CN114410766A - 一种血栓与出凝血性疾病检测panel及其应用 - Google Patents
一种血栓与出凝血性疾病检测panel及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种血栓与出凝血性疾病检测panel及其应用。本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel,包括检测或杂交捕获血栓与出凝血性疾病相关的86个基因的特异性杂交探针。本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel,可用于检测血栓与出凝血相关的多种基因结构,有助于解释血栓与出凝血性疾病分子机制,为开展出凝血疾病功能学、遗传性家系验证、发病分子机制等研究提供较全面的框架和基础。本申请panel涵盖的基因信息全面,能直接对多种血栓与出凝血性疾病进行联合检测,应用于出凝血疾病的伴随诊断,所得精准靶向测序结果能够准确评估血栓与出凝血性疾病的遗传风险、复发性风险、患病风险等。
Description
技术领域
本申请涉及基因检测检测领域,特别是涉及一种血栓与出凝血性疾病检测 panel及其应用。
背景技术
高通量测序技术(Next Generation Sequence,NGS),也称为二代测序。可一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定,其核心思想是边合成边测序,通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。具有高输出量以及高解析度等优势,能够迅速读取序列,在提供丰富的遗传学信息的同时,还能够起到缩短测序时间的作用。NGS技术可提供满足评估目标靶向基因所需的扩展性、速度和分辨率,可以同时对许多样本中的多个基因进行评估,可运行多个独立的分析,从而节省时间并降低成本。另外,与范围更广的方法相比,如相比于全基因组测序,Panel靶向基因测序生成的数据量更少,更易管理,检测成本低,因而分析起来更加轻松。
基因测序主要被应用在科学研究、临床研究、医院诊断、生物医药几大场景。其中科学研究仍旧是基因测序主流应用场景,市场占比达到55%以上;而临床研究、医院诊断、生物医药三大应用领域占比分别为17%、14%、10%,三者总占比达到41%。NGS作为第二代基因测序核心技术自问世以来主要在易感基因检测、伴随诊断、个性化用药等领域得到应用,是伴随诊断行业主要发展方向。
全球每年脑血栓、脑梗塞、心肌梗塞、冠心病、动脉粥样化等心脑血管疾病死亡人数达1200万,接近世界总死亡人数的四分之一,心脑血管疾病已经成了超越恶性肿瘤的“头号杀手”。而心脑血管疾病的主要发病机制就是血栓。
出凝血指标虽然是人体健康的一个直观指标,但是,若疾病根源并不在凝血***,比如由白血病、创伤、感染等因素引发的凝血功能问题,则不能作为治疗中的唯一靶点。
研究发现,基因变异在血栓形成中起重要的决定作用,苏州大学附属第一医院2017年至2020年对912例出凝血疾病患者基因检测结果统计显示:395例患者确诊遗传缺陷,确诊率43.3%,发现新致病基因位点51例,共计66个位点。 NGS对血液病的诊断、分型、危险度分层、治疗靶点筛选、疗效判断和血液病微小病灶残留(MRD)监测有重要意义。
余自强等收集了22例血管性血友病(VWD)患者,并对患者的外周血标本以及临床和实验室检查资料等,均进行了NGS检测,其中11例患者同时采用 Sanger法对VWF基因进行了测序。结果显示22例患者中,1型VWD 4例,2A 型VWD 1例,2B型VWD 2例,2M型VWD 3例,3型VWD 12例。综合分析 NGS检测和Sanger法的测序数据,从22例VWD患者中共发现25种VWF基因突变,其中8种为未见报道的新的基因突变。1型和2型VWD患者以杂合突变为主,3型患者主要表现为复合杂合突变。并且,NGS检测在10例VWD患者中发现了14种VWF基因突变,检出率为91%。
研究证明NGS提供了一个有效的用于分析单个大基因的实验室检测手段,其便捷性、准确性都有大幅提高,对于VWD基因诊断策略的改进具有重要意义。然而,目前尚未有比较全面覆盖的特别针对血栓与出凝血性疾病检测的专用 Panel。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的全面覆盖,且特别针对血栓与出凝血性疾病检测的panel及其应用。
本申请采用了以下技术方案:
本申请的一方面公开了一种血栓与出凝血性疾病检测panel,该panel包括检测或杂交捕获血栓与出凝血性疾病相关基因的特异性杂交探针;其中,血栓与出凝血性疾病相关基因包括86个基因。
需要说明的是,本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel,涵盖抗凝***、止血***、纤溶***、血小板相关基因、个性化用药基因等相关基因,能够全面覆盖现有的血栓与出凝血性疾病。本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel,通过二代测序,能够准确、全面、有效的检测出凝血疾病相关基因及其突变情况,进而实现出血和血栓性疾病的诊断和风险评估,是血栓与出凝血性疾病检测的首创,填补了血栓与出凝血性疾病二代测序检测领域的空白。
还需要说明的是,本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel,可用于检测血栓与出凝血相关的多种基因结构,有助于解释血栓与出凝血性疾病分子机制。并且,本申请的panel包括的基因信息全面,能够直接对多种血栓与出凝血性疾病进行联合检测,应用于出凝血疾病的伴随诊断,所得精准靶向测序结果能够准确评估血栓与出凝血性疾病的遗传风险、复发性风险、患病风险等。
优选的,本申请的86个基因包括A2M、ABCB1、ABCG2、ABCG5、ABCG8、 ABO、ACE、ACTN1、ADAMTS13、ADGRB3、ADTRP、ANKRD26、ANO6、ANXA3、AP3B1、AP3D1、APOH、APOM、ARPC1B、ATOH1、B3GAT2、BAZ1B、 BDKRB2、BLOC1S3、BLOC1S6、BLZF1、C3、C4BPA、C4BPB、CADM1、 CALR、CBS、CES1、CES1、CETP、CFB、CFD、CFH、CFP、CHST14、COL1A1、 COL28A1、COL3A1、COL5A1、COL5A2、CPB2、CYCS、CYP2C19、CYP2C9、 CYP3A4、CYP4F2、CYP4V2、DIAPH1、DTNBP1、EDEM2、EDN1、ETV6、 F10、F11、F12、F13A1、F13B、F2、F3、F5、F7、F8、F9、FERMT3、FGA、 FGB、FGG、FLI1、FLNA、FTO、FYB1、GATA1、GCKR、GFI1B、GGCX、 GNE、GP1BA、GP1BB、GP6、GP9和HABP2。
优选的,本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel,其特异性杂交探针覆盖血栓与出凝血性疾病相关基因的基因编码区、非编码区、启动子区、3’UTR区和5’URT区。
优选的,本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel,其特异性杂交探针覆盖血栓与出凝血性疾病相关基因的基因突变,这些基因突变包括SNV、CNV、Indel 和基因融合。
需要说明的是,本申请的特异性杂交探针可以根据需求,对86个基因进行全覆盖,即覆盖率100%;也可以根据使用情况,仅仅对86个基因中的已知突变进行100%覆盖。
优选的,本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel,其特异性杂交探针由 12000条探针组成。
需要说明的是,本申请的12000条探针是采用探针设计原则和软件,针对 86个基因设计的100%覆盖的探针,采用这12000条探针能够对86个基因进行全面、有效的捕获和检测。可以理解,本申请的12000条探针都是按照常规方案设计,具体序列也可以根据参数设置的不同而改变,只要能够对86个基因进行100%覆盖即可;因此,具体序列在此不作具体限定。
本申请的另一面公开了本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel在制备检测血栓与出凝血性疾病的试剂中的应用。
需要说明的是,本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel由86个基因的特异性杂交探针组成,因此可以作为检测血栓与出凝血性疾病的试剂。
本申请的再一面公开了一种检测血栓与出凝血性疾病的基因芯片、装置或试剂盒,其包括本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel。
需要说明的是,包括本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel的基因芯片,可以是固相芯片,也可以是液相芯片,具体的根据使用需求而定。包括本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel的装置,例如可以将本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel中的特异性杂交探针固定在一个反应装置中,利用该反应装置可以血栓与出凝血性疾病相关基因的杂交捕获或检测。包括本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel的试剂盒,可以是单纯的由86个基因的特异性杂交探针组成,或者固定这些特异性杂交探针的杂交捕获芯片等,在此不作具体限定。
本申请的有益效果在于:
本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel,包括检测或杂交捕获血栓与出凝血性疾病相关的86个基因的特异性杂交探针,可用于检测血栓与出凝血相关的多种基因结构,有助于解释血栓与出凝血性疾病分子机制,为开展出凝血疾病功能学、遗传性家系验证和发病分子机制研究提供较全面的框架和基础。本申请panel涵盖的基因信息全面,能直接对多种血栓与出凝血性疾病进行联合检测,应用于出凝血疾病的伴随诊断,所得精准靶向测序结果能够准确评估血栓与出凝血性疾病的遗传风险、复发性风险和患病风险。
具体实施方式
本申请在检索大量数据库、文献、疾病治疗专家共识等资料基础上进行特异性疾病相关基因探针设计,覆盖基因广;具体的,本申请设计实现86个疾病相关基因全覆盖,包括抗凝***、止血***、纤溶***、血小板相关基因、个性化用药基因等相关基因。本申请为了实现86个基因的100%全覆盖,针对86 个基因的基因编码区、非编码区、启动子区、3’UTR区和5’URT区总计10000 个位点,设计了12000条探针,可检测86个基因的SNV、CNV、Indel、基因融合等基于突变类型。
本申请的一种实现方式中,本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel可以捕获特定基因的特定区域,针对性测序,测序深度大,数据有效性高,信噪比高,检测灵敏度1‰,靶点区域1条reads即可检出基因变异类型;并且,冗余数据给生物信息学分析带来便利,数据准确性也相应提高。
本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel,是目前应用二代测序检测血栓与出凝血性疾病相关基因突变的首创;基于本申请panel的血栓与出凝血性疾病的诊断和风险评估也是首创。采用本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel进行血栓与出凝血性疾病检测,通过大量的积累测序数据有助于建设拥有自主知识产权的出凝血疾病相关基因变异数据库。此外,本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel还有助于加强个体化用药有助于提高药物疗效、降低不良反应,从而产生较好的社会价值与经济价值。
本申请中,检测panel是高通量基因检测和基因测序的专业术语,是指若干基因的特异性探针的组合,该组合可以设计多同一张捕获芯片上,以捕获目标 DNA并用于后续的基因检测或测序。基于检测panel可以实现多个位点、多个基因的同时检测。本申请的血栓与出凝血性疾病检测panel是指对86个基因的探针杂交捕获方案,相比于全基因组检测而言,本申请的panel可以只对少量目标区域进行捕获和检测。
下面通过具体实施例对本申请进行详细说明。以下实施例仅用于对本申请进行说明,不应理解为对本申请的限制。
实施例
本例首先制备了血栓与出凝血性疾病检测panel,并采用制备的检测panel 对95个血管性血友病的样本进行检测,验证本例血栓与出凝血性疾病检测panel 的检测效果。具体如下:
一、血栓与出凝血性疾病检测panel的制备
1.血栓与出凝血性疾病相关基因筛选
本例收集整理了现有的血栓与出凝血性疾病相关的数据库、文献和疾病治疗专家共识等资料;最终筛选获得86个基因检测靶标基因,用于构建本例的 panel。这86个基因包括A2M、ABCB1、ABCG2、ABCG5、ABCG8、ABO、 ACE、ACTN1、ADAMTS13、ADGRB3、ADTRP、ANKRD26、ANO6、ANXA5、 AP3B1、AP3D1、APOH、APOM、ARPC1B、ATOH1、B3GAT2、BAZ1B、BDKRB2、 BLOC1S3、BLOC1S6、BLZF1、C3、C4BPA、C4BPB、CADM1、CALR、CBS、 CES1、CES1、CETP、CFB、CFD、CFH、CFP、CHST14、COL1A1、COL28A1、 COL3A1、COL5A1、COL5A2、CPB2、CYCS、CYP2C19、CYP2C9、CYP3A4、CYP4F2、CYP4V2、DIAPH1、DTNBP1、EDEM2、EDN1、ETV6、F10、F11、 F12、F13A1、F13B、F2、F3、F5、F7、F8、F9、FERMT3、FGA、FGB、FGG、 FLI1、FLNA、FTO、FYB1、GATA1、GCKR、GFI1B、GGCX、GNE、GP1BA、 GP1BB、GP6、GP9和HABP2。
2.检测目标区域选择
以“1.血栓与出凝血性疾病相关基因筛选”获得的86个基因为基础,针对 86个基因的基因编码区、非编码区、启动子区、3’UTR区和5’URT区进行目标区域选择,具体的筛选标准是:(1)保留在千人基因组数据库中频率≤0.02的位点;(2)保留有文献报道的同义突变;(3)保留位点突变次数>5,突变频率>0.3的位点。
本例最终从86个基因的基因编码区、非编码区、启动子区、3’UTR区和 5’URT区获得总计10000个位点。
3.检测panel探针设计
本例针对“2.检测目标区域选择”获得的10000个位点,采用探针设计软件,设计了12000条探针。探针长度120nt/条,总体覆盖上述86个基因编码区、非编码区、启动子区、3’UTR区和5’URT区域>99%,覆盖均一性>99%,覆盖深度为每个位点1×。
4.检测panel合成
合成所设计的12000条探针,并将其固定在玻片上,制备获得本例的血栓与出凝血性疾病检测panel。
二、血栓与出凝血性疾病检测panel的应用
采用本例制备的检测panel对95个血管性血友病的血液样本进行检测,具体如下:
1.基因组DNA提取
本例采用TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒对血液样本进行DNA提取。具体步骤如下:
(1)前处理
200μL全血DNA提取:吸取200μL血液到对应标记的1.5mL EP管里直接进行下一步蛋白酶K处理。
500μL全血DNA提取:吸取500μL血液到对应标记的1.5mL EP管里,加入500μL细胞裂解液CL,颠倒混匀,10,000rpm(~11,500×g)离心1min,吸去上清,留下细胞核沉淀(如果裂解不彻底,可重复裂解一次),向细胞核沉淀中加200μL缓冲液GS,振荡至彻底混匀,再进行下一步实验。
(2)蛋白酶k处理
按每例样本200μL缓冲液GB和20μL Proteinase K的量配制预混液,混匀,瞬时离心。
分别加入220μL上述预混液至(1)前处理的样品中。
56℃,1000rpm孵育10min至溶液应变清亮,如未清亮可适当延长孵育时间。
(3)过柱
室温放置2-5min,加入350μL缓冲液BD,充分颠倒混匀,瞬时离心。
将样本转移至吸附柱中,12,000rpm(~13,400×g)离心30s,弃流出液。
(4)洗涤和干燥
依次用500μL缓冲液GDB、600μL PWB、600μL PWB洗涤吸附柱,每次12,000rpm(~13,400×g)离心30s。
最后,12,000rpm(~13,400×g)空离2min干燥吸附柱。
将吸附柱转移至新的1.5mL离心管,室温开盖放置2min晾干吸附柱。
(5)洗脱
向吸附膜中间位置悬空滴加50μL洗脱缓冲液TB,室温放置2min,12,000 rpm(~13,400×g)离心2min。重复该步骤一次
将洗脱液转移至低吸附离心管中,储存在-20℃备用。
2.DNA文库制备
(1)基因组DNA片段化处理
本例采用Covaris EM80超声波破碎仪对提取的DNA样本进行片段化。在 130μL打断管内用TE稀释样本至6ng/μL,总体积55μL;打断时间50s。
打开超声打断仪,设置仪器参数并检查如下:
Peak Incident Power(W)50、Duty Factor 20%、Cycle per Burst 200、Treatment Time(s)50、Temperature(c)6。
打断结束后将打断产物混匀并短暂离心,将打断产物全部转移到离心管中冰上暂存备用或储存于-20℃冰箱。
(2)末端修复及加“A”
A.将XP磁珠从冰箱取出,从SureSelect(Pre PCR)试剂盒中取出以下试剂,并按要求做好准备。AgencourtAMPure XP Kit(简称:XP磁珠)室温放置;End Repair&A TailingBuffer冰上解冻后,冰上放置;Ligation Buffer冰上解冻后,冰上放置;End Repair&ATailing Enzyme Mix冰上放置;T4 DNA Ligase冰上放置;Adaptor Oligo Mix冰上解冻后,放置冰上。
B.取出打断好的待测样本,溶解后混匀离心,冰上放置。
C.打开PCR仪,确认已开启热盖。启动程序后立即暂停程序。
末端修复&加A程序:20℃15min、72℃15min,最后4℃待机。
D.取合适的离心管,配制接头连接混合液。
接头连接混合液(Lmix)总体积为25μL,包括:Ligation Buffer(瓶装)23μL 和T4DNA Ligase(蓝盖)2μL。
E.将接头连接混合液(Lmix)高速涡旋15s充分混匀,瞬时离心。室温下保持30-45分钟使用。
F.取合适的离心管,标记Emix,在冰盒上配制末端修复&3’端加A混合液。
末端修复&3’端加A混合液(Emix)总体积20μL,包括:End Repair&A TailingBuffer(瓶装)16μL,End Repair&A Tailing Enzyme Mix(橙盖)4μL。
G.将末端修复&3’端加A混合液(Emix)高速涡旋5-10s充分混匀,瞬时离心,放置冰上。
H.分别往样本管中加20μL末端修复&3’端加A混合液(Emix),盖上管盖,涡旋5-10s充分混匀,瞬时离心以去除气泡。
I.检查PCR程序,确认“末端修复&加A程序”的步骤1剩余时间为15min,模块温度为20℃。把样本管放置到PCR仪上,在开启PCR仪盖子情况下按“继续”启动程序,待20℃15min反应结束后盖上PCR仪盖子继续72℃反应15min。
J.当PCR程序温度降到4℃后,取下样本,放置冰上备用。
(3)连接接头
待末端修复&加A程序结束后,选择连接接头程序,核对程序如下,确认关闭热盖,反应体积为100μL。启动程序后立即暂停程序。
连接接头程序:20℃30min,4℃待机。
向上步骤70μL产物的PCR管中加入5μL的Adaptor Oligo Mix,盖上管盖,涡旋5-10s,并瞬时离心。
室温向每个样品管中加入25μL接头连接混合液,盖上管盖,涡旋5-10s,并瞬时离心。
检查PCR程序,确认连接接头程序剩余时间为30min,温度为20℃。将样本管放入PCR仪中,在开启PCR仪盖子情况下按“继续”运行程序。
待PCR仪温度降至4℃,取出反应管,瞬时离心,放置4℃备用或放置-20℃过夜。
(4)连接产物纯化
提前30min将XP磁珠从冰箱中取出平衡至室温,按每个样本450μL的量配制新鲜的80%乙醇(配制方法,NF水∶无水乙醇=2∶8),充分混匀。
充分振荡XP磁珠不少于1min使其完全混匀。
按样本数量取1.5mL离心管并标记Ln,吸取80μL已混匀的磁珠至标记好的1.5mL离心管内。
将连接产物(约100μL)全部转移至装有80μL磁珠的离心管中,涡旋5-10s 混匀,室温孵育5min。
将样本管瞬时离心,放置于磁力架上5min,直至溶液完全澄清。
用移液器小心吸弃上清,确保枪头不会碰到磁珠。
加入200μL新鲜的80%乙醇,盖上离心管盖,在磁力架上快速顺时针旋转离心管8次,每次45°,直至转回原来位置,快速吸弃所有上清。
重复上一步骤再用200μL 80%乙醇清洗一次,一共清洗两次。
从磁力架上取下1.5mL离心管,瞬时离心后放回磁力架上,使用10μL/20μL 移液器吸弃管内残余液体。
保持离心管在磁力架上,打开管盖,室温静置干燥磁珠不反光,没有裂痕。
从磁力架上取下样本管,加入35μL NF水,盖上管盖,涡旋至磁珠完全混匀,室温孵育5min。
瞬时离心,将1.5mL离心管放回磁力架,室温静置5min至溶液完全澄清。
按样本数量准备新的0.2mL PCR管,转移两次17.25μL上清至标记好的PCR 管中,确保不会吸取到磁珠。将该样本置于冰上或4℃暂存。
(5)文库扩增
提前取出试剂盒中的试剂,并按要求做好准备。
Hercμlase II Fusion DNA Polymerase冰上放置、5×Hercμlase II ReactionBuffer冰上放置、100mM dNTP Mix冰上放置、Forward Primer冰上放置、 SureSelect XTLow Input Index Primers冰上放置。
确认样本对应的PCR循环数程序,核对程序如下,确认开启热盖,反应体积为50μL。启动程序后立即暂停程序。
PCR反应程序:98℃2min,然后进入6个循环:98℃30s、60℃30s、72℃ 1min,循环结束后,72℃5min,最后4℃待机。
取出纯化好的连接产物,轻弹混匀后瞬时离心,冰上放置备用。
给每个样本分配不同的Index Primer。
取合适的离心管,标记Ymix,在冰上配制预文库扩增混合液。涡旋5-10s 充分混匀,并瞬时离心。
预文库扩增混合液(Ymix)总体积13.5μL,包括:5×Hercμlase II ReactionBuffer(透明盖)10μL、Forward Primer 2μL(棕盖)、100mM dNTP Mix(绿盖)0.5μL、Hercμlase II Fusion DNA Polymerase(红盖)1μL。
往样本管中加入13.5μL预文库扩增混合液。
再往样本管中加入2μL对应步骤D分配编号的Index Primer,盖紧管盖,涡旋5s混匀,瞬时离心收集液体并去除管内的气泡。
检查PCR程序,确认PCR反应程序第一步剩余时间为2min,温度98℃,循环数正确。将样本管放入PCR仪中,盖好PCR仪,继续运行程序。
待PCR仪反应结束,取出反应管,瞬时离心放置冰上备用。
(6)扩增产物纯化
A.提前将XP磁珠从冰箱中取出放置室温平衡30min,按每个样本450μL 的量配制新鲜的80%乙醇(配制方法,NF水∶无水乙醇=2∶8),充分混匀。
B.充分振荡XP磁珠不少于1min使其完全混匀。
C.按样本数量取1.5mL离心管,吸取50μl已混匀的XP磁珠至1.5mL离心管内。
D.将预文库扩增产物(约50μL)全部转移至装有50μL磁珠的离心管中,涡旋5-10s混匀,室温孵育5min。
E.将样本管瞬时离心,放置于磁力架上5min,直至溶液完全澄清。
F.用移液器小心吸弃上清,确保枪头不会碰到磁珠。
G.加入200μL新鲜的80%乙醇,盖上离心管盖,在磁力架上顺时针旋转离心管8次,每次45°,直至转回原来位置,吸弃所有上清,避免吸走磁珠。
H.重复上一步骤再用200μL 80%乙醇清洗一次,一共清洗两次。
I.从磁力架上取下1.5mL离心管,瞬时离心后放回磁力架上30s,用 10μL/20μL移液器吸弃管内残余液体。
J.保持离心管在磁力架上,打开管盖,室温静置干燥磁珠。(干燥标准:磁珠不反光,没有裂痕。过度干燥影响洗脱效率。)
K.从磁力架上取下样本管,加入15μL NF水,盖上管盖,涡旋至磁珠完全混匀,瞬时离心,室温孵育5min。
L.将1.5mL离心管放到磁力架上,室温静置2-3min至溶液完全澄清。
N.转移约15μL上清至新的PCR管中。混匀瞬时离心。将所有样本置于冰上或4℃暂存,以备下一步反应,如不进行下一步操作,则将产物放置于-20℃保存。
(7)panel杂交
提前取出试剂盒中的试剂,并按要求做准备。
SureSelect XT HS and XT Low Input Blocker Mix冰上放置,SureSelectRNase Block冰上放置,SureSelect Fast Hybridization Buffer室温放置。
打开PCR仪,选择杂交程序,核对程序如下,确认开启热盖,反应体积为 30μL。启动程序后立即暂停程序。
杂交程序:95℃5min,65℃10min,65℃1min,在该步骤暂停等待加入试剂,然后进入60个循环:65℃1min、37℃3s,循环结束后65℃待机。
取出纯化好的预文库,混匀后瞬时离心,冰上放置备用。
预文库上样总量为500~1000ng,体积12μl。根据预文库浓度计算预文库添加体积,并用NF水补足12μL。
计算公式如下:
混合量=该样本上机数据×1000/∑上机数据量
混合体积=混合量/浓度
上机数据量:panel 1000×深度数据量大约为0.7G
例如,样本1浓度为200ng/μL,混合量为667ng,混合体积为3.34μL;样本2浓度为250ng/μL,混合量为167ng,混合体积为0.67μL;样本3浓度为 100ng/μL,混合量为167ng,混合体积为1.67μL;NF水6.32μL。
向每管中加入5μL的SureSelect XT HS and XT Low Input Blocker Mix,盖好管盖,涡旋5s混匀,短时离心收集液体并去除管内气泡。
检查PCR仪程序,确认杂交程序步骤1剩余时间为5min,温度为95℃,将样本放置在PCR仪中启动程序。
取离心管,标记按下体系在室温配制杂交混合液(Zmix)并瞬时离心。
杂交混合液(Zmix)总体积13μL,包括:NF水1.5μL、SureSelect RNase Block 0.5μL、SureSelect Fast Hybridization Buffer 6μL、panel 5μL。
其中,NF水1.5μL和SureSelect RNase Block 0.5μL,即25%RNase Block。
当PCR程序运行到第3步骤:65℃1min时,按暂停键,保持样本在PCR 仪上,往每管样本加入13μL杂交混合液(Zmix),缓慢上下吸打8-10次,充分混合。
盖好管盖,短暂涡旋后短暂离心,收集反应液至管底并去除气泡,立即将样本管放回PCR仪继续运行PCR程序。
(8)捕获杂交文库
取出试剂盒中的以下试剂及T1磁珠,并按要求做好准备。
SureSelect Binding Buffer,颠倒混匀,室温放置;SureSelect Wash Buffer 1,颠倒混匀,室温放置;SureSelect Wash Buffer 2,颠倒混匀,室温放置; DynabeadsMyOneStreptavidin T1,放置室温平衡30min,室温备用。
涡旋T1磁珠1min以上,充分混匀后按每反应50μL的量将磁珠装入合适的离心管中,取出的T1磁珠按以下步骤进行洗涤。
每50μL T1磁珠加200μL SureSelect Binding Buffer,涡旋5-10s充分混匀,将离心管放置在磁力架上5min,待溶液澄清后吸弃上清。
重复上一步骤2次,共洗3次。
每反应(50μL磁珠原液)加入200μL SureSelect Binding Buffer,涡旋1min 以上充分重悬磁珠。
按样本数准备1.5mL或0.6mL离心管,标记Cn。并将上述重悬好的T1磁珠按200μL每管分装到Cn管中。
准备SureSelect Wash Buffer2,并预热:
用0.5mL离心管分装SureSelect Wash Buffer2,每个样本准备3管,每管 450μL。将分装好的SureSelect Wash Buffer2放置PCR仪上,设置PCR仪程序为70℃4h,热盖105℃,反应体积200μL。启动PCR仪程序预热SureSelect Wash Buffer 2,并将其保持在70℃PCR仪上使用。
杂交步骤完成,PCR仪到达65℃后,将样本取出瞬时离心。立即将全部样本转移到含200μL T1磁珠管中。震荡混匀,放置到恒温混匀仪上,室温 1400-1800rpm混合30min。
按样本数量准备0.2mL PCR管。
室温混合30min完成后,从恒温混匀仪上取下样本,瞬时离心。
将样本管放到磁力架上,待溶液澄清,去除上清。
将样本管从磁力架上取下,每管加入200μL SureSelect Wash Buffer1,吸打 15-20次或涡旋5-10s混匀,并转移到标记Cn的PCR管中,将PCR管放置在磁力架上1min,待溶液澄清,去除上清。
将样本管从磁力架上取下,按以下步骤洗涤磁珠:
a.样本管加入200μL预热的SureSelect Wash Buffer 2,盖上管盖涡旋8s混匀,瞬时离心。
b.将样本管放在PCR仪上70℃孵育10min。
c.将样本取出放置在磁力架上室温静置1min,待溶液澄清,吸弃上清。
d.将a到c步骤再重复5次,共6次。
J.将样本管短暂离心后置于磁力架上静置1min,用10μL移液器吸弃剩余液体。
K.向每个样本管加入25μL NF水,盖上管盖涡旋8s混匀,瞬时离心。把样本置于冰上待用。
(9)扩增杂交捕获的文库
取出SureSelect(Post PCR)试剂盒中的以下试剂,并按要求做好准备。
Hercμlase II Fusion DNA Polymerase,轻弹混匀,冰上放置;5×Hercμlase IIReaction Buffer冰上解冻后,涡旋混匀,短时离心,冰上放置;100mM dNTP Mix 冰上解冻后,涡旋混匀,短时离心,冰上放置;SureSelect Post-Capture Primer Mix 冰上解冻后,涡旋混匀,短时离心,冰上放置。
打开PCR仪,选择PCR对应循环数的程序,按下核对程序,设置反应体积:50μL,确认开启热盖。启动程序后立即暂停。
PCR反应程序:98℃2min,然后进入6个循环:98℃30s、60℃30s、72℃ 1min,循环结束后,72℃5min,最后4℃待机。
取合适的离心管,标记Pmix,在冰上配制捕获后PCR混合液。涡旋5-10s 充分混匀,并瞬时离心。
捕获后PCR混合液总体积25μL,包括:NF水12.5μL、5×Hercμlase II ReactionBuffer 10μL、100 mM dNTP Mix 0.5μL、SureSelect Post-Capture Primer Mix 1μL、Hercμlase II Fusion DNA Polymerase 1μL。
加25μL捕获后PCR混合液(Pmix)至约25μL样本产物Cn中,上下吸打 10-15次充分混匀样本。
检查PCR程序,确认PCR反应程序步骤1剩余时间为2min,温度98℃,循环数正确。将样本管放入PCR仪中,盖上PCR仪,继续运行PCR程序。
(10)测序文库纯化
磁珠纯化前的准备:
A.提前将XP磁珠从冰箱中取出放置室温平衡30min,按每个样本450μL的量配制新鲜的80%乙醇(配制方法,NF水∶无水乙醇=2∶8),充分混匀。
B.充分振荡XP磁珠不少于1min使其完全混匀。
C.按样本数量准备1.5mL离心管,标记PCn。往PCn离心管内加50μL已混匀的XP磁珠。
磁珠纯化:
A.待PCR仪PCR反应结束,温度降到4℃后,取出反应管,瞬时离心。
B.把样本管放在磁力架上静置2min,待溶液澄清后将全部上清转移到装有XP磁珠的PCn离心管中,涡旋5-10s混匀,室温孵育5min。
C.将样本管瞬时离心,放置于磁力架上5min,直至溶液完全澄清。
D.用移液器小心吸弃上清,确保枪头不会碰到磁珠。
E.加入200μL新鲜的80%乙醇,盖上离心管盖,在磁力架上顺时针旋转离心管8次,每次45°,直至转回原来位置,吸弃所有上清,避免吸走磁珠。
F.重复上一步骤再用200μL 80%乙醇清洗一次,一共清洗两次,确保在每个洗涤步骤吸弃所有上清。
G.从磁力架上取下1.5mL离心管,瞬时离心后放回磁力架上30s,用 10μL/20μL移液器吸弃管内残余液体。
H.保持离心管在磁力架上,打开管盖,室温静置干燥磁珠。干燥标准为,磁珠不反光,没有裂痕即可。过度干燥会影响洗脱效率。
I.从磁力架上取下样本管,加入20μL NF水,盖上管盖,涡旋至磁珠完全混匀,瞬时离心,室温孵育5min。
J.按样本数量准备新的1.5mL低吸附离心管,管盖标记Lib-n-月日,管身标记对应文库编号、浓度、建库人及检测批次。
K.将样本管放到磁力架上,室温静置2-3min至溶液完全澄清。
L.转移约20μL上清至标记Lib-n-月日的离心管中。将所有样本置于冰上或 4℃暂存,以备下一步使用,如不进行下一步操作,则将产物放置于-20℃保存。
3.测序
本例采用Illumina 550测序仪对捕获的目标区域进行测序。
4.测序结果分析
生物信息分析流程建立过程中,需要建立必要的质量控制标准,包括reads 质量,GC含量,比对率,reads比对质量,最低测序深度,最小突变率等。根据检测方法特点及预期用途对这些标准建立阈值。每一个质量控制标准可建立不同水平阈值,如高度可信(pass)、报警(warning)、不可信(fail)。在分析过程中,后续的分析是在满足质控标准的阈值的基础上进行才能保证分析结果的准确性。具体如下:Q30>85%;PF>95%;FL170-230k/mm2,覆盖度>95%,均一性>99%,中靶率>95%。
本例采用设计的血栓与出凝血性疾病检测panel,按照以上方法,对获取自血管性血友病的95个血液样本进行检测和分析;结果显示,本例的血栓与出凝血性疾病检测panel能直接对多种血栓与出凝血性疾病进行联合检测,检测结果与实际确诊情况相符。本例的血栓与出凝血性疾病检测panel,可用于检测血栓与出凝血相关的多种基因结构,有助于解释血栓与出凝血性疾病分子机制,为开展出凝血疾病功能学、遗传性家系验证、发病分子机制等研究提供较全面的框架和基础;并且,可以应用于出凝血疾病的伴随诊断,所得精准靶向测序结果能够准确评估血栓与出凝血性疾病的遗传风险、复发性风险、患病风险等。
以上内容是结合具体实施方式对本申请所作的详细说明,不能认定本申请的实现方式只局限于这些说明。对于本申请技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请基本发明构思的前提下,还可以进行若干简单推演或替换。
Claims (8)
1.一种血栓与出凝血性疾病检测panel,其特征在于:所述panel包括检测或杂交捕获血栓与出凝血性疾病相关基因的特异性杂交探针;所述血栓与出凝血性疾病相关基因包括86个基因。
2.根据权利要求1所述的血栓与出凝血性疾病检测panel,其特征在于:所述86个基因包括A2M、ABCB1、ABCG2、ABCG5、ABCG8、ABO、ACE、ACTN1、ADAMTS13、ADGRB3、ADTRP、ANKRD26、ANO6、ANXA5、AP3B1、AP3D1、APOH、APOM、ARPC1B、ATOH1、B3GAT2、BAZ1B、BDKRB2、BLOC1S3、BLOC1S6、BLZF1、C3、C4BPA、C4BPB、CADM1、CALR、CBS、CES1、CES1、CETP、CFB、CFD、CFH、CFP、CHST14、COL1A1、COL28A1、COL3A1、COL5Al、COL5A2、CPB2、CYCS、CYP2C19、CYP2C9、CYP3A4、CYP4F2、CYP4V2、DIAPH1、DTNBP1、EDEM2、EDN1、ETV6、F10、F11、F12、F13A1、F13B、F2、F3、F5、F7、F8、F9、FERMT3、FGA、FGB、FGG、FLI1、FLNA、FTO、FYB1、GATA1、GCKR、GFI1B、GGCX、GNE、GP1BA、GP1BB、GP6、GP9和HABP2。
3.根据权利要求1所述的血栓与出凝血性疾病检测panel,其特征在于:所述特异性杂交探针覆盖所述血栓与出凝血性疾病相关基因的基因编码区、非编码区、启动子区、3’UTR区和5’URT区。
4.根据权利要求3所述的血栓与出凝血性疾病检测panel,其特征在于:所述特异性杂交探针覆盖所述血栓与出凝血性疾病相关基因的基因突变,所述基因突变包括SNV、CNV、Indel和基因融合。
5.根据权利要求4所述的血栓与出凝血性疾病检测panel,其特征在于:所述特异性杂交探针对所述血栓与出凝血性疾病相关基因的覆盖率为100%。
6.根据权利要求1-5任一项所述的血栓与出凝血性疾病检测panel,其特征在于:所述特异性杂交探针由12000条探针组成。
7.根据权利要求1-6任一项所述的血栓与出凝血性疾病检测panel在制备检测血栓与出凝血性疾病的试剂或装置中的应用。
8.一种检测血栓与出凝血性疾病的基因芯片、装置或试剂盒,其特征在于:包括权利要求1-6任一项所述的血栓与出凝血性疾病检测panel。
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