用体积比为3:1的乙腈和甲苯混合液进行活化，采用体积比为3:1的乙腈和甲苯混合液进行洗脱。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中，通过固相萃取净化得到的洗脱液经减压蒸馏至干，冷却，加入正己烷，再进行气相色谱-质谱联用仪检测。
7.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于气相色谱条件为：色谱柱是HP-5MS石英毛细管柱，尺寸为30.0m×250μm×0.25μm；进样口温度为280℃；不分流进样；进样量为1μL；载气为高纯氦气，恒定流量，流速为1.0mL/min；升温程序如下：初始温度80℃，保持1min，以6℃/min升至140℃，保持2min，再以2℃/min升至150℃，保持2min，再以5℃/min升至180℃，保持1min，以6℃/min升至250℃，保持1min，再以3℃/min升至270℃，在270℃保持1min。
8.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于质谱条件为：电离方式为电子轰击电离源(EI)；电离能量为70eV；传输线温度为280℃；离子源温度为230℃；溶剂延迟5min；检测方式为选择离子扫描(SIM)。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)所述的超声为在40℃下超声3h，之后再进行静置。
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