CN114404608B - 一种嵌入式搭载siRNA的四面体框架核酸及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特殊设计的四面体框架核酸，它是内部嵌入了siRNA的四面体框架核酸。本发明通过碱基互补配对，使目的siRNA的两端均连接到四面体框架核酸上，从而将目的siRNA嵌入到载体框架中，实现对siRNA的保护性搭载，提高siRNA的入胞能力。同时，利用pH响应性开关进一步实现siRNA在靶细胞的动态释放，实现了siRNA的可控性递送。

Description

一种嵌入式搭载siRNA的四面体框架核酸及其用途
技术领域
本发明具体涉及一种嵌入式搭载siRNA的四面体框架核酸及其应用。
背景技术
寡核苷酸疗法是由20个以内短链核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成的寡核苷酸，通过Watson-Crick碱基互补配对原理与DNA、mRNA或者pre-mRNA配对实现非常高的选择性，精准地抑制某些基因，让编码异常的基因保持“沉默”，从而阻止许多“错误”的蛋白质表达。目前在研的寡核苷酸药物种类很多，包括反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide，ASO)、小干扰核糖核酸(small interfering RNA，siRNA)、微小核糖核酸(microRNA，miRNA)、核酸适配体(aptamer)等。
寡核苷酸疗法与传统药物相比，具有选择性靶向、个性化设计和高可预测性等突出优势。迄今为止，FDA批准的寡核苷酸治疗方案已经超过10种，主要包括反义寡核苷酸链和siRNA，主要是针对眼、肝脏和骨骼肌的疾病。可观的治疗效果和仍存在的改进空间激励着研究人员进一步的探索。siRNA治疗研究的挑战仍然是目的siRNA的有效递送。常见的问题包括靶细胞的难以入胞性、递送过程中核酸酶导致siRNA降解、材料入胞后溶酶体逃逸失败、无关蛋白质的包裹、肾脏清除等。
四面体框架核酸(tFNA)具有极强且普适的入胞能力，因此在近年来显现出作为药物递送平台的巨大研究潜力，并且凭借高效的自组装合成方式，物化性质的高可控性，以及可编辑性下的高度可定制性和可升级性，在纳米颗粒递送***中占有独特的地位。专利CN113736776A一种基于框架核酸材料的microRNA纳米复合体及其制备方法和用途，通过在四面体框架核酸的4个顶点增加粘性末端来携带目的RNA或DNA片段。管粘性末端的“尾状”结构设计简便，但在这种载体设计中，tFNA在作为静态纳米载体，仅为目的货物链提供了一个能够连接的“座位”，且这种黏性末端的连接方式会影响DNA纳米材料的空间结构和大小，进而影响其入胞能力，同时无法携带长核酸穿过细胞膜，否则可能需要额外的阳离子聚合物的保护和辅助。直接悬挂的连接方式还无法对所搭载的siRNA进行进一步的保护和稳定。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种四面体框架核酸，它是内部嵌入了siRNA的四面体框架核酸。
进一步地，它是内部通过碱基互补配对嵌入了siRNA的四面体框架核酸。
更进一步地，所述四面体框架核酸的四条DNA单链边长30bp，其中一条DNA单链序列包含4段重复的CCCCC。
更进一步地，所述四面体框架核酸的四条DNA单链中一条DNA单链序列包含ACCCCCTAACCCCCTAACCCCCTAACCCCC，一条DNA单链序列包含CGAGAAGGGCATCTC，一条DNA单链序列包含GGATCTTCAGACTTA。
更进一步地，所述嵌入了siRNA的四面体框架核酸的四条DNA单链序列如SEQ IDNO.1～4所示。
更进一步地，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5～6所示。
本发明还提供了一种前述四面体框架核酸的制备方法，它包括如下步骤：
取四条DNA单链与siRNA的意义链和反义链，加入到TM缓冲液中，95℃维持10min，快速降温到4℃维持20min以上，即得。
进一步地，所述四条DNA单链与siRNA的意义链和反义链的终浓度均为1000nM。
本发明最后提供了一种前述四面体框架核酸在制备抗炎药物中的用途。
本发明通过四面体框架核酸(tFNA)的外框架上特定的碱基序列CGAGAAGGGCATCTC和GGATCTTCAGACTTA，与目的siRNA碱基互补配对，使目的siRNA成功嵌入四面体框架核酸内部，实现对siRNA的保护性搭载，并通过tFNA外框架上4段重复的CCCCC，成功构建了pH响应性开关，使tFNA能够在进入细胞溶酶体后实现从关闭结构到开放结构的转换，从而使得所递送的siRNA能够从载体上释放出来，发挥相应的基因沉默作用。
本发明相对现有的技术中的四面体框架核酸具体有益效果如下：
1、实现对siRNA的保护性搭载
通过将siRNA嵌入到tFNA内部，加强所包裹的siRNA的抗RNA酶能力，并增强其在血清中的稳定性，提高其在37℃(作用温度下)的搭载稳定性，降低其脱落风险，提高siRNA有效载荷。
2、提高tFNA的入胞能力
利用tFNA原本的内部空间，通过嵌入式的siRNA搭载方式，使搭载siRNA后对tFNA的尺寸无明显影响，因此很好地保留tFNA优异的入胞的能力。
3、降低siRNA潜在的免疫原性
siRNA存在潜在的免疫原性，由于tFNA在前期研究中被证实具有良好的生物相容性，无细胞毒性。在被包裹到tFNA后，siRNA在递送过程中不容易被免疫细胞识别和摄取，因此避免了潜在的免疫原性，生物安全性良好。
4、可搭载的siRNA的多样性
本发明采用的tFNA边长为30bp，嵌入了长度为25bp的能够沉默TNFαmRNA的前体siRNA。对于常规21-25bp长度的其他siRNA来说，是具有普适性的。能够根据研究需要以及治疗需要将siRNA调整为相应的目的siRNA。
5、实现siRNA在靶细胞的动态释放
通过调整tFNA合成的序列，在框架上增加pH响应性序列，使tFNA能够在进入细胞溶酶体后实现从关闭结构到开放结构的转换，从而使得所递送的siRNA能够从载体上释放出来，并进一步进入细胞质内发挥相应的基因沉默作用。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1tFNA-siR的原子力显微镜(AFM)图
图2tFNA-siR的透射电镜(TEM)图
图3动态光散射测量tFNA-siR的粒径结果
图4tFNA-siR在pH8与pH5条件下的圆二色谱仪扫描结果
图5酶标仪测得tFNA-siR在不同pH条件下的荧光强度变化
图6游离siRNA和tFNA-siR在不同浓度的RNaseA中孵育1小时后的降解直观的折线图
图7游离siRNA和tFNA-siR在1U/mL RNaseA中孵育不同时间后的降解直观的折线图
图8游离siRNA和tFNA-siR在不同浓度的胎牛血清中孵育24小时后的降解直观的折线图
图9游离siRNA和tFNA-siR在10％浓度的血清中孵育不同时间后的降解直观的折线图
图10在室温下常规pH8缓冲液中得到的tFNA、tFNA-siR、tFNA(s)和tFNA(s)-siR的5％PAGE电泳图
图11在37℃下常规pH8缓冲液中得到的tFNA、tFNA-siR、tFNA(s)和tFNA(s)-siR的5％PAGE电泳图
图12在37℃下pH5的酸性缓冲液中得到的tFNA、tFNA-siR、tFNA(s)和tFNA(s)-siR的5％PAGE电泳图
图13共聚焦荧光显微镜下观察tFNA-siR和溶酶体的共定位情况(绿色荧光信号：Lyso Tracker标记溶酶体；紫色荧光信号：Cy5标记tFNA-siR；蓝色荧光信号：Hochst标记细胞核。Merge图中绿色箭头指示从溶酶体中逃逸出的tFNA-siR的Cy5荧光信号，红色箭头指示溶酶体与tFNA-siR的信号重叠的情况，也就是尚未从溶酶体中逃逸的tFNA-siR)
图14转染游离siRNA、tFNA、tFNA-siR、tFNA(s)-siR和lipo3000-siR的巨噬细胞刺激后的mRNA水平的qPCR分析。
图15转染游离siRNA、tFNA、tFNA-siR、tFNA(s)-siR和lipo3000-siR的巨噬细胞刺激后分泌的TNFα蛋白的ELISA分析。
具体实施方式
实施例1、本发明嵌入式搭载siRNA的四面体框架核酸的制备、表征及应用
1、tFNA-siRNA(tFNA-siR)的合成：
1)tFNA由4条DNA单链形成边长30bp的外框架，其中
S1(SEQ ID NO.1)：
TACGGGTAGGCCGAGACTACTATGGCGTGCAGCAGCTGGTGATAAAACCCCCTAACCCCCTAACCCCCTAACCCCC
S2(SEQ ID NO.2)：
CTCGGCCTACCCGTACGAGAAGGGCATCTCATAGTACGGTATTGGACCGAGTCCTCGCATGAGAGTTGACGGAGTCTGCCTGTCCACTATGC
S3(SEQ ID NO.3)：
TTTATCACCAGCTGCTGCACGCCATAGTAGAGCATAGTGGACAGGCAGACTCCGTCAACTCAGATCTCGAACATTCC
S4(SEQ ID NO.4)：
CATGCGAGGACTCGGTCCAATACCGTACTAAAGGGAATTAGGGAATTAAGGGGTTAAAGGGAGGATCTTCAGACTTAGGAATGTTCGAGATC
2)siRNA由2条链组成，其中反义链的两端增加延长的DNA链：
正义链(又称为货物链，是真正发挥基因沉默作用的序列，SEQ ID NO.5)：gucucagccucuucucauuccugCT；
反义链(又称为载体链，其进入细胞的后续转归为被降解，SEQ ID NO.6)：
GAGATGCCCTTCTCGAagcaggaaugagaagaggcugagacauATAAGTCTGAAGATCC。
其中，小写字母表示RNA碱基序列，大写字母表示DNA碱基序列。
3)合成程序
将4条DNA单链(S1、S2、S3、S4)以及siRNA的2条链溶解于TM Buffer(10mM Tris-HCl，50mM MgCl2，pH＝8.0)中，6条寡核苷酸链的终浓度都为1000nM，充分混合后迅速加热至95℃，10分钟后迅速降温至4℃并维持20分钟以上，即可得到tFNA-siR。4℃下保存待用。
2.tFNA-siR的合成鉴定表征结果：
使用2种电镜观察，结果见图1～2。镜下可见特征的四面体结构。合成后的tFNA-siR大小约为10-20nm，结果见图3，可认为tFNA-siR已成功合成。
3、tFNA-siR的pH响应性验证结果：
本发明所用的pH响应性富C序列为ACCCCCTAACCCCCTAACCCCCTAACCCCC，搭载于S1中。在pH8的条件下(也就是材料正常合成的pH环境时)，该序列与S4链之间部分发生碱基的互补配对，形成正常的四面体框架结构。但是在pH5时，该富C序列内部会形成四链结构(i-motif结构)，进而导致tFNA的四面体结构被打开。
1)利用圆二色谱仪对i-motif结构进行扫描，会有特征性的波峰与波谷形成。如图4所示：当pH从8变为5，也就是模拟溶酶体的酸性环境下时，tFNA-siR的波峰值明显增大，而且出现了典型的右移(从～273nm移动到～283nm)，说明在pH5时，tFNA-siR的i-motif结构形成了，tFNA框架被打开。
2)荧光淬灭反应
在tFNA-siR的S1和S3链上分别修饰淬灭基团BHQ2和荧光基团ROX。当i-motif结构形成时，BHQ2基团会非常靠近ROX基团，导致ROX被激发后的发射光被淬灭，无法测得荧光信号。而当富C序列从原本的碱基互补配对转向i-motif四链结构时，ROX与BHQ2基团分离，导致距离增加，荧光不再被淬灭，可以测得荧光信号。利用酶标仪测tFNA-siR-ROX/BHQ2在不同pH条件下的ROX荧光强度变化，具体结果见图5。结果显示随着pH的降低，环境酸度增加，原本C-G，A-T配对的平衡被打破，逐渐形成i-motif结构，材料的荧光强度也逐渐降低。当pH调至5时，荧光淬灭程度约90％。说明在此时，i-motif结构形成完全，tFNA几乎完全被打开。
4、tFNA提供了所搭载的siRNA更好的RNA酶稳定性。
通过2％琼脂糖凝胶比较游离siRNA和tFNA-siR在不同浓度的RNaseA中孵育1小时后的降解情况，并将其统计为直观的折线图，具体见图6。
如图6所示：Cy5通道指示了未被降解完整siRNA的量。经2U/mL的RNase A降解1h后，游离siRNA几乎完全降解，但tFNA-siR仍有明显的完整的siRNA条带。包裹在tFNA中的siRNA在酶浓度达到8U/mL(2U/mL的4倍)时才能被完全降解。统计分析显示在2U/mL RNaseA中孵育1小时后，未降解的游离siRNA仅占17％，而tFNA-siR中的siRNA有超过一半得到保护未被降解(65％)。
通过2％琼脂糖凝胶比较游离siRNA和tFNA-siR在1U/mL RNaseA中孵育不同时间后的降解情况，并将其统计为直观的折线图，具体见图7。
如图7所示：未受保护的游离siRNA在降解4-6小时期间完全消失，而tFNA-siR在孵育6-12小时后才完全消失。在1U/mL的RNase A中酶解1小时后，tFNA中的siRNA几乎全部得以保存，而裸露的游离siRNA则降解了一半以上。
5、tFNA提供了所搭载的siRNA更好的血清稳定性。
通过2％琼脂糖凝胶比较游离siRNA和tFNA-siR在不同浓度的胎牛血清中孵育24小时后的降解情况，并将其统计为直观的折线图，具体见图8。
如图8所示：即使与10％浓度的胎牛血清孵育24小时后，受tFNA保护的大部分siRNA仍然保持稳定，并被检测到清晰的荧光条带。相反，当胎牛血清的浓度超过超过4％时，游离siRNA就完全被降解了。
通过2％琼脂糖凝胶比较了游离siRNA和tFNA-siR在10％浓度的血清中孵育不同时间后的降解情况，并将其统计为直观的折线图，具体见图9。
如图9所示：在10％血清的条件下，游离siRNA和tFNA-siR孵育不同时间后的降解程度也证实了tFNA对siRNA的保护作用。仅培养12小时后，大部分游离siRNA已被分解，未检测到荧光条带，而此时tFNA-siR中的大部分siRNA在孵育24小时后仍是完整的。
6、tFNA提供了所搭载的siRNA更可控的释放管理。
tFNA(s)-siR是一种模拟黏性末端搭载目的siRNA的纳米材料。siRNA只有一个末端能与tFNA(s)外框架形成碱基互补配对，类似于常规的黏性末端连接。在室温下常规pH8缓冲液中得到的tFNA、tFNA-siR、tFNA(s)和tFNA(s)-siR的5％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)结果表明，tFNA和tFNA(s)均能在室温下稳定携带siRNA(如图10所示)。而将跑胶温度上调到37℃以模拟真实的细胞培养温度时，siRNA从tFNA(s)上分离；与此相反，tFNA-siR中嵌入的siRNA在37℃下以100V电压在聚丙烯酰胺凝胶中跑50分钟后仍能被tFNA稳定携带(如图11所示)。将跑胶的缓冲液更换为pH5的缓冲液以进一步模拟被细胞摄取后进入溶酶体的环境时，tFNA的pH开关作出响应，形成i-motif结构，使得框架结构打开，而嵌入的siRNA可以从开放的tFNA中释放(如图12所示)。
7、tFNA能够辅助siRNA从溶酶体中逃逸出来，进入细胞质中
共聚焦荧光显微镜下观察巨噬细胞在孵育tFNA-siR 3小时、6小时、12小时和24小时后，tFNA-siR和溶酶体的共定位情况，如图13所示：在共聚焦显微镜下观察到了tFNA-siR从溶酶体逃逸的情况。在转染siRNA3小时后观察到单独的Cy5荧光，表明tFNA中嵌入siRNA发生了溶酶体逃逸(绿色箭头表示单独的Cy5信号，红色箭头表示Cy5信号和Lyso Tracker信号重叠)。随着时间的延长，溶酶体外的Cy5荧光信号明显增强，并充满整个细胞质。证实了tFNA-siR具有突出的溶酶体逃逸能力，有利于siRNA克服第二道膜障碍进入细胞质发挥作用。
8、tFNA-siR能够明显抑制炎性刺激后巨噬细胞的TNFαmRNA的表达
分别合成游离siRNA、tFNA、tFNA-siR、tFNA(s)-siR和lipo3000-siR，浓度均为1000nM。其中lipo3000-siR是按照Lipofectamine3000说明书进行孵育合成的由Lipofectamine3000包裹搭载的siRNA。同时合成了siRNA只有单端与四面体框架核酸连接的目的药物，此时siRNA未嵌入，位于四面体框架核酸载体的外侧。在转染巨噬细胞时，使用无血清高糖培养基将上述合成的药物从1000nM稀释至200nM浓度的工作液使用。转染巨噬细胞24小时后，给予细胞LPS刺激4小时对细胞内TNFα的mRNA水平进行qPCR分析，结果见图14。
如图14所示：tFNA-siR可使LPS诱导的TNFαmRNA表达下调5倍，表现出与lipo3000-siR相当的基因沉默效果。另外，嵌入性搭载的优点也反映在基因沉默效果上:tFNA-siR组的TNFαmRNA表达水平明显低于tFNA(s)-siR组。
游离siRNA、tFNA、tFNA-siR、tFNA(s)-siR和lipo3000-siR转染巨噬细胞后，给予细胞LPS刺激4小时后，对4小时内细胞分泌到上清中的TNFα蛋白进行ELISA分析，结果见图15。
如图15所示：TNFα蛋白表达的抑制效果与qPCR一致。tFNA-siR抑制TNFα表达的效果是各组中最强的，可与商业化的Lipofectamine 3000相当。
综上，本发明通过碱基互补配对，使目的siRNA的两端均连接到四面体框架核酸上，从而将目的siRNA嵌入到载体框架中，实现对siRNA的保护性搭载，提高siRNA的入胞能力，同时，利用pH响应性开关进一步实现siRNA在靶细胞的动态释放，实现了siRNA的可控性递送，使寡核苷酸药物的治疗效果更显著。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 一种嵌入式搭载siRNA的四面体框架核酸及其用途
<130> GYKH1118-2022P0114747CC
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tacgggtagg ccgagactac tatggcgtgc agcagctggt gataaaaccc cctaaccccc 60
taacccccta accccc 76
<210> 2
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctcggcctac ccgtacgaga agggcatctc atagtacggt attggaccga gtcctcgcat 60
gagagttgac ggagtctgcc tgtccactat gc 92
<210> 3
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tttatcacca gctgctgcac gccatagtag agcatagtgg acaggcagac tccgtcaact 60
cagatctcga acattcc 77
<210> 4
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catgcgagga ctcggtccaa taccgtacta aagggaatta gggaattaag gggttaaagg 60
gaggatcttc agacttagga atgttcgaga tc 92
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gucucagccu cuucucauuc cugct 25
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gagatgccct tctcgaagca ggaaugagaa gaggcugaga cauataagtc tgaagatcc 59

Claims (4)

1.一种用于抗炎的四面体框架核酸，其特征在于：它是内部通过碱基互补配对嵌入了siRNA的四面体框架核酸；
所述四面体框架核酸的四条DNA单链序列如SEQ ID NO .1～4 所示；
所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5~6所示。
2.一种权利要求1所述四面体框架核酸的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
取四条DNA单链与siRNA的正义链和反义链，加入到TM缓冲液中， 95℃维持10min，快速降温到4℃维持20min以上，即得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述四条DNA单链与siRNA的正义链和反义链的终浓度相同。
4.权利要求1所述四面体框架核酸在制备抗炎药物中的用途。
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