CN114369160A - 结合抗繆勒氏管激素amhn二聚体蛋白的高亲和力兔单抗 - Google Patents

结合抗繆勒氏管激素amhn二聚体蛋白的高亲和力兔单抗 Download PDF

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Abstract

本发明提供了结合抗繆勒氏管激素AMHN二聚体蛋白的高亲和力兔单抗。制备方法包括以下步骤：(1)重组AMHN蛋白为免疫原，免疫新西兰大白兔，经三次加强免疫后用ELISA方法测定血清效价，取血清效价高的兔子，再加强免疫一次，三天后取脾脏；(2)分离兔子脾脏细胞，并进行B淋巴细胞分选；(3)培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后提取RNA并反转录成cDNA。采用PCR方法，将兔单克隆抗体轻重链可变区基因(VH和VL)从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，测序确定序列。本发明所制备的兔单抗结合AMHN的亲和力高，检测限低，可配对使用，在免疫检测领域具有广泛的应用。

Description

结合抗繆勒氏管激素AMHN二聚体蛋白的高亲和力兔单抗
技术领域
本发明涉及抗体制备，尤其涉及结合抗繆勒氏管激素AMHN二聚体蛋白的高亲和力兔单抗。
背景技术
抗繆勒氏管激素(Anti-Müllerian hormone,AMH)又称为繆勒氏管抑制物质(MIS)，是转化生长因子β(TGF-β)超家族成员。AMH蛋白序列(Uniprot序列号：P03971)包含1-18AA信号肽，7AA前肽，26-451AA为AMHN，452-560AA为AMHC。AMH前体蛋白proAMH为同源二聚体，人体内经酶切，proAMH被切开形成N端二聚体蛋白(AMHN)，和C端二聚体蛋白(AMHC)，AMHN和AMHC以非共价键结合形成的蛋白复合物(AMHN,C)为功能活性蛋白。人体内同时存在proAMH和AMHN,C复合物这两种形态(Human blood contains both the uncleavedprecursor of anti-Müllerian hormone and a complex of the NH2-and COOH-terminal peptides.Am J Physiol Endocrinol Metab 305:E1241–E1247,2013；HighVariability of Molecular Isoforms of AMH in Follicular Fluid and GranulosaCells From Human Small Antral Follicles.Frontiers in Endocrinology Vol.12,Article 617523,2021)。
AMH是评估卵巢储备功能的重要指标，AMH水平检测为生殖***相关疾病的辅助诊断及其他疾病治疗中的女性生育能力提供评估依据。目前临床检测试剂盒能够测定AMH总量，无法区分proAMH和AMHN,C复合物各自组份含量(Novel Monoclonal Anti-MüllerianHormone Antibodies Applicable to Sensitive Diagnostic Immunoassays.71st AACCAnnual Scientific Meeting&Clinical Lab Expo August4-8,2019；Establishment of ahomogeneous immunoassaylight-initiated chemiluminescence assay for detectinganti-Müllerian hormone in human serum.Journal of Immunological Methods,Vol.494,2021,113059；Evaluation of a new automated immunoassay for thequantification of anti-Müllerian hormone.Practical Laboratory MedicineVol.25,2021,e00220)。
发明内容
本发明以重组AMHN免疫兔子，筛选获得了结合AMHN的高亲和力抗体13A4，8C8，这些抗体与US2016/0274130A1专利中所公开的结合AMHN的抗体比较，结合不同的AMHN抗原表位。
本发明配对抗体对AMHN的检测限达到64pg/mL。本发明实施例中的13A4抗体能够结合富集出细胞表达上清中重组AMHN,C复合物蛋白。
本发明的第一个方面公开了一种Anti-AMHN高亲和力兔单抗13A4或其抗原结合片段，包括轻链可变区和重链可变区，其特征在于：所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步地，上述兔单抗13A4或其抗原结合片段，包括具有如SEQ ID NO:2所示的轻链氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:5所示的重链氨基酸序列。
本发明的第二个方面公开了一种Anti-AMHN高亲和力兔单抗8C8或其抗原结合片段，包括轻链可变区和重链可变区，其特征在于：所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
进一步地，上述兔单抗8C8或其抗原结合片段，包括具有如SEQ ID NO:8所示的轻链氨基酸序列，以及SEQ ID NO:11所示的重链氨基酸序列。
进一步地，本发明还包括与上述抗体可变区序列有>90％序列相同的抗体或其抗原结合片段，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
本发明的第三个方面公开了一种试剂盒，其特征在于，包括上述任意一种或数种兔单抗或其抗原结合片段。进一步地，试剂盒所用的样本为血液。
本发明的第四个方面公开了上述任一种或多种兔单抗或其抗原结合片段在检测AMHN中的用途。
本发明的第五个方面公开了上述任一种或多种兔单抗或其抗原结合片段，在制备用于检测AMHN的试剂盒中的用途。
本发明的第六个方面公开了包括上述兔单抗13A4或其抗原结合片段在制备用于检测AMHN,C复合物的试剂盒中的用途。
本发明的第七个方面公开了所述的13A4兔单抗或其抗原结合片段，和所述的8C8兔单抗或其抗原结合片段，在制备用于同时检测AMHN和proAMH的试剂盒中的用途。
与现有技术相比，本发明取得了以下有益效果：
1. 13A4，8C8为结合AMHN的高亲和力兔单抗,Biacore数据显示抗体与AMHN结合常数KD(M)为10-10～10-11数量级；
2. 13A4/8C8可配对应用于化学发光免疫检测，分析显示，配对抗体检测AMHN能够达到64pg/mL检测限；
3. 13A4抗体可结合富集(pulldown)重组表达的AMHN,C复合物；
4.结合AMHN的高亲和力兔单抗13A4，8C8将可以与结合非AMHN抗原表位的抗体配对用于AMH的诊断检测。
附图说明
图1为Biacore表征配体：13A4抗体与分析物：AMHN的动力学结合曲线及结合常数KD值。
图2为Biacore表征配体：8C8抗体与分析物：AMHN的动力学结合曲线及结合常数KD值。
图3为化学发光免疫检测CLIA结果，以13A4/8C8抗体对检测抗原AMHN。
图4为13A4抗体结合富集重组表达上清中的AMHN,C复合物；
Lane1：13A4抗体(还原)；
Lane2：13A4抗体(非还原)；
Lane3：AMHN<His tag>重组蛋白(还原)；
Lane4：AMHN<His tag>重组蛋白(非还原)；
Lane5：箭头A指示AMHc；箭头C指示13A4抗体轻链；箭头D指示抗体重链及AMHN(还原)
Lane6：箭头B指示AMHc；箭头E指示13A4抗体及AMHN(非还原)
图5为实施例4的Elisa实验结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明所述的核苷酸或氨基酸序列：
13A4轻链可变区序列(SEQ ID NO:1)：
IKMTQTPASVSAAVGGTVTINCQASEDIERYLGWYQQKPGQPPKLLIYDASDLASGVPSRFKGSGSGKQFTLTISGVQCDDAATYYCQHGYYTSVSENVFGGGTEVVVKG
13A4轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：
IKMTQTPASVSAAVGGTVTINCQASEDIERYLGWYQQKPGQPPKLLIYDASDLASGVPSRFKGSGSGKQFTLTISGVQCDDAATYYCQHGYYTSVSENVFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC
13A4轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:3)：
ATCAAGATGACCCAGACCCCAGCCAGCGTTTCTGCCGCTGTTGGTGGCACAGTGACTATCAATTGCCAGGCATCAGAAGACATCGAGCGGTATCTGGGCTGGTACCAGCAGAAACCTGGACAACCCCCCAAGCTCCTGATATACGATGCGAGCGATCTTGCCTCAGGTGTCCCTTCCAGATTCAAAGGAAGCGGATCTGGAAAACAATTCACGCTGACAATTTCTGGCGTTCAGTGCGATGATGCCGCCACCTATTATTGTCAGCACGGCTACTACACAAGTGTATCAGAAAATGTCTTCGGGGGGGGAACCGAGGTCGTGGTTAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGT
13A4重链可变区序列(SEQ ID NO:4)：
QELVESGGGLVQPGESLKLSCKASGIHFSAYGVSWVRQAPGKGPEWIAYIYPGFGMTNHANSVKGRFTISGDNAQNTVFLQMTSLTAADTATYFCARDRGDADGDSIHYFNFWGPGTLVTVSS
13A4重链氨基酸序列(SEQ ID NO:5)：
QELVESGGGLVQPGESLKLSCKASGIHFSAYGVSWVRQAPGKGPEWIAYIYPGFGMTNHANSVKGRFTISGDNAQNTVFLQMTSLTAADTATYFCARDRGDADGDSIHYFNFWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK
13A4重链核苷酸序列(SEQ ID NO:6)：
CAGGAACTGGTCGAATCCGGTGGCGGGTTGGTGCAGCCAGGAGAGTCACTGAAGCTTTCCTGTAAGGCTAGCGGCATCCATTTCAGCGCTTATGGTGTCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCCGGCAAAGGACCAGAATGGATTGCCTATATATACCCTGGGTTTGGAATGACGAACCACGCCAATTCAGTGAAGGGCAGATTCACAATCAGCGGGGACAACGCCCAGAATACAGTTTTTCTGCAAATGACGAGCCTCACCGCCGCAGATACAGCAACCTATTTTTGTGCCAGAGACCGGGGGGACGCCGATGGCGACTCCATACATTACTTCAATTTCTGGGGTCCAGGGACCCTGGTGACTGTGTCTTCAGGGCAACC TAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGG TCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAA
8C8轻链可变区序列(SEQ ID NO:7)：
QVLTQTPSTVSAAVGGTVTINCQSSQNVYNNNRLSWYQQKPGQPPKLLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGSYYSSVWYHAFGGGSEVVVKG
8C8轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:8)：
QVLTQTPSTVSAAVGGTVTINCQSSQNVYNNNRLSWYQQKPGQPPKLLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCQGSYYSSVWYHAFGGGSEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC
8C8轻链核苷酸序列(SEQ ID NO:9)：
CAGGTGCTCACTCAAACCCCTTCTACCGTTTCTGCTGCAGTCGGAGGGACTGTAACAATTAACTGCCAATCAAGCCAGAATGTGTATAACAACAACAGGCTGTCCTGGTATCAACAAAAGCCCGGCCAACCTCCGAAGCTGCTGATCTACTTGGCAAGCACACTTGCCAGCGGGGTACCATCACGCTTTTCAGGCAGCGGATCCGGAACACAGTTCACGCTGACCATCTCCGGAGTTCAGTGCGACGACGCTGCAACTTACTACTGCCAGGGTAGCTACTACAGCTCAGTGTGGTACCACGCGTTCGGCGGAGGATCTGAAGTGGTTGTAAAGGGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGT
8C8重链可变区序列(SEQ ID NO:10)：
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLTNYHMSWVRQAPGKGLEWIGFIAANGGRWYATWAKGRFTISKTSSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARFDIYGHAYDIWGPGTLVTVSS
8C8重链氨基酸序列(SEQ ID NO:11)：
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLTNYHMSWVRQAPGKGLEWIGFIAANGGRWYATWAKGRFTISKTSSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARFDIYGHAYDIWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK
8C8重链核苷酸序列(SEQ ID NO:12)：
CAGAGTGTAGAGGAATCAGGAGGCAGGCTGGTAACGCCTGGAACTCCACTGACACTCACTTGTACTGCATCCGGATTTTCCCTCACTAACTACCACATGTCCTGGGTGAGGCAAGCCCCCGGTAAAGGACTCGAATGGATTGGATTCATCGCAGCCAATGGGGGACGCTGGTATGCAACGTGGGCCAAAGGTCGCTTCACAATCAGCAAGACATCCTCAACGACCGTTGACCTTAAAATCACCTCCCCGACCACTGAGGACACAGCTACCTACTTCTGCGCCCGGTTTGACATTTACGGCCACGCATATGACATCTGGGGACCGGGTACTCTCGTAACGGTTAGCTCCGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCATGTGCCCACCCCCTGAACTCCCGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGACCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAA
重组表达AMHN序列(Uniprot:P03971 1-449AA)
AMHN氨基酸序列：(SEQ ID NO:13)：
MRDLPLTSLALVLSALGALLGTEALRAEEPAVGTSGLIFREDLDWPPGSPQEPLCLVALGGDSNGSSSPLRVVGALSAYEQAFLGAVQRARWGPRDLATFGVCNTGDRQAALPSLRRLGAWLRDPGGQRLVVLHLEEVTWEPTPSLRFQEPPPGGAGPPELALLVLYPGPGPEVTVTRAGLPGAQSLCPSRDTRYLVLAVDRPAGAWRGSGLALTLQPRGEDSRLSTARLQALLFGDDHRCFTRMTPALLLLPRSEPAPLPAHGQLDTVPFPPPRPSAELEESPPSADPFLETLTRLVRALRVPPARASAPRLALDPDALAGFPQGLVNLSDPAALERLLDGEEPLLLLLRPTAATTGDPAPLHDPTSAPWATALARRVAAELQAAAAELRSLPGLPPATAPLLARLLALCPGGPGGLGDPLRALLLLKALQGLRVEWRGRDPRGPGRAGSHHHHHH
AMHN核苷酸序列：(SEQ ID NO:14)：
ATGAGAGACCTGCCCCTGACATCTCTGGCTCTGGTGCTGAGCGCTCTTGGAGCCCTTCTGGGAACAGAAGCTCTGAGAGCTGAAGAACCCGCTGTGGGAACATCTGGCCTGATCTTCAGAGAGGACCTGGATTGGCCTCCTGGCAGCCCTCAAGAACCTCTGTGTCTGGTTGCTCTGGGCGGAGATAGCAATGGAAGCAGCAGCCCTCTTAGAGTGGTTGGAGCTCTGAGCGCTTACGAACAGGCTTTTCTGGGAGCCGTGCAAAGAGCTAGATGGGGCCCTAGAGACCTGGCTACCTTCGGCGTTTGTAACACCGGCGATAGACAGGCTGCTCTGCCTAGCCTTAGAAGACTGGGCGCTTGGCTGAGAGATCCTGGAGGACAGAGACTGGTGGTGCTGCATCTGGAAGAGGTGACCTGGGAACCTACCCCTAGCCTGAGATTTCAAGAGCCTCCTCCTGGAGGCGCTGGACCTCCTGAACTGGCTCTGCTGGTGCTGTATCCTGGACCTGGCCCTGAAGTGACAGTGACAAGAGCTGGACTGCCTGGAGCTCAAAGCCTGTGTCCCAGCAGAGACACCAGATACCTGGTGCTGGCTGTGGATAGACCTGCCGGAGCTTGGAGAGGATCTGGACTGGCTCTTACACTGCAACCCAGAGGCGAGGATTCTAGACTGAGCACCGCCAGACTGCAAGCTCTGCTGTTCGGCGATGACCACAGATGCTTCACCAGAATGACCCCTGCCCTGCTGCTTCTTCCTAGAAGCGAGCCTGCCCCTCTTCCTGCTCATGGACAGCTTGACACAGTGCCCTTTCCTCCTCCTAGACCCAGCGCTGAACTGGAAGAAAGCCCCCCTAGCGCTGATCCCTTTCTGGAGACCCTGACCAGACTTGTGAGAGCCCTGAGAGTGCCTCCTGCTAGAGCTAGCGCTCCTAGACTGGCTCTGGATCCCGATGCTCTGGCTGGATTCCCTCAAGGACTGGTGAACCTGTCTGATCCCGCCGCTCTGGAAAGACTGCTGGATGGCGAAGAACCTCTGCTGCTGCTGCTTAGACCTACAGCTGCTACCACAGGAGATCCCGCCCCTCTGCATGATCCTACAAGCGCCCCTTGGGCTACAGCTCTGGCTAGAAGAGTGGCTGCCGAACTGCAGGCTGCCGCTGCTGAACTTAGAAGCCTGCCTGGACTGCCTCCTGCTACAGCCCCTCTGCTTGCTAGACTGCTGGCTCTGTGTCCTGGCGGACCTGGAGGACTGGGAGATCCTCTGAGAGCTCTGCTGCTGCTGAAAGCTCTGCAAGGCCTGAGAGTGGAGTGGAGAGGCAGAGATCCTAGAGGACCTGGCAGAGCCGGATCTCACCACCACCACCATCATTGA
实施例所用的实验材料及设备：
Biacore T200：GE healthcare
全自动化学发光仪(SMART 500)：科斯迈生物科技有限公司
Expi293TMExpression System kit高密度细胞哺乳表达体系；蛋白A280浓度测定Nanodrop；ELISA高吸附96孔板：Thermo Fisher Scientific
AMHN重组蛋白：恺佧生物科技(上海)有限公司
ProteinA树脂；镍-装载的IMAC树脂：GE healthcare
无机盐；Tween20；H2SO4:国药集团
proclin300；BSA；咪唑(Imidazole):Sigma-Aldrich
SA-磁珠：苏州纳微科技有限公司
吖啶酯：赫利森(厦门)生物科技有限公司
生物素(biotin)：APEXBIOTechnology LLC
预激发液，激发液:北京百龙腾科技发展有限公司
SA-HRP；抗体稳定剂：上海闪晶分子生物科技有限公司
TMB显色液：湖州英创生物科技有限公司
实施例1重组AMHN抗原免疫及兔单抗筛选
1.1动物免疫：为获得结合人AMHN蛋白的兔单克隆抗体，本发明以重组人AMHN蛋白(恺佧生物生产制备，如图4的泳道3，4所示)为免疫原，免疫新西兰大白兔；经三次加强免疫后用ELISA方法测定血清效价，取血清效价高的兔子，再加强免疫一次，三天后取脾脏。
1.2分离兔子脾脏细胞，并进行B淋巴细胞分选：参见专利201910125091.4《从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法》：
1)利用以生物标记的非B细胞淋巴细胞表面标志物抗体对脾脏细胞进行负筛选，再利用亲和素磁珠与磁性分离原理去除非B细胞，以提高脾脏细胞中B淋巴细胞相对丰度；
2)利用荧光标记的IgM多克隆抗体和预标记筛选用抗原，对步骤1得到的脾脏细胞进行进一步负筛选，以流式细胞技术去表面不表达IgG分子的B细胞，保留与预标记筛选抗原结合的目标淋巴细胞；
3)利用7-AAD进行分选，去除死细胞；
4)用流式细胞仪，进行单细胞的筛选，得到目标淋巴细胞。
1.3编码兔单克隆抗体基因的克隆
培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后提取RNA并反转录成cDNA。采用PCR方法，将兔单克隆抗体轻重链可变区基因(VH和VL)从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，测序确定序列。
以上抗原免疫及兔单抗鉴定测序委托优睿赛思(武汉)生物科技有限公司完成。
实施例2抗体表征及评价
2.1 Biacore实验方法
2.1.1将proteinA偶联到CM5芯片上。
将50mM NHS及200mM EDC溶液1：1混合，该缓冲液以10μL/min流速运行600s，以激活CM5芯片(FlowCell1，2)。将ProteinA蛋白以醋酸钠缓冲液pH4.5稀释到20μg/mL浓度，手动模式，以10μL/min流速进样偶联。接着1M乙醇胺以10μL/min流速进样封闭。ProteinA偶联水平为3400Ru。
实验过程中流动相为1×HBS-EP+buffer(pH7.4)即：(0.01M HEPES,pH7.4,0.15MNaCl,3mM EDTA,0.05％(v:v)表面活性剂P20)
2.1.2以proteinA捕获抗体，评价抗体与分析物AMHn的动力学结合
Flow cell 1为参比通道，流动相为1×HBS-EP+buffer(pH7.4)，用Flow cell 2通过所偶联的proteinA捕获抗体，再以30μL/min流速进样分析物AMHn，抗体与分析物的结合时间为180s.
2.1.3 Biacore实验结果
Biacore显示Anti-AMHN抗体13A4,8C8与AMHN有高亲和力结合
Figure BDA0003439434990000101
上表中的Ligand表示配体，Antigen表示抗原。
2.2化学发光免疫检测(CLIA)
2.2.1 CLIA实验方法
1)将抗体13A4和8C8分别在buffer1中透析过夜；
2)抗体标记
a.8C8抗体标记吖啶酯
抗体8C8与吖啶酯按照质量比15：1的比例混匀，室温避光孵育2h；
b.生物素标记13A4抗体
抗体13A4与生物素按照质量比5.2：1(摩尔比：1：50)的比例混匀，室温孵育1h；
3)标记后的抗体分别在buffer2中透析>24h,中间换液一次；
吖啶酯标记的8C8抗体需全程避光；
4)用buffer2清洗SA-磁珠2次，复溶至浓度10mg/mL；
5)生物素标记13A4抗体与SA-磁珠偶联。将磁珠与生物素标记13A4抗体按照质量比，即磁珠：生物素化抗体＝40：1混合，磁珠终浓度为5mg/mL，置于恒温震荡仪上室温过夜；
6)磁珠包被13A4抗体后，用保存液以2倍体积洗涤2次放置4度冰箱备用，；
7)取出透析后的吖啶酯标记8C8抗体，用保存液5倍稀释，放置4度冰箱备用；
8)新鲜配制浓度1μg/mL的AMHN，然后以5倍浓度梯度稀释8个点，最低12.8pg/mL；用保存液设定2个空白对照，依次放入样品仓。
9)将吖啶酯标记8C8抗体用保存液以1：10000倍稀释后放入棕色避光试剂瓶；
磁珠偶联13A4抗体按照磁珠浓度稀释到0.2mg/mL放入白色试剂瓶；
10)将2个试剂瓶放入试剂仓，设置实验反应参数，根据预实验确定试剂上样量和磁珠-抗体进样量；AMHN上样体积：50μL；磁珠-13A4上样体积：80μL；吖啶酯标记8C8上样体积：100μL；
11)将磁珠-13A4与AMHN孵育，洗涤后再加入吖啶酯标记8C8。再孵育，洗涤；
先加入预激发液，后加入激发液产生化学发光反应，仪器检测信号，并导出实验结果。
Buffer1:4mM NaH2PO4﹒2H2O,100mM Na2HPO4﹒12H20,150mM NaCl,pH8.0
Buffer2:3mM NaH2PO4﹒2H2O,15mMNa2HPO4﹒12H20,150mMNaCl,pH7.4
保存液:50mM Tris-HCl,150mM NaCl,1％BSA,0.1％Tween-20,0.5％抗体稳定剂,0.1％Proclin 300,pH7.2
2.2.2化学发光免疫检测(CLIA)实验结果
图3为化学发光免疫检测CLIA结果，以13A4/8C8抗体对检测抗原AMHN。
13A4/8C8抗体对检测限为64pg/mLAMHN。
实施例3 13A4抗体结合富集细胞上清中的重组蛋白AMHN,C复合物
AMHN,C复合物的重组表达参考恺佧专利CN112251444A,AMHN,C与受体蛋白AMHRII-Fc共表达，以proteinA树脂结合哺乳细胞表达上清中的AMHRII-Fc及与AMHRII-Fc结合的AMHc，这一步骤流穿的细胞上清(1L)中还含有AMHN及AMHN,C。将13A4抗体结合到proteinA树脂上，0.5mg抗体结合到1mL protein A树脂上，以13A4-proteinA树脂，结合流穿液中的AMHN,C(估算复合物的量约为200μg/L),如图4所示，13A4抗体能够结合富集出重组表达的AMHN,C复合物。
Lane1：13A4抗体(还原)
Lane2：13A4抗体(非还原)
Lane3：AMHN<His tag>重组蛋白(还原)
Lane4：AMHN<His tag>重组蛋白(非还原)
Lane5：箭头A指示AMHc；箭头C指示13A4抗体轻链；箭头D指示抗体重链及AMHN(还原)
Lane6：箭头B指示AMHc；箭头E指示13A4抗体及AMHN(非还原)
实施例4双抗夹心法Elisa实验
1.Anti-AMHN antibody为US10160274130A1中的Hybridoma A#10 antibody。以该专利抗体5μg/mL包被高吸附Elisa板37℃,2小时
2.PBST(0.05％Tween 20，PBS,pH7.4)洗板三次
3.加300μL 3％BSA(3g BSA+100mL PBST)在37℃孵育2小时封闭
4.再以PBST洗板三次
5.加100μL的AMHN抗原与Elisa板上的Anti-AMHN抗体结合，抗原AMHN浓度从10μg/μL起3倍梯度稀释
6.以PBST洗板三次
7.加100μL 5μg/mL生物素标记13A4抗体或者生物素标记8C8抗体，37℃结合1h.
8.PBST洗板三次
9.加100μLSA-HRP，37℃结合1h.
10.PBST洗板三次
11.加100μL TMB室温显色5分钟
12.加50μL的0.5MH2SO4终止反应
13.450nm光吸收读数
实验结果如图5所示：
Anti-AMHN antibody为US10160274130A1中的Hybridoma A#10 antibody，该抗体可以与13A4或8C8配对，结合抗原AMHN,表明Hybridoma A#10 antibody与13A4，8C8具有不同的抗原结合表位。
实施例5实施例1中所述的AMHN抗原的制备方法
1.哺乳表达质粒构建
编码AMHN的核苷酸序列由通用生物***(安徽)有限公司合成。起始密码子ATG前面加Kozac序列，以EcoRI/HindIII酶点构建进pTT5哺乳细胞表达载体。测序正确。哺乳细胞表达载体可以选择pCDNA3.1,pCMV等其它表达载体。
2.哺乳细胞Expi293瞬时转染及蛋白表达纯化
Expi293细胞培养及转染采用Expi293表达体系产品手册中建议的实验条件(Ref:MAN0007814)。细胞转染后第2天补料，第6天收获，10000rpm离心获得细胞上清。
摇瓶瞬时转染Expi293细胞,收获分泌上清1L，以5ml柱体积的镍-装载的IMAC预装柱，挂柱，平衡缓冲液为20mM PB,500mM NaCl,pH7.4.，以20mM PB,500mM NaCl,20mMimizazole,pH7.4缓冲液冲洗5个柱体积，以20mM PB,500mM NaCl,50mM imizazole,pH7.4缓冲液冲洗5个柱体积.以20mM PB,500mM NaCl,500mM imizazole,pH7.4缓冲液洗脱。洗脱蛋白透析到PBS,pH7.4缓冲液,得到AMHN蛋白，收率>10mg/L.
重组表达AMHN蛋白的氨基酸和核苷酸序列如SEQ ID NO:13-14所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种Anti-AMHN高亲和力兔单抗或其抗原结合片段，包括轻链可变区和重链可变区，其特征在于：所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述的兔单抗或其抗原结合片段，包括具有如SEQ ID NO:2所示的轻链氨基酸序列，以及如SEQ ID NO:5所示的重链氨基酸序列。
3.一种Anti-AMHN高亲和力兔单抗或其抗原结合片段，包括轻链可变区和重链可变区，其特征在于：所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
4.根据权利要求3所述的兔单抗或其抗原结合片段，包括具有如SEQ ID NO:8所示的轻链氨基酸序列，以及SEQ ID NO:11所示的重链氨基酸序列。
5.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4任一项或多项所述的兔单抗或其抗原结合片段。
6.一种试剂盒，其特征在于，包括：
(a)权利要求1所述的兔单抗或其抗原结合片段；以及
(b)权利要求3所述的兔单抗或其抗原结合片段。
7.权利要求1和/或3所述的兔单抗或其抗原结合片段在制备用于检测AMHN的试剂盒中的用途。
8.权利要求1所述兔单抗或其抗原结合片段在制备用于检测AMHN,C复合物的试剂盒中的用途。
9.权利要求1和3所述的兔单抗或其抗原结合片段，在制备用于同时检测AMHN和proAMH的试剂盒中的用途。
10.权利要求1和/或3所述的兔单抗或其抗原结合片段，用于检测AMHN的用途。
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