CN114410502A - 一株罗伊氏乳杆菌mrd01及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及微生物技术领域，尤其涉及一株罗伊氏乳杆菌MRD01及其应用。所述罗伊氏乳杆菌MRD01的保藏编号为GDMCC 62017，研究发现经该菌株干预后，小鼠脂体重降低，总体重降低，具有减肥等功效；同时该菌株还具有优异的降血糖功能；所述罗伊氏乳杆菌MRD01同时可以缓解便秘，无毒无抗原反应，可作为益生菌，制成兼具降体重、减肥和降血糖的多功能的药物、功能食品或保健食品。
Description
技术领域
本申请涉及微生物技术领域，尤其涉及一株罗伊氏乳杆菌MRD01及其应用。
背景技术
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)是存在于所有脊椎动物和哺乳动物肠道内的乳酸菌。罗伊氏乳杆菌对肠黏膜具有很强的黏附能力，可改善肠道菌群分布，拮抗有害菌定植，避免罹患肠道疾病；罗伊氏乳杆菌能产生一种被称为“罗伊氏菌素(Reuterin)”的非蛋白质类广谱抗菌物质，能广泛抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、真菌和病原虫等的生长。罗伊氏乳杆菌形状呈轻微不规则、圆形末端的弯曲杆菌。罗伊氏乳杆菌属专性异型发酵菌种，能发酵糖产生CO2、乳酸、乙酸和乙醇。
罗伊氏乳杆菌常栖息于人和动物的肠道***中，对人和动物无害，具有良好的生物相容性。它代谢甘油产生一种特殊的抑菌物质——罗伊氏素(reuterin)，其主要成分是3-羟基丙醛(3-HPA)的单体、水合物和环化二聚体。
体内各组织细胞活动所需的能量大部分来自葡萄糖，所以血糖必须保持一定的水平才能维持体内各器官和组织的需要，而当血糖值高于正常值时，即为高血糖。长期的高血糖会使全身各个组织器官发生病变，导致多种急慢性并发症的发生。而通过药物如常用的阿卡波糖、二甲双胍、胰岛素等进行血糖调节时会存在多种副作用，因此通过食疗和肠道益生菌的调节来改善血糖水平是目前的重点研究方向，目前，没有发现罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) 具有调节血糖的作用。
发明内容
本申请提供了一株罗伊氏乳杆菌MRD01及其应用，提供了一种新的肠道菌来调节改善血糖水平。
第一方面，本申请提供了一株罗伊氏乳杆菌MRD01(Lactobacillus reuteri)，所述罗伊氏乳杆菌MRD01的保藏编号为GDMCC 62017。
可选的，所述罗伊氏乳杆菌MRD01的基因序列如SEQ ID NO：1所示。
第二方面，本申请提供了一种含罗伊氏乳杆菌MRD01(Lactobacillus reuteri)的微生物菌剂，所述微生物菌剂包括：保藏编号为GDMCC 62017的罗伊氏乳杆菌MRD01和/或所述罗伊氏乳杆菌MRD01的培养物和/或所述罗伊氏乳杆菌MRD01的加工物。
第三方面，本申请提供了第一方面所述的罗伊氏乳杆菌MRD01，或第二方面所述的微生物菌剂在制备治疗和/或预防高血糖药物、功能食品、保健食品中的应用。
第四方面，本申请提供了第一方面所述的罗伊氏乳杆菌MRD01，或第二方面所述的微生物菌剂在控制体重和/或控制血糖中的应用。
第五方面，本申请提供了第一方面所述的罗伊氏乳杆菌MRD01，或第二方面所述的微生物菌剂在便秘中的应用。
第六方面，一种控制血糖的方法，所述方法包括使用第一方面所述的罗伊氏乳杆菌 MRD01，或使用第二方面所述的微生物菌剂。
第七方面，一种控制体重的方法，所述方法包括使用第一方面所述的罗伊氏乳杆菌 MRD01，或使用第二方面所述的微生物菌剂。
第八方面，一种治疗便秘的药物，所述药物包括第一方面所述的罗伊氏乳杆菌MRD01，或第二方面所述的微生物菌剂。
可选的，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本申请实施例提供的一株罗伊氏乳杆菌MRD01(Lactobacillus reuteri)，所述罗伊氏乳杆菌MRD01的保藏编号为GDMCC 62017，研究发现经该菌株干预后，小鼠脂体重降低，具有减肥等功效；同时该菌株还具有优异的降血糖功能；所述罗伊氏乳杆菌MRD01同时可以缓解便秘，无毒无抗原反应，可作为益生菌，制成兼具降体重、减肥和降血糖的多功能的药物、功能食品或保健食品，具有广泛的市场前景和应用价值。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例1提供的菌株在MRS培养基上的不同倍数下的菌落形态；
图2为本申请中不同实验组3号剂量组、空白对照组和模型对照组的体重结果图；
图3为本申请中不同实验组4号剂量组、空白对照组和模型对照组的体重结果图；
图4为本申请中不同实验组5号剂量组、空白对照组和模型对照组的体重结果图；
图5为本申请中不同实验组3号剂量组、空白对照组和模型对照组的血糖变化结果图；
图6为本申请中不同实验组4号剂量组、空白对照组和模型对照组的血糖变化结果图；
图7为本申请中不同实验组5号剂量组、空白对照组和模型对照组的血糖变化结果图；
图8为本申请中罗伊氏乳杆菌MRD01依据16S rDNA的***进化树。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
罗伊氏乳杆菌MRD01(Lactobacillus reuteri)的保藏编号为：GDMCC 62017；分类命名为：罗伊氏乳杆菌MRD01(Lactobacillus reuteri)；保藏日期为：2021年11月12日；保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心；保藏单位地址为：中国广州广东省微生物菌种保藏中心。
实施例1罗伊氏乳杆菌MRD01(Lactobacillus reuteri)菌株的分离和鉴定
罗伊氏乳杆菌MRD01(Lactobacillus reuteri)菌株从人体肠道中分离获得，分离后在 MRS培养基(MRS固体培养基以质量分数计包括：葡萄糖2.0％、柠檬酸铵0.2％、乙酸钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、蛋白胨1.0％、牛肉膏1.0％、酵母膏0.5％、土温-80，1％和琼脂粉1.5％，调pH6.2～6.6)中进行厌氧培养，挑取不同形态的菌株进行纯化，并传代培养20-30代后，得到单克隆活化菌株，并进行保藏。
菌株在MRS培养基上的形态特征观察：如图1所示，左图是在100倍镜下观察得到，中间的图是在400倍镜下中观察得到，右图是在培养基上观察得到。MRS培养基上接种罗伊氏乳杆菌MRD01，28℃恒温培养10d，观察菌株的基本特征。本试验获得的罗伊氏乳杆菌MRD01菌株的基本特征如下：白色小菌落，饱满，边缘规则。
生理生化特性分析结果为：菌株的生理生化特征与常规罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)吻合；同时，分泌的非蛋白质类广谱抗菌物质，能广泛抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、真菌和病原虫等的生长。
16S rDNA序列分析：采用酶解法，提取罗伊氏乳杆菌MRD01的总DNA，利用细菌16SrDNA通用引物(27F 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；1492R 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增，得到长度为1400～1500bp片段。扩增产物送上海生工股份有限公司测序。罗伊氏乳杆菌MRD01的16S rDNA序列全长1401bp，将所获得序列拼接校对后(如SEQ ID NO：1所示)，采用Blast方法从GenBank数据库中进行序列相似性搜索，调取与相似性较高的6株乳杆菌属相关典型菌株，ClustalX v2.2软件进行同源性分析，Mega 5.0软件中的Neighbor-Joining方法构建***进化树。本申请要保护的菌株与罗伊氏乳杆菌MRD01(Lactobacillus reuteri)在同一***进化分支上，如图8，一致性为 100％，平均相似性为98.3％。
综合，根据16S rDNA序列分析结果及形态、生理生化特征，将菌株鉴定为罗伊氏乳杆菌MRD01。
实施例4
罗伊氏乳杆菌干预实验，根据《保健食品检验与评价技术规范》中减肥功能检验方法，选用体重范围22±2g C57/6J小鼠(实验动物及饲料均为市售)，每组20只，实验设空白对照组、模型对照组和五个剂量组，高糖高脂适应性喂养10d后建模成功，得到C57/6J高糖高脂模型小鼠，空白对照组继续采用基础饲料饲喂，其余给予高热量饲料(基础饲料80％、猪油 10％、蛋黄粉10％)喂养14d，称重淘汰1/3肥胖抵抗大鼠，高热量饲料的建模成功的小鼠随机分配为6组，分别为模型对照组和1-5号剂量组，继续采用高热量饲料喂养，1号剂量组给予高热量饲料，同时添加市售原花青素进行灌胃；2号剂量组给予高热量饲料的同时，添加市售芦丁进行灌胃；3号剂量组给予高热量饲料的同时，添加市售原花青素和本申请的罗伊氏乳杆菌进行灌胃，罗伊氏乳杆菌的量为2×109CFU/(kg·d)；4号剂量组给予高热量饲料的同时，添加市售芦丁和本申请的罗伊氏乳杆菌进行灌胃，罗伊氏乳杆菌的量为2×109 CFU/(kg·d)；5号剂量组给予高热量饲料的同时，添加本申请的罗伊氏乳杆菌进行灌胃，罗伊氏乳杆菌的量为2×109CFU/(kg·d)，空白对照组和模型对照组继续保持之前饲养条件，同时灌胃等量的生理盐水。
每10天记录摄食量、称量体重，每10d称体重，3-5号剂量组和空白对照组、模型对照组的体重结果如图2-图4，横坐标为实验的时间，纵坐标为体重的变化量，由图2-4的体重变化图可知，3-5号剂量组可判定减肥功能结果阳性，由实验结果可知，1号剂量组最开始的减肥效果最佳，但伴有原便秘发生；2号剂量组具有减肥效果，伴有原便秘发生；3号剂量组减肥效果佳，同时没有便秘现象；4号剂量组减肥效果佳，同时没有便秘现象；5号剂量组减肥效果在所有实验组中效果最佳，同时没有便秘现象；可以得出结论，本申请的罗伊氏乳杆菌 MRD01具有缓解并治疗便秘的作用。
实施例5
降低血糖功能实验：参照《保健食品检验与评价技术规范》进行辅助降血糖功能检验评价，选用体重范围22±2g C57/6J小鼠(实验动物及饲料均为市售)，每组20只，实验设空白对照组、模型对照组和五个剂量组，高糖高脂适应性喂养10d后建模成功，得到C57/6J高糖高脂模型小鼠，对空白对照组继续采用基础饲料饲喂，其余给予高热量饲料(基础饲料80 ％、猪油10％、蛋黄粉10％)喂养10d，高热量饲料的建模成功的小鼠继续采用高热量饲料喂养，适应性喂养7d后，禁食24h，给予四氧嘧啶45mg/kg(BW·iv)造模，6d后禁食4h，采用血糖仪进行剪尾取血测定血糖，选定血糖值10-25mmol/L造模成功小鼠，按照血糖水平分配称重淘汰1/3肥胖抵抗大鼠，随机分配为6组，分别为模型对照组和1-5号剂量组，1号剂量组给予高热量饲料，同时添加市售原花青素进行灌胃；2号剂量组给予高热量饲料的同时，添加市售芦丁进行灌胃；3号剂量组给予高热量饲料的同时，添加市售原花青素和本申请的罗伊氏乳杆菌进行灌胃，罗伊氏乳杆菌的量为2×19CFU/(kg·d)；4号剂量组给予高热量饲料的同时，添加市售芦丁和本申请的罗伊氏乳杆菌进行灌胃，罗伊氏乳杆菌的量为2×109CFU/(kg·d)；5号剂量组给予高热量饲料的同时，添加本申请的罗伊氏乳杆菌进行灌胃，罗伊氏乳杆菌的量为2×109CFU/(kg·d)，空白对照组和模型对照组继续保持之前饲养条件，同时灌胃等量的生理盐水。禁食4h，测定试验后空腹血糖值，计算实验前后血糖变化量。
血糖变化量＝(实验前血糖值-实验后血糖值)
糖耐量测定方法，禁食4h，不同组给予不同受试样品，15min后给予葡萄糖2.0g/kg，然后测定给葡萄糖后1h的血糖值，血糖的单位为mmol/L，3-5号剂量组和空白对照组、模型对照组的血糖结果如图5-图7，横坐标为实验的时间，纵坐标为血糖的变化量，由图5-7的血糖变化图可知，3-5号剂量组可判定降血糖成功，由实验可知，1号剂量组的降血糖结果3.5±0.2； 2号剂量组的降血糖结果4.0±0.3；3-5号剂量组具有明显的降血糖作用；5号剂量组的降血糖效果在所有实验组中降血糖效果最佳。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性地包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 安徽医科大学
<120> 一株罗伊氏乳杆菌MRD01及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1401
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actgattgat ggtgcttgca cctgattgac gatggatcac cagtgagtgg cggacgggtg 60
agtaacacgt aggtaacctg ccccggagcg ggggataaca tttggaaaca gatgctaata 120
ccgcataaca acaaaagcca catggctttt gtttgaaaga tggctttggc tatcactctg 180
ggatggacct gcggtgcatt agctagttgg taaggtaacg gcttaccaag gcgatgatgc 240
atagccgagt tgagagactg atcggccaca atggaactga gacacggtcc atactcctac 300
gggaggcagc agtagggaat cttccacaat gggcgcaagc ctgatggagc aacaccgcgt 360
gagtgaagaa gggtttcggc tcgtaaagct ctgttgttgg agaagaacgt gcgtgagagt 420
aactgttcac gcagtgacgg tatccaacca gaaagtcacg gctaactacg tgccagcagc 480
cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttatc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg 540
cggttgctta ggtctgatgt gaaagccttc ggcttaaccg aagaagtgca tcggaaaccg 600
ggcgacttga gtgcagaaga ggacagtgga actccatgtg tagcggtgga atgcgtagat 660
atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tgtctggtct gcaactgacg ctgaggctcg 720
aaagcatggg tagcgaacag gattagatac cctggtagtc catgccgtaa acgatgagtg 780
ctaggtgttg gagggtttcc gcccttcagt gccggagcta acgcattaag cactccgcct 840
ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg 900
gagcatgtgg tttaattcga agctacgcga agaaccttac caggtcttga catcttgcgc 960
taaccttaga gataaggcgt tcccttcggg gacgcaatga caggtggtgc atggtcgtcg 1020
tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgttactag 1080
ttgccagcat taagttgggc actctagtga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg 1140
ggacgacgtc agatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggacg 1200
gtacaacgag tcgcaagctc gcgagagtaa gctaatctct taaagccgtt ctcagttcgg 1260
actgtaggct gcaactcgcc tacacgaagt cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg 1320
ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtttgta 1380
acgcccaaag tcggtggcct a 1401
Claims (10)
1.一株罗伊氏乳杆菌MRD01(Lactobacillus reuteri)，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌MRD01的保藏编号为GDMCC 62017。
2.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌MRD01(Lactobacillus reuteri)，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌MRD01的基因序列如SEQ ID NO：1所示。
3.一种含罗伊氏乳杆菌MRD01(Lactobacillus reuteri)的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包括：保藏编号为GDMCC 62017的罗伊氏乳杆菌MRD01和/或所述罗伊氏乳杆菌MRD01的培养物和/或所述罗伊氏乳杆菌MRD01的加工物。
4.一种如权利要求1或2所述的罗伊氏乳杆菌MRD01，或如权利要求3所述的微生物菌剂在制备治疗和/或预防高血糖药物、功能食品、保健食品中的应用。
5.一种如权利要求1或2所述的罗伊氏乳杆菌MRD01，或如权利要求3所述的微生物菌剂在控制体重和/或控制血糖中的应用。
6.一种如权利要求1或2所述的罗伊氏乳杆菌MRD01，或如权利要求3所述的微生物菌剂在便秘中的应用。
7.一种控制血糖的方法，其特征在于，所述方法包括使用如权利要求1或2所述的罗伊氏乳杆菌MRD01，或使用如权利要求3所述的微生物菌剂。
8.一种控制体重的方法，其特征在于，所述方法包括使用如权利要求1或2所述的罗伊氏乳杆菌MRD01，或使用如权利要求3所述的微生物菌剂。
9.一种治疗便秘的药物，其特征在于，所述药物包括如权利要求1或2所述的罗伊氏乳杆菌MRD01，或如权利要求3所述的微生物菌剂。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
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2021
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