CN114350560B - 一株抑制***加德纳菌生长与生物膜并产过氧化氢的副格氏乳杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株抑制***加德纳菌生长与生物膜并高产过氧化氢的副格氏乳杆菌，属于微生物技术领域。本发明的副格氏乳杆菌在过氧化氢的生产能力、对致病菌(加德纳菌)的生长以及生物膜的抑制能力都有显著提升，同时对***具有很强的粘附能力。并且，由于所述副格氏乳杆菌的来源于健康女性***，从而对身体的副作用小、是一株适用于人类***炎的益生菌株，将其用于制备女性***炎的产品和卫生用品中，有助于缓解和改善女性细菌性***炎，具备良好的应用前景。

Description

一株抑制***加德纳菌生长与生物膜并产过氧化氢的副格氏 乳杆菌

技术领域

本发明涉及一株抑制***加德纳菌生长与生物膜并高产过氧化氢的副格氏乳杆菌，属于微生物技术领域。

背景技术

细菌性***炎是育龄妇女最常见的***感染疾病。在某些因素作用下，如***水平的降低、性行为、抗生素的使用等，以***定植厌氧菌群和失去正常优势菌乳杆菌为特征，其临床表现为外阴瘙痒、出现烧灼感、大量***分泌物并伴有腐烂的鱼腥味。同时，细菌性***炎与广泛的健康问题有关，包括早产、***、对艾滋病毒感染的易感性增加，以及其他慢性健康问题。鉴于细菌性***炎的流行、相关并发症，细菌性***炎代表着一个重要的全球公共卫生问题。

健康女性***微生物区系主要由某些乳杆菌组成，其中以卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、约氏乳杆菌和詹氏乳杆菌为最常见菌种。这些存在于***中的乳杆菌代谢***上皮分泌的糖原，产生有机酸，维持***正常的酸性环境(pH<4.5)。低pH值环境往往会抑制具有致病潜力的兼性和必需的厌氧微生物的生长。此外，过氧化氢是***乳杆菌产生的又一活性物质，也是其防御致病菌的另一个重要机制，有证据表明产过氧化氢的乳杆菌具有抑制、杀伤其它细菌的作用，阻止细菌性***炎的发生。

在患有细菌性***炎的妇女中则更常见的是***加德纳菌属、普雷沃特氏菌属等，这些厌氧菌取代乳杆菌，导致***正常优势菌群明显减少，***致病性菌群明显增加。其中，***加德纳菌是细菌***炎主要的致病菌。细菌性***炎与附着在生物组织上的生物膜形成有关，而生物膜的形成主要由***加德纳氏菌群构成，其强烈地粘附于***上皮细胞，形成生物膜是细菌性***炎建立的关键，并促进了其他细菌性***炎相关厌氧菌的粘附和生长。同时，以生物膜形式固着的***加德纳菌通常比浮游形式对抗生素的耐受性要更强，并增强了对宿主免疫防御的抵抗力。

传统治疗主要通过口服或***内注射甲硝唑、克林霉素或替硝唑。然而，使用这些抗生素治疗与较高的失败率和复发率有关。这可能与抗生素耐药性、无法根除致病菌生物膜、未能重建酸性环境以及以乳杆菌为主共生菌群有关。因此，为了更有效地治疗细菌性***炎，可从微生态学角度出发，利用益生菌缓解细菌性***炎。乳杆菌作为***微生物中的优势菌，可以通过产生有机酸、过氧化氢、细菌素及某些表面活性物质等代谢产物，有效抑制致病菌的生长并杀死它们，安全可靠，达到维持女性***内各菌群平衡的目的。

目前，已在市面上销售用于治疗细菌性***炎的本土益生菌产品十分有限，且产品中的活菌均不是筛选自我国健康育龄期女性***内的优势菌群。早在20世纪初，国内康白等人(对德氏乳杆菌DM8909菌株的微生物学研究[J].中国微生态学杂志,2001)筛选出一株***来源乳杆菌—德氏乳杆菌DM8909并已研制成一款益生菌产品，但该菌株对细菌性***炎治疗作用的探讨存在局限性，仅仅从竞争排斥及单一的抑菌物质发挥阻碍病原菌是不全面的(康白,吕虎,傅晓丽,et al.对DM8909菌株治疗菌群失调性***病作用机制的研究[J].中国微生态学杂志,2001)。此外，部分专利公开涉及到优势菌-格氏乳杆菌(CN111088178A)虽然其所保护的菌株对***炎相关致病菌生长有良好的抑制作用且有一定产过氧化氢能力，但在***微环境中，细菌性***炎与附着在生物组织上的***加德纳菌生物膜形成有关，生物膜的形成是建立细菌性***炎的关键。由于不同乳杆菌菌株表现出不同的功能特异性，是否有效抑制致病菌生物膜仍未可知。此外，对于副格氏乳杆菌用于潜在治疗细菌性***炎的挖掘，目前专利报道比较稀少。

发明内容

本发明提供了一株能够抑制***加德纳菌生长与生物膜并高产过氧化氢的副格氏乳杆菌。

本发明提供了一株副格氏乳杆菌CCFM1212(Lactobacillus paragasseri)，已于2021年12月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:62138。

本发明提供了含有所述副格氏乳杆菌CCFM1212的微生物制剂。

在一种实施方式中，所述微生物制剂中副格氏乳杆菌CCFM1212的含量不低于1×10⁸CFU/mL或1×10⁸CFU/g。

在一种实施方式中，所述菌剂是将含有副格氏乳杆菌CCFM1212的菌液干燥得到的菌体数量不小于10⁸CFU/mL的粉剂。

本发明提供了一种产品，所述产品含有所述副格氏乳杆菌CCFM1212或权利要求1所述副格氏乳杆菌CCFM1212的发酵产物。

在一种实施方式中，所述产品中副格氏乳杆菌CCFM1212的含量不低于1×10⁸CFU/mL或1×10⁸CFU/g。

在一种实施方式中，所述产品为药品或卫生用品。

在一种实施方式中，所述药品包含权利要求1所述副格氏乳杆菌和/或所述副格氏乳杆菌CCFM1212的发酵产物以及药学上允许的载体。

在一种实施方式中，所述载体包括医学上通常使用的填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。

在一种实施方式中，所述药品的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、栓剂或口服液。

在一种实施方式中，所述卫生用品包括卫生湿纸巾、卫生巾、卫生护垫、卫生栓、卫生棉、***洗液、女士抗菌/抑菌洗剂。

本发明提供了所述副格氏乳杆菌CCFM1212在制备缓解和/或治疗细菌性***炎的产品中的应用。

在一种实施方式中，所述产品为药品或卫生用品。

在一种实施方式中，所述缓解和/或治疗细菌性***炎包括抑制***加德纳菌的生长、提升***内抗菌物质的含量；所述抗菌物质包括过氧化氢。

本发明的有益效果：本发明从健康女性***中筛选到一株副格氏乳杆菌，所述副格氏乳杆菌在过氧化氢的生产能力、对致病菌(加德纳菌)的生长以及生物膜的抑制能力都较商业化的德氏乳杆菌DM8909以及同期筛选到的其他乳杆菌有显著提升，同时对***上皮具有很强的粘附能力。并且，由于所述副格氏乳杆菌的来源于健康女性***，从而对身体的副作用小、是一株适用于人类***炎的益生菌株，将其应用于制备女性***炎的产品和卫生用品中，有助于缓解和改善女性细菌性***炎。

生物材料保藏

本发明所提供的副格氏乳杆菌CCFM1212，分类学命名为Lactobacillusparagasseri，于2021年12月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:62138，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1为乳杆菌对***加德纳菌生物膜形成的影响；将8株乳杆菌与空白对照组相比，**：p<0.01，****：p<0.0001。

图2为乳杆菌抑制***加德纳菌生长的能力；a、b、c表示不同株之间显著差异(p<0.05)。

图3为乳杆菌黏附能力；将7株实验菌株与德氏乳杆菌DM8909相比，*：p<0.05，**：p<0.01，****：p<0.0001。

图4为乳杆菌产过氧化氢能力；将7株实验菌株与德氏乳杆菌DM8909相比，**：p<0.01。

具体实施方式

BHIs培养基：胰蛋白胨10.0g/L、牛心浸粉17.5g/L、氯化钠5.0g/L、葡萄糖3.0g/L、十二水合磷酸氢二钠2.5g/L、酵母粉10.0g/L、麦芽糖1.0g/L，pH7.2～7.4；待温度凉至55℃左右，添加10％无菌胎牛血清。

实施例1：乳杆菌体外抑制***加德纳菌生物膜形成能力

选取从健康女性***中筛选到的乳杆菌和商业菌株德氏乳杆菌(DM8909)，在4℃下以10000×g离心10min，收集相应培养物浓度为10⁸CFU/mL的乳杆菌上清液。将BHIs培养基中***加德纳菌24h培养物调至10⁸CFU/mL，向96孔板每孔转移100μL***加德纳菌悬液，加入100μL乳杆菌上清液。MRS用作空白对照。将板在37℃下孵育24h。24h生物膜形成后，用PBS洗涤3次小心去除浮游细胞，每孔加入100μL甲醇(国药集团化学试剂有限公司)固定30分钟。弃去甲醇后，生物膜用0.1％结晶紫染色5分钟。弃去结晶紫，用PBS洗涤3次，每孔加入200μL 33％冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司)。通过酶标仪测量每个孔在570nm处的吸光度。

结果如图1所示，副格氏乳杆菌CCFM1212、约氏乳杆菌QJSWX309M14的体外抑制***加德纳菌生物膜效果显著优于市售益生菌产品中已商业化的德氏乳杆菌(DM8909)(p<0.05)。并且与空白对照组相比，副格氏乳杆菌CCFM1212显著抑制了***加德纳菌生物膜的形成(p<0.05)，抑制率为66.52％。其次，另一株约氏乳杆菌QJSWX309M14也有效地抑制了***加德纳菌生物膜形成(OD_590nm 1.08，OD_590nm 3.80；p<0.05)，抑制率为71.49％。其余5株实验菌株抑制生物膜形成抑制率在19.71％～45.73％之间。其中，与空白对照组相比，格氏乳杆菌QJSWX195M1抑制***加德纳菌生物膜形成的能力在所有格氏乳杆菌中最弱，抑制率仅为16.02％(OD_590nm 3.05，OD_590nm 3.80；p<0.05)。

实施例2：乳杆菌体外抑制***加德纳菌生长能力

将在MRS培养基中过夜培养的乳杆菌(约1×10⁸CFU/mL)取2μL菌悬液点样于含有1.5％(w/v)琼脂的MRS固体培养基表面，在37℃下孵育24h。随后，将1mL***加德纳菌悬液与100ml含琼脂的BHIs肉汤(0.7％琼脂)混合(最终活菌数约为1×10⁶CFU/mL)，倾注于已点样乳杆菌的固体平板上，并将平板在37℃下厌氧培养48h，测定抑菌圈直径。以未接种的MRS琼脂固体培养基作为阴性对照，德氏乳杆菌DM8909为阳性菌株对照。

图2显示了8株乳杆菌对***加德纳菌生长的抑制作用。阳性对照菌株德氏乳杆菌DM8909的抑菌圈为16.5mm，其他7株乳杆菌抑菌圈直径在9.3-13mm之间，抑菌能力有所差异，呈现菌株特异性。副格氏乳杆菌CCFM1212抑菌圈直径为13±2.2mm，为其余7株乳杆菌中抑菌能力最显著的，而其余6株格氏乳杆菌对***加德纳菌有生长抑制作用并不显著，抑菌圈直径在9.3-11.5mm之间。而格氏乳杆菌QJSWX195M1抑菌能力与阳性对照菌株德氏乳杆菌DM8909参比，抑菌能力差异显著(p<0.05)，抑菌圈直径为9.3mm。综合比较，副格氏乳杆菌CCFM1212对***加德纳菌生长有较强的抑制能力，而格氏乳杆菌QJSWX195M1则对***加德纳菌生长无显著抑制能力。

表1乳杆菌菌株的抑菌能力

实施例3：乳杆菌黏附能力

将生长融合至80％的HeLa细胞消化，将无菌盖玻片放置在6孔培养板中，加入2mL/孔的细胞完全培养悬液(1×10⁵个/mL)，37℃条件下放入5％CO₂培养箱中培养，待细胞贴壁后，弃去培养基，加入2mL/孔的乳杆菌悬液(1×10⁸CFU/mL)，随后孵育2h。结束后，用磷酸盐缓冲液清洗以除去未黏附的乳杆菌，甲醇固定20min后进行革兰氏染色，显微镜观察。随机选取20个视野进行评价，计录100个细胞所黏附的细菌数目，并以每个HeLa细胞黏附细菌数表示，即为黏附指数。

结果表明，每株菌株对HeLa细胞的粘附能力有显著差异(图3)。其中副格氏乳杆菌CCFM1212具有较强的粘附能力，为23.8个/细胞，显著高于德氏乳杆菌DM8909(17.1个/细胞；p<0.05)，而格氏乳杆菌QJSWX310M13、QJSWX195M1与约氏乳杆菌309M14黏附能力显著低于德氏乳杆菌DM8909，它们的黏附能力分别为9.1个/细胞、3.8个/细胞、10.6个/细胞(p<0.05)。而乳杆菌的粘附能力有助于自身在***环境中的定植，抑制病原菌的入侵，调节宿主的局部免疫防御反应。由于副格氏乳杆菌CCFM1212在体外表现出高黏附能力，推测可能其在体内具有较好的定植能力。

实施例4：乳杆菌产过氧化氢能力

配制100Mm PIPE、20Mm TMB溶液。制作标准曲线：首先用100mmol/L哌嗪-N,N’-二-乙磺酸(Piperazine-N'NjBis 2-ethanesulfonic acid，PIPES)将质量分数浓度为30％的H₂O₂(相当于9.128mol/L)储存液稀释成1mol/L，再用100mmol/L PIPES将1mol/L H₂O₂分别稀释成0μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L工作液；然后分别取100μL上述H₂O₂工作液与100μL 20mmol/L TMB混合，最后向混合溶液中加入2μL辣根过氧化物酶(1mg/mL)并混匀，16℃孵育10min，测量OD₆₀₀作出相应标准曲线；吸取100μL菌上清液进行如上操作，根据标准曲线计算上清液中过氧化氢浓度。

表2显示了8株乳杆菌产过氧化氢能力。阳性对照菌株德氏乳杆菌DM8909过氧化氢浓度为14.86μmol/L，其他7株乳杆菌产过氧化氢能力在12.83-24.09μmol/L之间，呈现菌株特异性。与阳性对照菌株德氏乳杆菌DM8909相比，副格氏乳杆菌CCFM1212上清液过氧化氢浓度为24.09μmol/L，为其余7株乳杆菌中产过氧化氢能力最显著的，而其余6株乳杆菌产过氧化氢能力与德氏乳杆菌DM890相比并无显著差异。其中，格氏乳杆菌QJSWX195M1产过氧化氢能力最弱，为12.83μmol/L。综合比较，副格氏乳杆菌CCFM1212具有优良的产过氧化氢能力，推测其对***加德纳菌生长有较强的抑制能力。

表2乳杆菌菌株产过氧化氢能力

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1. 一株副格氏乳杆菌（Lactobacillus paragasseri），已于2021年12月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:62138。

2.含有权利要求1所述副格氏乳杆菌的微生物制剂。

3. 根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中副格氏乳杆菌的含量不低于1×10⁸ CFU/mL或1×10⁸ CFU/g。

4.一种产品，其特征在于，含有权利要求1所述的副格氏乳杆菌；所述产品为药品或卫生用品。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述药品含有权利要求1所述副格氏乳杆菌以及药学上允许的载体。

6.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述卫生用品为卫生湿纸巾、卫生巾、卫生护垫、卫生棉或***洗液。

7.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述卫生用品为女士抗菌/抑菌洗剂。

8.权利要求1所述副格氏乳杆菌在制备缓解和/或治疗细菌性***炎的产品中的应用，其特征在于，所述产品为药品或卫生用品。

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