CN114410791B - 基于NanoString平台用于检测肺癌基因融合的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于NanoString平台用于检测肺癌基因融合的检测方法，该方法包括：1、基因融合信息收集和管家基因确定；2、探针设计；3、建立阳性阈值计算模型和阳性结果判定；它收集了目前肺癌靶向治疗相关的大部分融合类型，并确定了每个基因融合断点处的上下游序列，以及基于element方法设计探针。与其他基于NanoString平台检测的肺癌相关融合更加全面，尤其是在MET和NTRK1/2/3这四个基因的融合方面；通过检测ROS1基因5’和3’端是否不平衡的方式检测是否发生融合一直是一个难题，检测灵敏度很低且阈值很难判定，我们重新优化了算法并确定了新的阳性判断标准。
Description
技术领域
本发明涉及肺癌检测领域，尤其是涉及一种基于NanoString平台用于检测肺癌基因融合的方法，用于检测肺癌相关基因融合以此来指导靶向治疗。
背景技术
肺癌的靶向治疗是目前肺癌治疗中一种重要的形式。靶向治疗是针对已经明确的致癌驱动基因的治疗方式。致癌驱动基因的变异类型主要有突变、融合和扩增。肺癌中融合驱动的变异比例达到6％-10％，相关的靶向药物已经获批上市，肺癌患者因此可以从中获益。
目前，多种分子检测技术应用于肺癌基因融合检测中，主要有免疫组化(IHC)、荧光原位杂交技术(FISH)、聚合酶链反应(PCR)和二代测序(NGS)，但各个方法在应用中都存在一定的局限性。IHC和FISH一次性只能检测一种基因的融合类型，需要多次检测不同基因的融合状态，不能满足临床常见穿刺活检小样本的检测需求。另外，有些IHC结果易受不同病理亚型的干扰或检测结果不能作为最终的判定结果。目前FISH大多数只能检测基因的断裂，无法分辨伴侣基因。另外，FISH人工判断的主观性较大，且经常出现不典型信号不易判断。PCR检测的融合类型受引物的限制，种类较少。此外，PCR容易因PCR的交叉污染而出现假阳性。NGS检测往往对样本质量要求较高，且检测周期长，判读结果复杂。
NanoString平台也可以用于检测肺癌相关基因融合，它具有对样本质量要求低，检测周期短，检测通量大等优点。但是目前国内外尚无相应的检测试剂盒，文献报道可检测的肺癌融合探针类型一般只包含ALK、RET、ROS1少数基因。已获批靶向用药的MET和NTRK等基因尚未被纳入检测范围。NanoString可以通过检测基因5’和3’端表达是否不平衡来判断融合的发生以此来检测未知融合类型，但目前公开的数据显示由于ROS1基因本底表达值很高，发生融合后的表达与本底表达差异很小，这导致该方法在检测ROS1未知融合上的灵敏度较低。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的不足，而提供一种基于NanoString平台用于检测肺癌基因融合的检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种基于NanoString平台用于检测肺癌基因融合的检测方法，所述方法的具体步骤如下：
1、基因融合信息收集和管家基因确定
以NCCN非小细胞肺癌诊疗指南(2020.v2)推荐检测的融合为基本指导，确定收集ALK、RET、MET、ROS1、NTRK1/2/3的融合信息；在COSMIC数据库中通过检索这七个基因在肺癌中的融合，再收集它们在5’端和3’端的具体断点信息，最后根据每个基因的转录本信息确定基因融合断点处的上下游序列，确定ALK、RET、ROS1的常见断点处，并获取上游和下游序列；选择在肺癌中具有不同表达量的四个管家基因GAPDH、OAZ1、POLR2A、GUSB用作质控和标准化。
2、探针设计
依据每个融合亚型断点处的上下游序列分别设计探针A、探针B和保护探针，并在ALK、RET、ROS1常见断点处的上游和下游分别设计四段探针(5p-1、5p-2、5p-3、5p-4和3p-1、3p-2、3p-3、3p-4)，包括探针A和探针B，在四个管家基因GAPDH、OAZ1、POLR2A、GUSB的保守区设计探针，包括探针A和探针B。
3、建立阳性阈值计算模型和阳性结果判定
1)收集经RNA-based NGS验证为ALK、RET、ROS、MET、NTRK1/2/3融合阳性和阴性的肺腺癌患者样本，进行NanoSring实验。具体操作步骤如下：
a)利用Qiagen RNA提取试剂盒提取总RNA，并利用Nanodrop 2000测定样本浓度和Agilent 2100生物分析仪测定DV200；
b)样本的总投入量限定在30-150ng，DV200≥30％，将样本、探针(捕获探针、报告探针和保护探针)、杂交缓冲液以及TagSet混匀杂交并将杂交混合物置于67℃的PCR仪器上杂交16h-24h；杂交充分以后，用RNase-free H2O稀释到30～35ul，将稀释后的杂交物用移液器转移到NanoString专用的卡夹中，按照仪器操作提示将卡夹置于nCounter SPRINT中；
c)将样本信息添加至nCounter SPRINT TM Profiler Control Center***，点击“Start”即可开始运行；
d)***运行结束后，将生成的RCC文件导出；
2)将RCC文件导入nSolver(v4.0)软件中，首先利用四个管家基因(GAPDH，OAZ1，POLR2A，GUSB)和六个阳性质控品的counts数来判断质控是否合格；再利用四个管家基因(GAPDH，OAZ1，POLR2A，GUSB)将counts数进行标准化处理，将标准化之后的信息导出到excel表格中；
3)建立阳性阈值计算模型
a)质控标准：样本中GAPDH基因的原始数据counts数＞600。
b)ALK和RET的5’和3’端不平衡阳性阈值计算：利用标准化后的数据先计算每个样本ALK和RET基因3’端的四个探针(3p-1、3p-2、3p-3、3p-4)的几何平均数，定义为E3，再计算每个样本5’端的四个探针(5p-1、5p-2、5p-3、5p-4)的中位数，定义为A5；ALK和RET基因的背景值定义为B5(具体方法见文献：J Mol Diagn 2014 Mar；16(2)：229-43.A single-tubemultiplexed assay for detecting ALK，ROS1，and RET fusions in lung cancer)；取每个样本中E3/A5(B5)的最小值，以RNA-based NGS结果为标准分为阳性组和阴性组，利用ROC曲线计算阳性阈值。
c)ROS1基因5’和3’端不平衡计算：利用标准化后的数据我们先计算每个样本ROS1基因3’端的四个探针(3p-1、3p-2、3p-3、3p-4)的几何平均数，定义为E3，若E3＞700，可以作为ROS阳性的初步筛选条件，若E3＜700，即可排除阳性结果；计算E3＞700样本中ROS1基因5’端的四个探针(5p-1、5p-2、5p-3、5p-4)的中位数，定义为A5；ROS1基因的背景值定义为B5(具体计算方法见文献：J Mol Diagn 2014 Mar；16(2)：229-43.A single-tubemultiplexed assay for detecting ALK，ROS1，and RET fusions in lung cancer)；取每个样本中E3/A5(B5)的最大值，以RNA-based NGS结果为标准分为阳性组和阴性组，利用ROC曲线计算阳性阈值。
d)MET野生型探针的质控：利用标准化后的数据求得一个批次中阴性质控品counts数的mean±2SD，若MET野生型探针(MET-MET_E13：E14和MET-MET_E14：E15)的counts数大于mean±2SD，则认为质控合格，可以正常判断MET-MET_E13：E15。
e)融合探针阳性阈值计算：将标准化后的counts数除以每批次样本(12个)中各自融合探针counts数的中位数，得到的数值用来评估融合探针是否为阳性。求得每个样本中该数值的最大值作为ROC曲线的值，以RNA-based NGS结果为标准分为阳性组和阴性组，并利用ROC曲线计算阳性阈值。
f)阳性结果判定：若ALK、RET和ROS1基因检测到5’和3’端不平衡，即可判定为阳性，其中若同时检测到ALK、RET和ROS1的融合探针阳性，即可判定为某种融合阳性，若未检测到ALK、RET和ROS1的融合探针阳性，可判定为某种基因的未知融合类型阳性。若仅检测到ROS1融合探针阳性但未检测到ROS1基因的5’和3’端不平衡，亦可判定为ROS1某种融合阳性。若ALK和RET基因未检测到5’和3’端不平衡，但检测到ALK和RET的融合探针阳性，认为可能检测到的融合为假阳性，判定为阴性结果。若MET、NTRK1/2/3检测到融合探针阳性即可判定为阳性。
本发明的有益效果在于：1、收集了目前肺癌靶向治疗相关的大部分融合类型，并确定了每个基因融合断点处的上下游序列，以及基于element方法自行设计探针。与其他基于NanoString平台检测的肺癌相关融合更加全面，尤其是在MET和NTRK1/2/3这四个基因的融合方面。
2、通过检测ROS1基因5’和3’端是否不平衡的方式检测是否发生融合一直是一个难题，检测灵敏度很低且阈值很难判定，我们重新优化了算法并确定了新的阳性判断标准。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的基于NanoString平台用于检测肺癌基因融合的探针检测方法，所述方法的具体步骤如下：
1、基因融合信息收集和管家基因确定
以NCCN非小细胞肺癌诊疗指南(2020.v2)推荐检测的融合为基本指导，确定收集ALK、RET、MET、ROS1、NTRK1/2/3的融合信息；在COSMIC数据库中通过检索这七个基因的融合，再收集它们在5’端和3’端的具体断点信息，最后根据每个基因的转录本信息确定基因融合断点处的上下游序列，确定ALK、RET、ROS1的常见断点处，并获取上游和下游序列；选择GAPDH、OAZ1、POLR2A、GUSB四个管家基因用作标准化。基因和融合列表如附表1；
2、探针设计
依据每个融合亚型断点处的上下游序列分别设计探针A、探针B和保护探针，并在ALK、RET、ROS1常见断点处的上游和下游分别设计四段探针(5p-1，5p-2，5p-3，5p-4，3p-1，3p-2，3p-3，3p-4)，包括探针A和探针B，在管家基因的保守区设计探针，包括探针A和探针B，探针信息如附表1；
3、建立阳性阈值计算模型和阳性结果判定
1)收集经RNA-based NGS验证为ALK、RET、ROS、MET、NTRK1/2/3融合阳性和阴性的肺腺癌患者样本，进行NanoSring实验。具体操作步骤如下：
a)利用Qiagen RNA提取试剂盒提取总RNA，并利用Nanodrop 2000测定样本浓度和Agilent 2100生物分析仪测定DV200；
b)样本的总投入量限定在30-150ng，DV200≥30％，将样本、探针(捕获探针、报告探针和保护探针)、杂交缓冲液以及TagSet混匀杂交并将杂交混合物置于67℃的PCR仪器上杂交16h-24h；杂交充分以后，用RNase-free H2O稀释到30～35ul，将稀释后的杂交物用移液器转移到NanoString专用的卡夹中，按照仪器操作提示将卡夹置于nCounter SPRINT中；
c)将样本信息添加至nCounter SPRINT TM Profiler Control Center***，点击“Start”即可开始运行；
d)***运行结束后，将生成的RCC文件导出；
2)将RCC文件导入nSolver(v4.0)软件中，首先利用四个管家基因(GAPDH，OAZ1，POLR2A，GUSB)和六个阳性质控品的counts数来判断质控是否合格；再利用四个管家基因(GAPDH，OAZ1，POLR2A，GUSB)将counts数进行标准化处理，将标准化之后的信息导出到excel表格中；
3)建立阳性阈值计算模型
a)质控标准：样本中GAPDH基因的原始数据counts数＞600。
b)ALK和RET的5’和3’端不平衡阳性阈值计算：利用标准化后的数据先计算每个样本ALK和RET基因3’端的四个探针(3p-1、3p-2、3p-3、3p-4)的几何平均数，定义为E3，再计算每个样本5’端的四个探针(5p-1、5p-2、5p-3、5p-4)的中位数，定义为A5；ALK和RET基因的背景值定义为B5(具体方法见文献：J Mol Diagn 2014 Mar；16(2)：229-43.A single-tubemultiplexed assay for detecting ALK，ROS1，and RET fusions in lung cancer)；取每个样本中E3/A5(B5)的最小值，以RNA-based NGS结果为标准分为阳性组和阴性组，利用ROC曲线计算的阳性阈值为：ALK＝3，在该阈值下检测ALK融合的灵敏度达94.1％，特异性达100％。RET＝5，在该阈值下检测ALK融合的灵敏度达92.8％，特异性达100％。
c)ROS1基因5’和3’端不平衡计算：利用标准化后的数据我们先计算每个样本ROS1基因3’端的四个探针(3p-1、3p-2、3p-3、3p-4)的几何平均数，定义为E3，若E3＞700，可以作为ROS阳性的初步筛选条件，若E3＜700，即可排除阳性结果；计算E3＞700样本中ROS1基因5’端的四个探针(5p-1、5p-2、5p-3、5p-4)的中位数，定义为A5；ROS1基因的背景值定义为B5(具体计算方法见文献：J Mol Diagn 2014 Mar；16(2)：229-43.A single-tubemultiplexed assay for detecting ALK，ROS1，and RET fusions in lung cancer)；取每个样本中E3/A5(B5)的最大值，以RNA-based NGS结果为标准分为阳性组和阴性组，利用ROC曲线计算阳性阈值＝1.852，在该阈值下检测ROS1融合的灵敏度达81.82％，特异性达100％。
d)MET野生型探针的质控：利用标准化后的数据求得一个批次中阴性质控品counts数的mean±2SD，若MET野生型探针(MET-MET_E13：E14和MET-MET_E14：E15)的counts数大于mean±2SD，则认为质控合格，可以正常判断MET-MET_E13：E15。
e)融合探针阳性阈值计算：将标准化后的counts数除以每批次样本(12个)中各自融合探针counts数的中位数，得到的数值用来评估融合探针是否阳性。求得每个样本中该数值的最大值作为ROC曲线的值，以RNA-based NGS结果为标准分为阳性组和阴性组，并利用ROC曲线计算的阳性阈值＝5。
f)阳性结果判定：若ALK、RET和ROS1基因检测到5’和3’端不平衡，即可判定为阳性，其中若同时检测到ALK、RET和ROS1的融合探针阳性，即可判定为某种融合阳性，若未检测到ALK、RET和ROS1的融合探针阳性，可判定为某种基因的未知融合类型阳性。若仅检测到ROS1融合探针阳性但未检测到ROS1基因的5’和3’端不平衡，亦可判定为ROS1某种融合阳性。若ALK和RET基因未检测到5’和3’端不平衡，但检测到ALK和RET的融合探针阳性，认为可能检测到的融合为假阳性，判定为阴性结果。若MET、NTRK1/2/3检测到融合探针阳性即可判定为阳性。
附表1
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种基于NanoString平台的探针在制备用于检测肺癌基因融合产品中的应用，其中具体步骤如下：
(1)基因融合信息收集和管家基因确定
以NCCN非小细胞肺癌诊疗指南2020.v2版推荐检测的融合为基本指导，确定收集ALK、RET、MET、ROS1和NTRK1/2/3的融合信息；在COSMIC数据库中通过检索这七个基因在肺癌中的融合，再收集它们在5’端和3’端的具体断点信息，最后根据每个基因的转录本信息确定基因融合断点处的上下游序列，确定ALK、RET和ROS1的常见断点处，并获取上游和下游序列；选择在肺癌中具有不同表达量的四个管家基因GAPDH、OAZ1、POLR2A和GUSB用作质控和标准化；
(2)探针设计
依据每个融合亚型断点处的上下游序列分别设计探针A、探针B和保护探针，并在ALK、RET、ROS1常见断点处的上游和下游分别设计四段探针：5p-1、5p-2、5p-3、5p-4和3p-1、3p-2、3p-3、3p-4，包括探针A和探针B，在四个管家基因GAPDH、OAZ1、POLR2A和GUSB的保守区设计探针，包括探针A和探针B；
(3)建立阳性阈值计算模型和阳性结果判定，其具体步骤如下：1)收集经RNA-basedNGS验证为ALK、RET、ROS1、MET和NTRK1/2/3融合阳性和阴性的肺腺癌患者样本，进行NanoString实验，具体操作步骤如下：
a)利用Qiagen RNA提取试剂盒提取总RNA，并利用Nanodrop 2000测定样本浓度和Agilent 2100生物分析仪测定DV200；
b)样本的总投入量限定在30-150ng，DV200≥30％，将样本、探针(包括捕获探针、报告探针和保护探针)、杂交缓冲液以及TagSet混匀杂交并将杂交混合物置于67℃的PCR仪器上杂交16h-24h；杂交充分以后，用RNase-free H2O稀释到30～35ul，将稀释后的杂交物用移液器转移到NanoString专用的卡夹中，按照仪器操作提示将卡夹置于nCounter SPRINT中；
c)将样本信息添加至nCounter SPRINT TM Profiler Control Center***，点击“Start”即可开始运行；
d)***运行结束后，将生成的RCC文件导出；
2)将RCC文件导入nSolver v4.0版软件中，首先利用四个管家基因GAPDH、OAZ1、POLR2A、GUSB和六个阳性质控品的counts数来判断质控是否合格；再利用四个管家基因GAPDH、OAZ1、POLR2A和GUSB将counts数进行标准化处理，将标准化之后的信息导出到excel表格中；
3)建立阳性阈值计算模型
a)质控标准：样本中GAPDH基因的原始数据counts数＞600；
b)ALK和RET的5’和3’端不平衡阳性阈值计算：利用标准化后的数据先计算每个样本ALK和RET基因3’端的四个探针3p-1、3p-2、3p-3和3p-4的几何平均数，定义为E3，再计算每个样本5’端的四个探针：5p-1、5p-2、5p-3和5p-4的中位数，定义为A5；ALK和RET基因的背景值定义为B5；取每个样本中E3/A5(B5)的最小值，以RNA-based NGS结果为标准分为阳性组和阴性组，利用ROC曲线计算ALK融合阳性阈值为3，RET融合阳性阈值为5；
c)ROS1基因5’和3’端不平衡计算：利用标准化后的数据我们先计算每个样本ROS1基因3’端的四个探针3p-1、3p-2、3p-3和3p-4的几何平均数，定义为E3，若E3＞700，可以作为ROS1阳性的初步筛选条件，若E3＜700，即可排除阳性结果；计算E3＞700样本中ROS1基因5’端的四个探针5p-1、5p-2、5p-3和5p-4的中位数，定义为A5；ROS1基因的背景值定义为B5；取每个样本中E3/A5(B5)的最大值，以RNA-based NGS结果为标准分为阳性组和阴性组，利用ROC曲线计算ROS1融合阳性阈值为1.852；
d)MET野生型探针的质控：利用标准化后的数据求得一个批次中阴性质控品counts数的mean±2SD，若MET野生型探针MET-MET_E13：E14和MET-MET_E14：E15的counts数大于mean±2SD，则认为质控合格，可以正常判断MET-MET_E13：E15；
e)融合探针阳性阈值计算：将标准化后的counts数除以每批次样本中各自融合探针counts数的中位数，得到的数值用来评估融合探针是否阳性；求得每个样本中该数值的最大值作为ROC曲线的值，以RNA-based NGS结果为标准分为阳性组和阴性组，并利用ROC曲线计算阳性阈值为5；
f)阳性结果判定：若ALK、RET和ROS1基因检测到5’和3’端不平衡，即可判定为阳性，其中若同时检测到ALK、RET和ROS1的融合探针阳性，即可判定为某种融合阳性，若未检测到ALK、RET和ROS1的融合探针阳性，可判定为某种基因的未知融合类型阳性；若仅检测到ROS1融合探针阳性但未检测到ROS1基因的5’和3’端不平衡，亦可判定为ROS1某种融合阳性；若ALK和RET基因未检测到5’和3’端不平衡，但检测到ALK和RET的融合探针阳性，认为可能检测到的融合为假阳性，判定为阴性结果；若MET、NTRK1/2/3检测到融合探针阳性即可判定为阳性；
其中，探针序列如下：
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| CN114410791A CN114410791A (zh) | 2022-04-29 |
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2022
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