CN114317741A - 一种软组织肉瘤基因检测试剂盒和*** - Google Patents
一种软组织肉瘤基因检测试剂盒和*** Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种软组织肉瘤基因检测试剂盒和***。该检测试剂盒包括71对融合基因进行检测的引物组合物以及如下内参基因的扩增引物：MYC、YEATS4、CFHR5、FOSL1、VGLL3、MTTP、PLAG1、FRS2、CSF1、MDM2、HMGA2和MATN1。本发明提供的试剂盒和检测***通过经过修饰的多重扩增引物，可以均一性的扩增出目的序列，并加入10个内参基因进行质控，通过ion torrent高通量测序平台进行检测，共检测233种融合形式，可以一次全面检出患者体内可能存在的融合基因，帮助临床全面快速进行疾病诊断，还可用于对靶向用药进行提示。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学检测技术领域，具体涉及一种软组织肉瘤基因检测试剂盒和***。
背景技术
软组织肉瘤通常发生基因融合，临床上需要检测基因融合来辅助软组织肉瘤基因检测。目前应用最广泛的检测方法是荧光原位杂交(FISH)，通过基因融合探针或基因断裂探针来判断某个基因的融合情况。免疫组化标记(immunohistochemistry，IHC)也可以用来检测软组织肉瘤中的分子改变，其主要是依据抗原抗体反应和化学显色的原理。有些软组织肉瘤已明确一些序列变异，对患者的预后和用药有指导意义，目前临床上进行基因突变检测的常规方法是一代测序(Sanger测序)，通过PCR产物测序，分析序列中碱基变化情况。
理想情况下采用融合探针(fusion probe)可以帮助确定具体的基因融合类型，但一些肿瘤拥有多个伴侣基因，部分伴侣基因发生频率低，如均采用融合探针检测，成本高，并不适合常规开展，采用断裂探针可以解决多个融合伴侣的问题，但依然存在通量较低，一次只能检测一种融合断裂方式的问题。免疫组化标记根据软组织肉瘤中的分子改变或基因表达谱而研制的抗体有着一定的辅助诊断价值，但有一些抗体并不特异，如Fli1、TLE1、MDM2、SATB2和BCOR等，而且仅能检测蛋白表达水平，在表达量判断时需依靠检测者主观观察，不同检测者出具的结果可能会不同，需注意辩证分析。采用一代测序进行基因突变检测，该方法受限于标本中肿瘤细胞含量和比例，且存在灵敏度较低，检测通量较低的问题。随着新的分子异常报道不断涌现，一代测序来检测基因突变愈来愈不能满足临床需求。
此外，软组织肉瘤涉及疾病种类较多，涉及融合基因种类复杂，随着基因检测技术的飞速发展，越来越多以前未被报道的软组织肉瘤相关融合基因被报道，但目前公共数据库中收录的融合基因远远落后于前沿研究，仅依赖公共数据库中收录的融合基因及融合断裂类型，难以满足临床日益增长的需求，如何涵盖尽可能多的融合基因类型及融合断裂方式是提高试剂盒检测性能和检测意义的关键。因此目前亟需一种可以全面快速评估软组织肉瘤患者体内遗传变异的产品和方法。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种软组织肉瘤基因检测试剂盒和***。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面是提供一种软组织肉瘤基因检测试剂盒，其包括用于检测如下融合基因对的引物组合物：ACTB-GLI1、AHRR-NCOA2、ASPSCR1-TFE3、ATIC-ALK、BCOR-CCNB3、C11orf95-MKL2、CARS-ALK、CIC-DUX4、CLTC-ALK、COL1A1-PDGFB、COL3A1-PLAG1、COLA3-CSF1、ETV6-NTRK3、EWSR1-ATF1、EWSR1-CREB1、EWSR1-DDIT3、EWSR1-ERG、EWSR1-ETV1、EWSR1-ETV4、EWSR1-FEV、EWSR1-FLI1、EWSR1-NFATC2、EWSR1-NR4A3、EWSR1-PATZ1、EWSR1-PBX1、EWSR1-POU5F1、EWS-SMARCA5、EWSR1-SP3、EWSR1-WT1、EWSR1-ZNF444、FUS-ATF1、FUS-CREB3L1、FUS-CREB3L2、FUS-DDIT3、FUS-ERG、FUS-FEV、GAB1-ABL1、GTF2I-NCOA2、HEY1-NCOA2、HMGA2-LPP、HMGA2-PPAP2B、HSPA8-NR4A3、JAZF1-SUZ12、NAB2-STAT6、NTRK3-ETV6、PAX3-FOXO1、PAX3-FOXO4、PAX3-NCOA1、PAX3-NCOA2、PAX7-FOXO1、PPFIBP1-ALK、RAB2A-PLAG1、RANBP2-ALK、SEC31A-ALK、SRF-NCOA2、SS18L1-SSX1、SS18-SSX1、SS18-SSX2、SS18-SSX4、TAF15-NR4A3、TCF12-NR4A3、TEAD1-NCOA2、TFG-NR4A3、TPM3-ALK、TPM4-ALK、VGLL2-CITED2、VGLL2-NCOA2、WWTR1-CAMTA1、YAP1-TFE3、YWHAE-FAM22A和YWHAE-FAM22B。
进一步地，上述融合基因对的引物组合物包括核苷酸序列为SEQ ID No.1～198的序列。
进一步地，上述试剂盒还包括内参基因的扩增引物；该内参基因包括MYC、YEATS4、CFHR5、FOSL1、VGLL3、MTTP、PLAG1、FRS2、CSF1、MDM2、HMGA2和MATN1。
本发明的第二方面是提供采用上述试剂盒的软组织肉瘤基因检测***，其包括：
检测单元：采用上述试剂盒进行高通量测序；
数据分析单元：在ion torrent平台IR服务器上构建分析流程，对下机数据进行分析；
质控单元：通过预定的质控程序校验，校验通过则输出检测结果，校验不通过则显示样本失效。
进一步地，在上述检测单元中，通过如下步骤进行高通量测序：
步骤一，样本处理；
步骤二，RNA抽提：提取样本中的RNA；
步骤三，Ampliseq文库构建：将上述RNA进行反转录成cDNA，采用上述试剂盒中的引物组合物分别扩增cDNA目标区域和DNA目标区域，将扩增产物进行混合并进行消化引物，然后进行连接接头并纯化连接产物，最后进行文库富集和纯化；
步骤四，文库Qubit定量和上机测序。
进一步地，在上述数据分析单元中，通过以下步骤进行数据分析：
步骤一，在TS服务器上查看DNA测序数据QC情况；
步骤二，下机数据初始分析，得到QC信息及原始BAM文件；
步骤三，将数据上传到IR上进行分析得到RNA文库融合结果。
进一步地，上述质控单元通过以下程序进行校验：内参基因质控校验和/比对率校验。
进一步地，上述质控单元的质控标准为：样本匹配的reads数大于20000条，且比对率大于85％。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供的试剂盒和检测***通过经过修饰的多重扩增引物，可以均一性的扩增出目的序列，并加入10个内参基因进行质控，通过ion torrent高通量测序平台进行检测，共检测233种融合形式，可以一次全面检出患者体内可能存在的融合基因，帮助临床全面快速进行疾病诊断，还可用于对靶向用药进行提示。
附图说明
图1是本发明一实施例中软组织肉瘤基因检测***的工作流程示意图。
具体实施方式
软组织肉瘤涉及疾病种类较多，涉及融合基因种类复杂，随着基因检测技术的飞速发展，越来越多以前未被报道的软组织肉瘤相关融合基因被报道，但目前公共数据库中收录的融合基因远远落后于前沿研究，仅依赖公共数据库中收录的融合基因及融合断裂类型，难以满足临床日益增长的需求，如何涵盖尽可能多的融合基因类型及融合断裂方式是提高试剂盒检测性能和检测意义的关键。基于上述，本发明提供了一种软组织肉瘤基因检测试剂盒和***，能够对肉瘤相关的71对融合基因(涉及融合断裂方式达233种)进行检测。
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
本实施例提供一种软组织肉瘤基因检测试剂盒，可以检测233种融合形式。该试剂盒包括检测如下表1所示的融合基因的引物组合物(表3)，这些融合基因的临床意义如下表2。
表1 融合基因
表2 融合基因与检测疾病的对应关系
表3 融合基因的引物组合物
上述试剂盒还包括以下内参基因的扩增引物：MYC、YEATS4、CFHR5、FOSL1、VGLL3、MTTP、PLAG1、FRS2、CSF1、MDM2、HMGA2和MATN1。
实施例2
本实施例提供一种软组织肉瘤基因检测***，其包括如下模块单元：
1.检测单元：采用实施例1的试剂盒进行高通量测序。
2.数据分析单元：在ion torrent平台IR服务器上构建分析流程，对下机数据进行分析。
3.质控单元：通过预定的质控程序校验，校验通过则输出检测结果，校验不通过则显示样本失效。
参考图1，该软组织肉瘤基因检测***的工作流程如下：
一、检测
1.1样本处理：对组织标本采用RNA提试剂盒进行核酸提取。提取试剂盒为：Magen石蜡RNA提取试剂盒。
1.2去除石蜡：
1.2.1用干净刀片刮取切片上的样本，立即转移至1.5ml离心管中。
1.2.2用二甲苯去除石蜡。
1.2.3加入1ml二甲苯至装有样本的离心管中，剧烈涡旋10-30s后放至温度为56℃的金属浴中10min。
1.2.4 14,000×g离心3min；小心吸弃上清液，不要吸到沉淀。
1.2.5加入1ml无水乙醇，涡旋混匀10-30s；14,000×g离心5min。
1.2.6小心彻底吸弃上清液，不要吸到沉淀。
1.2.7打开管盖，将离心管置于温度为56℃的金属浴中10min以彻底去除残留的乙醇(注：充分干燥去除乙醇非常重要！残留的乙醇会影响到RNA的抽提效率)。
1.2.8裂解消化。
1.2.9加入200μl Buffer FRL和20μl Proteinase K至样品中，涡旋10s重悬样品。
1.2.10将样本置于56℃金属浴中10min，然后冰上放置3min。
1.2.11室温，20,000×g离心10min。
1.2.12准备新的1.5ml离心管，在管盖上写上样本序号+R。
1.2.13小心转移上清液至上述离心管用于RNA抽提。
1.3RNA抽提
1.3.1将样本放置80℃金属浴15min。
1.3.2短暂离心，加入200μl Buffer RL和600μl无水乙醇，涡旋混匀20s，短暂离心。
1.3.3把HiPure RNA Mini ColumnI装在2ml收集管中，在管盖上写上样本序号+R。
1.3.4转移一半体积的混合液至柱子中，8,000×g离心30s。
1.3.5倒弃流出液，把柱子装在收集管中，转移剩余混合液至柱子中，8,000×g离心30s。
1.3.6倒弃流出液，把柱子装在收集管中，加入500μl Buffer RW2(已用乙醇稀释)至柱子中，8,000×g离心30s。
1.3.7重复步骤1.3.6。
1.3.8倒弃流出液，把柱子装在收集管中，13,000×g离心空柱3min，以甩干柱子的基质。
1.3.9准备新的1.5ml离心管，在管盖上写上样本序号+R、患者姓名、样本编号、抽提日期。
1.3.10将柱子转移至上述1.5ml离心管。加入30μlRNase-Free Water至柱子的膜中央，不要触碰到滤膜，静置1min。13,000×g离心1min。
1.3.11弃去HiPure RNA Mini Column I，盖好管盖，确认管盖上的编号和吸附柱上的是否一致，涡旋混匀10s，短暂离心。
1.3.12Qubit定量：使用Qubit dsRNA HS Assay Kit参照Qubit QuantificationProtocol Guide对样本进行定量
1.4Ampliseq文库构建
1.4.1RNA文库构建。
1.4.2将RNA反转录成cDNA。
1.4.2.1从冰箱冷冻室取出ReverTra Ace试剂盒(TOYOBO)，核对生产批号、生产日期和效期，核对无误后拆开试剂盒。
1.4.2.2室温平衡10-20分钟(待试剂完全融化)，漩涡混匀器上振荡混匀3-5秒，而后放入微型离心机内短暂离心5秒备用。
1.4.2.3按下表4的组份配制逆转录反应液(1人份)：
表4 逆转录反应液
| 试剂名称 | 用量(μl) |
| Template RNA | 10 |
| Primer mix | 1 |
注意：RNA最佳总量为1000ng，若提取RNA浓度大于100ng/μl则稀释至100ng/μl。
将混合液置于普通PCR仪(博日)中，设定反应程序如下表5：
表5 反应程序
1.4.2.4程序结束后继续加入下表6所示的试剂：
表6 反应液的配制
| 试剂名称 | 用量(μl) |
| 5×PCR Buffer | 4 |
| ReverTra Ace | 1 |
| ddH<sub>2</sub>O | 4 |
将混合液置于普通PCR仪(博日)中，设定反应程序如下表7：
表7 反应程序
1.4.2.5程序结束后，将逆转录产物取出，进行下一步实验，如不立即使用，放入4℃冰箱保存。
1.4.3cDNA目标区域的扩增
1.4.3.1将PCR产物短暂离心后，按下表8所示的顺序用移液器缓慢加入各个试剂，其中PCR酶混合液和cDNA扩增引物混合液在使用前应彻底融化，振荡混匀并离心，建议在冰上配制反应体系：
表8 反应体系的组成
| 组分 | 单个样本体积 |
| HIFI MIX | 2μL |
| 5×STS RNA Research panel | 2μL |
| cDNA | 6μl |
| 总体积 | 10μL |
1.4.3.2配好后盖紧PCR管盖，涡旋振荡彻底混匀，瞬离以收集管壁和管盖上的残余溶液，将PCR管置于冰上备用。
1.4.3.3按照下表9设置PCR程序，选择“start”后，设置体积为5μL，确保八连管盖已盖紧，选择“start”开始运行，PCR运行时间约3h；热盖温度105℃(每次提前设置好程序)。
表9 PCR程序
1.4.4DNA目标区域的扩增
1.4.4.1PCR混合液配制(如下表10)：
表10 PCR混合液的组成
| 组分 | 单个样本2个pool的PCR混合液 |
| 5×HIFI MIX | 2μL |
| DNA | 40ng |
| 水 | 与DNA混合到6.5μl |
| 总体积 | 8.5μl |
1.4.4.2分装(2个pool，如下表11)：
表11 各个分装管的组成
| 组分 | Pool1 | Poo12 |
| 1.4.4.1步骤中配制的PCR混合液 | 4μl | 4μl |
| 5×STS DNAResearch panel | 1μl | 1μl |
| 总体积 | 5μl | 5μl |
1.4.4.3配好后盖紧PCR管盖，涡旋振荡彻底混匀，瞬离以收集管壁和管盖上的残余溶液，将PCR管置于冰上备用。
1.4.4.4按照下表12设置PCR程序，选择“start”后，设置体积为5μL，确保八连管盖已盖紧，选择“start”开始运行，PCR运行时间约2.5h；热盖温度105℃(每次提前设置好程序)。该步骤可以10℃过夜。
表12 PCR程序
1.4.4.5PCR结束后，将DNA PCR扩增产物pool1和pool2合并成1管，总体积10μl。
1.4.4.6从-20℃冰箱中取出文库构建试剂盒中的消化酶，于冰上放置，使用前振荡混匀并离心。
1.4.4.7将合并后的DNA PCR扩增产物(总体积10μl)和cDNA扩增产物(10μl)，瞬离后，在每管扩增产物中各加入1μl的消化酶，盖紧PCR盖，涡旋振荡混匀，简短离心以收集管壁和管盖上的残余溶液。
1.4.4.8按照下表13设置PCR程序，选择“start”后，设置体积为12μL，确保PCR管盖已盖紧，选择“start”开始运行：
表13 PCR反应程序
| 温度 | 时间 |
| 50℃ | 10分钟 |
| 55℃ | 10分钟 |
| 60℃ | 20分钟 |
| 10℃ | 保持(最多1小时) |
1.4.4.9PCR仪开始运行后，应提前准备下一步“扩增子的接头连接”的试剂。
1.4.5扩增子的接头连接
1.4.5.1从-20℃冰箱中将提前配好的标签，置于冰上彻底融化。充分振荡混匀离心，置于冰盒上备用。其中标签有96个(1到96)，通常每个文库使用一个唯一的接头。
表14 接头连接反应溶液
| 组分 | 体积 |
| 消化后的PCR产物 | 11μl |
| 标签 | 1μl |
| DNA Ligase(blue cap) | 1μl |
| Switch Solution(yellow cap) | 2μl |
| 总体积 | 15μl |
1.4.5.2震荡混匀，设置PCR反应程序(如下表15)：
表15 接头连接程序
| 温度 | 时间 |
| 22℃ | 30分钟 |
| 68℃ | 5分钟 |
| 72℃ | 5分钟 |
| 10℃ | Hold |
1.4.6连接产物纯化
1.4.6.1将磁珠置于室温平衡30min，并涡旋混匀；
1.4.6.2在1.4.4.3步骤中PCR反应后的每个样本中加入45μL(1.5倍体积)磁珠，吹打混匀，室温孵育5min；
1.4.6.3放置在磁力架上2min，直到上清液变清亮，弃上清；
1.4.6.4加入200μL新鲜配置的70％乙醇，转动离心管进行磁珠清洗，然后弃上清；
1.4.6.5重复步骤1.4.6.4一次；
1.4.6.6保持离心管在磁力架上，晾干5min，但不要太干；
1.4.6.7向离心管中加入25μL无核酸酶水(Life:50μL 1×酶液Black cap)，将离心管从磁力架上取下，充分涡旋混匀重悬磁珠。
1.4.6.8室温温育3min。
1.4.6.9将离心管放置到磁力架上，室温放置2min或直至溶液澄清。
1.4.7文库富集
1.4.7.1向PCR管中加入2μL引物混合液和25μL高保真反应液，从步骤1.4.6.9获得的23μL上清液(自研试剂盒)。
1.4.7.2向PCR管中加入48μL 1×洗脱产物和2μL酶(red cap)。
1.4.7.3在PCR仪上进行以下程序：
1.4.8文库纯化
1.4.8.1将磁珠置于室温平衡30min，并涡旋混匀；
1.4.8.2加入25μL(0.5倍体积)磁珠，吹打混匀，室温孵育5min；
1.4.8.3放置在磁力架上5min，直到上清变清亮，转移上清至新的离心管中；
1.4.8.4加入60μL(1.2倍体积)磁珠，吹打混匀，室温孵育5min；
1.4.8.5放置在磁力架上3min，直到上清变清亮，弃上清；
1.4.8.6加入200μL新鲜配置的70％乙醇，转动离心管进行磁珠清洗，然后弃上清；
1.4.8.7重复步骤1.4.8.6一次；
1.4.8.8保持离心管在磁力架上，晾干5min，但不要太干；
1.4.8.9将离心管从磁力架上取下，加入50μL无核酸酶水，涡旋混匀；
1.4.8.10放置在磁力架上2min，直到上清变清亮，从离心管中吸取45μL上清液，转移至新的1.5ml离心管。
1.5文库Qubit定量
1.5.1配置Qubit working solution(针对每一个样本)：取199μl QubitTM ssDNAbuffer加入到500μl离心管中，然后再加1μl Qubit ssDNAreagent，涡旋混匀。
1.5.2标准品校准：取10μl QubitTM ssDNA Standard 1加入到190μl Qubitworking solution，涡旋混匀；取10μl QubitTM ssDNA Standard 2加入到190μl Qubitworking solution，涡旋混匀，室温静置2min；按照仪器提示选择“标准品”，读数。在仪器不关机的情况下，标准品校准时间最少一周校准一次，每次仪器重新启动，需要重新使用标准品校准一次。
1.5.3取1μl DNA样本加入到199μl Qubit working solution中，涡旋混匀。
1.5.4按照仪器提示选择DNA样本，然后读数。文库浓度>0.2ng/μl进行后续实验。如果文库浓度<0.2ng/μl需要分析原因，重新构建文库。
1.6上机测序。
二、数据分析
2.1在TS服务器上查看DNA测序数据QC情况。
2.1.1BED文件上传，设置基本分析参数(bed文件即panel设计时产生的设计区域信息文件)。
2.1.2首先打开TS服务器(192.168.10.54)，找到界面中的Reference Sequences选择，进入数据库存储页面。
2.1.3选择Target Regions选项，然后选择右边Add Target Regions选项，将软组织肉瘤panel的检测区域bed文件导入***中。
2.1.4上传完成，再次选择Target Regions选项能看到上传好的bed文件。
2.1.5选择Data，点击到对应日期上机数据，查看对应具体数据情况。
2.2下机数据初始分析，得到QC信息，及原始BAM文件。
2.2.1在上机数据概览页面点击Plugins按钮，选择select Plugins to run选择，点击进入。在此界面可以对扩增片段大小分布进行查看，需集中在设计扩增子大小区域内。
2.2.2选择coverageAnalysis分析(Thermo Fisher Scientific自写QC脚本生成，当前版本v5.12.0.0)。
2.2.3选择文库类型，找到刚才上传到服务器的软组织肉瘤panel bed文件，点击确定，开始分析。
2.2.4分析完成，查看数据上靶率，测序深度和数据均一性的信息，此处要求上靶率>90％，测序深度>500X，均一性>85％。
2.3将数据上传到IR上进行分析
2.3.1将原始数据bam文件下载到本地。
2.3.2登录IR服务器，点击define Sample选项，上传本地样本。
2.3.3使用IR服务器中的Launch Analysis开始分析(该流程使用平台自写脚本，应用BaseCaller、tmap、variant caller等软件)。
2.3.4分析得到RNA文库融合结果。
三、质控
通过预定的质控程序校验，校验通过则输出检测结果，校验不通过则显示样本失效。
质控标准：样本mapping reads数大于20000条，且mapping率大于85％。
验证实施例1
本实施例对实施例2提供的试剂盒以及相应的检测方法进行方法学验证，具体的验证过程和结果如下：
1.准确性和特异性
本研究采用已被临床诊断的35例肉瘤标本(基本信息如表16)，并采用一代测序和FISH方法进行平行验证，检测特异性高达100％(结果如下表17)。
表16 35例肉瘤患者的基本信息
表17 35例肉瘤标本的检测结果
2.灵敏度及检测下限
选取5例样本RNA进行稀释检测，分别取5ng、10ng、15ng进行梯度实验，结果有一例5ng的稀释浓度未检出，其余浓度样本均成功检出融合(见下表18)，因此将样本最低输入量定位10ng，依据生信结果将最低检出reads数定义为20条。
表18 5例样本的检测结果
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海桐树医学检验实验室有限公司
<120> 一种软组织肉瘤基因检测试剂盒和***
<160> 198
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 10
caggagcttg gcaaattgct c 21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 11
ctcatcgttg gcccacagag aa 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 12
ctcagggctc tgcagctcca tc 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 13
ccagttcctg ttgcagactg tg 22
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 14
cgagcggctt cactcagacc ctg 23
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 15
cctgacccgc tgcttcatct gc 22
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 16
attcagtggc ttccccatc 19
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 17
aggagatccg caaatacagc at 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 18
ctcgtctccc acgaccgcgt gg 22
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 19
agtgagcgaa tggacaggt 19
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 20
gatggactac gacggcagcc gg 22
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 21
tggtgcctga cactggcaga 20
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 22
cgctggagag cgaggtggct tc 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 23
tccagcctat gggcagcagc ca 22
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 24
tctgatgcat gttgtgatg 19
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 25
ctcagggctc tgcagct 17
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 26
gatatagacc aacacagcct gg 22
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 27
gagtaactac agttatcccc ag 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 28
ccgtgtgccc tggcactgag cg 22
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 29
actcttcgtg gaagagagtg g 21
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 30
gatttgatcg tggaggcatg ag 22
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 31
ggaatgaacc cacatcagac cc 22
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 32
actaaggtgg gccttgagca cc 22
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 33
ctcccaggtc aagccag 17
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 34
ctcctgaggg caaaacccag ag 22
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 35
ggtgactctc acagccga 18
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 36
cagttcagcg atgaccccaa gg 22
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 37
tctttctttt cagattgtgt ac 22
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 38
gtgacccagc tcacccgcga gg 22
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 39
gtggccacca gcttcagg 18
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 40
cctgacagca tcatctggga ca 22
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 41
ttgtcctcct tgaagggctc ca 22
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 42
ccaccattct tcagagggca at 22
<210> 43
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 43
catgttcatc tctaatt 17
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 44
cctatgtacc cccataccgc cc 22
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 45
tccacggtca tcttgatgg 19
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 46
tgggagttgt taaacctggc 20
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 47
gatgagcttt gtgcaaaagg gg 22
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 48
tctgaatcat atgaacctcc ac 22
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 49
tctgaatcat atgaacctcc ac 22
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 50
agctgctgtt cccattgct 19
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 51
actctgctgg gctcctctgt ag 22
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 52
ttctccataa tgtttggtac c 21
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 53
tctgaatcat atgaacctcc ac 22
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 54
cctcatcact cggagactca 20
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 55
gaggagcgcg ctcctgaggg ca 22
<210> 56
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 56
ggtcagcttc ccacatctcc ag 22
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 57
ctcagggctc tgcagctcca 20
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 58
ccctaccttc aggtgttatc ag 22
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 59
tttgtgcctc cgtcggggcc ct 22
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 60
gcctcgttgt gaaccttgat 20
<210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 61
gtcaatatag ccaacagagc ag 22
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 62
ctgtatgtct cctttggtgt 20
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 63
agcaggccta ccccatccag cc 22
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 64
ggtgactctc acagccgaac t 21
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 65
gggtacaggc agttgcaatc a 21
<210> 66
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 66
ggtgccttcc caggtgat 18
<210> 67
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 67
ggttacaacc gcagcagtgg tg 22
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 68
gatgcagctg gagttggagc t 21
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 69
ccctcgggac caaggatcac gt 22
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 70
cagagacccg tgctgagttt gc 22
<210> 71
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 71
ctcagggctc tgcagctc 18
<210> 72
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 72
ctccggcatg tgcaaggccg gc 22
<210> 73
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 73
ccttctacaa tgagctgcgt gt 22
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 74
gggccctttt tggtgattca 20
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 75
cacttgccaa ccagcatgtc c 21
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 76
cagattcagg ctcacgcttc 20
<210> 77
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 77
ctgagcattt catcattgt 19
<210> 78
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 78
tccaagccaa agaagtccaa gt 22
<210> 79
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 79
gctgacagtg atggctggt 19
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 80
tcgccaggag ctcatccagc 20
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 81
ggtgccaagg gagatgctgg tc 22
<210> 82
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 82
ggcgttggag atcatcaa 18
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 83
tgatggtgct actggtgctg cc 22
<210> 84
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 84
gctggccctg ctggaaaccc tg 22
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 85
gccctcctgg tcccaagggt aa 22
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 86
cccaaaggat ctcctggtga ag 22
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 87
gtggtcaggc tggtgtgatg gg 22
<210> 88
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 88
tcggtcctgc tggcaaagat gg 22
<210> 89
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 89
ctccaggtga agcaggcaaa cc 22
<210> 90
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 90
gagcgtggtg tgcaaggtcc cc 22
<210> 91
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 91
cttcagggaa tgcctggtga ac 22
<210> 92
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 92
gcgtccgtgg tctgactggc cc 22
<210> 93
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 93
cctggtgaca agggtgaaag tg 22
<210> 94
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 94
ggcgaacctg gtgatgctgg tg 22
<210> 95
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 95
cctggcccca ttggtaatgt tg 22
<210> 96
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 96
tggtccccct ggtgctactg gt 22
<210> 97
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 97
acgtcctggt gaagttggtc cc 22
<210> 98
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 98
ttgctggaca gcgtggtgtg gt 22
<210> 99
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 99
cccctggatt ggctggaccc cc 22
<210> 100
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 100
ctgctggcaa gagtggtgat cg 22
<210> 101
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 101
ggtgacaagg gtgagacagg cg 22
<210> 102
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 102
tcctggctct cctggtgaac aa 22
<210> 103
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 103
caaagatgga ctcaacggtc tc 22
<210> 104
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 104
cacctgccgt gacctcaaga tg 22
<210> 105
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 105
ctggttcggc gagagcatga cc 22
<210> 106
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 106
gagatggcat ccctggacag cc 22
<210> 107
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 107
ctttgctccc cagctgtctt at 22
<210> 108
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 108
ggtcctcgtg gtctccctgg cc 22
<210> 109
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 109
ccccctggaa agaatggaga tg 22
<210> 110
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 110
ctcagggtgc tcgaggattg cc 22
<210> 111
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 111
cggttttcca ggcatttca 19
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 112
cctgtacccc atcggtacca t 21
<210> 113
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 113
tgcagttgga tcagtctg 18
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 114
gatttgcaag gcggctactt 20
<210> 115
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 115
ggtgccttcc caggtgatg 19
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 116
cggtcacggc caccccacgc 20
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 117
ccctctgtgt ggaggtacat 20
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 118
gtccgctgcc tttctgaacc 20
<210> 119
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 119
cgggcccagg atctgatacg ga 22
<210> 120
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 120
gtgaactttc cctgaggtaa ct 22
<210> 121
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 121
tgacactcaa tcgtgagga 19
<210> 122
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 122
gcaccgctaa gggtccag 18
<210> 123
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 123
gtaagggttg ctgagatggg aa 22
<210> 124
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 124
ccattgatgc cattctcata c 21
<210> 125
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 125
cagttacaaa caaaagggcg tt 22
<210> 126
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 126
agaagtgaca gcagcagaa 19
<210> 127
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 127
aggttggcct tccttgg 17
<210> 128
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 128
gtaagggttg ctgagatggg a 21
<210> 129
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 129
ccatagactt taccaca 17
<210> 130
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 130
ctcctgcttg taggggcgca c 21
<210> 131
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 131
gttattgccc caagctcctc tt 22
<210> 132
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 132
ctggtggacc catggatgaa gg 22
<210> 133
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 133
tctgcgccgc ataactggaa c 21
<210> 134
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 134
gatgccacag tgtcctatga ag 22
<210> 135
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 135
gcaccgctaa gggtccagg 19
<210> 136
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 136
ggaagaagcc tccaatgaac ag 22
<210> 137
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 137
tgcagttgga tcagtctgct 20
<210> 138
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 138
gggtgagaat gttacaattg ag 22
<210> 139
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 139
gagccgtcgc tgtcactgc 19
<210> 140
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 140
cttgcaggtc ctcataccag g 21
<210> 141
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 141
ctcgccgggc agactttaat cg 22
<210> 142
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 142
ccagtgtaag gcccctaaac ca 22
<210> 143
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 143
cagagttaca gtggttatag cc 22
<210> 144
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 144
cagcaaagct ataatccccc tc 22
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 145
tctgaagtcc ctgtactcca 20
<210> 146
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 146
atgaggagcc gtgaggagag 20
<210> 147
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 147
ctaaagcagc tcaaaagaaa gc 22
<210> 148
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 148
ggtgctcaag ctcatcctct g 21
<210> 149
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 149
gtggctcgga gaatccgctc 20
<210> 150
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 150
agacatgtaa gtaagagttc 20
<210> 151
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 151
cgaccttgcc aacgtaccag ct 22
<210> 152
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 152
ggaatctgat cgcctgtt 18
<210> 153
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 153
gagcatccac caagaactt 19
<210> 154
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 154
gtctcacata agcctggcaa 20
<210> 155
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 155
tggcctcgtg tctgggaaaa g 21
<210> 156
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 156
gatcttcgac agtgcctgaa ca 22
<210> 157
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 157
acctccacaa cagggatatc ca 22
<210> 158
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 158
cttctgacac tcccttc 17
<210> 159
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 159
gattttctcc gaggatttca 20
<210> 160
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 160
cccatcattt tgtgggccag 20
<210> 161
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 161
cagggtcgct gatctcttca t 21
<210> 162
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 162
ctgacactcc cttcgaatca 20
<210> 163
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 163
cagcagcatg attcctatag tc 22
<210> 164
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 164
tgacagtcga ttaggagccc at 22
<210> 165
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 165
cggctatggt gcacagcagc cg 22
<210> 166
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 166
ctgacaaact gaaagaggct ga 22
<210> 167
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 167
ggactctaca cttatcatgc ag 22
<210> 168
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 168
tgtggtgaag ggcagagccg 20
<210> 169
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 169
ccttcccagg tgatgcagct 20
<210> 170
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 170
gttagtgaaa tggacagtga ga 22
<210> 171
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 171
gttagtgaaa tggacagtga ga 22
<210> 172
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 172
tcatcgggaa gacctggctt ac 22
<210> 173
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 173
agttctcgct tcagcacgat g 21
<210> 174
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 174
tgcaaggcgg ctacttgttg g 21
<210> 175
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 175
gcttctctga aaggctctcc tt 22
<210> 176
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 176
tacggctgca ccgagtcgta 20
<210> 177
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 177
cttcttccgt gggacaatat gt 22
<210> 178
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 178
agtgtgccca tcttcttctc t 21
<210> 179
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 179
gcactcagtc tgtataaacg gg 22
<210> 180
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 180
gaacagctac tttttctcca tc 22
<210> 181
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 181
cgggcatgtt ccgagacttc gg 22
<210> 182
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 182
ctgactgcca ctcatggtgt t 21
<210> 183
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 183
ctggagcctt tcatggaaca gt 22
<210> 184
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 184
ccagtgggcc cttggattt 19
<210> 185
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 185
tgtgtcagaa tgaaggctgc aa 22
<210> 186
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 186
gacttgggat gccttctgga a 21
<210> 187
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 187
ggccctacaa gtgcatacaa ca 22
<210> 188
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 188
gattcttcag atgatctttc cg 22
<210> 189
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 189
gttgtagctg tccagataaa ga 22
<210> 190
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 190
agtcacgttt gcgggtgtat 20
<210> 191
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 191
gctggagaag gtcaagaatg tc 22
<210> 192
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 192
gtacaggcag ttgcaatca 19
<210> 193
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 193
tggttggatc aggattcagt tt 22
<210> 194
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 194
tgcctgatac acagtaactt g 21
<210> 195
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 195
cacaacaagt tgttcagaag aa 22
<210> 196
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 196
tgcagtgtct tctcccttca 20
<210> 197
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 197
gagggtcctc tctggcacta gc 22
<210> 198
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence (人工序列）
<400> 198
agagctgtcg acaacaaaca 20
Claims (8)
1.一种软组织肉瘤基因检测试剂盒，其特征在于，包括用于检测如下融合基因对的引物组合物：ACTB-GLI1、AHRR-NCOA2、ASPSCR1-TFE3、ATIC-ALK、BCOR-CCNB3、C11orf95-MKL2、CARS-ALK、CIC-DUX4、CLTC-ALK、COL1A1-PDGFB、COL3A1-PLAG1、COLA3-CSF1、ETV6-NTRK3、EWSR1-ATF1、EWSR1-CREB1、EWSR1-DDIT3、EWSR1-ERG、EWSR1-ETV1、EWSR1-ETV4、EWSR1-FEV、EWSR1-FLI1、EWSR1-NFATC2、EWSR1-NR4A3、EWSR1-PATZ1、EWSR1-PBX1、EWSR1-POU5F1、EWS-SMARCA5、EWSR1-SP3、EWSR1-WT1、EWSR1-ZNF444、FUS-ATF1、FUS-CREB3L1、FUS-CREB3L2、FUS-DDIT3、FUS-ERG、FUS-FEV、GAB1-ABL1、GTF2I-NCOA2、HEY1-NCOA2、HMGA2-LPP、HMGA2-PPAP2B、HSPA8-NR4A3、JAZF1-SUZ12、NAB2-STAT6、NTRK3-ETV6、PAX3-FOXO1、PAX3-FOXO4、PAX3-NCOA1、PAX3-NCOA2、PAX7-FOXO1、PPFIBP1-ALK、RAB2A-PLAG1、RANBP2-ALK、SEC31A-ALK、SRF-NCOA2、SS18L1-SSX1、SS18-SSX1、SS18-SSX2、SS18-SSX4、TAF15-NR4A3、TCF12-NR4A3、TEAD1-NCOA2、TFG-NR4A3、TPM3-ALK、TPM4-ALK、VGLL2-CITED2、VGLL2-NCOA2、WWTR1-CAMTA1、YAP1-TFE3、YWHAE-FAM22A和YWHAE-FAM22B。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述融合基因对的引物组合物包括核苷酸序列为SEQ ID No.1～198的序列。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括内参基因的扩增引物；所述内参基因包括MYC、YEATS4、CFHR5、FOSL1、VGLL3、MTTP、PLAG1、FRS2、CSF1、MDM2、HMGA2和MATN1。
4.一种采用权利要求1-3任一项所述试剂盒的软组织肉瘤基因检测***，其包括：检测单元：采用所述试剂盒进行高通量测序；
数据分析单元：在ion torrent平台IR服务器上构建分析流程，对下机数据进行分析；
质控单元：通过预定的质控程序校验，校验通过则输出检测结果，校验不通过则显示样本失效。
5.根据权利要求4所述的软组织肉瘤基因检测***，其特征在于，在所述检测单元中，通过如下步骤进行高通量测序：
步骤一，样本处理；
步骤二，RNA抽提：提取样本中的RNA；
步骤三，Ampliseq文库构建：将所述RNA进行反转录成cDNA，采用所述试剂盒中的引物组合物分别扩增cDNA目标区域和DNA目标区域，将扩增产物进行混合并进行消化引物，然后进行连接接头并纯化连接产物，最后进行文库富集和纯化；
步骤四，文库Qubit定量和上机测序。
6.根据权利要求4所述的软组织肉瘤基因检测***，其特征在于，在所述数据分析单元中，通过以下步骤进行数据分析：
步骤一，在TS服务器上查看DNA测序数据QC情况；
步骤二，下机数据初始分析，得到QC信息及原始BAM文件；
步骤三，将数据上传到IR上进行分析得到RNA文库融合结果。
7.根据权利要求4所述的软组织肉瘤基因检测***，其特征在于，所述质控单元通过以下程序进行校验：内参基因质控校验和/比对率校验。
8.根据权利要求4所述的软组织肉瘤基因检测***，其特征在于，所述质控单元的质控标准为：样本匹配的reads数大于20000条，且比对率大于85％。
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|---|---|---|---|
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