CN114324859B

CN114324859B - 一种检测滑液囊支原体抗体的包被抗原、试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN114324859B
Application number: CN202111339885.4A
Authority: CN
Inventors: 周庆丰; 魏晓娜; 孙乾晋; 陈苇; 严专强; 周祺; 尹丽娟; 陈�峰
Original assignee: South China Agricultural University; Wens Foodstuff Group Co Ltd
Current assignee: South China Agricultural University; Wens Foodstuff Group Co Ltd
Priority date: 2021-11-12
Filing date: 2021-11-12
Publication date: 2024-05-24
Anticipated expiration: 2041-11-12
Also published as: CN114324859A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测滑液囊支原体抗体的包被抗原、试剂盒及其检测方法。检测滑液囊支原体抗体的包被抗原为重组EFG蛋白；所述重组EFG蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示序列；所述重组EFG蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO：2所示序列。本发明将重组EFG蛋白作为检测滑液囊支原体抗体的ELISA方法的包被抗原，可以用于临床滑液囊支原体血清抗体检测，高效检测养殖场滑液囊支原体抗体；重组EFG蛋白作为检测滑液囊支原体抗体的ELISA方法的包被抗原，使得检测方法具有良好的反应原性、特异性、敏感性和重复性，可用于临床滑液囊支原体血清抗体检测，为滑液囊支原体疫苗免疫程序的制定提供了一定的指导，从而达到防控滑液囊支原体感染的目的。

Description

一种检测滑液囊支原体抗体的包被抗原、试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测滑液囊支原体抗体的包被抗原、试剂盒及其检测方法。

背景技术

滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是禽类的主要致病性支原体之一，其主要感染群体为鸡或火鸡，家禽感染MS后主要表现为关节渗出性的滑液囊膜及腱鞘滑膜炎，还可引起亚临床呼吸道症状以及气囊炎。MS对各个年龄的鸡和火鸡都能感染，但雏鸡感染性最高，一旦感染便终身带菌。MS感染多为慢性或隐性感染，急性病例较少，临床上常常表现为与NDV、IBV、IBDV、大肠杆菌等病原的混合感染。MS主要通过健康鸡与发病鸡之间的接触进行水平传播，此外也还包括通过垂直传播、经蛋传播，危害极大。

目前对于MS的防控主要通过药物预防和疫苗免疫。疫苗使用方面，国外父母代种鸡只在4～6周龄免疫一次活疫苗，而国内则主要采取“一活一死”或“一活两死”的免疫程序。疫苗的免疫效果需进行有效的抗体检测，才能达到防控滑液囊支原体感染的目的，但是现有的检测方法中抗原的特异性及敏感性较差，无法有效开展疫苗的抗体评价。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种检测滑液囊支原体抗体的包被抗原、试剂盒及其检测方法。

为实现上述目的，本发明采取以下的技术方案：

第一方面，本发明提供一种检测滑液囊支原体抗体的包被抗原，所述包被抗原为重组EFG蛋白；所述重组EFG蛋白的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示序列；所述重组EFG蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO：2所示序列。

进一步的，所述重组EFG蛋白的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：1具有至少90％同源性的序列；所述重组EFG蛋白核苷酸序列包含与SEQ ID NO：2具有至少90％同源性的序列。

进一步的，所述重组EFG蛋白的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：1具有至少95％同源性的序列；所述重组EFG蛋白核苷酸序列包含与SEQ ID NO：2具有至少95％同源性的序列。

优选的，所述重组EFG蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示序列；所述重组EFG蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示序列。

进一步的，所述重组EFG蛋白的扩增引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列：

SEQ ID NO：3：5’-ATGGCACGTGATTATGATCTGAAAG-3’；

SEQ ID NO：4：5’-TTCTTCATCTTTATTCTGAATATTAC-3’。

第二方面，本发明提供一种检测滑液囊支原体抗体的试剂盒，所述试剂盒包括以上述重组EFG蛋白作为酶标板的包被抗原。

进一步的，所述试剂盒还包括酶标板、包被液、封闭液、酶标二抗、TMB显色液、终止液、洗涤液、血清稀释液。

进一步的，所述包被液为碳酸盐缓冲液。

进一步的，所述洗涤液为PBST。

进一步的，所述酶标二抗为羊抗兔酶标二抗。

进一步的，所述封闭液为5％脱脂奶粉。

进一步的，所述血清稀释液为5％脱脂奶粉。

第三方面，本发明提供一种检测滑液囊支原体抗体的检测方法，包括以下步骤：

S1；将包被抗原用包被液稀释后放入酶标板内，包被过夜；

S2：去除S1中的包被液，洗涤液清洗后拍干，加入封闭液封闭；

S3：去除S2中的封闭液，洗涤液清洗后拍干，加入用血清稀释液稀释后的待测血清样品，孵育；

S4：去除S3中的血清样品，洗涤液清洗后拍干，加入稀释后的酶标二抗，孵育；

S5：去除S4中的酶标二抗，洗涤液清洗后拍干，加入TMB显色液避光反应，反应结束后加入终止液终止反应；

S6：在酶标仪上测试酶标板孔中液体OD_450nm值，OD_450nm值≥0.3998时，检测结果判定为阳性；当待检样品的OD_450nm值＜0.3998时，检测结果判定为阴性。

进一步的，S1中包被抗原包被液稀释后浓度为0.8μg/mL，酶标板孔中每孔加入100μL，4℃包被过夜。

进一步的，S2中洗涤液清洗4次，每次2min；封闭液为每孔加入100μL，4℃温度下封闭16h。

进一步的，S3中洗涤液清洗4次，每次2min；每孔加入100μL用血清稀释液按1：800～3200倍稀释后的待测血清样品，37℃孵育90min。

进一步的，S4中洗涤液清洗4次，每次2min；每孔加入100μL用PBS按照1：2000倍稀释后的酶标二抗，37℃孵育120min。

进一步的，S4中洗涤液清洗5次，每次2min；每孔加入100μL TMB显色液，避光反应10min，按100μL/孔加入终止液，终止反应。

本发明的有益效果为：

(1)本发明将重组EFG蛋白作为检测滑液囊支原体抗体的ELISA方法的包被抗原，可以用于临床滑液囊支原体血清抗体检测，高效检测养殖场滑液囊支原体抗体。

(2)本发明将重组EFG蛋白作为检测滑液囊支原体抗体的ELISA方法的包被抗原，使得检测方法具有良好的反应原性、特异性、敏感性和重复性，可以用于临床滑液囊支原体血清抗体检测，为滑液囊支原体疫苗免疫程序的制定提供了一定的指导，从而达到防控滑液囊支原体感染的目的。

附图说明

图1为纯化的重组EFG蛋白SDS-PAGE分析结果图：图1中M为蛋白分子质量标准，1为EFG-pSmartI诱导收集的破碎细菌上清裂解液，2为EFG-pSmartI过镍柱后，3为经50mMol咪唑洗杂后，4～7为经250mMol咪唑洗脱；

图2为实施例4中重组EFG蛋白的抗原反应性分析结果图；

图3为实施例5中重组EFG蛋白的抗原特异性分析结果图：其中抗体阳性血清Po.(+)为阳性标准品，Neg.(-)为阴性标准品；

图4为实施例6中重组EFG蛋白包被抗原敏感性试验结果数据图；

图5为实施例8中检测不同免疫背景的临床血清样品在OD_450nm值的数据图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案作进一步清楚、完整地描述。需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种检测滑液囊支原体抗体的包被抗原，所述包被抗原为重组EFG蛋白；所述重组EFG蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示序列；所述重组EFG蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示序列，序列进行了GC含量优化，方便了表达。

所述包被抗原的制备方法为：

1、EFG基因引物设计：

参考滑液囊支原体EFG蛋白基因全长序列(NCBI基因序列号：Sequence ID:WP_011283211.1)，经过密码子优化后，获得EFG目的基因序列。设计一对引物以扩增EFG目的基因序列，引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列：

SEQ ID NO：3：5’-ATGGCACGTGATTATGATCTGAAAG-3’；

SEQ ID NO：4：5’-TTCTTCATCTTTATTCTGAATATTAC-3’；

EFG蛋白目的基因序列大小为2088bp；

2、重组质粒的构建：

将EFG目的基因序列连接至pSmart-I骨架载体，转化和纯化获得测序正确的重组质粒pSmartI-EFG，重组质粒pSmartI-EFG序列如SEQ ID NO：5所示；

3、重组EFG蛋白的表达和纯化：

3.1重组EFG蛋白的表达：将测序结果正确的重组质粒pSmartI-EFG转化表达菌Rosetta，无菌涂布于LB/Kan平板培养基，37℃培养18h。挑取PCR鉴定结果阳性的单克隆按照1:100接种到10mL LB/Kan液体培养基中，于摇床37℃、200r/min培养到OD600nm值约为0.6时加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，37℃、150r/min诱导表达6h。取1mL菌液8000r/min离心5min，弃上清，用50μL PBS重悬，加入50μL 2×蛋白上样缓冲液，100℃煮沸5min，离心取上清进行SDS-PAGE分析，选出蛋白表达阳性的菌株；

选取蛋白表达阳性的菌株摇床培养过夜，按照1:100的比例接种到含有300mL LB/Kan液体培养基中，在优化后的条件下进行诱导表达。菌液8000r/min离心5min，菌体用灭菌PBS吹打，再离心，重复几次直至上清变清亮为止。最后得到的菌体用30mL灭菌PBS吹散，冰浴超声破碎，超声程序为：超声3s间隔8s，每次十分钟，超声3次。超声完的菌体在4℃，12000r/min离心10min，收集细菌上清裂解液；

3.2重组EFG蛋白的纯化：

将镍加入纯化柱中，使用Tris-Hcl缓冲液平衡镍柱，直至镍柱完全变色，镍柱平衡好后加入破碎后细菌上清裂解液，缓速过柱吸附。吸附后使用50mmol咪唑洗杂，然后使用250mmol咪唑洗脱，得到纯化后的重组EFG蛋白，结果如图1所示，表明重组EFG蛋白纯化成功。

实施例2

一种检测滑液囊支原体抗体的试剂盒，所述试剂盒包括以实施例1纯化后的重组EFG蛋白作为酶标板的包被抗原、酶标板、包被液、封闭液、酶标二抗、TMB显色液、终止液、洗涤液和血清稀释液；所述包被液为碳酸盐缓冲液；所述洗涤液为PBST；所述酶标二抗为酶标羊抗兔抗体；所述封闭液为5％脱脂奶粉；所述血清稀释液为5％脱脂奶粉。

实施例3

采用实施例2所述的试剂盒检测滑液囊支原体抗体的方法，包括以下步骤：

S1；将包被抗原用碳酸盐缓冲液稀释成浓度为0.8μg/mL，100μL/孔加入酶标板内，4℃包被过夜；

S2：去除S1中的包被液，PBST清洗4次，每次2min，拍干，每孔加入100μL的5％脱脂奶粉封闭液，4摄氏度封闭16h。

S3：去除S2中的封闭液，PBST清洗4次，每次2min，拍干，每孔加入100μL用5％脱脂奶粉按1：800倍稀释后的待测血清样品，37℃孵育90min；

S4：去除S3中的血清样品，PBST清洗4次，每次2min，拍干，用PBS按照1：2000倍稀释后的羊抗兔酶标二抗，37℃孵育120min；

S5：去除S4中的酶标二抗，PBST清洗5次，每次2min，拍干，100μL TMB显色液，避光反应10min，按100μL/孔加入终止液，终止反应；

阴阳性临界值的确定：检测29份阴性血清，每个样品重复3孔平行，计算出阴性样本OD_450nm值的平均值(X)和标准差(SD)，计算公式为阈值＝X+3SD，计算所得ELISA OD_450nm阈值为0.3998。当待检样品的OD_450nm值大于0.3998时，结果判定为阳性；当待检样品的OD_450nm值小于0.3998时，结果判定为阴性。

实施例4

按照实施例3的检测方法，分别检测阳性标准品和阴性标准品；所述阳性标准品为免疫后的血清或母源抗体血清；

所述免疫后的抗体血清为在3周龄肌肉注射弱毒疫苗，7周龄肌肉注射灭活疫苗，17周龄肌肉注射灭活疫苗，免疫后两周收集血清；

所述母源抗体血清为免疫后的母鸡产蛋孵化的1日龄雏鸡血清；

所述阴性标准品为未经过疫苗免疫注射、相同养殖状况的血清样品。

检测结果如图2所示，重组EFG蛋白抗原与免疫后的血清抗体或母源抗体血清反应良好，且不与阴性标准品反应，说明检测方法的反应性良好。

实施例5

按照实施例3的检测方法，分别对不同的血清样品进行检测，所检测的血清样品分别为新城疫病毒(NDV)抗体阳性血清、禽流感(AIV)抗体阳性血清、鸡毒支原体(MG)抗体阳性血清、禽大肠杆菌(E.coli)抗体阳性血清、鸭支原体(MA)抗体阳性血清、牛支原体(MB)抗体阳性血清，并采用实施例4中的阴、阳性标准品作为对照。检测结果如图3所示。由图3可知，本发明重组EFG蛋白包被抗原不与其他抗体血清反应，抗原特异性良好。

实施例6

取3份实施例4中阳性标准品，按照实施例3的检测方法，不同之处在于S3中稀释的比例分别从1：800开始倍比稀释至1:12800，检测结果如图4可知，阳性标准品血清稀释至3200倍后，本发明的检测发明仍能检测到抗体阳性，说明本发明的重组EFG蛋白包被抗原的敏感性高。

实施例7

按照实施例3的检测方法，进行批次内与批次间重复性试验，用同一批次的蛋白包被酶标板，检测3份不同抗体滴度的阳性血清，每个样本重复4孔平行，测出每孔的OD_450nm值，算出每个样本的标准差，进而算出每个样本的批次内变异系数(C.V)，C.V＝(SD/MN)×100％。相同的实验环境下，在三个不同时间段包被酶标板，分别检测3份不同抗体滴度的阳性血清，每份血清重复4孔平行，检测每孔的OD_450nm值，算出每个样本的批次间变异系数，结果如表1所示。从表1结果可知，批次内与批次间重复性试验变异系数均低于10％，说明该方法重复性好，结果稳定。

表1.不同阳性样品血清批次内与批次间重复性试验结果

实施例8

按照实施例3的检测方法，检测不同免疫背景的临床血清样品，免疫程序为3周龄肌肉注射弱毒疫苗，7周龄肌肉注射灭活疫苗，17周龄肌肉注射灭活疫苗。检测结果如表2和图5所示。

表2

组群	免疫背景	日龄	阳性率
				2018	三免后10周	27周	93.75％
2019	三免后10周	27周	100％
				2020	三免后10周	27周	100％
2021	三免后10周	27周	100％
				2026	二免后12周	19周	100％
2101	二免后12周	19周	93.75％
				2103	一免后4周	11周	100％
2105	一免后1周	30天	56.25％
				2106	未免疫	16天	25％
2107	未免疫	16天	0％

由图5和表2可知，本发明的检测方法能特异性的检测滑液囊支原体抗体水平，其中抽检的三免后10周阳性率为100％，二免后12周阳性率达到93.75％，其中一群一免后4周阳性率达100％，一免后1周阳性率只有56.25％，两群未免疫鸡群中有一群阳性率达25％，可能提示有滑液囊支原体感染。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 温氏食品集团股份有限公司

华南农业大学

<120> 一种检测滑液囊支原体抗体的包被抗原、试剂盒及其检测方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 696

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Arg Asp Tyr Asp Leu Lys Asp Tyr Arg Asn Ile Gly Ile Met

1 5 10 15

Ala His Ile Asp Ala Gly Lys Thr Thr Thr Thr Glu Arg Ile Leu Tyr

20 25 30

His Thr Gly Lys Ile His Lys Ile Gly Glu Thr His Asp Gly Val Ser

35 40 45

Gln Met Asp Trp Met Glu Gln Glu Lys Glu Arg Gly Ile Thr Ile Thr

50 55 60

Ser Ala Ala Thr Thr Ala Tyr Trp Lys Asn Lys Arg Ile Asn Ile Ile

65 70 75 80

Asp Thr Pro Gly His Val Asp Phe Thr Val Glu Val Glu Arg Ser Leu

85 90 95

Arg Val Leu Asp Gly Ala Val Ala Val Leu Asp Ala Gln Ser Gly Val

100 105 110

Glu Pro Gln Thr Glu Thr Val Trp Arg Gln Ala Thr Asn Tyr Lys Val

115 120 125

Pro Arg Ile Val Tyr Val Asn Lys Met Asp Lys Ala Gly Ala Asp Phe

130 135 140

Glu Ala Ala Val Ala Ser Val Lys Ser Arg Leu Gly Gly Asn Ala Val

145 150 155 160

Ala Ile Gln Trp Pro Ile Gly Ser Glu Ser Asn Phe Asn Gly Ile Ile

165 170 175

Asp Leu Val Thr Met Thr Ala Thr Thr Tyr Asn Gly Glu Ser Ala Glu

180 185 190

Glu Glu Phe Pro Met Glu Ile Pro Thr Asp Leu Leu Asp Val Ala Lys

195 200 205

Ala Lys Arg Gln Glu Leu Leu Glu Ala Ala Ala Asn Phe Asp Glu Glu

210 215 220

Val Met Met Met Val Leu Glu Gly Ala Asp Val Asp Ile Asp Thr Phe

225 230 235 240

Lys Asn Thr Ile Arg Lys Ala Thr Leu Thr Ser Glu Phe Phe Pro Val

245 250 255

Val Cys Gly Thr Ser Phe Lys Asn Lys Gly Val Lys Lys Met Ile Asp

260 265 270

Ala Val Val Asp Tyr Leu Pro Ser Pro Leu Asp Ile Pro Pro Ile Lys

275 280 285

Ala Tyr Leu Asn Asp Gln Glu Thr Asp Val Val Ala Thr Asp Asp Gly

290 295 300

Glu Phe Ala Ala Leu Ala Phe Lys Val Met Thr Asp Pro Phe Val Gly

305 310 315 320

Ser Leu Thr Phe Phe Arg Val Tyr Arg Gly Val Leu Glu Lys Gly Ser

325 330 335

Tyr Val Tyr Asn Ser Thr Lys Glu Gln Lys Glu Arg Ile Gly Arg Ile

340 345 350

Leu Gln Met His Ala Asn Asn Arg Val Glu Ile Asp Glu Cys Arg Ala

355 360 365

Gly Asp Ile Ala Ala Ala Val Gly Leu Lys Phe Thr Thr Thr Gly Asp

370 375 380

Thr Leu Val Gly Glu Lys Ser Pro Lys Val Val Leu Glu Lys Met Val

385 390 395 400

Phe Pro Glu Pro Val Ile Ser Gln Ala Leu Glu Pro Glu Ser Lys Ala

405 410 415

Ala Asn Glu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Gln Lys Leu Ser Ala Glu Asp

420 425 430

Pro Thr Phe Arg Thr Tyr Thr Asp Glu Glu Thr Gly Gln Thr Ile Ile

435 440 445

Ser Gly Met Gly Glu Leu His Leu Asp Ile Ile Val Asp Arg Leu Lys

450 455 460

Arg Glu Phe Gly Val Lys Val Lys Val Gly Ala Pro Gln Val Ser Tyr

465 470 475 480

Arg Glu Thr Ile Thr Lys Ser Ala Glu Val Glu Gly Lys His Ile Lys

485 490 495

Gln Ser Gly Gly Lys Gly Gln Tyr Gly His Val Trp Leu Lys Phe Glu

500 505 510

Pro Asn His Asp Gln Gly Phe Glu Phe Ile Asp Lys Ile Val Gly Gly

515 520 525

Lys Ile Pro Lys Glu Tyr Ile Lys Pro Ile Gln Lys Gly Leu Glu Glu

530 535 540

Lys Met Ala Val Gly Ile Leu Ala Gly Tyr Pro Met Ile Asp Val Lys

545 550 555 560

Ala Thr Leu Phe Asp Gly Ser Tyr His Asp Val Asp Ser Ser Glu Leu

565 570 575

Ala Tyr Lys Ile Ala Ala Ser Lys Ala Leu Thr Lys Ala Lys Asp Leu

580 585 590

Ile Gly Thr Val Leu Leu Glu Pro Ile Met Asp Val Ser Val Val Val

595 600 605

Pro Ser Asp His Met Gly Asp Val Ile Gly Asp Leu Ser Arg Arg Arg

610 615 620

Gly Leu Ile Ser Asp Gln Glu Gln Arg Asn Asp Gly Ala Val Ile Val

625 630 635 640

Arg Ala Lys Val Pro Leu Ser Glu Met Phe Gly Tyr Ser Thr Glu Leu

645 650 655

Arg Ser Met Thr Ser Gly Arg Gly Thr Tyr Gln Met Gln Phe Asp His

660 665 670

Tyr Glu Lys Cys Pro Lys Asn Ile Ser Asp Glu Ile Ile Lys Lys Arg

675 680 685

Asn Ile Gln Asn Lys Asp Glu Glu

690 695

<210> 2

<211> 2088

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcacgtg attatgatct gaaagattat cgtaacatcg gtattatggc gcatattgat 60

gcgggtaaaa ccaccaccac cgaacgcatt ctgtatcata ccggtaaaat tcataaaatc 120

ggtgaaacac atgatggtgt ttctcagatg gattggatgg aacaggaaaa agaacgtggc 180

attacaatca ccagcgcagc aaccacagca tattggaaaa ataaacgtat taacatcatc 240

gataccccgg gtcatgttga ttttaccgtt gaagttgaac gtagcctgcg tgttctggat 300

ggcgccgttg cagttctgga tgcacagagc ggtgtggaac cgcagaccga aaccgtgtgg 360

cgccaggcaa ccaattataa agttccgcgt attgtgtatg ttaataaaat ggataaagca 420

ggtgcggatt ttgaagcggc agtagcaagc gttaaaagcc gtctgggtgg caatgcggtt 480

gcaattcagt ggccgatcgg tagcgaaagc aattttaatg gcatcattga tctggttaca 540

atgaccgcga caacctataa tggtgaaagt gcagaagaag aatttccgat ggaaattccg 600

accgatctgc tggatgtggc aaaagcaaaa cgtcaggaac tgctggaagc agcggccaac 660

tttgatgaag aagttatgat gatggtgctg gaaggtgcag atgttgatat tgataccttt 720

aaaaacacca tccgtaaagc aacactgacc agcgaatttt ttccggtagt ttgtggcacg 780

agctttaaaa ataaaggtgt caaaaagatg atcgatgcag tggtggatta tctgccgagc 840

ccgctggata ttccgccgat taaagcatat ctgaatgatc aggaaaccga tgttgtcgca 900

acagatgatg gtgaatttgc agcactggca tttaaagtta tgaccgatcc ttttgttggt 960

agcctgacct tttttcgtgt ctatcgcggt gttctggaaa aaggcagcta tgtttataat 1020

agcacgaaag aacagaaaga acgtattggt cgtattctgc agatgcatgc aaataatcgt 1080

gttgaaattg atgaatgtcg tgcaggtgat attgcagcag cagtgggtct gaaatttacc 1140

accaccggtg atacactggt tggcgaaaaa tcacctaaag ttgttctgga aaaaatggtt 1200

tttccggaac cggttattag ccaggcactg gaaccggaaa gcaaagcagc aaatgaaaaa 1260

ctgagcctgg gtctgcagaa actgagcgca gaagatccga cctttcgtac ctataccgat 1320

gaagaaaccg gtcagaccat tattagcggt atgggtgaac tgcatctgga tattattgtt 1380

gatcgtctga aacgtgaatt tggtgttaaa gttaaagttg gtgcaccgca ggttagctat 1440

cgtgaaacca ttaccaaaag cgcagaagtt gaaggtaaac atattaaaca gagcggtggt 1500

aaaggtcagt atggtcatgt ttggctgaaa tttgaaccga atcatgatca gggttttgaa 1560

tttattgata aaattgttgg tggtaaaatt ccgaaagaat atattaaacc gattcagaaa 1620

ggtctggaag aaaaaatggc agttggtatt ctggcaggtt atccgatgat tgatgttaaa 1680

gcaaccctgt ttgatggtag ctatcatgat gttgatagca gcgaactggc atataaaatt 1740

gcagcaagca aagcactgac caaagcaaaa gatctgattg gtaccgttct gctggaaccg 1800

attatggatg ttagcgttgt tgttccgagc gatcacatgg gtgatgttat tggtgatctg 1860

agccgtcgtc gtggtctgat tagcgatcag gaacagcgta atgatggtgc agttattgtt 1920

cgtgcaaaag ttccgctgag cgaaatgttt ggttatagca ccgaactgcg tagcatgacc 1980

agcggtcgtg gtacctatca gatgcagttt gatcattatg aaaaatgtcc gaaaaatatt 2040

agcgatgaaa ttattaaaaa acgtaatatt cagaataaag atgaagaa 2088

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcacgtg attatgatct gaaag 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcttcatct ttattctgaa tattac 26

<210> 5

<211> 7651

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggtcacc atcaccatca ccatatgtcg 5100

gactcagaag tcaatcaaga agctaagcca gaggtcaagc cagaagtcaa gcctgagact 5160

cacatcaatt taaaggtgtc cgatggatct tcagagatct tcttcaagat caaaaagacc 5220

actcctttaa gaaggctgat ggaagcgttc gctaaaagac agggtaagga aatggactcc 5280

ttaagattct tgtacgacgg tattagaatt caagctgatc agacccctga agatttggac 5340

atggaggata acgatattat tgaggctcac agagaacaga ttggtggcca aggatccatg 5400

gcacgtgatt atgatctgaa agattatcgt aacatcggta ttatggcgca tattgatgcg 5460

ggtaaaacca ccaccaccga acgcattctg tatcataccg gtaaaattca taaaatcggt 5520

gaaacacatg atggtgtttc tcagatggat tggatggaac aggaaaaaga acgtggcatt 5580

acaatcacca gcgcagcaac cacagcatat tggaaaaata aacgtattaa catcatcgat 5640

accccgggtc atgttgattt taccgttgaa gttgaacgta gcctgcgtgt tctggatggc 5700

gccgttgcag ttctggatgc acagagcggt gtggaaccgc agaccgaaac cgtgtggcgc 5760

caggcaacca attataaagt tccgcgtatt gtgtatgtta ataaaatgga taaagcaggt 5820

gcggattttg aagcggcagt agcaagcgtt aaaagccgtc tgggtggcaa tgcggttgca 5880

attcagtggc cgatcggtag cgaaagcaat tttaatggca tcattgatct ggttacaatg 5940

accgcgacaa cctataatgg tgaaagtgca gaagaagaat ttccgatgga aattccgacc 6000

gatctgctgg atgtggcaaa agcaaaacgt caggaactgc tggaagcagc ggccaacttt 6060

gatgaagaag ttatgatgat ggtgctggaa ggtgcagatg ttgatattga tacctttaaa 6120

aacaccatcc gtaaagcaac actgaccagc gaattttttc cggtagtttg tggcacgagc 6180

tttaaaaata aaggtgtcaa aaagatgatc gatgcagtgg tggattatct gccgagcccg 6240

ctggatattc cgccgattaa agcatatctg aatgatcagg aaaccgatgt tgtcgcaaca 6300

gatgatggtg aatttgcagc actggcattt aaagttatga ccgatccttt tgttggtagc 6360

ctgacctttt ttcgtgtcta tcgcggtgtt ctggaaaaag gcagctatgt ttataatagc 6420

acgaaagaac agaaagaacg tattggtcgt attctgcaga tgcatgcaaa taatcgtgtt 6480

gaaattgatg aatgtcgtgc aggtgatatt gcagcagcag tgggtctgaa atttaccacc 6540

accggtgata cactggttgg cgaaaaatca cctaaagttg ttctggaaaa aatggttttt 6600

ccggaaccgg ttattagcca ggcactggaa ccggaaagca aagcagcaaa tgaaaaactg 6660

agcctgggtc tgcagaaact gagcgcagaa gatccgacct ttcgtaccta taccgatgaa 6720

gaaaccggtc agaccattat tagcggtatg ggtgaactgc atctggatat tattgttgat 6780

cgtctgaaac gtgaatttgg tgttaaagtt aaagttggtg caccgcaggt tagctatcgt 6840

gaaaccatta ccaaaagcgc agaagttgaa ggtaaacata ttaaacagag cggtggtaaa 6900

ggtcagtatg gtcatgtttg gctgaaattt gaaccgaatc atgatcaggg ttttgaattt 6960

attgataaaa ttgttggtgg taaaattccg aaagaatata ttaaaccgat tcagaaaggt 7020

ctggaagaaa aaatggcagt tggtattctg gcaggttatc cgatgattga tgttaaagca 7080

accctgtttg atggtagcta tcatgatgtt gatagcagcg aactggcata taaaattgca 7140

gcaagcaaag cactgaccaa agcaaaagat ctgattggta ccgttctgct ggaaccgatt 7200

atggatgtta gcgttgttgt tccgagcgat cacatgggtg atgttattgg tgatctgagc 7260

cgtcgtcgtg gtctgattag cgatcaggaa cagcgtaatg atggtgcagt tattgttcgt 7320

gcaaaagttc cgctgagcga aatgtttggt tatagcaccg aactgcgtag catgaccagc 7380

ggtcgtggta cctatcagat gcagtttgat cattatgaaa aatgtccgaa aaatattagc 7440

gatgaaatta ttaaaaaacg taatattcag aataaagatg aagaataact cgagcaccac 7500

caccaccacc actgagatcc ggctgctaac aaagcccgaa aggaagctga gttggctgct 7560

gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt 7620

tttttgctga aaggaggaac tatatccgga t 7651

Claims

1.一种检测滑液囊支原体抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测滑液囊支原体抗体的包被抗原，所述包被抗原为重组EFG蛋白；所述重组EFG蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID NO：1所示序列；所述重组EFG蛋白的核苷酸序列为如SEQ ID NO：2所示序列。

2.根据权利要求1所述的检测滑液囊支原体抗体的试剂盒，其特征在于，所述重组EFG蛋白的扩增引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列：

SEQ ID NO：3：5’-ATGGCACGTGATTATGATCTGAAAG-3’；

SEQ ID NO：4：5’-TTCTTCATCTTTATTCTGAATATTAC-3’。

3.根据权利要求1所述的检测滑液囊支原体抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶标板、包被液、封闭液、酶标二抗、TMB显色液、终止液、洗涤液、血清稀释液。

4.根据权利要求3所述的检测滑液囊支原体抗体的试剂盒，其特征在于，所述包被液为碳酸盐缓冲液；所述洗涤液为PBST；所述酶标二抗为羊抗兔酶标二抗；所述封闭液为5%脱脂奶粉；所述血清稀释液为5%脱脂奶粉。

5.采用权利要求1~4任一项所述的试剂盒检测滑液囊支原体抗体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1；将包被抗原用包被液稀释后放入酶标板内，包被过夜；

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于， S1中包被抗原包被液稀释后浓度为0.8μg/mL，酶标板孔中每孔加入100µL，4℃包被过夜。