CN114395568A - 一种猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建方法及其应用，本发明属于生物技术领域。该构建方法包括：以猪流行性腹泻病毒的基因组RNA反转录产物为模板，扩增F1、F2、F3、F4、F5、F6和F7片段；基于酵母内同源重组机制，将线性化的pYES1L载体和F1～F7片段混合、转化如酵母感受态细胞，从而实现病毒cDNA片段与原载体的一步无缝连接得到猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆质粒；基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，将病毒ORF3编码区替换成绿色荧光蛋白基因，构建表达绿色荧光蛋白的重组猪流行性腹泻病毒。本发明所述方法快速简便、成功率高，可用于拯救猪流行性腹泻病毒及其它冠状病毒，为研究该病毒的复制机制、致病机理以及开发新型疫苗提供可靠的技术平台。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建方法及其应用。
背景技术
猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)引起的一种急性和高度传染性的猪肠道疾病，临床症状与猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)相似，其特征是呕吐、腹泻和厌食，最后因消瘦和严重脱水死亡。各年龄段均可感染，其中仔猪感染后的临床症状尤为严重，死亡率接近100％。除了感染哺乳仔猪，PEDV还可降低育肥猪的生长性能。近年来，高致病性PEDV变异毒株的出现和广泛传播给养猪业造成了巨大的经济损失。除生物安全防控外，疫苗接种是防控猪流行性腹泻最有效的方法。但是，目前商品化的疫苗提供的保护有限，研制新一代疫苗仍然迫在眉睫。PEDV归属于套式病毒目、冠状病毒亚科、甲型冠状病毒属。它是一种囊膜包裹的单股正链RNA病毒，其全长基因组约28kb，包括5’端帽子结构和非编码区，3’端非编码区和poly(A)尾巴，以及7个开放阅读框(ORFs)，包括ORF1a、ORF1b、S、ORF3、E、M和N基因。5’端的ORF1a和ORF1b编码的两个多聚蛋白(pp1a和pp1ab)，3’端的5个ORF依次编码纤突蛋白(S)、ORF3蛋白、小包膜糖蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。有研究表明，ORF3为PEDV复制非必需元件，可被替换用于表达外源基因。
反向遗传操作***是一种定向改造和修饰病毒基因组的重要基因工程技术，该技术已成为病毒学基础研究和疫苗研发必不可少的技术平台。目前，PEDV反向遗传操作***主要包括以下三种：基于靶向RNA重组的技术、基于细菌人工染色体的感染性cDNA克隆、基于体外连接的感染性cDNA克隆等。根据病毒拯救方式不同，PEDV反向遗传操作***又可以分为RNA转染和DNA转染两类***。为简化PEDV感染性cDNA克隆的构建过程，本发明以基因II型的PEDV HM毒株为亲本株，基于酵母转化同源重组技术(Transformation AssociatedRecombination，TAR)构建了CMV启动的猪流行性腹泻病毒的反向遗传操作平台，并借助CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了表达绿色荧光蛋白的PEDV标记病毒。本发明为PEDV致病机制及其基因工程疫苗研制奠定了基础。
发明内容
发明目的：本发明需要解决的技术问题是提供一种猪流行性腹泻病毒的感染性cDNA克隆的构建方法，该构建方法简便、稳定好、效率高，该感染性克隆拯救的病毒rPEDV和rPEDV-EGFP感染Vero CCL-81细胞后能够引起细胞病变，生长特性与亲本病毒基本一致，且保持遗传稳定。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建方法，包括如下步骤：
(1)以猪流行性腹泻病毒的cDNA为模板、SEQ ID NO.：1～14所示的序列为引物，将猪流行性腹泻病毒生物基因组分为7个片段扩增出来；
(2)以pYES1L-vector为模板、SEQ ID NO.：15～16所示的序列为引物，扩增得到线性化载体pYES1L，所述pYES1L-vector的核苷酸序列如SEQ ID NO.：18所示；
(3)将线性化载体pYES1L与步骤(1)得到的7个基因组片段混和，加入到MaV203酵母感受态中，利用醋酸锂转化法转化至酵母细胞，接种于色氨酸(Trp)缺陷型平板上，经菌落PCR法筛选出阳性克隆，将阳性克隆的酵母裂解液转化DH10B电击感受态，获得重组质粒，即猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆。
作为优选，所述猪流行性腹泻病毒的基因组序列如SEQ ID NO.：17所示。
上述猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建方法构建得到的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆。
基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的表达绿色荧光蛋白的猪流行性腹泻病毒构建方法，包括以下步骤：
(4)以EGFP基因为模板，以SEQ ID NO.：19～20所示的序列为引物进行PCR扩增，得到EGFP基因片段；
(5)用Cas9 Nuclease和两条guide RNA切割权利要求1得到的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆，所述guide RNA的序列如SEQ ID NO.：21～22所示，得到缺失ORF3的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆骨架；
(6)将EGFP和缺失ORF3的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆骨架片段混合，进行体外同源重组，转化至DH10B电击感受态中，获得重组质粒，即表达绿色荧光蛋白的猪流行性腹泻病毒。
上述基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的表达绿色荧光蛋白的猪流行性腹泻病毒构建方法构建得到的表达绿色荧光蛋白的猪流行性腹泻病毒在本发明的保护范围之内。
上述猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆或表达绿色荧光蛋白的猪流行性腹泻病毒在拯救病毒中的应用。
进一步地，利用转染试剂LipofectamineTM 3000将权利要3猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆和辅助质粒共转染VeroCCL-81细胞，当出现典型细胞病变收取病毒上清，获得拯救的rPEDV。
作为优选，所述辅助质粒的构建方法如下：以猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆为模板、SEQ ID NO.17～18为引物，PCR扩增得到N基因片段，N基因片段***到pCAGGS载体的SacI和XhoI位点之间，得到辅助质粒。
下面以猪流行性腹泻病毒HM株为例对本发明的方法进行进一步说明。
猪流行性腹泻病毒HM株感染性cDNA克隆构建方法，包括以下步骤：
(1)以pYES1L载体为模板，用引物pYES1L-F和pYES1L-R进行PCR扩增，得到线性化的pYES1L载体；
(2)以猪流行性腹泻病毒HM株的病毒RNA的反转录产物为模板，用引物PEDV-F1和PEDV-R1扩增F1片段，用引物PEDV-F2和PEDV-R2扩增F2片段，用引物PEDV-F3和R3扩增F3片段，用引物PEDV-F4和PEDV-R4扩增F4片段，用引物PEDV-F5和PEDV-R5扩增F5片段，用引物PEDV-F6和PEDV-R6扩增F6片段，采用引物PEDV-F7和PEDV-R7扩增F7片段；
(3)将线性化载体pYES1L和F1～F7片段混和，导入酵母内进行同源重组，得到猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆质粒pYES1L-PEDV。
基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的表达绿色荧光蛋白的猪流行性腹泻病毒构建方法，包括以下步骤：
(7)以pEGFP-N1为模板，用引物PEDV-EGFP-F和PEDV-EGFP-R进行PCR扩增，得到EGFP基因片段；
(8)用Cas9 Nuclease和两条guide RNA(PEDV-sgRNA 1和PEDV-sgRNA 2)切割pYES1L-PEDV质粒，得到缺失ORF3的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆骨架；
(9)将EGFP和缺失ORF3的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆骨架片段混合，进行体外同源重组，转化至DH10B电击感受态中，获得重组质粒pYES1L-PEDV-EGFP。
本发明中，所述应用包括如下步骤：构建表达猪流行性腹泻病毒HM毒株N蛋白的辅助质粒，利用转染试剂LipofectamineTM 3000将感染性cDNA克隆质粒(pYES1L-PEDV或pYES1L-PEDV-EGFP)和辅助质粒共转染Vero CCL-81细胞，收获细胞培养物，获得拯救的感染性猪流行性腹泻病毒rPEDV或rPEDV-EGFP。
本发明中，所述辅助质粒是将猪流行性腹泻病毒N蛋白的编码基因克隆至pCAGGS载体，得到pCAGGS-PEDV-N辅助质粒。
有益效果：
与现有技术相比，本发明提供了一种快速、高效、稳定的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建方法，具有如下优势：
(1)本发明提供的感染性cDNA克隆构建方法具有高效、快速、稳定等特点。本发明将PEDV HM株基因组划分为7个片段，基于酵母同源重组的一步法完成克隆构建，解决了传统的酶切连接效率较低的问题，大大提高了效率。
(2)本发明提供的感染性cDNA克隆具有良好的稳定性。pYES1L载体含有酵母人工染色体和细菌人工染色体元件，在酵母和细菌中复制具有良好的稳定性，解决了冠状病毒部分复制酶基因在大肠杆菌中不能稳定保存的问题；同时在载体上游有巨细胞病毒(CMV)真核启动子序列，在下游有丁型肝炎病毒核酶(HDV Ribozyme)序列与牛生长激素多聚腺苷酸信号(BGH)转录终止序列，大大提高了病毒的拯救效率。
(3)本发明提供的感染性cDNA克隆可直接利用CRISPR/Cas9基因编辑在基因水平上改造猪流行性腹泻病毒基因组，提高了构建重组病毒的效率，为猪流行性腹泻病毒基因组建立了一个快速、有效的技术平台。
(4)本发明提供的感染性cDNA克隆直接转染哺乳动物细胞拯救重组病毒。本发明中的感染性cDNA克隆包含的CMV启动子可以在经DNA转染的细胞中启动病毒基因组RNA合成，避免了体外RNA转录合成过程，简化了病毒拯救操作流程，也解决了体外转录导致的转录本异质性的问题。
附图说明
图1为猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建示意图。
图2为猪流行性腹泻病毒HM株的基因组片段RT-PCR扩增的凝胶电泳图。
图3为猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆pYES1L-PEDV质粒的限制性内切酶酶切图谱。
图4为表达绿色荧光蛋白的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆pYES1L-PEDV-EGFP质粒的构建示意图。
图5为重组病毒的间接免疫荧光鉴定。
图6为感染性cDNA克隆拯救的病毒与亲本病毒的多步生长曲线。
图7为感染性cDNA克隆拯救的病毒与亲本病毒的空斑试验。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例1猪流行性腹泻病毒HM株感染性cDNA克隆质粒的构建
构建策略如图1所示。根据猪流行性腹泻病毒基因II型HM毒株全长基因组序列(Genbank登录号：MZ342899)，利用Snapgene软件设计7对特异性引物(见表1)分别RT-PCR扩增F1、F2、F3、F4、F5、F6和F7七个片段。
按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书提取PEDVHM株的病毒基因组RNA。以病毒基因组RNA为模板，按照
IV First-StrandcDNA Synthesis Reaction(Thermo Fisher Scientific)说明制备流行性腹泻病毒HM株cDNA。反应体系为：2μM gene-specific reverse primer(PEDV-R7、PEDV-R4或PEDV-R2)1μL，10μM dNTP Mix 1μL，模板RNA 11μL。反应程序为：65℃5min，置于冰上1min。之后反应体系为：5×SSIV Buffer 4μL，100mM DTT 1μL，Recombinant RNase Inhibitor 1μL，ReverseTranscriptase(200U/μL)1μL。反应程序为：50℃10min，80℃10min，将至室温。加入1μLRNase H，37℃20min去除RNA。
扩增F1和F2片段时，以cDNA(PEDV-R2)为模板，分别用两对引物PEDV-F1/PEDV-R1和PEDV-F2/PEDV-R2进行扩增；扩增F3和F4片段时，以cDNA(PEDV-R4)为模板，分别用两对引物PEDV-F3/PEDV-R3和PEDV-F4/PEDV-R4进行扩增；扩增F3和F4片段时，以cDNA(PEDV-R4)为模板，分别用两对引物PEDV-F3/PEDV-R3和PEDV-F4/PEDV-R4进行扩增；扩增F5、F6和F7片段时，以cDNA(PEDV-R7)为模板，分别用三对引物PEDV-F5/PEDV-R5、PEDV-F6/PEDV-R6和PEDV-F7/PEDV-R7进行扩增；反应体系为：cDNA 1μL，上游引物(40μM)和下游引物(40μM)各0.625μL，100mM dNTP Mix 1μL，5×Q5 Reaction Buffer 10μL，Q5 High Fidelity DNAPolymerase 0.5μL，ddH2O补至50μL。扩增程序为：98℃30s；98℃10s，58℃-63℃20s，72℃5min，循环30次；72℃2min。目的条带大小分别为4050bp，4122bp，4010bp，4803bp，3417bp，4305bp，3612bp，结果如图2所示。
以pYES1L-Vector(该质粒由本实验室保存)为模板，用引物pYES1L-F和pYES1L-R进行PCR扩增，获得线性化pYES1L载体。反应体系为：pYES1L-vector 10ng，上游引物(40μM)和下游引物(40μM)各0.625μL，100mM dNTP Mix 1μL，5×Q5 Rection Buffer 10μL，Q5High Fidelity DNA Polymerase 0.5μL，ddH2O补至50μL。扩增程序为：98℃30s；98℃10s，63℃20s，72℃5min，循环30次；72℃2min。目的条带大小应为10243bp。
将线性化的pYES1L载体与F1～F7片段混合，通过醋酸锂转化法转化至酵母菌中。具体操作为：各取100ng线性化载体pYES1L与上述片段F1，F2，F3，F4，F5，F6，F7均匀混合；随后从-80℃中取出MaV203酵母感受态细胞于30℃中解冻，时间不超过90s，将上述混合物加入MaV203酵母感受态细胞中，轻弹管壁使其混匀，随后加入600μL PEG/LiAc至DNA于酵母感受态的混合物中，轻柔上下颠倒混匀后置于30℃水浴中孵育30min，每隔10min轻柔上下颠倒重悬混合物；孵育结束后加入35.5μL的DMSO，轻柔上下颠倒混匀后置于42℃水浴中热激20min，每隔5min轻柔上下颠倒混匀；热激结束后1800rpm(200-400xg)离心5min，小心弃去上清，并用1mL 0.9％NaCl溶液重悬酵母细胞；取100μL涂于色氨酸缺陷的酵母培养皿中，30℃培养2-3天。由于线性化的pYES1L载体和片段F1、片段F1和片段F2、片段F2和片段F3、片段F3和片段F4、片段F4和片段F5、片段F5和片段F6、片段F6和片段F7、线性化的pYES1L载体和片段F7分别存在着末端同源臂，因此，在宿主细胞酵母内，通过同源重组机制组装成携带CPIV3全长cDNA的重组质粒。
挑取单菌落置于含15μL Lysis Buffer的PCR管中，轻轻吹打三次裂解酵母菌，转移5μL至一个新的PCR管中，4℃备用，其余10μL进行菌落PCR检测，筛选出阳性克隆，然后电转化至DH10B电击感受态中。通过Spectinomycin抗性筛选阳性重组子，增殖后通过质粒中量提取试剂盒纯化携带PEDV全长cDNA的重组质粒，命名为pYES1L-PEDV。
用限制性内切酶Mlu I对重组质粒进行酶切鉴定，经0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切图谱。基于Snapgene软件预测，酶切图谱应包含4002bp、7175bp，10559bp和16538bp四个片段，结果如图3所示。
实施例2基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建重组质粒pYES1L-PEDV-EGFP
构建策略如图4所示。基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，设计PEDV-sgRNA1和PEDV-sgRNA2(合成于南京金斯瑞生物科技有限公司，见表1)两条guide RNA用于切割pYES1L-PEDV中ORF3的两侧序列，获得缺失ORF3的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆载体骨架。具体操作为：将Cas9 Nuclease Buffer 5μL、PEDV-sgRNA 1(300nM)和PEDV-sgRNA 2(300nM)各3μL、Cas9 Nuclease3μL混合，37℃10min后加入重组质粒pYES1L-PEDV 3μg，37℃2h后，回收缺失ORF3的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆载体骨架。
以pEGFP-N1(Clontech)为模板，用引物EGFP-F和EGFP-R(见表1)进行PCR扩增，得到EGFP基因片段。
回收纯化后的载体骨架和EGFP片段，采用NEB公司的HiFi DNA Assembly MasterMix，通过体外同源重组的方法(参照试剂盒说明书操作)组装重组质粒，电转化DH10B电击感受态细胞，经菌落PCR法筛选出阳性克隆。
实施例3：辅助质粒的构建
针对PEDV中N基因的开放阅读框区域，利用Snapgene软件设计特异性引物PEDV-N-F和PEDV-N-R(见表1)，以pYES1L-PEDV为模板，进行PCR扩增，得到N基因片段。通过常规酶切连接试验，将回收纯化的N基因片段***到pCAGGS载体的SacI和XhoI位点之间，然后将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，经测序鉴定筛选出正确的重组质粒pCAGGS-PEDV-N。按照无内毒素质粒提取试剂盒的操作说明提取质粒，测定浓度后分装，于-20℃保存。
表1本发明所应用的引物序列
实施例4：猪流行性腹泻病毒HM株重组病毒及绿色荧光标记病毒的拯救与生物学特性鉴定
1.重组病毒的拯救与扩增
将Vero CCL-81细胞接种于12孔细胞培养板中，待细胞密度达到80％左右，按照Lipofectamine 3000转染试剂说明进行质粒转染，每孔的质粒用量为：感染性cDNA克隆质粒(重组质粒pYES1L-PEDV或pYES1L-PEDV-EGFP)2μg和辅助质粒pCAGGS-N 0.5μg。转染24h后，将细胞培养基换成含有10μg/mL的DMEM培养基。
待出现典型细胞病变时，收取细胞上清，获得拯救病毒rPEDV和rPEDV-EGFP。将拯救病毒在Vero CCL-81细胞连续传代，每一代培养物均置-80℃保存。
2.重组病毒的鉴定
2.1间接免疫荧光检测病毒N蛋白表达
将收取完病毒上清的细胞用4％多聚甲醛固定15min，待细胞完全变干后，加入0.1％Triton-X 100覆盖细胞打孔15min，弃去0.1％Triton-X 100后加入1％BSA覆盖细胞封闭30min，随后加入抗PEDV N蛋白的单克隆抗体，室温孵育1h，用PBS洗5次，再加入Alexa
488G conjugated oat Anti-Mouse IgG H&L二抗(购自Jackson immune researchInc)，用PBS洗5次，加入DAPI染色5min，PBS洗2次，用荧光显微镜观察并记录实验结果(图5)。
2.2RT-PCR鉴定
分别提取重组病毒(拯救病毒rPEDV-EGFP)RNA，用一步法RT-PCR试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)，使用引物PEDV-EGFP-F和PEDV-EGFP-R进行RT-PCR扩增。
1％琼脂糖凝胶电泳后回收片段，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，比较序列是否与设计的一致。结果：扩增的序列与病毒cDNA质粒序列一致。
3.生物学特性鉴定
3.1多步生长曲线
将Vero CCL-81细胞接种至24孔板中，置于含5％CO2的37℃培养箱中培养，待细胞密度达到100％进行感染。将PEDV HM、rPEDV P5和rPEDV-EGFP P5以0.01MOI分别感染VeroCCL-81细胞，每个病毒感染6个孔。分别于感染后0h、24h、48h和72h，收集两个孔的病毒上清，保存于-80℃备用。将收集的病毒上清分别进行10倍梯度稀释，把待感染的Vero CCL-81细胞用PBS洗2遍去除培养基中的血清，将稀释好的病毒液加入到96孔板中，每孔加入100μL，各稀释度的病毒设4个重复，孵育2h后弃去培养液，每孔加入100μL含有10μg/mL胰酶的DMEM培养基继续在37℃培养。逐日观察并记录病变，于感染后7天观察细胞病变并按照Reed-Muench方法计算TCID50，绘制病毒的生长曲线(如图6)。结果表明，与亲本病毒相比，重组病毒(rPEDV和rPEDV-EGFP)在细胞上的生长特性基本一致。但是，在感染后48h和72hrPEDV-EGFP的病毒滴度比亲本病毒低0.5log。
3.2病毒蚀斑试验
将Vero CCL-81细胞接种至12孔板中，置于含5％CO2的37℃培养箱中培养，待细胞密度达到100％进行感染。将PEDV HM、rPEDV P5和rPEDV-EGFP P5分别用DMEM培养基进行10倍梯度稀释，把待感染的细胞用PBS洗2遍去除培养基中的血清，将稀释好的病毒液加入到12孔板中，37℃、5％CO2的条件下孵育。感染2h后，弃去病毒液，将2×DMEM(含20μg/mL胰酶)和2％UltraPureTM LMP Agarose等比例混匀后加入12孔板中，待完全凝固后倒置于37℃、5％CO2培养箱中培养。感染3天后，用4％多聚甲醛固定过夜，第二天弃去4％多聚甲醛与凝胶，每孔加入300μL 1％结晶紫染色液，染色10min，弃去结晶紫溶液、用水清洗，干燥后拍照记录(如图7)。结果表明，三个病毒的空斑形态和大小没有显著差异。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆及其构建方法与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10243
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaggccggc atggtcccag cctcctcgct 60
ggcgccggct gggcaacatt ccgaggggac cgtcccctcg gtaatggcga atgggacctg 120
tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 180
aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 240
gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 300
aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcctcgccg cagttaatta 360
aagtcagtga gcgaggaagc gcgtaactat aacggtccta aggtagcgaa tcctgatgcg 420
gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atagatcggc aagtgcacaa 480
acaatactta aataaatact actcagtaat aacctatttc ttagcatttt tgacgaaatt 540
tgctattttg ttagagtctt ttacaccatt tgtctccaca cctccgctta catcaacacc 600
aataacgcca tttaatctaa gcgcatcacc aacattttct ggcgtcagtc caccagctaa 660
cataaaatgt aagctttcgg ggctctcttg ccttccaacc cagtcagaaa tcgagttcca 720
atccaaaagt tcacctgtcc cacctgcttc tgaatcaaac aagggaataa acgaatgagg 780
tttctgtgaa gctgcactga gtagtatgtt gcagtctttt ggaaatacga gtcttttaat 840
aactggcaaa ccgaggaact cttggtattc ttgccacgac tcatctccat gcagttggac 900
gatatcaatg ccgtaatcat tgaccagagc caaaacatcc tccttaagtt gattacgaaa 960
cacgccaacc aagtatttcg gagtgcctga actattttta tatgctttta caagacttga 1020
aattttcctt gcaataaccg ggtcaattgt tctctttcta ttgggcacac atataatacc 1080
cagcaagtca gcatcggaat ctagagcaca ttctgcggcc tctgtgctct gcaagccgca 1140
aactttcacc aatggaccag aactacctgt gaaattaata acagacatac tccaagctgc 1200
ctttgtgtgc ttaatcacgt atactcacgt gctcaatagt caccaatgcc ctccctcttg 1260
gccctctcct tttctttttt cgaccgaatt aattcttaat cggcaaaaaa agaaaagctc 1320
cggatcaaga ttgtacgtaa ggtgacaagc tatttttcaa taaagaatat cttccactac 1380
tgccatctgg cgtcataact gcaaagtaca catatattac gatgctgttc tattaaatgc 1440
ttcctatatt atatatatag taatgtcgtg atctatggtg cactctcagt acaatctgct 1500
ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac 1560
gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca 1620
tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac 1680
gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacggat cgcttgcctg 1740
taacttacac gcgcctcgta tcttttaatg atggaataat ttgggaattt actctgtgtt 1800
tatttatttt tatgttttgt atttggattt tagaaagtaa ataaagaagg tagaagagtt 1860
acggaatgaa gaaaaaaaaa taaacaaagg tttaaaaaat ttcaacaaaa agcgtacttt 1920
acatatatat ttattagaca agaaaagcag attaaataga tatacattcg attaacgata 1980
agtaaaatgt aaaatcacag gattttcgtg tgtggtcttc tacacagaca aggtgaaaca 2040
attcggcatt aatacctgag agcaggaaga gcaagataaa aggtagtatt tgttggcgat 2100
ccccctagag tcttttacat cttcggaaaa caaaaactat tttttcttta atttcttttt 2160
ttactttcta tttttaattt atatatttat attaaaaaat ttaaattata attattttta 2220
tagcacgtga tgaaaaggac ccaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 2280
tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 2340
aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 2400
ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 2460
aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggac gcgtagtcta gaccagccag gacagaaatg 2520
cctcgacttc gctgctaccc aaggttgccg ggtgacgcac accgtggaaa cggatgaagg 2580
cacgaaccca gtggacataa gcctgttcgg ttcgtaagct gtaatgcaag tagcgtatgc 2640
gctcacgcaa ctggtccaga accttgaccg aacgcagcgg tggtaacggc gcagtggcgg 2700
ttttcatggc ttgttatgac tgtttttttg gggtacagtc tatgcctcgg gcatccaagc 2760
agcaagcgcg ttacgccgtg ggtcgatgtt tgatgttatg gagcagcaac gatgttacgc 2820
agcagggcag tcgccctaaa acaaagttaa acattatgag ggaagcggtg atcgccgaag 2880
tatcgactca actatcagag gtagttggcg ccatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc 2940
tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg 3000
atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg 3060
accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca 3120
ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat 3180
ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca 3240
ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag 3300
cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa 3360
ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta 3420
cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg 3480
ccggctgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctagac 3540
aggcttatct tggacaagaa gaagatcgct tggcctcgcg cgcagatcag ttggaagaat 3600
ttgtccacta cgtgaaaggc gagatcacca aggtagtcgg caaataaccc tcgagcattc 3660
aaggcgcctt gattatttga cgtggtttga tggcctccac gcacgttgtg atatgtagat 3720
gataatcatt atcactttac gggtcctttc cggtgatccg acaggttacg gggcggcgac 3780
ctcgcgggtt ttcgctattt atgaaaattt tccggtttaa ggcgtttccg ttcttcttcg 3840
tcataactta atgtttttat ttaaaatacc tcgcgagtgg caacactgaa aatacccatg 3900
gagcggcgta accgtcgcac aggaaggaca gagaaagcgc ggatctggga agtgacggac 3960
agaacggtca ggacctggat tggggaggcg gttgccgccg ctgctgctga cggtgtgacg 4020
ttctctgttc cggtcacacc acatacgttc cgccattcct atgcgatgca catgctgtat 4080
gccggtatac cgctgaaagt tctgcaaagc ctgatgggac ataagtccat cagttcaacg 4140
gaggtctaca cgaaggtttt tgcgctggat gtggctgccc ggcaccgggt gcagtttgcg 4200
atgccggagt ctgatgcggt tgcgatgctg aaacaattat cctgagaata aatgccttgg 4260
cctttatatg gaaatgtgga actgagtgga tatgctgttt ttgtctgtta aacagagaag 4320
ctggctgtta tccactgaga agcgaacgaa acagtcggga aaatctccca ttatcgtaga 4380
gatccgcatt attaatctca ggagcctgtg tagcgtttat aggaagtagt gttctgtcat 4440
gatgcctgca agcggtaacg aaaacgattt gaatatgcct tcaggaacaa tagaaatctt 4500
cgtgcggtgt tacgttgaag tggagcggat tatgtcagca atggacagaa caacctaatg 4560
aacacagaac catgatgtgg tctgtccttt tacagccagt agtgctcgcc gcagtcgagc 4620
gacagggcga agccctcgag tgagcgagga agcaccaggg aacagcactt atatattctg 4680
cttacacacg atgcctgaaa aaacttccct tggggttatc cacttatcca cggggatatt 4740
tttataatta ttttttttat agtttttaga tcttcttttt tagagcgcct tgtaggcctt 4800
tatccatgct ggttctagag aaggtgttgt gacaaattgc cctttcagtg tgacaaatca 4860
ccctcaaatg acagtcctgt ctgtgacaaa ttgcccttaa ccctgtgaca aattgccctc 4920
agaagaagct gttttttcac aaagttatcc ctgcttattg actctttttt atttagtgtg 4980
acaatctaaa aacttggcac acttcacatg gatctgtcat ggcggaaaca gcggttatca 5040
atcacaagaa acgtaaaaat agcccgcgaa tcgtccagtc aaacgacctc actgaggcgg 5100
catatagtct ctcccgggat caaaaacgta tgctgtatct gttcgttgac cagatcagaa 5160
aatctgatgg caccctacag gaacatgacg gtatctgcga gatccatgtt gctaaatatg 5220
ctgaaatatt cggattgacc tctgcggaag ccagtaagga tatacggcag gcattgaaga 5280
gtttcgcggg gaaggaagtg gttttttatc gccctgaaga ggatgccggc gatgaaaaag 5340
gctatgaatc ttttccttgg tttatcaaac gtgcgcacag tccatccaga gggctttaca 5400
gtgtacatat caacccatat ctcattccct tctttatcgg gttacagaac cggtttacgc 5460
agtttcggct tagtgaaaca aaagaaatca ccaatccgta tgccatgcgt ttatacgaat 5520
ccctgtgtca gtatcgtaag ccggatggct caggcatcgt ctctctgaaa atcgactgga 5580
tcatagagcg ttaccagctg cctcaaagtt accagcgtat gcctgacttc cgccgccgct 5640
tcctgcaggt ctgtgttaat gagatcaaca gcagaactcc aatgcgcctc tcatacattg 5700
agaaaaagaa aggccgccag acgactcata tcgtattttc cttccgcgat atcacttcca 5760
tgacgacagg atagtctgag ggttatctgt cacagatttg ggggtggttc gtcacatttg 5820
ttctgaccta ctgagggtaa tttgtcacag ttttgctgtt tccttcagcc tgcatggatt 5880
ttctcatact ttttgaactg taatttttaa ggaagccaaa tttgagggca gtttgtcaca 5940
gttgatttcc ttctctttcc cttcgtcatg tgacctgata tcgggggtta gtttgtcatc 6000
attgatgagg gttgattatc acagtttatt actctgaatt ggctatccgc gtgtgtacct 6060
ctacctggag tttttcccac ggtggatatt tcttcttgcg ctgagcgtaa gagctatctg 6120
acagaacagt tcttctttgc ttcctcgcca gttcgctcgc tatgctcggt tacacggctg 6180
cggcgagcgc tagtgataat aagtgactga ggtatgtgct cttcttatct ccttttgtag 6240
tgttgctctt attttaaaca actttgcggt tttttgatga ctttgcgatt ttgttgttgc 6300
tttgcagtaa attgcaagat ttaataaaaa aacgcaaagc aatgattaaa ggatgttcag 6360
aatgaaactc atggaaacac ttaaccagtg cataaacgct ggtcatgaaa tgacgaaggc 6420
tatcgccatt gcacagttta atgatgacag cccggaggcg aggaaaataa cccggcgctg 6480
gagaataggt gaagcagcgg atttagttgg ggtttcttct caggctatca gagatgccga 6540
gaaagcaggg cgactaccgc acccggatat ggaaattcga ggacgggttg agcaacgtgt 6600
tggttataca attgaacaaa ttaatcatat gcgtgatgtg tttggtacgc gattgcgacg 6660
tgctgaagac gtatttccac cggtgatcgg ggttgctgcc cataaaggtg gcgtttacaa 6720
aacctcagtt tctgttcatc ttgctcagga tctggctctg aaggggctac gtgttttgct 6780
cgtggaaggt aacgaccccc agggaacagc ctcaatgtat cacggatggg taccagatct 6840
tcatattcat gcagaagaca ctctcctgcc tttctatctt ggggaaaagg acgatgtcac 6900
ttatgcaata aagcccactt gctggccggg gcttgacatt attccttcct gtctggctct 6960
gcaccgtatt gaaactgagt taatgggcaa atttgatgaa ggtaaactgc ccaccgatcc 7020
acacctgatg ctccgactgg ccattgaaac tgttgctcat gactatgatg tcatagttat 7080
tgacagcgcg cctaacctgg gtatcggcac gattaatgtc gtatgtgctg ctgatgtgct 7140
gattgttccc acgcctgctg agttgtttga ctacacctcc gcactgcagt ttttcgatat 7200
gcttcgtgat ctgctcaaga acgttgatct taaagggttc gagcctgatg tacgtatttt 7260
gcttaccaaa tacagcaata gtaatggctc tcagtccccg tggatggagg agcaaattcg 7320
ggatgcctgg ggaagcatgg ttctaaaaaa tgttgtacgt gaaacggatg aagttggtaa 7380
aggtcagatc cggatgagaa ctgtttttga acaggccatt gatcaacgct cctcaactgg 7440
tgcctggaga aatgctcttt ctatttggga acctgtctgc aatgaaattt tcgatcgcct 7500
gattaaacca cgctgggaga ttagataatg aagcgtgcgc ctgttattcc aaaacatacg 7560
ctcaatactc aaccggttga agatacttcg ttatcgacac cagctgcccc gatggtggat 7620
tcgttaattg cgcgcgtagg agtaatggct cgcggtaatg ccattacttt gcctgtatgt 7680
ggtcgggatg tgaagtttac tcttgaagtg ctccggggtg atagtgttga gaagacctct 7740
cgggtatggc caggtaatga acgtgaccag gagctgctta ctgaggacgc actggatgat 7800
ctcatccctt cttttctact gactggtcaa cagacaccgg cgttcggtcg aagagtatct 7860
ggtgtcatag aaattgccga tgggagtcgc cgtcgtaaag ctgctgcact taccgaaagt 7920
gattatcgtg ttctggttgg cgagctggat gatgagcaga tggctgcatt atccagattg 7980
ggtaacgatt atcgcccaac aagtgcttat gaacgtggtc agcgttatgc aagccgattg 8040
cagaatgaat ttgctggaaa tatttctgcg ctggctgatg cggaaaatat ttcacgtaag 8100
attattaccc gctgtatcaa caccgccaaa ttgcctaaat cagttgttgc tcttttttct 8160
caccccggtg aactatctgc ccggtcaggt gatgcacttc aaaaagcctt tacagataaa 8220
gaggaattac ttaagcagca ggcatctaac cttcatgagc agaaaaaagc tggggtgata 8280
tttgaagctg aagaagttat cactctttta acttctgtgc ttaaaacgtc atctgcatca 8340
agaactagtt taagctcacg acatcagttt gctcctggag cgacagtatt gtataagggc 8400
gataaaatgg tgcttaacct ggacaggtct cgtgttccaa ctgagtgtat agagaaaatt 8460
gaggccattc ttaaggaact tgaaaagcca gcaccctgat gcgaccacgt tttagtctac 8520
gtttatctgt ctttacttaa tgtcctttgc tacaggccag aaagcataac tggcctgaat 8580
attctctctg ggcccactgt tccacttgta tcgtcggact gataatcaga ctgggaccac 8640
ggtcccactc gtatcgtcgg tctgattatt agtctgggac cacggtccca ctcgtatcgt 8700
cggtctgatt attagtctgg gaccacggtc ccactcgtat cgtcggtctg ataatcagac 8760
tgggaccacg gtcccactcg tatcgtcggt ctgattatta gtctgggacc atggtcccac 8820
tcgtatcgtc ggtctgatta ttagtctggg accacggtcc cactcgtatc gtcggtctga 8880
ttattagtct ggaaccacgg tcccactcgt atcgtcagtc tgattattag tctgggacca 8940
cggtcccact cgtatcgtcg gtctgattat tagtctggga ccacgatccc actcgtgttg 9000
tcggtctgat tatcggtctg ggaccacggt cccacttgta ttgtcgatca gactatcagc 9060
gtgagactac gattccatca atgcctgtca agggcaagta ttgacatgtc gtcgtaacct 9120
gtagaacgga gtaacctcgg tgtgcggttg tatgcctgct gtggattgct gctgtgtcct 9180
gcttatccac aacattttgc gcacggttat gtggacaaaa tacctggtta cccaggccgt 9240
gccggcacgt taaccgggct gcatccgatg caagtgtgtc gctgtcgacg gcctcctcac 9300
ccggtcacgt gagctcattt aacccactcc acaaaaaggc tcaacaggtt ggtggttctc 9360
accaccaaaa gcaccacacc ccacgcaaaa acaagttttt gctgattttt ctttataaat 9420
agagtgttat gaaaaattag tttctcttac tctctttatg atatttaaaa aagcggtgtc 9480
ggcgcggcta caacaacgcg ccgacaccgt tttgtagggg tggtactgac tatttttata 9540
aaaaacatta ttttatatta ggggtgctgc tagcggcgcg gtgtgttttt ttataggata 9600
ccgctagggg cgctgctagc ggtgcgtccc tgtttgcatt atgaattagt tacgctaggg 9660
ataacagggt aatatagaac ccgaacgacc gagcgcagcg gcggccgcgc tgataccgcc 9720
gccgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 9780
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 9840
caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 9900
ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 9960
tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 10020
accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg 10080
ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa 10140
cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt 10200
gtacggtggg aggtctatat aagcagagct tgagctctaa tag 10243
<210> 2
<211> 28064
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acttaaaaga ttttctatct acggatagtt agctctttct ctagactctt gtctactcaa 60
ttcaactaaa cgaaattttg tccttccagt cgcatgtcta tgctgctgga agctgacgtg 120
gaatttcatt aggtttgctt aagtagccat cgcaagtgct gtgctgtcct ctagttcctg 180
gttggcgttc cgtcgccttc tacatactag acaaacagcc ttcctccggt tccgtctggg 240
ggttgtgtgg ataactagtt ccgtctagtt tgaaaccagt aactgtcggc tatggctagc 300
aaccatgtta cattggctgt tgccaatgat gcagaaattt cagcctttgg cttttgcact 360
gctagtgaag ccgtctcata ctattctgag gccgccgcta gtggatttat gcaatgccgt 420
ttcgtgtcct tcgatctcgt tgacactgtt gagggattgc ttcccgaaga ctatgtcatg 480
gttgtggtcg gcactaccaa gcttagtgcg tatgtggaca cttttggtag ccgccccaga 540
aacatctgtg gttggctatt attttctaac tgtaattact tcctcgaaga gttagagctc 600
acttttggtc gtcgtggtgg taacatcgtg ccagttgatc aatacatgtg tggtgctgac 660
gggaaacctg ttcttcagga atccgagtgg gagtatacag acttctttgc tgactccgag 720
gacggtcaac tcaacattgc tgggatcact tatgtgaagg cctggattgt agagagatcg 780
gatgtctctt atgcgagtca gaatttaaca tctattaaat ctattactta ttgttcaacc 840
tatgagcata cttttcctga tggtaccgcc atgaaggttg cacgtaatcc aaagatcaag 900
aagaatgttg tcttgtctga gtcacttgct actatctaca gggaaattgg ttctcctttt 960
gtggataatg ggagcgatgc tcgttctatc attaagagac cagtgttcct ccacgctttt 1020
gttaagtgta agtgtggtag ttatcattgg actgttggtg attggacctc ctatgtctcc 1080
acctgctgtg gctttaagtg caagccagtc cttgtggctt catgctctgc tacgcctggt 1140
tctgttgtgg ttacgcgcgc tggtgctggc actggtgtta agtattacaa caacatgttc 1200
ctgcgccatg tggcagacat tgatgggttg gcattctggc gaattcttaa ggtgcagtcc 1260
aaagacgacc tcgcttgctc tggtaaattc cttgaacacc atgaggaagg tttcacagat 1320
ccttgctact ttttgaatga ctcgagcatt gctactaagc tcaagtttga catccttagt 1380
ggcaagtttt ctgatgaagt caaacaagct atctttgctg gtcatgttgt tgttggcagt 1440
gcgctcgttg acattgttga cgatgcactg ggacaacctt ggtttatacg taagcttggt 1500
gaccttgcaa gtgcagcctg ggagcagctt aaggctgtcg ttagaggcct taacctcctg 1560
tctgatgaag tcgtgctctt tggcaaaaga cttagctgtg ccactcttag tatcgttaac 1620
ggtgtttttg agtttgtcgc cgaagtgcca gagaagttgg ctgcggccgt tacagttttt 1680
gtcaacttct tgaatgagct ttttgagtct gcctgtgact gtttaaaggt cggaggtaaa 1740
acctttaaca gggttggctc ttatgttctt tttgacaatg cattggttaa gcttgtcaag 1800
gcaaaagttc gcggcccacg acaggcaggt gtttgtgaag ttcgttacac aagccttgtt 1860
attgggagta ctaccaaggt ggtttccaag cgcgttgaaa atgccaatgt gaatctcatc 1920
gtcgttgacg aggatgtgac cctcaacacc actggtcgta cagttgttgt tgatggactt 1980
gcattcttcg agagtgacgg gttttacaga catcttgctg atgctgacgt tgtcattgaa 2040
catcctgttt ataagtctgc ttgtgagctc aagccagtct ttgagtgtga cccaatacct 2100
gattttccca tgcctgtggc cgctagtgtt gcagagcttt gtgtgcaaac tgatctgttg 2160
cttaaaaatt acaacactcc ttataaaact tacagctgcg tggtgagagg tgataagtgt 2220
tgcattactt gcaccttaca tttcacagca ccaagttata tggaggatgc tgctaatttt 2280
gtagacctct gtaccaagaa cattggtact gctggttttc atgagtttta cattacggcc 2340
catgaacaac agaatctgca agggttcgta accacttgtt gcacgatgtc aggttttgag 2400
tgttttatgc ctataatccc acagtgtcca gcagtgcttg aagagattga tggtggtagc 2460
atctggcggt cttttatcac tggtcttaat acaatgtggg atttttgcaa gcatcttaaa 2520
gtcagctttg gactagatgg cattgttgtc actgtagcac gcaaatttaa acgacttggt 2580
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gagaatttta aagtctttct taactgtgtt caccctgttg taccacgcgt cattgaaact 2820
tcttttgtgg aattagaaga gacgacattt aaaccaccag cactcaatgg tagtattgct 2880
attgttgatg gctttgcttt ctattatgat ggaacactat actatcccac cgatggtaat 2940
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gtttctgtta aaaccattga cccagtttat aaggtctccc ttgaatttga gttcgagtct 3060
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tgggacgatg ttgttgagta tatcaacgtt gccattgagg ttcttaaaga tcacatcgat 3180
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actactcctg tccaggaaga tgttcaacaa gtttcacaaa aaccagtttt gcctaatttt 4740
gaacctttca ggattgaagg tgctcatgct ttctatgagt gtaaccctga aggtttgatg 4800
tccttaggtg ctgacaagct ggtgttgttt acaaattcca ctttggattt ttgtagcgtt 4860
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tctattacta tggtagtatt gccagctgat ggtgatgcta attatgacaa aaattatgca 5040
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gtggagcgtt tctacgcaaa taagagtgtg gttattaaag tcactgagga tacacgtagt 5220
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accacagata ataactgttg ggttaatgtt acatgtttac aattacagtt tgctagattt 5520
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gacaaagttg ttgtagttaa aggtactaca attgttgtca atgttggaaa acctgtggtg 5880
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ggtgttgtcg gccattatac tgtttttgat catgacactg gtatggtgta tgatggagat 6000
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ttacatagtg cttttgttag tgtgttgtcg aatagtttcg gcaaagacct gtcaagttgt 7440
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aattttacca ccagttatgc aaaaccagag gaaaaatttc ccgtccatga cattgccacg 7620
tgtatgcgtg taggtgccaa gattgttaat cataacgttc ttgtcaagga tagtatacct 7680
gtggtgtggc tcgtacgtga tttcattgcc ctttcggaag aaactaggaa gtacattatt 7740
cgtacgacta aagttaaggg tataacattt atgctgacct ttaatgattg tcgtatgcat 7800
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aaggttaaga aattcttttg gtttttgtgt ctattcatag ttgctgtttt ctttgcacta 7920
agctttcttg attttagtat tcaggttagc agtgatagcg attatgattt caagtatatt 7980
gagagtggcc agttgaagac ttttgacaat ccacttagtt gtgtgcataa tgtctttagt 8040
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cctatagttg ttggtgtatc agacgaagct cgcactgttc caggtatccc agcaggtgtt 8160
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gatagattct ttgtctataa tgcagactct ggttctgact ttgtttgtgg cacggggctc 8580
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cagataaagg ttaatcaaaa caatgtccac acgcctaagt acacctatcg cacagttaga 9600
ccgggtgaat cttttaatat cttggcgtgc tatgatggtt ctgcagctgg tgtttatggc 9660
gttaacatgc gctctaatta cactattaga ggctcgttca ttaatggcgc ttgtggttca 9720
cctggttata atattaacaa tggtaccgtt gagttttgct atttacacca gctcgaactt 9780
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ttgaggtttc ctacttttgt ggctattttt ggtgatatta agagtgttat gttttgttac 10800
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tttctgacta caggttggca aatgatgtca aggactcatt gcgtctgttt gcagcggaaa 15780
ccatcaaggc caaggaggag agcgttaagt catcctacgc ttgtgcaaca ctacatgagg 15840
ttgtaggacc taaagagttg ttgctcaaat gggaagtcgg cagacccaaa ccacccctta 15900
atagaaattc ggttttcact tgttatcata taacgaagaa caccaaattt caaattggtg 15960
agtttgtgtt tgagaaggca gaatatgata atgatgctgt aacatataaa actaccgcca 16020
caacaaaact tgttcctggc atggtttttg tgcttacctc acataatgtt cagccattgc 16080
gtgcaccaac cattgctaat caagaacgtt attccactat acataagttg catcctgctt 16140
ttaacatacc tgaagcttat tctagcttag tgccctatta ccaattgatc ggtaagcaga 16200
agattacaac tatccaggga cctcccggta gtggtaaatc tcactgcgtc atagggctag 16260
gtttgtacta tccaggtgca cgtatagtgt ttacagcttg ttctcatgca gcggtcgatt 16320
cactttgtgt gaaagcctcc actgcttata gcaatgacaa atgttcacgc atcataccac 16380
agcgcgctcg tgttgagtgt tatgacggtt tcaagtctaa taatactagt gctcagtacc 16440
ttttttccac tgtaaacgct ttgccagagt gcaatgcgga cattgttgtg gtggatgagg 16500
tctctatgtg cactaattac gacttgtctg tcataaatca gcgcatcagc tataggcatg 16560
tagtctatgt tggtgaccct caacagctgc ccgcaccacg tgttatgatt tcccgtggca 16620
ctttggaacc aaaggactac aacgttgtca ctcaacgcat gtgtgccctt aagcctgatg 16680
ttttcttgca taagtgttat cgctgtcctg ctgagatagt gcgtactgtg tctgagatgg 16740
tttacgaaaa ccaattcatt cctgttcacc tagatagcaa gcagtgtttt aaaatctttt 16800
gcaagggtaa tgttcaggtg gagaatggtt caagcattaa tcgcaggcaa ttggatgttg 16860
tgcgtatgtt tttggctaaa aaccctaggt ggtcaaaggc tgtttttatt tctccttata 16920
acagccagaa ttatgttgcc agccgcatgc taggtttaca aattcagaca gttgactcat 16980
cccagggtag tgagtatgac tatgtcattt atacacaaac ttcagatact gcccatgcct 17040
gtaatgttaa caggtttaat gttgccatca caagggctaa gaaaggcata ttatgtataa 17100
tgtgcgatag gtcccttttt gatgtgctta aattttttga gcttaaattg tctgatttgc 17160
aggctaatga gggttgtggt ctttttaaag actgtagcag aggtgatgat ctgttgccac 17220
catctcacgc taataccttc atgtctttag cggacaattt taagactgat caagatcttg 17280
ctgttcaaat aggtgttaat ggacccatta agtatgagca tgttatctcg tttatgggct 17340
tccgttttga tatcaacata cccaaccatc acactctctt ttgcacacgc gattttgcca 17400
tgcgcaatgt tagaggttgg ttgggttttg acgttgaagg agcacatgtt gttggctcta 17460
acgtcggtac aaatgtccca ttgcaattag ggttttctaa cggtgttgat tttgttgtca 17520
gacctgaagg ttgcgttgta actgagtctg gtgactacat taaacccgtc agagctcgtg 17580
ctccaccagg ggaacaattt gcacaccttt tgcctctact taaacgcggc caaccatggg 17640
atgtggttcg taagcgtata gtgcaaatgt gtagtgacta cctggccaac ctatcagaca 17700
tactaatttt tgtgttgtgg gctggtggtt tggagttgac aactatgcgt tattttgtca 17760
agattggacc aagtaagagt tgtgattgtg gtaaggttgc tacttgttac aatagtgcgc 17820
tgcatacgta ctgttgtttc aaacatgccc ttggttgtga ttacctgtac aatccatact 17880
gtattgatat acagcagtgg ggatacaagg gatcacttag ccttaaccac catgagcatt 17940
gtaatgtaca tagaaacgag catgtggctt ctggtgatgc cataatgact cgctgtctgg 18000
ccatacatga ttgctttgtc aagaacgttg actggtccat cacataccca tttattggta 18060
atgaggctgt tattaataag agcggccgaa ttgtgcaatc acacaccatg cggtcagttc 18120
ttaagttata caatccgaaa gccatatatg atattggcaa tcctaagggc attagatgtg 18180
ccgtaacgga tgctaagtgg ttttgctttg acaagaatcc tactaattct aatgtcaaga 18240
cattggagta tgactatata acacatggcc aatttgatgg gttgtgcttg ttttggaatt 18300
gcaatgtaga catgtatcca gaattttctg tggtctgtcg ttttgacact cgctgtaggt 18360
caccactcaa cttggagggt tgtaatggtg gttcactgta tgttaataat catgcattcc 18420
atacaccggc ttttgacaag cgtgcttttg ctaagttgaa gccaatgcca tttttctttt 18480
atgatgatac tgagtgtgac aagttacagg actccataaa ctatgttcct cttagggcta 18540
gtaactgcat tactaaatgt aatgttggtg gagctgtctg tagtaagcat tgtgctatgt 18600
atcatagcta tgttaatgct tacaacactt ttacgtcggc gggctttact atttgggtgc 18660
ctacttcgtt tgacacctat aatctgtggc agacatttag taacaatttg caaggtcttg 18720
agaacattgc tttcaatgtc gtaaagaaag gatcttttgt tggtgccgaa ggtgaacttc 18780
ctgtagctgt ggttaatgac aaagtgctcg ttagagatgg tactgttgat actcttgttt 18840
ttacaaacaa gacatcacta cccactaacg tagcttttga gttgtatgcc aagcgtaagg 18900
taggactcac cccacccatt acgatcctac gtaacttggg tgtagtttgt acatctaagt 18960
gtgtcatttg ggactatgaa gccgaacgtc cacttactac ttttacaaag gatgtttgta 19020
aatataccga ctttgagggt gacgtctgta cactctttga taacagcatt gttggttcat 19080
tagagcgatt ctctatgacc caaaatgctg tgcttatgtc acttacagcc gttaaaaagc 19140
ttactggcat aaagttaact tatggttatc ttaatggtgt cccagttaac acacatgaag 19200
ataaaccttt tacttggtat atttacacta ggaagaacgg caaattcgag gactatcctg 19260
atggctattt tacccaaggt agaacaaccg ctgattttag ccctcgtagc gatatggaaa 19320
aggacttcct aagtatggat atgggtctgt ttattaacaa gtacggactt gaagattacg 19380
gctttgagca cgttgtgtat ggtgatgttt caaaaaccac ccttggtggt ttacatctac 19440
taatttcgca ggtgcgtctg tcctgtatgg gtgtgcttaa aatagacgag tttgtgtcta 19500
gtaatgatag cacgttaaag tcctgtactg ttacatatgc tgataaccct agtagtaaga 19560
tggtttgcac gtatatggat ctcctgcttg acgattttgt cagcattctt aaatcgttgg 19620
atttgagcgt tgtatctaaa gttcatgaag ttatggtcga ttgtaaaatg tggaggtgga 19680
tgttgtggtg taaggatcat aaactccaga cattttatcc gcaacttcag gccagtgaat 19740
ggaagtgtgg ttattccatg ccttctattt acaagataca acgtatgtgt ttagaacctt 19800
gcaatctcta taactatggc gctggtatta agttacctga tggcattatg tttaacgtag 19860
ttaaatacac acagctttgt caatatctca atagcaccac aatgtgtgta ccccatcaca 19920
tgcgtgtgct acatcttggt gctggctccg ataagggtgt tgcacctggc acggctgtct 19980
tacgacgttg gttgccactg gatgccatta tagttgacaa tgatagtgtg gattacgtta 20040
gcgatgctga ttatagtgtt acaggagatt gctctacctt atacctgtca gataagtttg 20100
acttagttat atctgatatg tatgatggta agattaaaag ttgtgatggg gagaacgtgt 20160
ctaaagaagg cttctttccc tatattaatg gtgtcatcac tgaaaagttg gcacttggtg 20220
gtactgtggc tattaaggtg acggagttta gttggaataa gaagttgtat gaactcattc 20280
agaagtttga gtattggaca atgttctgta ccagtgttaa cacgtcatcg tcagaggcat 20340
ttttaattgg tgttcactat ttaggtgatt ttgcaagtag cgctgttatt gatggcaaca 20400
ctatgcatgc caattatatc ttctggcgta attccacaat tatgactatg tcttacaata 20460
gtgtacttga tttaagcaag ttcaattgta agcataaggc tacagttgtt attaatttaa 20520
aggattcatc cattagtgat gttgtgttag gtttgttgaa gaatggtaag ttgctagtgc 20580
gtaataatga cgccatttgt ggtttttcta atcatttggt caacgtaaac aaatgaagtc 20640
tttaacttac ttctggttgt tcttaccagt actttcaaca cttagcctac cacaagatgt 20700
caccaggtgc tcagctaaca ctaattttag gcggttcttt tcaaaattta atgttcaggc 20760
gcctgcagtt gttgtactgg gcggttatct acctattggt gaaaaccagg gtgttaattc 20820
aacttggtac tgtgctggcc aacatccaac tgctagtggc gttcatggta tctttcttag 20880
ccatattaga ggtggtcatg gctttgagat tggcatttcg caagagcctt ttgaccctag 20940
tggttaccag ctttatttac ataaggctac taatggtaac actaatgcta ctgcgcgatt 21000
gcgcatttgc cagtttccca gcattaaaac attgggcccc actgctgata acgatgttac 21060
aacaggtcgt aactgcctat ttaacaaagc catcccagct catatgagtg aacatagtgt 21120
tgtcggcata acatgggata atgatcgtgt cactgtcttt tctgacaaga tctatcattt 21180
ttattttaaa aatgattggt cccgtgttgc gacaaagtgt tacaacagtg gaggttgtgc 21240
tatgcaatat gtttacgaac ccacttacta catgcttaat gttactagtg ctggtgagga 21300
tggtatttct tatcaacact gtacagctaa ttgcattggt tatgctgcca atgtatttgc 21360
tactgagccc aatggccaca taccagaagg ttttagtttt aataattggt ttcttttgtc 21420
caatgattct actttggtgc atggtaaggt ggtttccaac caaccattgt tggtcaattg 21480
tcttttggcc atgcctaaga tttatggact aggccaattt ttctccttca atcaaacgat 21540
cgatggtgtt tgtaatggag cttctgcgca gcgtgcacca gaggctctga ggtttaatat 21600
taatgatacc tctgtcattc ttgctgaagg ctcaattgta cttcatactg ctttaggaac 21660
aaatttttct tttgtttgca gtaattcttc agatcctcat ttagctacct tcaccatacc 21720
tctgggtgcc acccaagtac cctattattg ttttcttaaa gtggatactt acaactccac 21780
tgtttataaa ttcttggctg ttttacctcc taccgtcagg gaaattgtca tcaccaagta 21840
cggtgatgtt tatgtcaatg ggtttggcta cttgcatctc ggtttgttgg atgctgttac 21900
aattaatttc actggtcatg gcactgacga tgacgtttct ggtttttgga ccatagcatc 21960
gactaatttt gttgatgcac ttattgaagt tcaaggaact gccattcagc gtattcttta 22020
ttgtgatgat cctgttagcc aacttaagtg ttctcaggtt gcttttgacc ttgacgatgg 22080
tttttaccct atttcctcta caaaccttct gagtcatgaa cagccaactt cttttgttac 22140
tttgccatca tttaatgatc attcttttgt taatattact gtctctgctg cttttggcgg 22200
tcatagtggt gccaacctta ttgcatctga cactactatc aatgggttta gttctttctg 22260
tgttgatact agacaattta ccatttcact gttttataac gttacaaaca gttatggtta 22320
cgtgtctaaa tcacaggaca gtaattgccc ttttaccttg caatctgtta atgattacct 22380
gtcttttagc aaattttgtg tttctaccag ccttttggct agtgcttgta ccatagatct 22440
ttttggttac cctgagtttg gtagtggtgt taagttcacg tccctttact ttcaattcac 22500
aaagggtgag ttgattactg gcacgcctaa accacttgaa ggtgttacgg acgtttcttc 22560
tatgactctg gatgtgtgta ccaagtatac tatctatggc tttaaaggtg agggtattat 22620
tacccttaca aattctagtt ttttggcagg tgtttattac acatctgatt ctggacagtt 22680
gttagctttt aagaatgtca ctagtgatgc tgtttattct gttacgccat gttctttttc 22740
agagcaggct gcatatgttg atgatgatat agtgggtgtt atttctagtt tgtctagctc 22800
cacttttaac agtactaggg agttgcctgg tttcttctac cattctaatg atggctctaa 22860
ttgtacagag cctgtgttgg tgtatagtaa cataggtgtt tgtaaatctg gcagtattgg 22920
ctatgtccca tctcagtctg gtcaagtcaa gattgcaccc acggttactg ggaatattag 22980
tattcccacc aactttagta tgagtattag gacagaatat ttacagcttt acaacacgcc 23040
tgttagtgtt gattgtgcta catatgtttg taatggtaac tctcgttgta aacaattact 23100
cacccagtac actgcagcat gtaagaccat agagtcagca ttacaactca gcgctaggct 23160
tgagtctgct gaagtcaact ctatgcttac tatttctgaa gaggctctac agttagctac 23220
catcagttcg tttaatggtg atgggtataa ttttactaat gtgctgggtg tttccgtgta 23280
tgaccctgca agtggcaggg tggtacaaaa aaggtctttt attgaagacc tgctttttaa 23340
taaagtggtt actaatggcc ttggtactgt tgatgaagac tataagcgct gttctaatgg 23400
tcgctctgtg gcagatctag tctgtgcaca gtattactct ggtgtcatgg tactacctgg 23460
tgttgttgac gctgagaagc ttcacatgta tagtgcgtct ctcatcggtg gtatggcgct 23520
aggaggtttt acttctgcag cggcattgcc ttttagctat gctgttcaag ctagactcaa 23580
ttatcttgct ctacagacgg atgttctaca gcggaaccag caaatgcttg ctgagtcttt 23640
taactctgct attggtaata taacttcagc ctttgagagt gttaaagagg ctattagtca 23700
aacttccaag ggtttgaaca ctgtggctca tgcgcttact aaggttcaag aggttgttaa 23760
ctcgcagggt gcagctttga ctcaacttac cgtacagctg caacacaact tccaagccat 23820
ttctagttct attgatgaca tttactctcg actggacatt ctttcagccg atgttcaggt 23880
tgaccgtctc atcaccggca gattatcagc acttaatgct tttgttgctc aaaccctcac 23940
taagtatact gaggttcagg ctagcaggaa gctagcacag caaaaggtta atgagtgcgt 24000
taaatcgcaa tctcagcgtt atggtttttg tggtggtgat ggcgagcaca ttttctctct 24060
ggtacaggcc gcacctcaag gcctgctgtt tttacacaca gtacttgtac cgggtgactt 24120
tgtaaatgtt attgccatcg ctggcttatg tgttaacgat gaaatttcct tgactctacg 24180
tgagcctggc ttagtcttgt ttacgcatga acttcaagat actgcgacgg aatattttgt 24240
ttcatcgcga cgtatgtatg aacctagaaa acctaccgtt ggtgattttg ttcaaattga 24300
gagttgtgtg gtcacctatg tcaatttgac tagagaccaa ctaccagaag taatcccaga 24360
ttacatcgat gttaacaaaa cacttgatga gattttagct tctctgccca atagaactgg 24420
tccaagtctt tctctagatg tttttaatgc cacttatctt aatctcactg gtgaaattgc 24480
agatttagag cagcgttcag agtctctccg taatactaca gaagagctcc aaagtcttat 24540
atataatatc aacaacacac tagttgacct tgagtggctc aaccgagttg agacatatat 24600
caagtggccg tggtgggttt ggttgattat ttttattgtt ctcatttttg ttgtgtcatt 24660
actagtgttc tgctgcattt ccacgggttg ttgtggatgc tgcggctgct gtggtgcttg 24720
tttttcaggt tgttgtaggg gtcctagact tcaaccttac gaagcttttg aaaaggtcca 24780
cgtgcagtga tgtttcttgg actttttcaa tacacgattg acacagtcgt caaagatgtc 24840
tctaagtctg ccaacttgtc ttcggacgct gtccaagagt tggagcttaa tgtagttcca 24900
attagacaag cttcaaatgt gactggtttt cttttcacca gtgtttttat ttacttcttt 24960
gcactgttta aagcttcttc tttgaggcgc aattatgtta tgttggcagc gcgttttgct 25020
gtcatctttc tttattgccc acttttatat tactgtggtg catttttaga tgcaactatt 25080
atctgttgca cacttattgg caggctcttt ttagtctgct tttattcctg gcgctataaa 25140
aatgcgctct ttattatctt taatactact acactttctt ttctcaatgg taaagcagct 25200
tattacggca aatccattgt gattctagaa ggtggtgatc attacatcac ttttggcaac 25260
tctttcgttg ctttcgttag tagcattaac ttgtatctag ctatacgtgg gcggcaagaa 25320
gctgacctac atctgttgcg aactgttgag cttcttgatg gcaagaagct ttatgtcttt 25380
tcgcaacatc aaattgttgg cattactaat gctgcatttg actcaattca actagacgag 25440
tatgctacaa ttagtgaatg ataatggtct agtagttaat gttatacttt ggcttttcgt 25500
actctttttc ctgcttatta taagcattac tttcgtccaa ttggttaatc tgtgcttcac 25560
ttgtcaccgg ttgtgtaata gcgcagttta cacacctata gggcgtttgt atagagttta 25620
taagtcttac atgcaaattg accccctccc cagtactgtt attgacgtat aaacgaaata 25680
tgtctaacgg ttctattccc gttgatgagg tgattgaaca ccttagaaac tggaatttca 25740
catggaatat catactgacg atactacttg tagtgcttca gtatggccat tacaagtact 25800
ctgcgttctt gtatggtgtc aagatggcta ttctatggat actttggcct cttgtgttgg 25860
cactttcact ttttgatgca tgggctagct ttcaggtcaa ctgggtcttt tttgctttca 25920
gcatccttat ggcttgcatc actcttatgc tgtggataat gtactttgtc aatagcattc 25980
ggttgtggcg caggacacat tcttggtggt ctttcaatcc tgaaacagac gcgcttctca 26040
ctacttctgt gatgggccga caggtttgca ttccagtgct tggagcacca actggtgtaa 26100
cgctaacact ccttagtggt acattgcttg tagagggcta taaggttgct actggcgtac 26160
aggtaagtca attacctaat ttcgtcacag tcgccaaggc cactacaaca attgtctatg 26220
gacgtgttgg tcgttcagtc aatgcttcat ctagcactgg ttgggctttc tatgtccggt 26280
caaaacacgg cgactactca gctgtgagta atccgagtgc ggttctcaca gatagtgaga 26340
aagtgcttca tttagtctaa acagaaactt tatggcttct gtcagcttcc aggatcgtgg 26400
ccgcaaacgg gtgccattat ccctctatgc ccctcttagg gttactaatg acaaacccct 26460
ttctaaggta cttgcaaaca atgctgtacc cactaataaa ggaaataagg accagcaaat 26520
tggatactgg aatgagcaaa ttcgctggcg catgcgccgt ggtgagcgaa ttgagcaacc 26580
ttccaattgg catttctact acctcggaac aggacctcac gccgacctcc gctataggac 26640
tcgtactgag ggtgttttct gggttgctaa agaaggcgca aagactgaac ccactaacct 26700
gggtgtcaga aaggcgtctg aaaagccaat cattccaaat ttctctcaac agcttcccag 26760
cgtagttgag attgttgaac ctaacacacc tcctacttca cgtgcaaatt cacgtagcag 26820
gagtcgtggt aatggcaaca acaggtccag atctccaagt aacaacagag gcaataacca 26880
gtcccgcggt aattcacaga atcgtggaaa taaccagggt cgtggagctt ctcagaacag 26940
aggaggcaat aataataaca ataacaagtc tcgtaaccag tccaagaaca gaaaccagtc 27000
aaatgaccgt ggtggaatga catcacgcga tgatctggtg gctgctgtca aggatgccct 27060
taaatctctg ggtattggag aaaatcctga taggcttaag caacaacaga agcctaagca 27120
ggaaaagtct gacaacagcg gcaaaaatac acctaagaag aacaaatcca gggccacttc 27180
gaaggaacgt gacctcaagg acatcccaga gtggaggcga attcccaagg gcgaaaatag 27240
cgtagcagct tgcttcggac ccaggggggg cttcaaaaat tttggagatg cggagtttgt 27300
cgaaaaaggt gttgatgcct caggctatgc tcagatcgcc agtttggcac caaatgttgc 27360
agcattgctc tttggtggta atgtggctgt tcgcgagcta gcggactctt acgagattac 27420
atacaattat aaaatgactg tgccaaagtc tgatccaaat gttgagcttc ttgtttcaca 27480
ggttgatgca tttaaaactg gtaatgcaaa accccagaga aagaaggaaa agaagaacaa 27540
gcgtgaaacc acgcagcagc ttaatgaaga tgccatctac gatgacgtgg gtgtgccatc 27600
tgatgtgact catgccaatt tggaatggga cacagctgtt gatggtggtg acacggccgt 27660
tgaaattatc aacgagatct tcgatacagg aaattaaata atgtttgact ggcttatcct 27720
ggctatgtcc cagggtagtg ccattacact gttattactt agtgtttttc tagcgacttg 27780
gctgctgggc tatggctttg ccctctaact agcggtcttg gtcttgcaca caacggtaag 27840
ccagtggtaa tgtcagtgca agaaggatat taccatagca ctgtcacgag gggaacgcag 27900
taccttttca tctaaacctt tgcacgagta atcaaagatc cgcttgacga gcctatatgg 27960
aagagcgtgc caggtatttg actcaaggac tgttagtaac tgaagacctg acggtgttga 28020
tatggataca caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 28064
Claims (9)
1.一种猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以猪流行性腹泻病毒的cDNA为模板、SEQ ID NO.：1～14所示的序列为引物，将猪流行性腹泻病毒生物基因组分为7个片段扩增出来；
(2)以pYES1L-vector为模板、SEQ ID NO.：15～16所示的序列为引物，扩增得到线性化载体pYES1L，所述pYES1L-vector的核苷酸序列如SEQ ID NO.：23所示；
(3)将线性化载体pYES1L与步骤(1)得到的7个基因组片段混和，加入到MaV203酵母感受态中，利用醋酸锂转化法转化至酵母细胞，接种于色氨酸(Trp)缺陷型平板上，经菌落PCR法筛选出阳性克隆，将阳性克隆的酵母裂解液转化DH10B电击感受态，获得重组质粒，即猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆。
2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建方法，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒的基因组序列如SEQ ID NO.：24所示。
3.权利要求1～2任一所述猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建方法构建得到的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆。
4.基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的表达绿色荧光蛋白的猪流行性腹泻病毒构建方法，包括以下步骤：
(1)以EGFP基因为模板，以SEQ ID NO.：19～20所示的序列为引物进行PCR扩增，得到EGFP基因片段；
(2)用Cas9 Nuclease和两条guide RNA切割权利要求1得到的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆，所述guide RNA的序列如SEQ ID NO.：21～22所示，得到缺失ORF3的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆骨架；
(3)将EGFP和缺失ORF3的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆骨架片段混合，进行体外同源重组，转化至DH10B电击感受态中，获得重组质粒，即表达绿色荧光蛋白的猪流行性腹泻病毒克隆。
5.权利要求4所述的基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的表达绿色荧光蛋白的猪流行性腹泻病毒构建方法构建得到的表达绿色荧光蛋白的猪流行性腹泻病毒克隆。
6.权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆、权利要求5所述的表达绿色荧光蛋白的猪流行性腹泻病毒克隆在拯救病毒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用转染试剂LipofectamineTM3000将权利要3所述猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆或权利要求5所述的表达绿色荧光蛋白的猪流行性腹泻病毒克隆和辅助质粒共转染VeroCCL-81细胞，当出现典型细胞病变收取病毒上清，获得拯救的rPEDV。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆或表达绿色荧光蛋白的猪流行性腹泻病毒克隆与辅助质粒的质量比为4:1。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述辅助质粒的构建方法如下：以猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆为模板、SEQ ID NO.17～18为引物，PCR扩增得到N基因片段，N基因片段***到pCAGGS载体的SacI和XhoI位点之间，得到辅助质粒。
Priority Applications (1)
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- 2021-10-29 CN CN202111274202.1A patent/CN114395568A/zh active Pending
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