CN114410504A - 一种发酵提取茶氨酸的方法 - Google Patents

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郭晓东
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Abstract

本发明属于茶氨酸生产领域，公开了一种发酵提取茶氨酸的方法，其是将茶氨酸发酵液进行陶瓷膜过滤，脱色分离，之后经过蒸发器浓缩结晶、离心烘干得到茶氨酸成品。本发明的茶氨酸的发酵提取方法显著提高了茶氨酸的产率和收率，提高产品质量。

Description

一种发酵提取茶氨酸的方法
技术领域
本发明属于生物发酵行业茶氨酸生产领域，具体提供一种发酵提取茶氨酸的方法。
背景技术
茶氨酸是茶树中特有的化学成分之一，又名N-乙基-Y-谷氨酰胺，非蛋白氨基酸。自然界存在的茶氨酸均为L型，纯品为白色针状结晶，极易溶于水，而不溶于无水乙醇和无水***，水溶液呈微酸性，性质稳定，有焦糖香及类似味精的鲜爽味，毒性实验中未发现其有毒性。
茶氨酸影响脑中多巴胺等的代谢和释放，相关的脑部的疾病也有可能得到调节或预防。茶氨酸还可通过神经传达物质来改善学习能力和记忆力。茶叶的减肥作用是茶叶中包括茶氨酸在内的多种成分共同作用的结果。茶氨酸尤其对减少体内胆固醇有效。近年来，随着茶氨酸生理功能和医药价值的发现，茶氨酸在医疗、保健、食品、饮料和精细化工等领域被广泛利用。
目前，茶氨酸的生产方法主要有4种：1）茶叶提取法：主要从茶叶中直接提取、分离纯化茶氨酸，提取步骤繁杂，设备种类多，存在提取成本高的问题。2）化学合成法：该法可能残留毒性物质，且生成物包括D、L-型茶氨酸异构体，需要进行拆分才能得到L型产品，使得分离精制操作复杂。3）组织培育法：茶树愈伤组织有合成茶氨酸的能力，组织中茶氨酸的积累与生长同步。改善培育方法，如增加蔗糖浓度、减少光照、添加乙胺、使用生长激素等提高茶氨酸的积累。此法目前运行成本过高，无法产业化。4）发酵法：是指利用微生物酶法进行生产，以谷氨酰转肽酶的菌株发酵产生相应的酶后，再与L-谷氨酰胺、盐酸乙胺反应从而制备茶氨酸。
比如，中国专利CN102850235A公开了L-茶氨酸的纯化工艺，该方法以谷氨酰转肽酶的菌株发酵液为起始原料，通过催化反应、大孔树脂吸附、超滤浓缩、冷冻干燥得到的茶氨酸产品，纯度达到98%、收率为70%以上，但是该方法操作步骤复杂且收率相对不高。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种发酵提取茶氨酸的方法，该方法发酵效率高、操作简单、节能减排、产品收率和纯度高。
本发明是通过如下技术方案来实现的。
一种发酵提取茶氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1）生物发酵，步骤2）陶瓷膜过滤，步骤3）一次脱色，步骤4）脱色膜脱色，步骤5）浓缩蒸发，步骤6）二次脱色，步骤7）结晶和烘干。
进一步地，所述方法包括如下步骤：
步骤1）生物发酵：将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CTh2020-05种子液按照10-15%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵24h，收集茶氨酸发酵液；
步骤2）陶瓷膜过滤：将茶氨酸发酵液经过陶瓷膜过滤，收集陶瓷膜清液；
步骤3）一次脱色：将陶瓷膜清液打入脱色罐，加入活性炭进行脱色处理，脱色时间50min，脱色温度70℃；
步骤4）脱色膜脱色：将步骤3）脱色完成的清液在脱色膜中进行脱色处理，控制进膜压力0.8mpa，出膜压力0.8mpa，得到脱色清液；
步骤5）浓缩蒸发：将步骤4）得到的脱色清液输送到四效蒸发器进行蒸发浓缩结晶，离心收集粗晶体；
步骤6）二次脱色：将步骤5）得到的粗晶体溶于水，打入脱色罐，加入活性炭进行二次脱色处理，脱色时间50min，脱色温度70℃；
步骤7）结晶和烘干：将步骤6）得到的脱色清液输送到二效蒸发器进行蒸发结晶，离心收集晶体，烘干。
优选地，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖60g/L，玉米浆20g/L，七水硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸亚铁50mg/L，一水硫酸镁40mg/L，硫酸锌10mg/L，六水硝酸钴5mg/L。
优选地，所述发酵条件为：转速550rpm，pH=7.0，压力0.05MPa，温度36-40℃，溶氧控制为20%。
优选地，所述烘干采用流化床烘干，控制烘干温度80℃，烘干时间15min。
本发明的技术方案具有以下突出优点及独特性。
1、本发明所发酵的茶氨酸料液经陶瓷膜、一次脱色、脱色膜、蒸发浓缩结晶等工序并经过二次脱色、精品离心等环节，色素去除率达89%，极大的去除了大分子杂质，提高了产品的收率和纯度。
2、本发明所提取的茶氨酸溶液经浓缩结晶，茶氨酸色素去除率70，产品纯度98.5%左右。
3、本发明生产过程全自动化、劳动强度低、能有效的节约成本。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本技术方案进行完整地描述。
实施例1
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CTh2020-05，其于2021年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.23583。
样品采集于生产车间L-茶氨酸发酵废渣，48℃热水处理3min，升温至50℃继续处理3min，然后涂布LB固体培养基，38℃培养24h收集菌斑，挑选L-茶氨酸表达量最高的菌株XFM-7；采用微生物菌种鉴定Biology仪鉴定，鉴定结果为大肠埃希氏菌。采用常压室温等离子体技术进行诱变，筛选L-茶氨酸表达量最高的菌株，即为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)CTh2020-05。
实施例2
L-茶氨酸的发酵方法，具体操作步骤如下：
1）将微生物菌种接入葡萄糖30g/L，七水硫酸镁0.5g/L，酵母粉6g/L，磷酸二氢钾2g/L，柠檬酸2g/L，蛋白胨2g/L，七水硫酸亚铁10mg/L，一水硫酸镁10mg/L，硫酸锌6.5mg/L，六水硝酸钴5mg/L的种子培养基中，用氨水调节pH至4.5，温度121-123℃，时间25min，进行实消灭菌。灭菌后用冷凝水降温至38℃，控制pH 6.8~7.2、压力0.05MPa、溶氧控制为30%-50%，培养8h，得到种子液。
2）将步骤1）得到的种子液稀释50倍测得OD=0.4时开始移种，接种量为12.5%，接入到含有发酵培养基（发酵培养基：葡萄糖60g/L，玉米浆20g/L，七水硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸亚铁50mg/L，一水硫酸镁40mg/L，硫酸锌10mg/L，六水硝酸钴5mg/L）的发酵罐中进行发酵，测得OD=0.3时开始补加乙胺，初期流加速率为1mL/h.L，4h后增加到2mL/h.L。通过流加质量浓度为70%的葡萄糖溶液控制含糖量不低于1%（质量百分比）。控制发酵过程中搅拌转速: 550rpm，pH=7.0，压力0.05MPa，温度36-40℃，溶氧控制为20%，发酵24h，收集发酵液。
实施例3
L-茶氨酸的提取方法，具体操作步骤如下：
1）经发酵工序发酵完毕的茶氨酸发酵液，陶瓷膜分离工序在常温下从发酵工序接料，将料液接入激活陶瓷膜，控制输料频率50HZ，生产频率50HZ，排渣频率40HZ，过滤温度60℃，压力4.2Mpa，过滤时间8h，PH值4.5，通过料液在膜管内高速流动，在压力驱动下含小分子组分的清液沿与之垂直方向向外渗透，含大分子组分的浓缩液被膜截留，制得陶瓷膜清液。
2）将步骤1的陶瓷膜清液打入脱色罐，进行一次脱色，接料至脱色罐25%时打开搅拌装置，完成自循环，加入1%质量百分比的活性炭对陶瓷膜清液进行脱色处理，脱色时间50min，脱色温度70℃。
3）将步骤2脱色完成的清液在多级膜耦合***的脱色膜中进行二级脱色处理，控制进膜压力0.8mpa，出膜压力0.8mpa,料液流速100³/h，得到脱色清液。
4）将步骤3得到的脱色清液输送到四效蒸发器进行蒸发浓缩、结晶、粗品离心收集粗晶体，控制离心转速1100转/s，离心时间80min。
5）将步骤4得到的粗晶体溶于水，打入脱色罐，加入1%质量百分比的活性炭进行二次脱色处理，脱色时间50min，脱色温度70℃。
6）将步骤5得到的脱色清液进入输送到二效蒸发器进行蒸发结晶、离心收集晶体，控制离心转速1100转/s，离心时间80min。流化床烘干，控制烘干温度80℃，烘干时间15min，烘干水分0.5%。
经上述步骤得到的茶氨酸成品，经检测所得茶氨酸色素去除率达80%，纯度为99%。
实施例4
1、不同发酵温度对发酵产L-茶氨酸的影响。
发酵工艺参照实施例2，发酵液中L-茶氨酸产量见表1：
表1
菌株 36℃ 37℃ 38℃ 39℃ 40℃
XFM-7 31.3 35.4 35.8 33.1 27.6
CTh2020-05 46.8 48.9 53.2 54.0 47.9
如上表1所示，与出发菌株XFM-7相比较，CTh2020-05发酵产茶氨酸效率提高了约50%，性能优异；并且较常规发酵菌株的最适发酵温度有所提高，有利于减少杂菌污染的可能性。
2、发酵培养基碳源对L-茶氨酸的影响。
基础发酵培养基：碳源60g/L，玉米浆20g/L，七水硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸亚铁50mg/L，一水硫酸镁40mg/L，硫酸锌10mg/L，六水硝酸钴5mg/L。
不同碳源类型：
组1：葡萄糖；组2：葡萄糖：蔗糖=1:1质量比；组3：葡萄糖：甘油=1:1质量比；组4：葡萄糖：乳糖=1:1质量比；组5：蔗糖；组6：甘油。
发酵工艺参照实施例2，发酵温度为39℃，发酵液中L-茶氨酸产量见表2：
表2
菌株 组1 组2 组3 组4 组5 组6
XFM-7 33.1 31.4 27.9 29.8 27.6 32.0
CTh2020-05 54.0 52.5 57.8 53.6 45.3 51.2
如上表2所示，葡萄糖+甘油作为复合碳源的组3，CTh2020-05发酵产茶氨酸的效率最高，较葡萄糖作为碳源的组1提高了约7%，而这种趋势并没有在XFM-7和现有的L-茶氨酸生产用大肠杆菌中体现，葡萄糖是XFM-7菌株等大肠杆菌的最佳发酵碳源。考虑到生物能源领域中甘油大量过剩，成本相对低廉，CTh2020-05菌株利用部分甘油作为碳源，不仅能够提高发酵效率，而且解决了甘油过剩的问题，工业应用价值较高。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了介绍，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，这对本领域技术人员而言应该很明确，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明保护的范围。

Claims (5)

1.一种发酵提取茶氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1）生物发酵，步骤2）陶瓷膜过滤，步骤3）一次脱色，步骤4）脱色膜脱色，步骤5）浓缩蒸发，步骤6）二次脱色，步骤7）结晶和烘干。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1）生物发酵：将大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CTh2020-05种子液按照10-15%的接种量接入到含有发酵培养基的发酵罐中发酵24h，收集茶氨酸发酵液；
步骤2）陶瓷膜过滤：将茶氨酸发酵液经过陶瓷膜过滤，收集陶瓷膜清液；
步骤3）一次脱色：将陶瓷膜清液打入脱色罐，加入活性炭进行脱色处理，脱色时间50min，脱色温度70℃；
步骤4）脱色膜脱色：将步骤3）脱色完成的清液在脱色膜中进行脱色处理，得到脱色清液；
步骤5）浓缩蒸发：将步骤4）得到的脱色清液输送到四效蒸发器进行蒸发浓缩结晶，离心收集粗晶体；
步骤6）二次脱色：将步骤5）得到的粗晶体溶于水，打入脱色罐，加入活性炭进行二次脱色处理，脱色时间50min，脱色温度70℃；
步骤7）结晶和烘干：将步骤6）得到的脱色清液输送到二效蒸发器进行蒸发结晶，离心收集晶体，烘干。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组分为：葡萄糖60g/L，玉米浆20g/L，七水硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸亚铁50mg/L，一水硫酸镁40mg/L，硫酸锌10mg/L，六水硝酸钴5mg/L。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵条件为：转速550rpm，pH=7.0，压力0.05MPa，温度36-40℃，溶氧控制为20%。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述烘干采用流化床烘干，控制烘干温度80℃，烘干时间15min。
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