CN114354464A - 一种对不同金属纳米颗粒高光谱库之间的相似性进行定量分析的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对不同金属纳米颗粒高光谱库之间的相似性进行定量分析的方法，包括获取高光谱数据，并对高光谱图片进行预处理；提取AuNPs的特征光谱曲线建立高光谱库，并统计高光谱库内光谱曲线的数量；将高光谱库一一交叉过滤，统计各个高光谱库被过滤后剩下光谱曲线的数量；根据以上统计的光谱曲线数量计算高光谱相似性系数S，定量分析不同金属纳米颗粒高光谱库的相似性。其中提出的高光谱相似性系数S可以简单、快捷、准确的量化不同金属纳米颗粒光谱库之间的相似性。
Description
技术领域
本发明涉及利用高光谱技术识别金属纳米颗粒，具体的，涉及一种对不同金属纳米颗粒高光谱库之间的相似性进行定量分析的方法。
背景技术
结合了暗场显微成像***的高光谱技术是一种原位识别生物中金属纳米颗粒的新型方法。比如，AuNPs具有独特的表面等离子体共振效应使其在400-1000nm的可见-近红外波段展现出很强的光谱吸收，而装配有独特分光光度计的高光谱成像***中同时配备电荷耦合器件(CCD)相机，可记录这一波段AuNPs独特的光谱曲线。在暗场显微成像***中，类似于这种表面等离子体共振或其他与纳米材料相互作用后所形成光谱的形状与金属纳米颗粒的大小、形貌、聚集状态、表面修饰情况及周围介电环境密切相关。因此对高光谱进行分析有助于了解纳米粒子的微观组成和周围的微环境。
在利用高光谱技术对金属纳米材料进行识别时，构建高光谱库是一项重要的基础工作，高光谱库是进行识别分类的基础。同时，高光谱库内的光谱曲线也体现了金属纳米颗粒的表面等离子体共振的情况，因此，判断不同条件下构建的各种金属纳米颗粒光谱库的相似性也有助于了解这些金属纳米颗粒的微观组成和周围的介电环境。
但是已有的方法判断高光谱库的相似性多是将高光谱库中所有的特征光谱曲线平均化，然后比较平均化后光谱曲线峰值位置。然而，将高光谱库中所有的光谱曲线平均化后，可能会造成高光谱库中大量的光谱曲线信息的缺失和浪费，甚至是出现误判。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种更加全面准确且简单的方法，以定量分析不同金属纳米颗粒高光谱库之间的相似性。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种对不同金属纳米颗粒高光谱库之间的相似性进行定量分析的方法，包括如下步骤：
步骤一：获取金属纳米颗粒的高光谱图片，其中包括金属纳米颗粒的位置信息和光谱信息；
步骤二：将高光谱图片进行平滑处理，再用获取的光源光谱对平滑后的高光谱图片进行光谱校正；
步骤三：根据步骤二中平滑和校正后的金属纳米颗粒的高光谱图片，收集金属纳米颗粒的特征光谱曲线来构建金属纳米颗粒的高光谱库，并统计这些高光谱库中光谱曲线的总数；
步骤四：对步骤三中收集的多个金属纳米颗粒的高光谱库一一交叉过滤，统计过滤后所剩下光谱曲线的个数；
步骤五：计算高光谱库相似性系数S，从而定量分析不同金属纳米颗粒光谱库之间的相似性。
具体地，步骤一中，所述金属纳米颗粒为在暗场高光谱成像***下能够建立相应的参考库并特异性识别的含金属元素的纳米颗粒。
优选地，步骤一中，所述金属纳米颗粒为纳米金或纳米银。
具体地，步骤二中，利用高光谱数据处理软件ENVI4.8中的Adjacent BandAveraging功能将高光谱图片进行平滑处理。
具体地，步骤四中，在高光谱数据处理软件ENVI4.8中，利用Filter Spectrallibrary功能对步骤三中收集的多个金属纳米颗粒的高光谱库一一交叉过滤。
具体地，步骤五中S的定义为：
中Ni表示第i个高光谱库中的光谱曲线的数量；{Na,Nb}表示a库经过b库过滤后剩下的光谱曲线数量；
表示n个高光谱库交叉过滤后所剩光谱曲线数量的总和；S系数的大小体现了高光谱库之间相似性的大小，S系数越大，不同高光谱库内相似的光谱曲线越少，高光谱库的相似度越小。
优选地，利用S系数判断高光谱库之间的相似性时，Spectral Angle Mapping的阈值选择为0.1。
有益效果：本发明方法通过计算S系数量化判断高光谱库之间的相似性，这种计算S系数的方法简单、快捷、准确。通过S系数不光可以判断光谱库间的相似性，还可以判断在细胞中微环境金属纳米颗粒的差异，并以此系数为基础来判断多个光谱库是否能统一合并成一个相对较小容量的光谱库。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1经过平滑处理和灯光校正后的高光谱图片，该图片中的细胞累积了AuNPs。
图2细胞中10、17和60nmAuNPs的光谱库。
图3 A549、HeLa、HepG2细胞中AuNPs的光谱库。
图4整合合并Li-A549、Li-HeLa、Li-HepG2后统一的高光谱库Li-M。
图5吸收了AgNPs细胞的高光谱图片和细胞外AgNPs的高光谱图片。
图6细胞内和细胞外AgNPs的高光谱库。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。
实施例1
本实施例提供一种定量分析细胞中不同粒径AuNPs光谱库之间的相似性的方法，包括以下步骤：
步骤一：获取AuNPs的高光谱图片，其中包括AuNPs的位置信息和光谱信息。在六孔板中放入无菌盖玻片，将HeLa细胞接种在六孔板中生长24h以贴壁生长在盖玻片上，随后更换含有AuNPs的培养基，细胞吸收AuNPs后用PBS缓冲液清洗5遍，随后加入含2％多聚甲醛的PBS溶液将细胞固定。使用Cytoviva的增强暗场高光谱显微镜，对此吸收了AuNPs的HeLa细胞进行成像；
步骤二：利用ENVI 4.8软件中的Adjacent Band Averaging功能将高光谱图片进行平滑处理，再将获取的光源光谱把平滑后的高光谱图片进行光谱校正，最终得到如图1所示的高光谱图片；
步骤三：利用步骤二获取的高光谱图片，收集AuNPs的特征光谱曲线作为高光谱库。如图2所示，分别建立了细胞吸收的10nm、17nm和60nm柠檬酸修饰AuNPs的高光谱库记为Li-10、Li-17、Li-60，且三种高光谱库的光谱曲线数量分别为431、738、720。
步骤四：在高光谱处理软件ENVI4.8中，利用Filter Spectral library功能对步骤三中收集的多个AuNPs的高光谱库一一交叉过滤，统计过滤后所剩下光谱曲线的个数。Li-10用Li-17过滤，剩下的光谱曲线数量为21；Li-17用Li-10过滤，剩下的光谱曲线数量为36；Li-10用Li-60过滤，剩下的光谱曲线数量为90；Li-60用Li-10过滤，剩下的光谱曲线数量为569；Li-17用Li-60库过滤，剩下的光谱曲线数量为182。Li-60用Li-17过滤，剩下的光谱曲线数量为577。统计交叉过滤后剩下的光谱曲线总数量为1475。
步骤五：根据步骤三和四获得的光谱曲线数，计算S系数，计算公式为：
式中Ni表示第i个高光谱库中的光谱曲线的数量；{Na,Nb}表示x库经过y库过滤后剩下的光谱曲线数量；
表示n个高光谱库交叉过滤后所剩光谱曲线数量的总和。例如：在计算Li-10和Li-60的S系数中，记Li-10和Li-60为N1和N2,在步骤三中可得到N1＝431，N2＝720；{N1,N2}表示Li-10经过Li-60过滤后剩下的光谱曲线数量,在步骤四中可得到为{N1,N2}＝90；{N2,N1}表示Li-60经过Li-10过滤后剩下的光谱曲线数量,在步骤四中可得到为{N2,N1}＝569；
表示Li-10和Li-60这两个高光谱库交叉过滤后所剩光谱曲线数量的总和，在步骤四中可得到为
则Li-10和Li-60的相似性系数S＝0.572。
最终计算三种不同粒径AuNPs高光谱库的S系数如表1所示。由表1可得知Li-10和Li-17两个高光谱库的S系数很小，说明这两个高光谱库十分相似。而Li-60与Li-10和Li-17这两个AuNPs的高光谱库相似性较小。这体现了AuNPs尺寸显著的差异对表面等离子体共振吸收峰产生了较大的影响，同时这三种不同粒径AuNPs高光谱库的总S系数(0.390)较大，并不适合合并成一个通用的相对容量较小的高光谱库。
表1细胞中10、17和60nm AuNPs的光谱库的S系数
实施例2
本实施例提供一种定量分析不同细胞中同种粒径AuNPs光谱库之间的相似性的方法，包括以下步骤：
步骤一：获取AuNPs的高光谱图片，其中包括AuNPs的位置信息和光谱信息。在六孔板中放入无菌盖玻片，将A549、HeLa、HepG2三种细胞分别接种在六孔板中生长24h以贴壁生长在盖玻片上，随后更换含有AuNPs的培养基，细胞吸收AuNPs后用PBS缓冲液清洗5遍，随后加入含2％多聚甲醛的PBS溶液将细胞固定。使用Cytoviva的增强暗场高光谱显微镜，对此吸收了AuNPs的HeLa细胞进行成像；
步骤二：利用ENVI 4.8软件中的Adjacent Band Averaging功能将高光谱图片进行平滑处理，再将获取的光源光谱把平滑后的高光谱图片进行光谱校正，最终得到预处理后的高光谱图片；
步骤三：利用步骤二获取的高光谱图片，收集A549、HeLa、HepG2三种细胞内AuNPs的特征光谱曲线作为高光谱库。如图3所示，分别建立了A549、HeLa、HepG2三种细胞内AuNPs的高光谱库记为Li-A549、Li-HeLa、Li-HepG2，且三种高光谱库的光谱曲线数量分别为409、564、460。
步骤四：在高光谱处理软件ENVI4.8中，利用Filter Spectral library功能对步骤三中收集的多个AuNPs的高光谱库一一交叉过滤，统计过滤后所剩下光谱曲线的个数。Li-A549用Li-HeLa过滤，剩下的光谱曲线数量为2；Li-HeLa用Li-A549过滤，剩下的光谱曲线数量为0；Li-A549用Li-HepG2过滤，剩下的光谱曲线数量为16；Li-HepG2用Li-A549过滤，剩下的光谱曲线数量为102；Li-HepG2用Li-HeLa库过滤，剩下的光谱曲线数量为171，Li-HeLa用Li-HepG2过滤，剩下的光谱曲线数量为16。统计交叉过滤后剩下的光谱曲线总数量为307。
步骤五：根据步骤三和四获得的光谱曲线数，计算S系数，计算公式为：
式中Ni表示第i个高光谱库中的光谱曲线的数量；{Na,Nb}表示x库经过y库过滤后剩下的光谱曲线数量；
表示n个高光谱库交叉过滤后所剩光谱曲线数量的总和。例如：在计算Li-HeLa和Li-A549的S系数中，记Li-HeLa和Li-A549为N1和N2,在步骤三中可得到N1＝0，N2＝2；{N1,N2}表示Li-HeLa经过Li-A549过滤后剩下的光谱曲线数量,在步骤四中可得到为{N1,N2}＝0；{N2,N1}表示Li-A549经过Li-HeLa过滤后剩下的光谱曲线数量,在步骤四中可得到为{N2,N1}=2；
表示Li-A549和Li-HeLa这两个高光谱库交叉过滤后所剩光谱曲线数量的总和，在步骤四中可得到为
则Li-A549和Li-HeLa的相似性系数S＝0.572。
最终计算三种不同细胞中AuNPs高光谱库的S系数如表2所示。由表2可得知Li-A549和Li-HeLa两个高光谱库的S系数很小，说明这两个高光谱库十分相似，进而得知在A549和HeLa两种细胞内AuNPs所处的微环境是相似的。而Li-HepG2与Li-A549和Li-HeLa这两个AuNPs的高光谱库相似性相对较小，这也说明了HepG2中AuNPs的微环境与其它两种细胞有所差异，这可能是由于细胞中AuNPs表面蛋白冠的差异、AuNPs的团聚情况或者介电环境不同所导致的。同时这三种不同粒径AuNPs高光谱库的总S系数(0.107)较小，可以合并成一个通用的相对容量较小的高光谱库。合并方法如下：在高光谱数据处理软件ENVI 4.8中，收集Li-HeLa用Li-A549过滤后剩下的光谱和Li-HeLa用Li-HepG2过滤后剩下的光谱，用这些特征光谱与Li-A549整合到一起形成一个新的统一的光谱库记为Li-M(如图4)，在Li-M中拥有三种细胞中AuNPs的所有特征光谱，因此该高光谱库可以同时应用于识别这三种细胞中的AuNPs。
表2 A549、HeLa、HepG2细胞中AuNPs高光谱库的S系数
实施例3
本实施例提供一种通过分析细胞内外纳米银(AgNPs)光谱库相似性的方法来判断AgNPs进入细胞后光谱改变的程度，包括以下步骤：
步骤一：获取AgNPs的高光谱图片，其中包括AgNPs的位置信息和光谱信息。为了获取细胞内AgNPs的高光谱库，在六孔板中放入无菌盖玻片，将HepG2细胞接种在六孔板中生长24h以贴壁生长在盖玻片上，随后更换含有AgNPs的培养基，细胞吸收AgNPs后用PBS缓冲液清洗5遍，随后加入含2％多聚甲醛的PBS溶液将细胞固定。使用Cytoviva的增强暗场高光谱显微镜，对此吸收了AgNPs的HeLa细胞进行成像。为了获取细胞外AgNPs的光谱库，直接将AgNPs的原液滴在玻片上对AgNPs进行成像；
步骤二：利用ENVI 4.8软件中的Adjacent Band Averaging功能将高光谱图片进行平滑处理，再将获取的光源光谱把平滑后的高光谱图片进行光谱校正，最终得到如图5所示的高光谱图片；
步骤三：利用步骤二获取的高光谱图片，收集AuNPs的特征光谱曲线作为高光谱库。如图6所示，分别建立了细胞内AgNPs和细胞外AgNPs的高光谱库，且两种高光谱库的光谱曲线数量分别为720，725；
步骤四：在高光谱处理软件ENVI4.8中，利用Filter Spectral library功能对步骤三中收集的两个AuNPs的高光谱库交叉过滤，统计过滤后所剩下光谱曲线的个数。结果两者没有相似的光谱。
步骤五：根据步骤三和四获得的光谱曲线数，计算S系数，计算公式为：
可得到这两个光谱库的相似性系数S＝1。
这个结果说明了AgNPs在被细胞吸收后，其光谱发生了较大程度的改变，造成这种改变的原因可能是由于细胞内各种物质引起的，也有可能是AgNPs在细胞内团聚等行为造成的。总之S系数可以判断AgNPs在进入细胞后发生的变化，对研究其在细胞内光谱的变化程度有指导性的意义。
本发明提供了一种对不同金属纳米颗粒高光谱库之间的相似性进行定量分析的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (7)
1.一种对不同金属纳米颗粒高光谱库之间的相似性进行定量分析的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：获取金属纳米颗粒的高光谱图片，其中包括金属纳米颗粒的位置信息和光谱信息；
步骤二：将高光谱图片进行平滑处理，再用获取的光源光谱对平滑后的高光谱图片进行光谱校正；
步骤三：根据步骤二中平滑和校正后的金属纳米颗粒的高光谱图片，收集金属纳米颗粒的特征光谱曲线来构建金属纳米颗粒的高光谱库，并统计这些高光谱库中光谱曲线的总数；
步骤四：对步骤三中收集的多个金属纳米颗粒的高光谱库一一交叉过滤，统计过滤后所剩下光谱曲线的个数；
步骤五：计算高光谱库相似性系数S，从而定量分析不同金属纳米颗粒光谱库之间的相似性。
2.根据权利要求1所述的对不同金属纳米颗粒高光谱库之间的相似性进行定量分析的方法，其特征在于，步骤一中，所述金属纳米颗粒为在暗场高光谱成像***下能够建立相应的参考库并特异性识别的含金属元素的纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的对不同金属纳米颗粒高光谱库之间的相似性进行定量分析的方法，其特征在于，步骤一中，所述金属纳米颗粒为纳米金或纳米银。
4.根据权利要求1所述的对不同金属纳米颗粒高光谱库之间的相似性进行定量分析的方法，其特征在于，步骤二中，利用高光谱数据处理软件ENVI4.8中的Adjacent BandAveraging功能将高光谱图片进行平滑处理。
5.根据权利要求1所述的对不同金属纳米颗粒高光谱库之间的相似性进行定量分析的方法，其特征在于，步骤四中，在高光谱数据处理软件ENVI4.8中，利用Filter Spectrallibrary功能对步骤三中收集的多个金属纳米颗粒的高光谱库一一交叉过滤。
6.根据权利要求1所述的对不同金属纳米颗粒高光谱库之间的相似性进行定量分析的方法，其特征在于，步骤五中S的定义为：
式中Ni表示第i个高光谱库中的光谱曲线的数量；{Na,Nb}表示a库经过b库过滤后剩下的光谱曲线数量；
表示n个高光谱库交叉过滤后所剩光谱曲线数量的总和；S系数的大小体现了高光谱库之间相似性的大小，S系数越大，不同高光谱库内相似的光谱曲线越少，高光谱库的相似度越小。
7.根据权利要求4所述的对不同金属纳米颗粒高光谱库之间的相似性进行定量分析的方法，其特征在于，利用S系数判断高光谱库之间的相似性时，Spectral Angle Mapping的阈值选择为0.1。
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