CN114397454A - 一种人c-myc基因快速监测试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人c‑myc基因快速监测试剂盒及其使用方法，本试剂盒采用竞争法检测样本中c‑myc的含量。向预先包被了抗体的酶标孔中加入样本，再加入生物素标记的识别抗原，在37℃下孵育1小时，两者与固相抗体竞争结合形成免疫复合物，经PBST洗涤除去未结合的生物素抗原，然后加入亲和素‑HRP，在37℃下孵育1小时,亲和素‑HRP与生物素抗体结合，洗涤后结合的HRP催化TMB(四甲基联苯胺)成蓝色，随后在酸的作用下转化成黄色，在450nm波长下有吸收峰，吸光值与样本中抗原的浓度成负相关。
Description
技术领域
本发明涉及试剂盒技术领域，具体为一种人c-myc基因快速监测试剂盒及其使用方法。
背景技术
乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，发病率和死亡率居妇女各类恶性肿瘤之首严重威胁着女性的身体健康，尽管近年来筛查和诊疗技术的进步，在很大程度上提高了乳腺癌患者的生存率，但前提是能够及时发现并予以治疗，因此，通过检测生物标志物来进行预测诊断十分重要。
表观遗传学改变所导致的基因表达异常是癌症发生的重要因素在癌症发生、发展阶段基因表达谱均会发生相应的变化，本文采用对三阴性乳腺癌与 c-myc之间表达谱进行分析。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种人c-myc基因快速监测试剂盒及其使用方法，包括以下步骤：
S1：试剂盒组成：1、封板膜；2、密封袋；3、酶标包被板；4、冻干粉；5、样品稀释液；6、浓缩生物素抗原；7、浓缩亲和素-HRP；8、生物素抗原稀释液； 9、亲和素-HRP稀释液；10、显色剂A液；11、显色剂B液；12、终止液；13、浓缩洗涤液。
S2：实验辅助器材：1、37℃恒温箱；2、标准规格酶标仪；3、精密移液器及一次性吸头；4、双蒸水或超纯水；5、干净的试管或Eppendof管；6、吸水纸；7、自动洗板机或8道排枪；8、ELISA数据处理软件，推荐使用ELISACalc； 9、500ml烧杯的和适当量程的量筒；10、掌上离心机。
S3：使用前请先将试剂盒在室温下平衡半小时，空白孔不加样，只加显色剂A，显色剂B和终止液用于调零。
S4：标准品孔：每孔加入稀释好的标准品50μl，零孔加入标准品/样品稀释液50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl。
S5：样品孔：加入样品50μl(推荐直接加样，浓度高可以用样品稀释液稀释2-5倍)，然后加入生物素抗原工作液50μl。
S6：轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育60min。
S7：将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。
S8：第一次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
S9：加入50μl亲和素-HRP到标准品孔和样品孔中，轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育60min。
S10：第二次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
S11：显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。
S12：终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
S13：测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后10分钟以内进行。
S14：计算：根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程，建议用专用计算软件进行计算，推荐使用ELISAcalc进行计算，拟合模型选用logistic曲线(四参数)。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明详细描述了c-myc基因快速监测试剂盒的使用方法，检测样本当中c-myc的含量，有助于更好的对三阴乳腺癌进行研究，对于阐明三阴性乳腺癌发病的确切分子机制，寻找与疾病诊断、治疗及预后相关的潜在作用靶点，具有重要的临床意义。
附图说明
图1为本发明流程图；
图2为本发明试剂操作示意图；
图3为本发明标曲示意图如下。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-3，本发明提供一种技术方案：一种人c-myc基因快速监测试剂盒及其使用方法，包括以下步骤：
S1：试剂盒组成：1、封板膜；2、密封袋；3、酶标包被板；4、冻干粉；5、样品稀释液；6、浓缩生物素抗原；7、浓缩亲和素-HRP；8、生物素抗原稀释液； 9、亲和素-HRP稀释液；10、显色剂A液；11、显色剂B液；12、终止液；13、浓缩洗涤液。
1、试剂盒中“样品稀释液”为0.05M的PBS，“终止液”为2M的H2SO4，洗涤液为含0.15％吐温-20的PBST，如不够可自行配制；2、不同公司的缓冲体系存在较大差异，请勿将本试剂盒的试剂与其他公司的试剂混用以免影响实验结果；3、浓缩洗涤液在低温下会有少量盐类析出，稍微加温后即会消失，不影响使用；4、本试剂盒可以在2-8℃下保存6个月，在-20℃下可以保存更长的时间。酶标板为真空包装，板条可以拆卸，拆开以后如一次不能用完，请放入提供的密封袋中，放入干燥剂，2-8℃保存，在一个月之内仍然有效。试剂不能反复冻融。
S2：实验辅助器材：1、37℃恒温箱；2、标准规格酶标仪；3、精密移液器及一次性吸头；4、双蒸水或超纯水；5、干净的试管或Eppendof管；6、吸水纸；7、自动洗板机或8道排枪；8、ELISA数据处理软件，推荐使用ELISACalc； 9、500ml烧杯的和适当量程的量筒；10、掌上离心机。
S3：试剂准备：1、使用前所有试剂应置于37℃恒温箱内腔室温平衡至少 30分钟，空白孔不加样，只加显色剂A，显色剂B和终止液用于调零；2、本试剂盒可以直接加样，如浓度过高，可以进行适当比例的稀释(推荐2-5倍稀释)，计算时应将结果乘以稀释的倍数；3、洗涤液为25倍浓缩液，使用前将所有洗涤液倒入500ml或1L的烧杯中，用双蒸水定容到500ml即为工作液；4、标准品的稀释：取5支干净的Eppendorf管，每管加150μl的标准品稀释液，分别标记上640ng/L，320ng/L，160ng/L，80ng/L，40ng/L。取150μl标准品原液加入标记640ng/L的管中，混匀后同样取出150μl，加入下一管，以此类推直至最后一管，零孔：直接加标准品/样品稀释液，如附图2所示；
5、生物素抗原的稀释：先用掌上离心机离心，然后抽取生物素抗原稀释液 1ml到浓缩型生物素抗原中，漩涡混匀15秒，然后将所有液体倒入稀释液瓶中即为生物素抗原工作液；6、亲和素-HRP的稀释：先用掌上离心机离心，然后抽取亲和素-HRP稀释液1ml到浓缩型亲和素-HRP中，漩涡混匀15秒，然后将所有液体倒入稀释液瓶中即为亲和素-HRP工作液。
S4：样本前处理：1、标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融；2、血清：室温血液自然凝固10-20分钟，2000-3000转/分,离心20 分钟左右。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心；3、血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后， 2000-3000转/分,离心20分钟左右。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心；4、尿液：用无菌管收集，2000-3000转/分,离心20分钟左右。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行；5、细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。2000-3000转/ 分,离心20分钟左右。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS(PH7.2-7.4) 稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。2000-3000转/分,离心20分钟左右。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心；6、组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4)，用手工或匀浆器将标本匀浆充分，2000-3000 转/分,离心20分钟左右。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
S5：洗板方法：先洗去酶标孔中的的液体，在吸水纸上拍干，然后每孔加入300μl稀释好的洗涤液，轻轻摇晃30秒，然后甩掉，在吸水纸上拍干，重复4-5次。
S6：终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
S7：计算：根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程，建议用专用计算软件进行计算，推荐使用ELISAcalc进行计算，拟合模型选用logistic曲线(四参数)，如图3所示。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (1)
1.一种人c-myc基因快速监测试剂盒及其使用方法，其特征在于，所述一种人c-myc基因快速监测试剂盒及其使用方法包括以下步骤：
S1：试剂盒组成：1、封板膜；2、密封袋；3、酶标包被板；4、冻干粉；5、样品稀释液；6、浓缩生物素抗原；7、浓缩亲和素-HRP；8、生物素抗原稀释液；9、亲和素-HRP稀释液；10、显色剂A液；11、显色剂B液；12、终止液；13、浓缩洗涤液。
S2：实验辅助器材：1、37℃恒温箱；2、标准规格酶标仪；3、精密移液器及一次性吸头；4、双蒸水或超纯水；5、干净的试管或Eppendof管；6、吸水纸；7、自动洗板机或8道排枪；8、ELISA数据处理软件，推荐使用ELISACalc；9、500ml烧杯的和适当量程的量筒；10、掌上离心机。
S3：使用前请先将试剂盒在室温下平衡半小时，空白孔不加样，只加显色剂A，显色剂B和终止液用于调零。
S4：标准品孔：每孔加入稀释好的标准品50μl，零孔加入标准品/样品稀释液50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl。
S5：样品孔：加入样品50μl(推荐直接加样，浓度高可以用样品稀释液稀释2-5倍)，然后加入生物素抗原工作液50μl。
S6：轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育60min。
S7：将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。
S8：第一次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
S9：加入50μl亲和素-HRP到标准品孔和样品孔中，轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育60min。
S10：第二次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
S11：显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。
S12：终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
S13：测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后10分钟以内进行。
S14：计算：根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程，建议用专用计算软件进行计算，推荐使用ELISAcalc进行计算，拟合模型选用logistic曲线(四参数)。
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