CN114350837A - 用于检测柑橘apx基因家族的引物对、试剂盒及方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于检测柑橘APX基因家族的引物对、试剂盒及方法和应用，用于检测柑橘APX基因家族的引物对包括6对引物对，分别为CsAPX01～CsAPX05、CsAPX‑R，序列如SEQIDNO：1～SEQIDNO：12所示，利用引物对对柑橘APX家族的荧光定量PCR检测方法，提取待测样品的总RNA，采用试剂盒进行荧光定量PCR检测；本发明提供的6对引物能够通过荧光定量PCR方法快速、特异、准确检测出柑橘APX家族的表达特性，检测灵敏度高，检测结果准确、可靠，以鉴定抗坏血酸过氧化物酶APX基因家族在胁迫中对柑橘耐性机制的作用。

Description

用于检测柑橘APX基因家族的引物对、试剂盒及方法和应用

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及用于检测柑橘APX基因家族的引物对、试剂盒及方法和应用。

背景技术

生物或非生物胁迫会使植物产生过多的活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)，造成细胞膜和细胞器的不同程度损伤(Mittleret al.，2011；Mittleret al.，2004)。植物在细胞器中形成的多种同工酶或非酶的抗氧化防御***，保证了细胞中的活性氧能够维持在正常水平。这个体系包括：清除超氧自由基的超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)和清除过氧化氢的过氧化物酶(Peroxidase，POD)等。过氧化物酶如谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathioneperoxidase，GPX)、抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbateperoxidase，APX)、三型过氧化物酶(ClassIIIperoxidase，CIIIprx)和过氧化氢酶(Catalase，CAT)等，是广泛存在于动物、植物和微生物中的活性物质，其功能主要是催化过氧化氢(H₂O₂)和其他过氧化物的清除。其中，APX与H₂O₂的亲和力最强，是非常重要的一种过氧化物酶(苗雨晨等，2005)。植物APX基因家族由4个亚家族组成，分别是细胞质、叶绿体、线粒体和过氧化物酶体基因亚家族(Shigeruet al.，2002；Apelet al.，2004)。在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中已经鉴定出8个AtAPX基因家族成员，它们编码3个细胞质型APX，3个过氧化物酶体型APX和2个叶绿体型APX(Panchuket al.，2002；Narendraet al.，2006)。APX基因编码的蛋白功能随其亚细胞定位的不同而产生差异，位于线粒体中的APX主要参与清除脂肪酸的β氧化产生的H₂O₂(Andréiaet al.，2014)，细胞质型OsAPX2基因在维护H₂O₂稳态中起重要作用(Wuet al.，2018)，过氧化物酶体型OsAPX4的沉默会导致水稻的早衰(Guanet al.，2010)。

APX基因在不同植物的生长发育和对外界环境胁迫的响应中起着非常重要的作用。与野生型(生态型Col-0)相比，拟南芥的AtAPX1突变体生长缓慢，对氧化应激敏感(Pnuelinet al.，2010)。在拟南芥AtAPX6突变体中，ROS含量增加，萌发频率降低(Chenetal.，2014)。水稻(OryzaSAtiva)OsAPX2突变体具有半矮化苗、黄绿色叶片和不育种子(Zhanget al.，2013)。烟草(Nicotiana tabacum)中过氧化物酶体抗坏血酸过氧化物酶(SbAPX)的表达增强了对干旱胁迫的耐受性(Singhet al.，2014)。不同胁迫下APX基因在番茄、高粱、大豆、黄瓜、紫花苜蓿、毛果杨和陆地棉等不同植物中的鉴定和表达分析也有报道，大量研究报道了APX在干旱、热、盐、氧化和生物胁迫中对植物耐性调控的作用。

另有相关激素和病菌诱导的研究报道，在棉花胚珠离体培养中，缺铁诱导抗坏血酸升高可能是通过抑制APX来减缓脱落酸(Abscisic acid，ABA)下降的反馈调节途径(Guoet al.，2017)。镉胁迫下水稻根和地上部OsAPX的活性降低，而茉莉酸(Jasmonicacid，JA)的加入使水稻植株OsAPX的活性恢复并保持稳定(Singhet al.，2014)。甘蔗接种黑穗病菌48h内，抗病品种(崖城05-179)APX活性显著高于感病品种(柳城03-182)(王竹青等，2015)。Schenk等以拟南芥为材料研究发现，水杨酸(Salicylic acid，SA)和乙烯(Ethylene，ET)的信号途径参与了茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)对脂肪氧化酶(Lipoxygenase，LOX)、CAT、APX和H₂0₂的调节。程华等诱导表达分析研究表明，在银杏胞质细胞中GbAPX1受到ABA、SA、MeJA和紫外辐射均能诱导其转录上升，而乙烯和伤害处理对GbAPX1转录水平无显著影响。

此外，在柑橘中有关APX研究表明，卡利比克毕赤酵母(Pichiacaribbica)通过诱导柑橘产生防御酶、植物保卫素以及调节活性氧代谢来增强柑橘自身的抗病能力，其中涉及到不同程度的提高了APX的活性(陈燕，2013)。用酵母接种或浸泡处理柑橘果实都可以诱导提高果实的APX活性，同时诱导H₂O₂、还原型抗坏血酸(ASA)等含量的提高，使柑橘果实对青绿霉病害抗病性的增强(罗杨，2011)。大雅柑橘在ASA-GSH循环中，硒镉伴生使H₂O₂和ASA含量显著上升，在ASA-GSH循环中，硒镉伴生使H₂O₂和ASA含量显著上升，借此来调整ASA-GSH氧化循环来维持机体的稳定性(孙协平等，2020)。在枳和香橙中，叶片中的APX活性在干旱胁迫下迅速增加，从而减少干旱胁迫下对植株本身造成伤害(钟景，2012)。APX对于柑橘在高温或水分胁迫的联合逆境中至关重要(Balfagónet al.，2018)。

研究植物体受病原菌侵染后生理生化的变化，对于揭示植物抗病机制有着重要的作用。由于受寄主种类及病原菌种类不同的影响，植物受病原菌侵染后的ROS平衡也会发生变化。因此，检测柑橘体内ROS调控酶APX含量，以探明APX基因家族在胁迫中对柑橘耐性机制的作用尤为重要。有关APX的研究中，大多在于不同环境胁迫与植物体内APX表达量变化之间的关系，由此更加凸显了检测柑橘体内APX含量的重要性。同时，ABA、SA、JA等激素是植物的生长发育，生物和非生物胁迫响应过程中的重要信号分子，研究APX家族对这些激素的响应，也能鉴定与生长发育，生物和非生物胁迫相关的候选基因。所以，亟需设计一种能检测柑橘体内APX含量的试剂盒，检测在各种逆境状态下的表达模式，获得逆境相关的APX基因，用以进行抗逆分子育种。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测柑橘APX基因家族的引物对、试剂盒及方法，用于检测柑橘体内APX含量，以鉴定抗坏血酸过氧化物酶APX基因家族在胁迫中对柑橘耐性机制的作用。

本发明通过下述技术方案实现：

用于检测柑橘APX基因家族的引物对，包括6对引物对，分别为CsAPX1～CsAPX5和CsAPX-R，序列如SEQIDNO：1～SEQIDNO：12所示。

本发明针对柑橘的6种抗坏血酸过氧化物酶基因设计了引物，通过合理筛选获得了上述引物对能够实现对柑橘的抗坏血酸过氧化物酶基因家族进行检测。

用于检测柑橘APX基因家族试剂盒，包括上述引物对。

进一步地，还包括PCR检测的反应体系用试剂。

进一步地，反应体系用试剂包括2×SP SYBRG荧光染料。

进一步地，反应体系用试剂还包括H₂O和cDNA。

进一步地，还包括内参引物对，序列如SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:14所示。

柑橘APX基因家族的检测方法，提取待测样品的总RNA，利用上述试剂盒进行荧光定量PCR检测。

进一步地，荧光定量PCR检测的反应体系为12μL体系为：4.4uL H₂O，0.3μL 10mM上、下游引物，6μL2×SP SYBRG荧光染料，1μL cDNA。

进一步地，荧光定量PCR检测的反应条件为：循环前50℃60S，95℃2min；循环95℃5S，60℃5S，共40个循环。

上述引物对或试剂盒在柑橘遭逆境(如受病原菌侵害和外源激素诱导)时产生防御机制APX表达量检测中的应用。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明全面鉴定了柑橘APX基因家族，针对柑橘的6个APX基因设计了定量引物(表1)，用于检测柑橘体内APX的表达量，以分析APX基因在柑橘响应胁迫的功能。首先，以拟南芥的APX家族蛋白序列为基础(有关植物APX基因的研究在模式植物拟南芥中最为***和深入)，在甜橙基因组数据库(http://citrus.hzau.edu.cn/)第三版中进行BLAST比对，比对了全基因组，并从多对引物中筛选确保特异性，并进行PCR反应和通过琼脂糖凝胶电泳检测了其特异性，通过两个品种(柑橘溃疡病抗性品种金柑和感病品种晚锦橙)进行了检测了其在柑橘通用性等，APX基因家族所有引物均通过多重验证得出。

2、本发明通过特定的引物进行多次实验后确定了本申报中的最佳PCR反应体系，分别鉴定出了各种柑橘的6种APX在各种激素诱导和溃疡病菌诱导下的表达特性，有利于研究柑橘的抗逆特性。

3、本本发明提供的6对引物能够通过荧光定量PCR方法快速、特异、准确检测出柑橘APX家族的表达特性，前期大量的试验结果表明该检测方法灵敏度高，检测结果准确严谨，为柑橘抗逆研究打下基础。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为柑橘APX家族的实时引物位置示意图。

图2为柑橘APX家族表达检测PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；图A的PCR模板为金柑，图B模板为晚锦橙，M为分子量标准。

图3为柑橘APX家族的功能结构域图；利用Pfam对6个CsAPX进行功能结构域分析，结果表明CsAPX家族成员均含有典型的Peroxidase功能结构域，末尾数字为氨基酸数。

图4为柑橘APX家族的基因结构图；基因结构由GSDS软件分析，基因长度呈比例。

图5为柑橘与拟南芥中APX家族的***发育树；AtAPXs：拟南芥APX成员；CsAPXs：柑橘APX成员；拟南芥APX蛋白序列获取自RedoxiBase数据库，比对采用蛋白的全长序列进行，进化树采用最大似然法(Maximumlikelihood，ML)和泊松(Poisson)模型。

图6为柑橘APX家族受SA诱导表达分析图；柱上不同大小写字母表示差异显著(P<0.05)，小写字母表示晚锦橙差异显著，大写字母表示金柑差异显著。下同。

图7为柑橘APX家族受JA诱导表达分析图。

图8为柑橘APX家族受ABA诱导表达分析图。

图9为柑橘APX家族受溃疡病菌侵染诱导表达分析图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1：

一、材料与方法：

实验品种为晚锦橙和金柑，叶片取自西南大学/中国农业科学院柑桔研究所改良中心苗圃。植物RNA提取试剂盒购自北京艾德莱公司，引物由北京擎科生物技术有限公司合成，反转录试剂盒及实时荧光染料购于TAKARA公司。

二、柑橘APX家族的生物信息学分析

以拟南芥的APX家族蛋白序列为输入，在甜橙基因组数据库(http://citrus.hzau.edu.cn))第三版中进行BLAST比对，获得柑橘APX家族的蛋白序列，并检索获得其对应的编码框架序列；用在线软件ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)对氨基酸序列的分子量、理论等电点(Isoelectric point，pI)进行预测；在线(http://citrus.hzau.edu.cn/cgi-bin/orange/blast)分析基因内含子、外显子数目等；使用MEGAX与拟南芥APX家族进行比对和***发育树的构建；使用MEME和GSDS进行蛋白结构域和基因结构分析，柑橘APX家族的序列分析如表1和表2所示：

表1柑橘APX家族基本特征

表2柑橘APX家族二级结构

对柑橘APX家族进行了鉴定和理化性质分析，最终从柑橘基因组中鉴定到6个APX成员。CsAPX基因的数量明显低于拟南芥(8个APX基因)的报道，这一差异可能表明APX基因在木本植物中执行更为复杂的功能。这些CsAPX基因编码蛋白的长度在250(CsAPX01、CsAPX02)～414(CsAPX05)个氨基酸；其分子量变化范围为27558.22-44931.81Da；等电点(PI)分布在5.55(CsAPX01)～8.62(CsAPX06)，柑橘的大多数APX为酸性蛋白；CsAPX01编码的氨基酸脂肪指数最低(75.4)，CsAPX03的最高(89.93)，其余脂肪指数分布在77.66～83.81。蛋白质不稳定系数分布在33.06～48.78，其中CsAPX-R最不稳定。经亚细胞定位分析，柑橘CsAPX在细胞质(CsAPX01～04)、叶绿体(CsAPX05、CsAPX-R)均有分布(表1)。

经分析，柑橘中CsAPX基因大部分定位于细胞质中，也有两个位于叶绿体上，可以推测，它的功能与多位点的表达是不同的，它可以通过多种机制和多种细胞器清除细胞内多余的ROS，从而实现抗氧化功能。

经二级结构分析发现，这些蛋白均由α-螺旋、β-转角、伸展链和不规则卷曲构成，且主要以α-螺旋和不规则卷曲为主，占比较少的为伸展链(9.34％～28.09％)和β-转角(6.42％～9.17％)。但CsAPX-R是一种特殊的二级结构，它主要以伸展链和不规则卷曲为主(表2)。

三、柑橘叶片的激素和溃疡病菌诱导处理

1)、激素诱导：

将新鲜叶片(直径＝7mm)浸泡在不同的激素(SA：10μmol·L^-1、ABA：1000μmol·L^-1、JA：1000μmol·L^-1)中，然后在0h、6h、12h、24h后取样。

2)、溃疡病诱导：

使用75％的乙醇对清洗干净的感病品种晚锦橙和抗病品种金柑的叶片进行消毒，后在无菌培养皿内摆放两片浸无菌水的棉花(棉花水量保持挤压出水，不挤压则不出水的湿润状态)，将叶片背面朝上，叶柄放入棉花夹层中保持湿润。叶片下表皮注射OD600＝0.5的溃疡病菌悬液，对照注射无菌LB液体培养基，置于28℃光照培养。分别于0h、6h、12h、24h切取叶片的接种部位提取总RNA并反转录成cDNA保存。以cDNA为模板用CsAPXs和CsGAPDH的qRT-PCR引物测定APX相对表达量。每个处理进行3次生物学重复和3次技术重复。

四、RNA提取和反转录

1)、提取总RNA：

取50μLPLANTaid和500μL裂解液RLT充分混合均匀备用。将0.1g植物叶片放入1.5mL离心管中，用研磨枪在液氮中磨至样品为白色粉末。向离心管中加入550mL一开始的的混合物，并立即在涡旋振荡器上涡旋30秒，使得材料与裂解物充分接触以促进完全裂解。裂解物于13000r/min离心10min，沉淀匀浆。取上清液400μL加入到一个内有200μL(1/2体积)无水乙醇的1.5mL离心管中，吹打混匀。立刻将混合物加入吸附柱，13000r/min离心2min，弃废液。加入350μL去蛋白液RW1，室温放置1min，13000r/min离心30s，弃废液(此步骤再重复一次，确保蛋白除干净)。吸附柱中加入50μL含有DNA酶的混合液，室温放置30min。加入500μL漂洗液，12000r/min离心30s，弃废液(此步骤再重复一次，确保RNA漂洗干净)。后空管离心，13000r/min离心1min，力求除干净漂洗液。取出吸附柱放入1.5mL离心管中，将30μLRNasefreewater滴加在吸附膜的正中间部位，室温放置1min，12000r/min离心1min，即得RNA。检测所提RNA的浓度并记录，后放入-80℃冰箱保存。

2)、反转录：

RecombiantDNaseI(RNase-free)、PrimeScript^TM RTMasterMix、2×TaqPCRMix、限制性内切酶kit、T4DNALigase均购自TAKARA生物科技有限公司。

五、引物设计和实时荧光定量PCR分析

利用NCBI中PrimerBlast设计柑橘APX家族的定量PCR引物，充分考虑在柑橘基因组中的特异性，并尽量跨内含子区。共设计了6种APX基因的引物，这些引物的位置如图1所示。对这6对引物进行PCR反应、通过琼脂糖凝胶电泳检测了其特异性，在两个品种(柑橘溃疡病抗性品种金柑和感性品种晚锦橙)中进行检测证实了其柑橘多品种的通用性(图2)。以CsGAPDH基因为内参(SEQIDNO：13～SEQIDNO：14)，柑橘叶片的激素和溃疡病菌诱导后提取的cDNA为模板，使用表3所示的特异性引物通过实时逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，分析这6个基因的诱导表达特性。具体的反应体系和参数为：12μL体系：4.4uLH₂O，0.3μL10mM上游引物，0.3μL10mM下游引物，6μL2×SYBRG荧光染料，1μLcDNA。反应条件：循环前50℃60S，95℃2min；循环95℃5S，60℃5S，共40个循环。相对表达量采用2^-ΔΔCt法计算，使用Excel软件统计数据。

表3柑橘APX家族表达检测用的引物

六、结果分析与讨论

1.柑橘APX家族的信息学分析，如图3～图5所示。

结构域代表了蛋白质的基本功能单位(Copleyet al.，2002)，分析蛋白质的进化应该根据结构域来分析，而不是整个蛋白质(Kooninet al.，2000)。利用Pfam对6个CsAPX进行功能结构域分析，如图3结果表明CsAPX家族成员均含有典型的1个功能结构域，都含有Peroxidase结构域，血红素过氧化物酶是一种含血红素的酶，它利用H₂O₂作为电子受体来催化许多氧化反应。蛋白序列的比对发现过氧化酶结构域高度保守。CsAPX与拟南芥、水稻等物种都含有相同的保守抗坏血酸过氧化物酶结构域(PF00141)。AcAPX的保守元件与其他物种的APX基因非常相似(Yuet al.，2018)，这表明APX在进化上高度保守。

为更好地了解CsAPX的结构特点，利用GSDS对CsAPX的基因结构进行了分析和展示，发现6个基因均含9～12个外显子；CsAPX01/02/04包含8个内含子，CsAPX03包含9个内含子，CsAPX05包含11个内含子，CsAPX-R包含10个内含子(图4)。结合***进化树(图5)，发现相同亚家族基因具有相似基因结构，但内含子并非完全一致，其长度上有较大变异；柑橘CsAPX家族第I-A亚家族中的基因大多含9个外显子。

为了研究APX家族在多个物种中的进化关系，使用最大似然法构建了包含柑橘、拟南芥2个物种APX家族的***发育树(图5)。构建的ML***发育树表明，根据用于AtPAX鉴定的分支，CsAPX可以划分为两个不同的分支。根据***进化树，2个物种的14个APX蛋白(柑橘6个、拟南芥8个)，分为Ⅰ、Ⅱ个亚家族，其中I亚家族又可以分为A、B两个分支。根据***发育结果，CsAPX01-AtAPX01、CsAPX02-AtAPX02、CsAPX03-AtAPX03、CsAPX04-AtAPX04、CsAPX05-AtAPX05/AtAPX06和CsAPX-R-AtAPX-R这些对的基因表现出密切的关系，表明其种间同源性，也显示出柑橘和拟南芥的种内同源性。

2.柑橘APX家族受激素诱导表达分析，如图6～图8所示。

使用该试剂盒检测了6个CsAPX在3种与生物胁迫应答相关的植物激素和溃疡病菌诱导下的表达情况，证实了APX在不同激素和溃疡病菌诱导下的表达模式，供试qRT-PCR引物根据多重验证得到，确保两个品种qRT-PCR结果可以真实反映CsAPX在溃疡病抗、感品种中的表达模式。

ABA、JA和SA在细菌应激反应转导通路中作为信号分子。采用qRT-PCR方法检测外源性激素的诱导实验，探讨CsAPXs与SA、JA、ABA的相互作用。在晚锦橙和金柑片中，6个CsAPX表达均受SA、JA和ABA诱导，但其诱导模式存在差异。

SA诱导时，CsAPX01、CsAPX02、CsAPX03、CsAPX04、CsAPX05、CsAPX-R这6个基因在金柑中均在6h表达量最大，在晚锦橙中无显著差异。CsAPX01、CsAPX03、CsAPX04的表达量在金柑和晚锦橙中表现出相反趋势(图6)。

JA诱导时，在金柑中CsAPX02、CsAPX03、CsAPX04、CsAPX05、CsAPX-R均在6h表达量最大，晚锦橙中CsAPX01、CsAPX04、CsAPX05、CsAPX-R在诱导的12h表达量最高(图7)。

ABA诱导时，金柑中CsAPX01、CsAPX02、CsAPX04、CsAPX05、CsAPX-R在诱导的6h表达量最高，相比之下，ABA诱导的这些基因在晚锦橙中的表达没有显著差异，只有CsAPX01和CsAPX04在晚锦橙中表现为，12h的表达量最高(图8)。

有研究发现将SA喷施到拟南芥上，不仅诱导病原相关蛋白(PR)基因的上调表达，而且能获得***性抗性，从而使植物对病原菌的抵抗能力普遍增强(Rushtonet al.，2010)。植物激素与植物抗病密切相关，但不同激素的信号途径交叉，有时相互拮抗(Spoelet al.，2007)。在激素处理下6个基因在两个品种中均有不同程度的响应，SA诱导时，CsAPX01的表达量在金柑和晚锦橙中表现出相反趋势；JA诱导时，这6个基因在晚锦橙中的表达量中与在金柑中的表达量趋势基本相反；ABA诱导时，金柑的表达量增加，相比之下，ABA诱导的这些基因在晚锦橙中的表达差异性没有金柑显著。这三种激素的差异表达与柑橘的生物胁迫和非生物胁迫相关，推测CsAPX通过调节激素变化响应溃疡病菌诱导从而参与柑橘抗病过程。柑橘APX基因家族试剂盒为进后续的一步研究提供了基础。

3.柑橘APX家族受溃疡病菌诱导表达分析，如图9所示。

溃疡病菌侵染后，6个基因在两个品种中均有不同程度的响应。CsAPX01在晚锦橙和金柑中，表达量均先是下降、再上升的趋势；CsAPX02的表达量在晚锦橙中先下降再上升，而在金柑中是先上升再下降。其余基因在晚锦橙和金柑中的受溃疡病诱导的程度不大(图9)。

本研究发现CsAPX01和CsAPX02在柑橘溃疡病菌诱导下表达水平明显高于家族其他基因；在感病品种晚锦橙中CsAPX01和CsAPX02上调表达，表明该基因参与柑橘的基础免疫。CsAPX02在晚锦橙中的表达量增长幅度高于金柑，推测在感病品种中经溃疡病菌诱导产生更多的H₂O₂，从而激活植物过敏反应，且在同源基因中拟南芥AtAPX01一直处于最高的表达水平，在非生物逆境胁迫响应过程中，AtAPX01对盐、干旱和热胁迫均有响应(Liet al.，2019)，这与柑橘中CsAPX01在溃疡病处理下的表达量一致。相关研究表明，受柑橘溃疡病菌诱导后基因的表达差异性可能与抗病过程相关，比如CsBZIP40(Jiaet al.，2017)、CsXTH04(Liet al.，2019)和CSAP2-09(Savelliet al.，2019)等在抗、感品种中以相反模式响应溃疡病菌侵染的基因，经功能验证均与溃疡病发生有紧密关系。由此推断CsAPX01和CsAPX02可能参与抗溃疡病相关反应。

综上，由柑橘APX基因家族试剂盒筛选得出CsAPX01、CsAPX02可能在柑橘抗溃疡病发生的早期发挥着关键的基础免疫作用，可在后续对其功能进行深入研究。同理，将柑橘APX基因家族试剂盒用去检测其他生物或非生物逆境胁迫中的柑橘中APX的表达量也是可行的。方便、快捷、准确地检测在各种逆境状态下APX的表达模式，获得逆境相关的APX基因，用以进行抗逆分子育种。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 西南大学

<120> 用于检测柑橘APX基因家族的引物对、试剂盒及方法和应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列1(1)

<400> 1

gtgccacaag gagaggtctg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列2(2)

<400> 2

cagtcaagag ctccgtgaag t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列3(3)

<400> 3

gcggggactt atgacgtgaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列4(4)

<400> 4

tgagcaagct catctgggtg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列5(5)

<400> 5

gtggagttgc tgaatgggga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列6(6)

<400> 6

cgacggaact cagggtcttc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列7(7)

<400> 7

tcgctcctgg aagaaaggac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列8(8)

<400> 8

tacaccttga gcggcatcag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列9(9)

<400> 9

aacattgagg agtggcctcg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列10(10)

<400> 10

gcattcacaa gcccagcatt 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列11(11)

<400> 11

ttcatcaact gcctccagcc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列12(12)

<400> 12

aatttgggag cgaggagagg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列13(13)

<400> 13

gctttccgtg tacccactgt 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列14(14)

<400> 14

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Claims (10)

1.用于检测柑橘APX基因家族的引物对，其特征在于，包括6对引物对，序列如SEQ IDNO:1～SEQ ID NO:12所示。

2.用于检测柑橘APX基因家族试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物对。

3.根据权利要求2所述的用于检测柑橘APX基因家族试剂盒，其特征在于，还包括PCR检测的反应体系用试剂。

4.根据权利要求3所述的用于检测柑橘APX基因家族试剂盒，其特征在于，所述反应体系用试剂包括2×SP SYBRG荧光染料。

5.根据权利要求4所述的用于检测柑橘APX基因家族试剂盒，其特征在于，所述反应体系用试剂还包括H₂O和cDNA。

6.根据权利要求2所述的用于检测柑橘APX基因家族试剂盒，其特征在于，还包括内参引物对，序列如SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:14所示。

7.柑橘APX基因家族的检测方法，其特征在于，提取待测样品的总RNA，利用权利要求2-6任一项所述试剂盒进行荧光定量PCR检测。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR检测的反应体系为12μL体系：4.4uL H₂O，0.3μL 10mM上游引物，0.3μL 10mM下游引物，6μL2×SP SYBRG荧光染料，1μL cDNA。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR检测的反应条件为：循环前50C°60S，95℃2min；循环95℃5S，60℃5S，共40个循环。

10.如权利要求1所述引物对或权利要求2-6任一项所述试剂盒在柑橘受病原菌侵害时产生防御机制APX表达量检测中的应用。

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