CN114350691A

CN114350691A - 一种高效表达透明质酸水解酶的基因及其表达方法

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Publication number: CN114350691A
Application number: CN202110246672.0A
Authority: CN
Inventors: 王浩; 张天萌; 徐荣荣; 张由恒; 郭学平; 郝井坤
Original assignee: Bloomage Biotech Co Ltd
Current assignee: Bloomage Biotech Co Ltd
Priority date: 2021-03-05
Filing date: 2021-03-05
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2041-03-05
Also published as: WO2022183542A1; EP4303300A1; US20240150742A1; CN114350691B; JP2024508555A

Abstract

本发明提供一种高效表达透明质酸水解酶的基因，其核苷酸序列如SEQID NO.4所示。本发明通过在全长透明质酸水解酶基因的N端截掉了一段自身信号肽序列，构建了高水平表达基因工程透明质酸水解酶的毕赤酵母工程菌，使用所构建的毕赤酵母工程菌高密度发酵得到的发酵液中透明质酸水解酶的酶活高达4.7×10⁵U/mL。因此，将有利于进一步降低工业化生产山大齿猛蚁透明质酸水解酶的成本，从而扩大透明质酸酶在医药、化工及食品领域的应用范围。

Description

一种高效表达透明质酸水解酶的基因及其表达方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及一种高效表达透明质酸水解酶的基因及其表达方法。

背景技术

透明质酸酶(Hyaluronidase,HAase)是一类能够作用于透明质酸糖链β-1，3或β-1，4糖苷键来降解透明质酸的酶的总称，广泛分布于自然界中。透明质酸酶可以作为一种药理活性物质在临床上具有比较广泛的应用。例如在眼科手术中与局麻药合用，加快***的起效速度；促使眼局部积贮的药液、渗出液或血液的扩散，促使眼玻璃体浑浊的吸收、预防结膜化学烧伤后眼球粘连，并消除有关的炎症反应；透明质酸填充是整形美容的一个重要手段，但可能会发生透明质酸并发症，透明质酸水解酶作为可以用来水解透明质酸的最有效物质，可以有效治疗以上不良反应；透明质酸酶联合抗肿瘤药物辅助皮下给药，代替静脉穿刺，提高患者医疗体验，是目前市场应用热点，潜力巨大。另外，透明质酸酶作为工具酶能够高效制备低分子量透明质酸及透明质酸寡糖，更容易被机体吸收利用，在食品和化妆品领域也具有巨大的市场前景。

根据HAase的来源、催化机制和底物特异性差异，将其划分为三类。第一类为微生物来源的透明质酸裂解酶，这类HAase(EC 4.2.2.1)通过β消旋反应裂解透明质酸的β-1，4糖苷键，主要产物为不饱和的双糖分子2-acetamido-2-deoxy-3-O-(β-D-gluco-4-enepyranosyluronicacid)-D-glucose。这类透明质酸裂解酶主要来源于Clostridium,Micrococcus,Streptococcus,Bacillus及Streptomyces等菌属。第二类代表性的HAase(EC3.2.1.36)主要来源于水蛭唾液腺和十二指肠虫，属于内切-β-葡萄糖醛酸苷酶，能够水解透明质酸的β-1，3糖苷键，终产物以饱和的透明质酸四糖为主，含有少量的透明质酸六糖。这类HAase对底物的专一性强，对硫酸软骨素和硫酸皮肤素结构基本不具有水解和转糖苷活性。第三类透明质酸酶为内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.35)，主要来源于哺乳动物的睾丸及动物的毒液，能够水解透明质酸的β-1，4糖苷键，终产物主要为透明质酸四糖。这类酶的底物谱较宽，对硫酸软骨素和硫酸皮肤素结构也有一定的催化活性，且具有转糖苷活性。

第一类透明质酸裂解酶和第二类内切-β-葡萄糖醛酸苷酶的研究已有较多的文献报道。尽管也有对第三类内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的研究报道，但主要集中于哺乳动物睾丸来源的PH20酶，鲜有对动物毒液透明质酸酶的报道。2017年，Kohei Kazuma等首次基于转录组和多肽组学技术对山大齿猛蚁毒液组分进行了完全分析，鉴定了一段全长透明质酸水解酶序列。目前，尚无对山大齿猛蚁透明质酸水解酶重组表达的相关报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种高效表达透明质酸水解酶的基因及其表达方法。

具体来说，本发明涉及如下方面：

1、一种高效表达透明质酸水解酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2、根据项1所述的透明质酸水解酶基因编码的蛋白质，其序列如SEQ ID NO.5所示。

3、一种重组表达载体，其包含项1所述的核苷酸序列。

4、根据项3所述的重组表达载体，其中质粒骨架为毕赤酵母载体pPIC系列或pGAP系列或pAO815，优选pPIC9K。

5、一种毕赤酵母，其包含项3或4所述的表达载体。

6、一种生产透明质酸水解酶的方法，其包括如下步骤：

利用含有项1所述的透明质酸水解酶基因的重组毕赤酵母菌株或项5所述的毕赤酵母来生产透明质酸水解酶。

7、根据项6所述的方法，其中所述毕赤酵母为GS115、KM71或SMD1168。

8、根据项6所述的方法，其中所述方法包括使用BMMY培养基，甲醇诱导来发酵生产透明质酸水解酶。

9、根据项8所述的方法，其中所述发酵条件为：发酵温度为25℃-30℃，发酵过程中每隔24h补加0.5％-1％(v/v)甲醇，诱导表达96h。

10、根据项6所述的方法，其中所述方法包括使用BSM培养基，甲醇诱导来发酵生产透明质酸水解酶。

11、根据项10所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：

将毕赤酵母接种到种子培养基，得到种子液；

将种子液接种到BSM发酵培养基中进行发酵得到含有透明质酸水解酶的发酵液，其中发酵过程依次包括初始发酵，补料，饥饿培养，和甲醇诱导四个阶段。

12、根据项11所述的方法，其中初始发酵的条件为：发酵温度为25℃-30℃，pH为5-7。

13、根据项11所述的方法，其中饥饿培养的时间为2-3h。

14、根据项11所述的方法，其中甲醇诱导的温度为25℃-30℃，时间为80-120h。

15、根据项11所述的方法，其中所述方法还包括对发酵液进行纯化。

16、根据项15所述的方法，其中所述纯化采用镍柱介质进行亲和层析，并使用100-500mM的咪唑缓冲液进行梯度洗脱。

17、项2所述的蛋白质在制备含有透明质酸的辅药、食品及化妆品中的应用。

本发明通过在全长透明质酸水解酶基因的N端截掉了一段自身信号肽序列，构建了高水平表达基因工程透明质酸水解酶的毕赤酵母工程菌，使用所构建的毕赤酵母工程菌高密度发酵得到的发酵液中透明质酸水解酶的酶活高达4.7×10⁵U/mL。因此，将有利于进一步降低工业化生产山大齿猛蚁透明质酸水解酶的成本，从而扩大透明质酸酶在医药、化工及食品领域的应用范围。

附图说明

图1为密码子优化的山大齿猛蚁透明质酸水解酶基因与野生型基因的核苷酸序列比对图。

图2为重组透明质酸水解酶发酵上清液SDS-PAGE图。其中，泳道M代表分子量为180kDa的标准蛋白；泳道1代表重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K发酵上清液(阴性对照)；泳道2代表密码子优化重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-HYAL_OM^opt发酵上清液(阳性对照)；泳道3代表本发明构建的重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM^opt发酵上清液。

图3为DNS法测定的密码子优化重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-HYAL_OM^opt及本发明构建的重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM^opt发酵上清粗酶活。

图4为重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM^opt在5-L发酵罐中高密度培养的生物量及酶活曲线。

图5为重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM^opt发酵上清液经不同浓度咪唑缓冲液梯度洗脱后的SDS-PAGE图。其中，泳道M代表分子量为180kDa的标准蛋白；泳道1-4分别代表咪唑浓度为100mM、200mM、300mM、500mM。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。

如本文所使用的，术语“基因”或“编码序列”是指编码基因产物的体外或体内的核苷酸序列。在一些情况下，基因由或基本上由编码序列组成，即，编码基因产物的序列。在其它情况中，基因包括附加的非编码序列。例如，基因可以或可以不包括编码区之前和之后的区域，例如5’非翻译(5’UTR)或“前导”序列和3’UTR或“非转录尾区(trailer)”序列，以及各个编码区段(外显子)之间的***序列(内含子)。

如本文所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链。

如本文所使用的，术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。

如本文所使用的，术语“载体”用于描述可以被工程化以含有可以在宿主细胞中扩增的克隆的一种多核苷酸或多种多核苷酸的核酸分子。载体包括但不限于：单链，双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个游离末端，没有游离末端(例如环状)的核酸分子；包含DNA，RNA或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多核苷酸种类。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以***额外DNA片段的环状双链DNA环，例如通过标准分子克隆技术。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的那些基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。重组表达载体可以包含适于在宿主细胞中表达核酸的形式的本发明的核酸，这意味着重组表达载体包括一种或多种调节元件，其可以基于用于表达的、可以与待表达的核酸序列可操作地连接的宿主细胞来选择。

如本文所使用的，密码子优化是指在维持天然氨基酸序列的同时，通过用目的宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子来修饰核酸序列以在该宿主细胞中增强表达的过程。多种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏倚。密码子偏倚(生物体之间密码子选用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而信使RNA(mRNA)的翻译效率继而被认为尤其取决于所翻译密码子的特性和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。所选择tRNA在细胞中的优势通常反映了肽合成中最频繁使用的密码子。因此，可基于密码子优化来定制基因以在给定生物体中进行最佳基因表达。

密码子优化可以例如通过将一种物种的核苷酸序列转化为不同物种的遗传序列来实现。优化的密码子有助于实现更快的翻译速度和更高的准确性。由于这些因素，预计在高表达基因中翻译选择会更强。然而，尽管本文考虑了使用优化的密码子来表达公开的蛋白质，但是本文考虑了用于编码任何公开的蛋白质的核酸的所有可能的密码子。

如本文所使用的，术语“信号肽”意指存在于大多数新合成蛋白质的N-末端的短肽(通常为16-30个氨基酸)，这些蛋白质预定要进入分泌途径。其也可以称为信号序列、靶向信号、定位信号、定位序列、转运肽、前导序列或前导肽。信号肽通常通过信号肽酶从蛋白质切割下来。

具体地，首先针对山大齿猛蚁透明质酸水解酶全长基因序列，根据毕赤酵母密码子偏好性对其进行了密码子优化得到密码子优化的透明质酸水解酶基因，其序列如SEQ IDNO.1所示，由它编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示，这与野生型山大齿猛蚁透明质酸水解酶基因编码的氨基酸序列一致。进一步地，在密码子优化的透明质酸水解酶基因的N端截掉一段自身信号肽序列(SEQ ID NO.3)，得到本发明高表达透明质酸水解酶基因，其序列如SEQ ID NO.4所示，由它编码的蛋白质序列如SEQ ID NO.5所示。在SEQ ID NO.1所示的密码子优化的透明质水解酶基因的N端去掉SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列不引起翻译移码，能表达透明质酸水解酶并显著提高重组透明质酸水解酶的表达量和/或酶活。在N端截掉信号肽的方法可以采用任何现有技术已知的方法。

其中，山大齿猛蚁透明质酸水解酶属于第三类透明质酸酶，为内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，能够水解透明质酸的β-1，4糖苷键，产生终产物的还原端为N-乙酰氨基葡萄糖。另外，这类酶相比于第二类的水蛭透明质酸水解酶底物谱较宽，对软骨素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素结构也有一定的催化活性。山大齿猛蚁透明质酸水解酶能够丰富透明质酸水解产物的种类，还可以具有除透明质酸酶催化以外的更广泛的应用范围。

毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。毕赤酵母的另一个生物学特点是，甲醇代谢所需的醇氧化酶被分选到过氧化物酶体中，形成区域化。以葡萄糖作碳源时，菌体中只有1个或很少几个小的过氧化物酶体，而以甲醇作碳源时，过氧化物酶体几乎占到整个细胞体积的80％，AOX增至细胞总蛋白的35％-40％。因此，当在AOX基因前利用同源重组方式***外源蛋白基因时，可获得大量表达。同时，根据甲醇酵母这种可以形成过氧化物酶体的特性，既可利用该***表达一些毒性蛋白和易被降解的酶类，也可用以研究细胞特异区域化的生物发生及其机制和功能，为高等动物类似的研究提供启示。

如图1所示，优化后的山大齿猛蚁透明质酸水解酶基因与野生型基因序列同源性为73.2％。

本发明还提供一种重组表达载体，其包含本发明的核苷酸序列。进一步地，所述重组表达载体的骨架为毕赤酵母载体pPIC系列或pGAP系列或pAO815，优选载体pPIC9K。其中，毕赤酵母载体pPIC系列包括pPIC9K、pPIC3.5K、pPICZαA,B,C、pPIC9K-His、pPICZA,B,C等，以醇氧化酶基因启动子P_AOX1为启动子。毕赤酵母载体pGAP系列包括pGAPZαA,B,C、pGAPZA,B,C等，以3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子P_GAP为启动子。载体pPIC9K是毕赤酵母蛋白表达载体，pPIC9K载体中存在卡那抗性基因，允许利用卡那抗性在酵母体内筛选多克隆拷贝，载体其余部分与pPIC9载体完全一样。pPIC9K载体能够使用的毕赤酵母宿主菌包括KM71、GS115或SMD1168。

本发明还提供一种毕赤酵母，其包含上述的表达载体，即包含SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的表达载体。

本发明还提供一种表达本发明所述的透明质酸水解酶基因的方法，其包括如下步骤：

利用含有本发明的透明质酸水解酶基因的重组毕赤酵母菌株或本发明提供的毕赤酵母来生产透明质酸水解酶。

在一个具体的实施方式中，所述方法包括使用BMMY培养基，甲醇诱导来发酵生产透明质酸水解酶。

BMMY培养基的组成为酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K₂HPO₄ 3g/L，KH₂PO₄11.8g/L，YNB 3.4g/L，硫酸铵10g/L，生物素4生物素^-4g/L，甲醇10mL/L。

在一个优选的实施方式中，所述发酵条件为：发酵温度为25℃-30℃，发酵过程中每隔24h补加0.5％-1％(v/v)甲醇，诱导表达96h。

在一个更优选的实施方式中，以含有本发明的透明质酸水解酶基因的重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM^opt为生产菌株，发酵生产透明质酸水解酶。具体的发酵条件为：

P.pastoris GS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM^opt接种于40mL YPD培养基中，30℃培养24h，然后将种子培养液按10％的接种量接种到40mL BMGY培养基中继续培养24h，离心、洗涤菌体并转接到诱导培养基BMMY中，每隔24h补加1％(v/v)甲醇，诱导表达96h。

本发明还提供另一种表达本发明所述的透明质酸水解酶基因的方法，其包括如下步骤：

将毕赤酵母接种到种子培养基，得到种子液；

BSM培养基的组成为甘油40g/L，K₂SO₄ 18g/L，KOH 4.13g/L，85％H₃PO₄26.7mL/L，CaSO₄·2H₂O 0.93g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，4.4mL/L过滤除菌的PTM1；PTM1配方：CuSO₄·5H₂O 6g/L，KI 0.09g/L，MnSO₄·H₂O 3g/L，H₃BO₃ 0.02g/L，MoNa₂O₄·2H₂O 0.2g/L，CoCl₂·6H₂O 0.92g/L，ZnCl₂ 20g/L，FeSO₄·7H₂O 65g/L，生物素0.2g/L，H₂SO₄ 5.0mL。

其中，在第一阶段初始发酵阶段，发酵温度为25℃-30℃，pH为5-7。其中pH通过自动添加氨水控制。

在第二阶段补料阶段，待BSM培养基中的甘油被耗尽后，进入分批补料阶段，以指数流加的方式补加50％(v/v)甘油(含12mL/L PTM1)，同时设置转速与溶氧DO偶联。在一个优选的实施方式中，补料速率为前6h分别为13.5、16.2、19.2、22.8、27.2和32.4mL/h/L，随后6h的补料速率设置为30mL/h/L。

在第三阶段饥饿培养阶段，饥饿培养2-3h，至残余甘油耗尽。其中，饥饿培养为研究单一因子对微生物生长或产生代谢产物的影响，将培养至一定阶段的细胞与培养基分开，在脱离营养基质的情况下培养一定时间，使其积累于细胞内的内源营养物质耗尽。

在第四阶段甲醇诱导阶段，甲醇诱导温度为25℃-30℃，时间为80-120h。

在一个优选的实施方式中，流加含12mL/L PTM1的纯甲醇并且终浓度维持在1.8％(v/v)，同时将发酵温度调整至25℃，转速提高至1000rpm，甲醇流加速率和培养基中的甲醇终浓度由甲醇检测器实时在线控制。

本发明的方法还包括进一步对上述发酵液进行纯化。

在一个优选的实施方式中，采用镍柱介质进行亲和层析纯化透明质酸水解酶蛋白，并使用100-500mM的咪唑缓冲液进行梯度洗脱。

发酵生产得到的透明质酸水解酶的酶活表征采用平板透明圈法测定，发酵液上清酶活采用3，5-二硝基水杨酸法(DNS)测定。

其中，透明质酸水解酶活力单位定义(U)为：在pH 5.5和38℃条件下，每小时从透明质酸糖链中释放出1μg葡萄糖还原当量的还原糖所需的酶量。

DNS还原糖测定法：山大齿猛蚁透明质酸水解酶水解透明质酸的β-1,4糖苷键，产生带有还原端羟基的还原糖产物。通过DNS还原糖法测定水解透明质酸产生的相对于葡萄糖还原当量的还原糖产物的量，来计算透明质酸水解酶的催化活力。

本发明还提供如SEQ ID NO.5所示的蛋白质在制备含有透明质酸的辅药、食品及化妆品中的应用。

实施例

实施例1含密码子优化的透明质酸水解酶基因(HYAL_OM^opt)表达***的构建

基于NCBI数据库公开的山大齿猛蚁透明质酸水解酶全长基因序列(Genbank:FX985505.1)，根据毕赤酵母密码子偏好性对其进行了密码子优化。如图1所示，优化后的基因序列如SEQ ID NO.1所示，与野生型基因序列同源性为73.2％。优化后的基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，与野生型基因编码的氨基酸序列一致。密码子优化的山大齿猛蚁透明质酸水解酶序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司全基因合成，并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K的EcoRI和NotI酶切位点之间，得到重组表达载体pPIC9K-HYAL_OM^opt。经DNA测序比对，重组序列正确。重组表达质粒pPIC9K-HYAL_OM^opt经SalI快切酶线性化后电转入P.pastoris GS115表达宿主细胞中，重组转化子经遗传霉素G418筛选获得高拷贝重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-HYAL_OM^opt。

实施例2含高表达透明质酸水解酶基因(ΔN24HYAL_OM^opt)表达***的构建

以上述pPIC9K-HYAL_OM^opt重组表达载体为模板，设计引物，截掉全长透明质酸水解酶基因N端的一段信号肽序列，获得基因工程透明质酸水解酶基因片段。

其中引物序列如下：

上游引物F：5’-CCGGAATTCATGAAGACACTACGCGGCTC-3’(SEQ ID NO.6)；

下游引物R：5’-ATTTGCGGCCGCTCAATGATGATGATGGTGGTGATGAA GGGTGAACTTCTT-3’(SEQ ID NO.7)；

需要说明的是，上游引物中的GAATTC序列为引入的EcoRI限制性酶切位点，下游引物中的GCGGCCGC序列为引入的NotI限制性酶位点，下游引物中的ATGATGATGATGGTGGTG序列的反向互补序列编码6×His-tag标签。

对扩增得到的基因工程透明质酸水解酶基因片段进行EcoRI和NotI双酶切后，克隆至经相同酶切处理的线性表达载体pPIC9K上，转化至E.coil TOP10中，在确保阅读框不移码的前提下获得重组表达质粒pPIC9K-ΔN24HYAL_OM^opt，经DNA测序比对，重组序列正确。重组质粒经限制性内切酶SalI线性化后电转入P.pastoris GS115细胞中，重组转化子经遗传霉素G418筛选得到高拷贝透明质酸水解酶基因的重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM^opt。

实施例3重组毕赤酵母异源表达透明质酸水解酶

对获得的重组工程菌P.pastoris GS115/pPIC9K-HYAL_OM^opt和P.pastorisGS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM^opt分别进行摇瓶发酵培养。发酵步骤如下：挑取单克隆接种于40mL的YPD培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)，30、200rpm培养24h。按10％的接种量转接于40mL的初始表达培养基BMGY(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K₂HPO₄3g/L，KH₂PO₄11.8g/L，YNB 3.4g/L，硫酸铵10g/L，生物素4×10^-4g/L，甘油10mL/L)中，30，200rpm培养24h。离心收集菌体，用生理盐水洗涤菌体后更换至40mL诱导表达培养基BMMY(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K₂HPO₄ 3g/L，KH₂PO₄ 11.8g/L，YNB 3.4g/L，硫酸铵10g/L，生物素4×10^-4g/L，甲醇10mL/L)，30mL/L g/L盐培养，每隔24h向培养基中添加纯甲醇至终浓度为1.0％(v/v)进行诱导表达，诱导表达96h。

发酵上清液经SDS-PAGE蛋白电泳检测，结果图2所示，与泳道2的重组菌(含全长透明质酸水解酶基因序列的重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-HYAL_OM^opt)相比，在理论分子量39kDa左右，有一条明显的蛋白条带(箭头位置所示)，说明截掉自身信号肽序列后，该重组酶实现了高效分泌表达。

实施例4重组菌株摇瓶发酵上清液酶活检测

采用DNS法测定水解透明质酸产生的还原糖当量，用分析纯葡萄糖做标准曲线，计算出透明质酸水解酶活力。反应体系为1mL：将10μL发酵上清液(空白用等体积煮沸灭活后的发酵上清液)和190μL 50mM柠檬酸缓冲液(pH5.5)加入到800μL 2mg/mL透明质酸底物溶液中，置于38℃孵育15min，反应结束后立即置于沸水浴中2min，使酶失活以终止反应。将处理后的1mL反应液加入到2mL DNS(四水合酒石酸钾钠248g/L，3,5-二硝基水杨酸6.3g/L，2MNaOH 250mL/L，苯酚5.136g/L，亚硫酸钠5g/L)溶液中，震荡混匀，与葡萄糖标曲样品一起沸水浴10min；冰水浴降至室温后加入7mL去离子水，振荡混匀，540nm下测定吸光度，换算为反应产生的还原糖量，根据葡萄糖标准曲线计算出重组工程菌发酵上清液的粗酶活。结果如图3所示，本发明构建的重组菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-HYAL_OM^opt的发酵上清液酶活为3547.88U/mL，重组菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM^opt的发酵上清液酶活达到67970.04U/mL。

实施例5重组菌株5-L发酵罐高密度培养

将重组菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-ΔN24HYAL_OM^opt进行5-L发酵罐高密度培养。接YPD平板上的单菌落至50mL YPD液体培养基中，30培220rpm培养24h，将培养液按10％接种至200mL BMGY培养基中，30基中，L rpm培养24h；将培养24h的200mL种子液接入到含有2L BSM发酵培养基(甘油40g/L，K₂SO₄ 18g/L，KOH 4.13g/L，85％H₃PO₄ 26.7mL/L，CaSO₄·2H₂O0.93g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，4.4mL/L过滤除菌的PTM1；PTM1配方：CuSO₄·5H₂O 6g/L，KI 0.09g/L，MnSO₄·H₂O 3g/L，H₃BO₃ 0.02g/L，MoNa₂O₄·2H₂O 0.2g/L，CoCl₂·6H₂O0.92g/L，ZnCl₂ 20g/L，FeSO₄·7H₂O 65g/L，生物素0.2g/L，H₂SO₄ 5.0mL)的5-L发酵罐中。初始发酵参数设置为温度30℃，pH 5.5，通气量2.0vvm和转速500rpm；发酵过程中通过自动添加氨水将pH控制在5.5；待BSM培养基中的甘油被耗尽后，进入分批补料阶段，以指数流加的方式补加50％(v/v)甘油(含12mL/L PTM1)，同时设置转速与溶氧DO偶联，补料速率为前6h分别为13.5、16.2、19.2、22.8、27.2和32.4mL/h/L，随后6h的补料速率设置为30mL/h/L；补料结束后进入饥饿培养阶段，饥饿培养2-3h，至残余甘油耗尽；进入甲醇诱导阶段，流加含12mL/L PTM1的纯甲醇并且终浓度维持在1.8％(v/v)，同时将发酵温度调整至25℃，转速提高至1000rpm，甲醇流加速率和培养基中的甲醇终浓度由甲醇检测器实时在线控制。进入甲醇诱导阶段后每隔一定时间取样，检测发酵上清液酶活。

酶活检测结果如附图4所示，甲醇诱导88h时，发酵上清液透明质酸水解酶酶活力最高为4.7×10⁵U/mL。通过高密度发酵得到的酶活或蛋白表达水平是摇瓶发酵的6.97倍，为工业化生产实现了可能。

实施例6基因工程透明质酸水解酶的纯化制备

在基因工程透明质酸水解酶的C端引入了6个聚组氨酸纯化标签，该标签能特异性与镍离子结合，从而起到纯化蛋白的作用。首先，将镍柱介质填充到亲和层析柱中，然后用5倍柱体积的结合缓冲液(20mM磷酸钠，0.5NaCl，20mM咪唑，pH 6.0)活化镍柱，后加入适量的经0.22μm过滤的超滤浓缩发酵上清液，用5倍柱体积的结合缓冲液洗脱杂质，再分别以10倍柱体积的100、200、300、500mM咪唑的洗脱缓冲液梯度洗脱目标蛋白，洗脱液经SDS-PAGE验证，结果如附图5所示，泳道3为300mM咪唑缓冲液洗脱的蛋白条带，蛋白浓度最高且条带单一。获得的基因工程透明质酸水解酶纯蛋白，经酶活测定，具有正常的透明质酸水解酶活力。

序列表

<110> 华熙生物科技股份有限公司

<120> 一种高效表达透明质酸水解酶的基因及其表达方法

<130> TPE01383

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1074

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial

<400> 1

atgatcccac ccgcacgtga ctcgcttatg tttgtctttg cgactgcggt aatcgctagt 60

tttttcggta gcgcaaagac actacgcggc tcttccccac agcaattcga cgtatactgg 120

aatgtgccaa ctttcatgtg tcacaagcac ggtatgaaat ttgaagagct gaaagatttc 180

ggtatacacc agaacgcaat ggatatgttt cgcggcgaag aaattgcgat tctttatgac 240

cctggcatgt ttcccgccct tctagtagat aaagatggat acgtcactaa acggaacggt 300

ggggtgccgc aagaggggaa cctcaaggaa catttagaaa cctttagaaa gcatctgacg 360

acacaaattc cggacgagag ctttagcggg ataggaatca tagactttga gagttggaga 420

ccgattttca ggcagaactg ggcgtcactc gagccctata aaactttgtc cataaagttg 480

gagagggaaa aacacccatt ttggtcggag gcagctgtga agaaggaggc caaacgtcga 540

ttcgagaaat ccgggcgaat atttatggag gaaaccctca aaatggccaa aaaactaaga 600

ccgaaagcaa agtggggcta ttatgggtat ccccactgtt tcaatcaaac ccctggacag 660

cagtcggttc actgcaatcg gcaaacgatg atggaaaatg acggtatgag ttggctgttt 720

acactcgaag acgttcatgc tcccagcgtt tacctacgat tggaaatcaa ggaggatgac 780

cggccttcat tcgtgaaagg ccgggtttcc gaggccttaa ggttagccgc taaatcgtct 840

tcaaaacaac gtatcctacc ttactactgg ttcatttatc aggataagaa ggatgagttc 900

ttaacggaaa aggatacaca aaacactata aatatgatcg ctaatctggg atctaatggt 960

ttcataattt ggggatctag tgacgatgtc aacacggaac gcaaatgcaa ggatttacag 1020

caatacgtaa aggaagtctt gggcccagcg attaagaagt tcacccttca ttga 1074

<210> 2

<211> 357

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial

<400> 2

Met Ile Pro Pro Ala Arg Asp Ser Leu Met Phe Val Phe Ala Thr Ala

1 5 10 15

Val Ile Ala Ser Phe Phe Gly Ser Ala Lys Thr Leu Arg Gly Ser Ser

20 25 30

Pro Gln Gln Phe Asp Val Tyr Trp Asn Val Pro Thr Phe Met Cys His

35 40 45

Lys His Gly Met Lys Phe Glu Glu Leu Lys Asp Phe Gly Ile His Gln

50 55 60

Asn Ala Met Asp Met Phe Arg Gly Glu Glu Ile Ala Ile Leu Tyr Asp

65 70 75 80

Pro Gly Met Phe Pro Ala Leu Leu Val Asp Lys Asp Gly Tyr Val Thr

85 90 95

Lys Arg Asn Gly Gly Val Pro Gln Glu Gly Asn Leu Lys Glu His Leu

100 105 110

Glu Thr Phe Arg Lys His Leu Thr Thr Gln Ile Pro Asp Glu Ser Phe

115 120 125

Ser Gly Ile Gly Ile Ile Asp Phe Glu Ser Trp Arg Pro Ile Phe Arg

130 135 140

Gln Asn Trp Ala Ser Leu Glu Pro Tyr Lys Thr Leu Ser Ile Lys Leu

145 150 155 160

Glu Arg Glu Lys His Pro Phe Trp Ser Glu Ala Ala Val Lys Lys Glu

165 170 175

Ala Lys Arg Arg Phe Glu Lys Ser Gly Arg Ile Phe Met Glu Glu Thr

180 185 190

Leu Lys Met Ala Lys Lys Leu Arg Pro Lys Ala Lys Trp Gly Tyr Tyr

195 200 205

Gly Tyr Pro His Cys Phe Asn Gln Thr Pro Gly Gln Gln Ser Val His

210 215 220

Cys Asn Arg Gln Thr Met Met Glu Asn Asp Gly Met Ser Trp Leu Phe

225 230 235 240

Thr Leu Glu Asp Val His Ala Pro Ser Val Tyr Leu Arg Leu Glu Ile

245 250 255

Lys Glu Asp Asp Arg Pro Ser Phe Val Lys Gly Arg Val Ser Glu Ala

260 265 270

Leu Arg Leu Ala Ala Lys Ser Ser Ser Lys Gln Arg Ile Leu Pro Tyr

275 280 285

Tyr Trp Phe Ile Tyr Gln Asp Lys Lys Asp Glu Phe Leu Thr Glu Lys

290 295 300

Asp Thr Gln Asn Thr Ile Asn Met Ile Ala Asn Leu Gly Ser Asn Gly

305 310 315 320

Phe Ile Ile Trp Gly Ser Ser Asp Asp Val Asn Thr Glu Arg Lys Cys

325 330 335

Lys Asp Leu Gln Gln Tyr Val Lys Glu Val Leu Gly Pro Ala Ile Lys

340 345 350

Lys Phe Thr Leu His

355

<210> 3

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial

<400> 3

atcccacccg cacgtgactc gcttatgttt gtctttgcga ctgcggtaat cgctagtttt 60

ttcggtagcg ca 72

<210> 4

<211> 1020

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial

<400> 4

atgaagacac tacgcggctc ttccccacag caattcgacg tatactggaa tgtgccaact 60

ttcatgtgtc acaagcacgg tatgaaattt gaagagctga aagatttcgg tatacaccag 120

aacgcaatgg atatgtttcg cggcgaagaa attgcgattc tttatgaccc tggcatgttt 180

cccgcccttc tagtagataa agatggatac gtcactaaac ggaacggtgg ggtgccgcaa 240

gaggggaacc tcaaggaaca tttagaaacc tttagaaagc atctgacgac acaaattccg 300

gacgagagct ttagcgggat aggaatcata gactttgaga gttggagacc gattttcagg 360

cagaactggg cgtcactcga gccctataaa actttgtcca taaagttgga gagggaaaaa 420

cacccatttt ggtcggaggc agctgtgaag aaggaggcca aacgtcgatt cgagaaatcc 480

gggcgaatat ttatggagga aaccctcaaa atggccaaaa aactaagacc gaaagcaaag 540

tggggctatt atgggtatcc ccactgtttc aatcaaaccc ctggacagca gtcggttcac 600

tgcaatcggc aaacgatgat ggaaaatgac ggtatgagtt ggctgtttac actcgaagac 660

gttcatgctc ccagcgttta cctacgattg gaaatcaagg aggatgaccg gccttcattc 720

gtgaaaggcc gggtttccga ggccttaagg ttagccgcta aatcgtcttc aaaacaacgt 780

atcctacctt actactggtt catttatcag gataagaagg atgagttctt aacggaaaag 840

gatacacaaa acactataaa tatgatcgct aatctgggat ctaatggttt cataatttgg 900

ggatctagtg acgatgtcaa cacggaacgc aaatgcaagg atttacagca atacgtaaag 960

gaagtcttgg gcccagcgat taagaagttc acccttcatc accaccatca tcatcattga 1020

<210> 5

<211> 339

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial

<400> 5

Met Lys Thr Leu Arg Gly Ser Ser Pro Gln Gln Phe Asp Val Tyr Trp

1 5 10 15

Asn Val Pro Thr Phe Met Cys His Lys His Gly Met Lys Phe Glu Glu

20 25 30

Leu Lys Asp Phe Gly Ile His Gln Asn Ala Met Asp Met Phe Arg Gly

35 40 45

Glu Glu Ile Ala Ile Leu Tyr Asp Pro Gly Met Phe Pro Ala Leu Leu

50 55 60

Val Asp Lys Asp Gly Tyr Val Thr Lys Arg Asn Gly Gly Val Pro Gln

65 70 75 80

Glu Gly Asn Leu Lys Glu His Leu Glu Thr Phe Arg Lys His Leu Thr

85 90 95

Thr Gln Ile Pro Asp Glu Ser Phe Ser Gly Ile Gly Ile Ile Asp Phe

100 105 110

Glu Ser Trp Arg Pro Ile Phe Arg Gln Asn Trp Ala Ser Leu Glu Pro

115 120 125

Tyr Lys Thr Leu Ser Ile Lys Leu Glu Arg Glu Lys His Pro Phe Trp

130 135 140

Ser Glu Ala Ala Val Lys Lys Glu Ala Lys Arg Arg Phe Glu Lys Ser

145 150 155 160

Gly Arg Ile Phe Met Glu Glu Thr Leu Lys Met Ala Lys Lys Leu Arg

165 170 175

Pro Lys Ala Lys Trp Gly Tyr Tyr Gly Tyr Pro His Cys Phe Asn Gln

180 185 190

Thr Pro Gly Gln Gln Ser Val His Cys Asn Arg Gln Thr Met Met Glu

195 200 205

Asn Asp Gly Met Ser Trp Leu Phe Thr Leu Glu Asp Val His Ala Pro

210 215 220

Ser Val Tyr Leu Arg Leu Glu Ile Lys Glu Asp Asp Arg Pro Ser Phe

225 230 235 240

Val Lys Gly Arg Val Ser Glu Ala Leu Arg Leu Ala Ala Lys Ser Ser

245 250 255

Ser Lys Gln Arg Ile Leu Pro Tyr Tyr Trp Phe Ile Tyr Gln Asp Lys

260 265 270

Lys Asp Glu Phe Leu Thr Glu Lys Asp Thr Gln Asn Thr Ile Asn Met

275 280 285

Ile Ala Asn Leu Gly Ser Asn Gly Phe Ile Ile Trp Gly Ser Ser Asp

290 295 300

Asp Val Asn Thr Glu Arg Lys Cys Lys Asp Leu Gln Gln Tyr Val Lys

305 310 315 320

Glu Val Leu Gly Pro Ala Ile Lys Lys Phe Thr Leu His His His His

325 330 335

His His His

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial

<400> 6

ccggaattca tgaagacact acgcggctc 29

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial

<400> 7

atttgcggcc gctcaatgat gatgatggtg gtgatgaagg gtgaacttct t 51

Claims

1.一种高效表达透明质酸水解酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的透明质酸水解酶基因编码的蛋白质，其序列如SEQ ID NO.5所示。

3.一种重组表达载体，其包含权利要求1所述的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其中质粒骨架为毕赤酵母载体pPIC系列或pGAP系列或pAO815，优选pPIC9K。

5.一种毕赤酵母，其包含权利要求3或4所述的表达载体。

6.一种生产透明质酸水解酶的方法，其包括如下步骤：

利用含有权利要求1所述的透明质酸水解酶基因的重组毕赤酵母菌株或权利要求5所述的毕赤酵母来生产透明质酸水解酶。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述毕赤酵母为GS115、KM71或SMD1168。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法包括使用BMMY培养基，甲醇诱导来发酵生产透明质酸水解酶。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述发酵条件为：发酵温度为25℃-30℃，发酵过程中每隔24h补加0.5％-1％(v/v)甲醇，诱导表达96h。

10.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法包括使用BSM培养基，甲醇诱导来发酵生产透明质酸水解酶。