CN114317653A - 一种利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法，涉及蛋白提取技术领域。本发明先将粉碎后的牛心脉管利用碱液微波加热后，在超声波辅助下，利用水解蛋白酶提取蛋白，再利用中性蛋白酶结合大孔树脂进行吸附脱色，减少弹性蛋白损失，然后利用红外加热灭酶，并实现初步浓缩；接着通过自制除菌膜，减少弹性蛋白的微生物含量，并且进一步浓缩，最后通过喷雾冷冻干燥固化弹性蛋白，其中，自制除菌膜在超声波辅助下，利用十二烷基邻苯二甲酸酯、十二烷基二甲胺改性纤维素，并与聚偏氟乙烯交联，赋予自制除菌膜高效杀菌和优异的力学性能。本发明制备的利用牛心脉管提取弹性蛋白纯度高、微生物含量低、耗时短。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白提取技术领域，具体为一种利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法。
背景技术
弹性蛋白是细胞外基质中不溶性的、高度交联的大分子纤维状蛋白质，在体内可与微原纤维结合形成弹性纤维，主要功能是被动伸缩，赋予所在组织和器官以伸缩性和可逆的变形能力，因而大量存在于韧带、动脉、肺和皮肤等以弹性为基础的器官和组织中。
随着市场对弹性蛋白需求的与日俱增，但现有的提取工艺存在着一定缺陷；在进行酶解提取弹性蛋白后，利用棉饼脱色，往往会掺杂棉絮在溶液中，影响弹性蛋白的品质和纯度，引入了大量杂质，即便后续过滤，也会有少量棉絮残存在蛋白内，影响弹性蛋白的实际运用；此外，在杀菌处理过程中，对弹性蛋白生物活性有一定的影响，会破坏蛋白分子链，而且多次杀菌后，微生物含量虽然降低，但严重损失弹性蛋白，使得实际重量大大减少。因此，需要一种更高效的弹性蛋白提取工艺。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法，以解决现有技术中存在的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法，其特征在于，主要包括以下制备步骤：
(1)将牛心脉管、牛心脉管质量3～5倍的纯化水置于胶体磨粉碎机中，粉碎3～5min，得浆液；
(2)将浆液置于玻璃容器，加入质量分数为5％的氢氧化钠至溶液pH为7.0～7.5，置于微波炉中，微波功率为600～700W，加热50～70s后，冷却至室温，得加热提取液；
(3)将加热提取液置于超声波清洗机，超声波功率为140～160W，加入牛心脉管质量0.03倍的水解蛋白酶，提取40～60min，得酶解提取液；
(4)将酶解提取液置于离心机中，4000～4500rpm下离心10～15min后，置于50℃恒温水浴锅中，加入牛心脉管质量0.01倍的中性蛋白酶，酶解9～11min后，加入牛心脉管质量0.1倍的大孔树脂，吸附40～50min，过滤得上清液；
(5)将上清液置于红外发生器，红外能强度为3～5kW/m2，灭酶6～8min，加入质量分数为5％的盐酸至溶液pH为4.8～5.0；然后置于离心机中，6000～6200rpm下离心13～15min，得弹性蛋白；
(6)将弹性蛋白通过自制除菌膜进行杀菌；
(7)将杀菌后的弹性蛋白进行喷雾冷冻干燥，完成利用牛心脉管提取弹性蛋白。
进一步的，步骤(1)所述胶体磨粉碎机中转子线速度为20～30m/s。
进一步的，步骤(5)所述红外发生器使用前预热20min，温度达到180℃。
进一步的，步骤(6)所述自制除菌膜的制备方法为：
a、将纤维素溶于纤维素质量40～45倍的去离子水，200～250W下超声溶解3～5min后，升温至80～100℃，加入纤维素质量1.2～1.5倍的十二烷基邻苯二甲酸酯，200～300rpm下搅拌20～30min后，在200～300W超声功率下反应50～60min，冷却至室温，300rpm、80℃下旋蒸3～5h得芳基化纤维素；
b、将芳基化纤维素加入三颈烧瓶中，边以50rpm的速度搅拌边加入芳基化纤维素质量7.5～8倍的质量分数为65％的盐酸、芳基化纤维素质量0.35～0.4倍的多聚甲醛，控制温度在15～25℃，以0.5～0.7mL/min的速度滴加芳基化纤维素质量0.4～0.5倍的三氯氧磷，300～400rpm下反应16～20h，抽滤，依次用去离子水、碳酸氢钠水溶液洗涤7～10次，碳酸氢钠水溶液中碳酸氢钠和去离子水的质量比为1:32，再用蒸馏水洗涤至溶液pH为6～7、60℃、0.02MPa下真空干燥2～3h，得氯化纤维素；
c、将氯化纤维素、氯化纤维素质量3～3.5倍的乙酸乙酯加入反应瓶，搅拌溶解，0～2℃冰水浴冷却下，加入氯化纤维素质量0.6～0.7倍的十二烷基二甲胺，室温下反应20～24h后，过滤，得改性纤维素；
d、将聚偏氟乙烯置于100℃、0.08MPa的真空烘箱中干燥20～24h，加入聚偏氟乙烯质量2～3倍的磷酸三乙酯，200～300rpm下搅拌4～5h，置入外层纺丝料液罐内，静置脱泡12～14h；将改性纤维素、二甲基甲酰胺、丙酮和甘油按质量比1:1.45:0.88:3加入内层纺丝料液罐内；200～300rpm下搅拌2～4h，静置脱泡8～10h，共挤出制得中空纤维膜；
e、145～155℃下，中空纤维膜在300～400W功率的超声辐照下处理5～10min后，室温下静置2～3h得自制除菌膜。
进一步的，步骤d所述共挤出过程中，外层纺丝液速率为0.2mL/min，内层纺丝液速率为0.8mL/min，芯液速率为0.3mL/min，喷头温度为75℃，冷凝温度为15℃，冷凝源为自来水；芯液为甲基吡咯烷酮和去离子水按体积比95:5混合。
进一步的，步骤(7)所述喷雾冷冻干燥的冷浸温度为-90～-80℃，进料量为10～15mL/min。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：
本发明利用牛心脉管经过微波加热、超声酶解、吸附脱色、红外灭酶、除菌、喷雾冷冻干燥等步骤提取弹性蛋白，操作简单，提取的弹性蛋白纯度高、微生物含量低。
首先，牛心脉管通过碱液微波加热，使弹性纤维充分溶胀，利于后续提取弹性蛋白；然后在超声波辅助下，利用水解蛋白酶，高效、快速提取蛋白；再利用中性蛋白酶的限制性酶解结合大孔树脂进行吸附脱色，效果显著、弹性蛋白损失率较低；然后红外加热灭酶，时间短、效率高，同时还能达到部分脱水，实现初步浓缩；接着通过自制除菌膜，减少弹性蛋白的微生物含量，并且进一步浓缩；通过喷雾冷冻干燥固化弹性蛋白，形成多孔颗粒状，具有相互连通的孔隙网格结构，比表面积大，复水性好。
其次，自制除菌膜采用改性纤维素为内层、聚偏氟乙烯为外层共挤出制得双层非对称中空纤维膜；改性纤维素由纤维素、十二烷基邻苯二甲酸酯和十二烷基二甲胺制得；在超声波作用下，十二烷基邻苯二甲酸酯的羧基与纤维素的羟基反应；超声波使纤维素结构变得疏松，利于十二烷基邻苯二甲酸酯插层反应，加快反应速率；再将十二烷基邻苯二甲酸酯氯化，与十二烷基二甲胺的叔氨基反应形成抗菌基团季铵盐，使改性纤维素具有杀菌效果，减少弹性蛋白质中的微生物；十二烷基邻苯二甲酸酯、十二烷基二甲胺能够激发抗菌基团活性，提高自制除菌膜的抑菌效果，有效去除弹性蛋白中的细菌，并且，引入多个疏水基，提高改性纤维素的疏水性，有利于浓缩弹性蛋白；制成膜后，在超声辐照的作用下，聚偏氟乙烯分子链穿过改性纤维素层间，由于改性纤维素再次超声辐照，使改性纤维素结构重新聚合，从而两者紧密交联，减少膜分层，提高自制除菌膜的力学性能。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了更清楚的说明本发明提供的方法通过以下实施例进行详细说明，在以下实施例中提取的弹性蛋白的各指标测试方法如下：
纯度：取质量相同的实施例与对比例提取的弹性蛋白利用质谱法和凝胶分离色谱法测定纯度。
提取率：取质量相同的实施例与对比例提取的弹性蛋白采用凯氏定氮法测定弹性蛋白质含量，计算弹性蛋白质提取率。弹性蛋白提取率＝(弹性蛋白质量/牛心脉管质量)×100％。
微生物含量：取质量相同的实施例与对比例提取的弹性蛋白测定微生物含量，分别参照GB 4789.2、GB 4789.3、GB 4789.2测定菌落总数含量、大肠菌群含量和霉菌含量。
实施例1
一种利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法，所述利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法主要包括以下制备步骤：
(1)将牛心脉管、牛心脉管质量3倍的纯化水置于胶体磨粉碎机中，粉碎3min，得浆液；
(2)将浆液置于玻璃容器，加入质量分数为5％的氢氧化钠至溶液pH为7.0，置于微波炉中，微波功率为600W，加热70s后，冷却至室温，得加热提取液；
(3)将加热提取液置于超声波清洗机，超声波功率为140W，加入牛心脉管质量0.03倍的水解蛋白酶，提取40min，得酶解提取液；
(4)将酶解提取液置于离心机中，4000rpm下离心15min后，置于50℃恒温水浴锅中，加入牛心脉管质量0.01倍的中性蛋白酶，酶解9min后，加入牛心脉管质量0.1倍的大孔树脂，吸附40min，过滤得上清液；
(5)将上清液置于红外发生器，红外能强度为3kW/m2，灭酶8min，加入质量分数为5％的盐酸至溶液pH为4.8；然后置于离心机中，6000rpm下离心15min，得弹性蛋白；
(6)将弹性蛋白通过自制除菌膜进行杀菌；
(7)将杀菌后的弹性蛋白进行喷雾冷冻干燥，完成利用牛心脉管提取弹性蛋白。
进一步的，步骤(1)所述胶体磨粉碎机中转子线速度为20m/s。
进一步的，步骤(5)所述红外发生器使用前预热20min，温度达到180℃。
进一步的，步骤(6)所述自制除菌膜的制备方法为：
a、将纤维素溶于纤维素质量40倍的去离子水，200W下超声溶解3min后，升温至80℃，加入纤维素质量1.2倍的十二烷基邻苯二甲酸酯，200rpm下搅拌30min后，在200W超声功率下反应60min，冷却至室温，300rpm、80℃下旋蒸3h得芳基化纤维素；
b、将芳基化纤维素加入三颈烧瓶中，边以50rpm的速度搅拌边加入芳基化纤维素质量7.5倍的质量分数为65％的盐酸、芳基化纤维素质量0.35倍的多聚甲醛，控制温度在15℃，以0.5mL/min的速度滴加芳基化纤维素质量0.4倍的三氯氧磷，300rpm下反应20h，抽滤，依次用去离子水、碳酸氢钠水溶液洗涤7次，碳酸氢钠水溶液中碳酸氢钠和去离子水的质量比为1:32，再用蒸馏水洗涤至溶液pH为6、60℃、0.02MPa下真空干燥2h，得氯化纤维素；
c、将氯化纤维素、氯化纤维素质量3倍的乙酸乙酯加入反应瓶，搅拌溶解，0℃冰水浴冷却下，加入氯化纤维素质量0.6倍的十二烷基二甲胺，室温下反应20h后，过滤，得改性纤维素；
d、将聚偏氟乙烯置于100℃、0.08MPa的真空烘箱中干燥20h，加入聚偏氟乙烯质量2倍的磷酸三乙酯，200rpm下搅拌4h，置入外层纺丝料液罐内，静置脱泡12h；将改性纤维素、二甲基甲酰胺、丙酮和甘油按质量比1:1.45:0.88:3加入内层纺丝料液罐内；200rpm下搅拌4h，静置脱泡8h，共挤出制得中空纤维膜；
e、145℃下，中空纤维膜在300W功率的超声辐照下处理10min后，室温下静置2h得自制除菌膜。
进一步的，步骤d所述共挤出过程中，外层纺丝液速率为0.2mL/min，内层纺丝液速率为0.8mL/min，芯液速率为0.3mL/min，喷头温度为75℃，冷凝温度为15℃，冷凝源为自来水；芯液为甲基吡咯烷酮和去离子水按体积比95:5混合。
进一步的，步骤(7)所述喷雾冷冻干燥的冷浸温度为-90℃，进料量为10mL/min。
实施例2
一种利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法，所述利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法主要包括以下制备步骤：
(1)将牛心脉管、牛心脉管质量5倍的纯化水置于胶体磨粉碎机中，粉碎5min，得浆液；
(2)将浆液置于玻璃容器，加入质量分数为5％的氢氧化钠至溶液pH为7.5，置于微波炉中，微波功率为700W，加热50s后，冷却至室温，得加热提取液；
(3)将加热提取液置于超声波清洗机，超声波功率为160W，加入牛心脉管质量0.03倍的水解蛋白酶，提取40min，得酶解提取液；
(4)将酶解提取液置于离心机中，4500rpm下离心10min后，置于50℃恒温水浴锅中，加入牛心脉管质量0.01倍的中性蛋白酶，酶解11min后，加入牛心脉管质量0.1倍的大孔树脂，吸附50min，过滤得上清液；
(5)将上清液置于红外发生器，红外能强度为5kW/m2，灭酶6min，加入质量分数为5％的盐酸至溶液pH为5.0；然后置于离心机中，6200rpm下离心13min，得弹性蛋白；
(6)将弹性蛋白通过自制除菌膜进行杀菌；
(7)将杀菌后的弹性蛋白进行喷雾冷冻干燥，完成利用牛心脉管提取弹性蛋白。
进一步的，步骤(1)所述胶体磨粉碎机中转子线速度为30m/s。
进一步的，步骤(5)所述红外发生器使用前预热20min，温度达到180℃。
进一步的，步骤(6)所述自制除菌膜的制备方法为：
a、将纤维素溶于纤维素质量45倍的去离子水，250W下超声溶解3min后，升温至100℃，加入纤维素质量1.5倍的十二烷基邻苯二甲酸酯，300rpm下搅拌20min后，在300W超声功率下反应50min，冷却至室温，300rpm、80℃下旋蒸5h得芳基化纤维素；
b、将芳基化纤维素加入三颈烧瓶中，边以50rpm的速度搅拌边加入芳基化纤维素质量8倍的质量分数为65％的盐酸、芳基化纤维素质量0.4倍的多聚甲醛，控制温度在25℃，以0.7mL/min的速度滴加芳基化纤维素质量0.5倍的三氯氧磷，400rpm下反应16h，抽滤，依次用去离子水、碳酸氢钠水溶液洗涤10次，碳酸氢钠水溶液中碳酸氢钠和去离子水的质量比为1:32，再用蒸馏水洗涤至溶液pH为7、60℃、0.02MPa下真空干燥3h，得氯化纤维素；
c、将氯化纤维素、氯化纤维素质量3.5倍的乙酸乙酯加入反应瓶，搅拌溶解，2℃冰水浴冷却下，加入氯化纤维素质量0.7倍的十二烷基二甲胺，室温下反应24h后，过滤，得改性纤维素；
d、将聚偏氟乙烯置于100℃、0.08MPa的真空烘箱中干燥24h，加入聚偏氟乙烯质量3倍的磷酸三乙酯，300rpm下搅拌5h，置入外层纺丝料液罐内，静置脱泡14h；将改性纤维素、二甲基甲酰胺、丙酮和甘油按质量比1:1.45:0.88:3加入内层纺丝料液罐内；300rpm下搅拌2h，静置脱泡10h，共挤出制得中空纤维膜；
e、155℃下，中空纤维膜在400W功率的超声辐照下处理5min后，室温下静置3h得自制除菌膜。
进一步的，步骤d所述共挤出过程中，外层纺丝液速率为0.2mL/min，内层纺丝液速率为0.8mL/min，芯液速率为0.3mL/min，喷头温度为75℃，冷凝温度为15℃，冷凝源为自来水；芯液为甲基吡咯烷酮和去离子水按体积比95:5混合。
进一步的，步骤(7)所述喷雾冷冻干燥的冷浸温度为-80℃，进料量为15mL/min。
对比例1
一种利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法，所述利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法主要包括以下制备步骤：
(1)将牛心脉管、牛心脉管质量4.2倍的纯化水置于胶体磨粉碎机中，粉碎4min，得浆液；
(2)将浆液置于玻璃容器，加入质量分数为5％的氢氧化钠至溶液pH为7.2，置于微波炉中，微波功率为630W，加热60s后，冷却至室温，得加热提取液；
(3)向加热提取液加入牛心脉管质量0.03倍的水解蛋白酶，酶解8h，得酶解提取液；
(4)将酶解提取液置于离心机中，4350rpm下离心13min后，置于50℃恒温水浴锅中，加入牛心脉管质量0.01倍的中性蛋白酶，酶解10min后，加入牛心脉管质量0.1倍的大孔树脂，吸附43min，过滤得上清液；
(5)将上清液置于红外发生器，红外能强度为4kW/m2，灭酶7min，加入质量分数为5％的盐酸至溶液pH为4.9；然后置于离心机中，6150rpm下离心14min，得弹性蛋白；
(6)将弹性蛋白通过自制除菌膜进行杀菌；
(7)将杀菌后的弹性蛋白进行喷雾冷冻干燥，完成利用牛心脉管提取弹性蛋白。
进一步的，步骤(1)所述胶体磨粉碎机中转子线速度为25m/s。
进一步的，步骤(5)所述红外发生器使用前预热20min，温度达到180℃。
进一步的，步骤(6)所述自制除菌膜的制备方法为：
a、将纤维素溶于纤维素质量43.2倍的去离子水，230W下超声溶解4min后，升温至90℃，加入纤维素质量1.36倍的十二烷基邻苯二甲酸酯，260rpm下搅拌25min后，在276W超声功率下反应53min，冷却至室温，300rpm、80℃下旋蒸4h得芳基化纤维素；
b、将芳基化纤维素加入三颈烧瓶中，边以50rpm的速度搅拌边加入芳基化纤维素质量7.84倍的质量分数为65％的盐酸、芳基化纤维素质量0.38倍的多聚甲醛，控制温度在20℃，以0.65mL/min的速度滴加芳基化纤维素质量0.45倍的三氯氧磷，330rpm下反应18h，抽滤，依次用去离子水、碳酸氢钠水溶液洗涤8次，碳酸氢钠水溶液中碳酸氢钠和去离子水的质量比为1:32，再用蒸馏水洗涤至溶液pH为6.5、60℃、0.02MPa下真空干燥2.5h，得氯化纤维素；
c、将氯化纤维素、氯化纤维素质量3.27倍的乙酸乙酯加入反应瓶，搅拌溶解，1℃冰水浴冷却下，加入氯化纤维素质量0.67倍的十二烷基二甲胺，室温下反应22h后，过滤，得改性纤维素；
d、将聚偏氟乙烯置于100℃、0.08MPa的真空烘箱中干燥23h，加入聚偏氟乙烯质量2.45倍的磷酸三乙酯，240rpm下搅拌4.2h，置入外层纺丝料液罐内，静置脱泡13h；将改性纤维素、二甲基甲酰胺、丙酮和甘油按质量比1:1.45:0.88:3加入内层纺丝料液罐内；260rpm下搅拌3.5h，静置脱泡9h，共挤出制得中空纤维膜；
e、150℃下，中空纤维膜在340W功率的超声辐照下处理7min后，室温下静置2.5h得自制除菌膜。
进一步的，步骤d所述共挤出过程中，外层纺丝液速率为0.2mL/min，内层纺丝液速率为0.8mL/min，芯液速率为0.3mL/min，喷头温度为75℃，冷凝温度为15℃，冷凝源为自来水；芯液为甲基吡咯烷酮和去离子水按体积比95:5混合。
进一步的，步骤(7)所述喷雾冷冻干燥的冷浸温度为-85℃，进料量为13mL/min。
对比例2
一种利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法，所述利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法主要包括以下制备步骤：
(1)将牛心脉管、牛心脉管质量4.2倍的纯化水置于胶体磨粉碎机中，粉碎4min，得浆液；
(2)将浆液置于玻璃容器，加入质量分数为5％的氢氧化钠至溶液pH为7.2，置于微波炉中，微波功率为630W，加热60s后，冷却至室温，得加热提取液；
(3)将加热提取液置于超声波清洗机，超声波功率为150W，加入牛心脉管质量0.03倍的水解蛋白酶，提取50min，得酶解提取液；
(4)将酶解提取液置于离心机中，4350rpm下离心13min后，置于红外发生器，红外能强度为4kW/m2，灭酶7min，加入质量分数为5％的盐酸至溶液pH为4.9，得弹性蛋白；
(5)将弹性蛋白静置4h，取上清液；将上清液用棉饼过滤机过滤，然后加入上清液质量0.0001倍的活性炭，加热升温至80℃，保温90min后，用板框过滤机过滤进行脱色；
(6)将脱色后的弹性蛋白通过自制除菌膜进行杀菌；
(7)将杀菌后的弹性蛋白进行喷雾冷冻干燥，完成利用牛心脉管提取弹性蛋白。
进一步的，步骤(1)所述胶体磨粉碎机中转子线速度为25m/s。
进一步的，步骤(4)所述红外发生器使用前预热20min，温度达到180℃。
进一步的，步骤(6)所述自制除菌膜的制备方法为：
a、将纤维素溶于纤维素质量43.2倍的去离子水，230W下超声溶解4min后，升温至90℃，加入纤维素质量1.36倍的十二烷基邻苯二甲酸酯，260rpm下搅拌25min后，在276W超声功率下反应53min，冷却至室温，300rpm、80℃下旋蒸4h得芳基化纤维素；
b、将芳基化纤维素加入三颈烧瓶中，边以50rpm的速度搅拌边加入芳基化纤维素质量7.84倍的质量分数为65％的盐酸、芳基化纤维素质量0.38倍的多聚甲醛，控制温度在20℃，以0.65mL/min的速度滴加芳基化纤维素质量0.45倍的三氯氧磷，330rpm下反应18h，抽滤，依次用去离子水、碳酸氢钠水溶液洗涤8次，碳酸氢钠水溶液中碳酸氢钠和去离子水的质量比为1:32，再用蒸馏水洗涤至溶液pH为6.5、60℃、0.02MPa下真空干燥2.5h，得氯化纤维素；
c、将氯化纤维素、氯化纤维素质量3.27倍的乙酸乙酯加入反应瓶，搅拌溶解，1℃冰水浴冷却下，加入氯化纤维素质量0.67倍的十二烷基二甲胺，室温下反应22h后，过滤，得改性纤维素；
d、将聚偏氟乙烯置于100℃、0.08MPa的真空烘箱中干燥23h，加入聚偏氟乙烯质量2.45倍的磷酸三乙酯，240rpm下搅拌4.2h，置入外层纺丝料液罐内，静置脱泡13h；将改性纤维素、二甲基甲酰胺、丙酮和甘油按质量比1:1.45:0.88:3加入内层纺丝料液罐内；260rpm下搅拌3.5h，静置脱泡9h，共挤出制得中空纤维膜；
e、150℃下，中空纤维膜在340W功率的超声辐照下处理7min后，室温下静置2.5h得自制除菌膜。
进一步的，步骤d所述共挤出过程中，外层纺丝液速率为0.2mL/min，内层纺丝液速率为0.8mL/min，芯液速率为0.3mL/min，喷头温度为75℃，冷凝温度为15℃，冷凝源为自来水；芯液为甲基吡咯烷酮和去离子水按体积比95:5混合。
进一步的，步骤(7)所述喷雾冷冻干燥的冷浸温度为-85℃，进料量为13mL/min。
对比例3
一种利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法，所述利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法主要包括以下制备步骤：
(1)将牛心脉管、牛心脉管质量4.2倍的纯化水置于胶体磨粉碎机中，粉碎4min，得浆液；
(2)将浆液置于玻璃容器，加入质量分数为5％的氢氧化钠至溶液pH为7.2，置于微波炉中，微波功率为630W，加热60s后，冷却至室温，得加热提取液；
(3)将加热提取液置于超声波清洗机，超声波功率为150W，加入牛心脉管质量0.03倍的水解蛋白酶，提取50min，得酶解提取液；
(4)将酶解提取液置于离心机中，4350rpm下离心13min后，置于50℃恒温水浴锅中，加入牛心脉管质量0.01倍的中性蛋白酶，酶解10min后，加入牛心脉管质量0.1倍的大孔树脂，吸附43min，过滤得上清液；
(5)将上清液加热升温至88℃，灭酶20min，加入质量分数为5％的盐酸至溶液pH为4.9；然后置于离心机中，6150rpm下离心14min，得弹性蛋白；
(6)将弹性蛋白通过自制除菌膜进行杀菌；
(7)将杀菌后的弹性蛋白进行喷雾冷冻干燥，完成利用牛心脉管提取弹性蛋白。
进一步的，步骤(1)所述胶体磨粉碎机中转子线速度为25m/s。
进一步的，步骤(6)所述自制除菌膜的制备方法为：
a、将纤维素溶于纤维素质量43.2倍的去离子水，230W下超声溶解4min后，升温至90℃，加入纤维素质量1.36倍的十二烷基邻苯二甲酸酯，260rpm下搅拌25min后，在276W超声功率下反应53min，冷却至室温，300rpm、80℃下旋蒸4h得芳基化纤维素；
b、将芳基化纤维素加入三颈烧瓶中，边以50rpm的速度搅拌边加入芳基化纤维素质量7.84倍的质量分数为65％的盐酸、芳基化纤维素质量0.38倍的多聚甲醛，控制温度在20℃，以0.65mL/min的速度滴加芳基化纤维素质量0.45倍的三氯氧磷，330rpm下反应18h，抽滤，依次用去离子水、碳酸氢钠水溶液洗涤8次，碳酸氢钠水溶液中碳酸氢钠和去离子水的质量比为1:32，再用蒸馏水洗涤至溶液pH为6.5、60℃、0.02MPa下真空干燥2.5h，得氯化纤维素；
c、将氯化纤维素、氯化纤维素质量3.27倍的乙酸乙酯加入反应瓶，搅拌溶解，1℃冰水浴冷却下，加入氯化纤维素质量0.67倍的十二烷基二甲胺，室温下反应22h后，过滤，得改性纤维素；
d、将聚偏氟乙烯置于100℃、0.08MPa的真空烘箱中干燥23h，加入聚偏氟乙烯质量2.45倍的磷酸三乙酯，240rpm下搅拌4.2h，置入外层纺丝料液罐内，静置脱泡13h；将改性纤维素、二甲基甲酰胺、丙酮和甘油按质量比1:1.45:0.88:3加入内层纺丝料液罐内；260rpm下搅拌3.5h，静置脱泡9h，共挤出制得中空纤维膜；
e、150℃下，中空纤维膜在340W功率的超声辐照下处理7min后，室温下静置2.5h得自制除菌膜。
进一步的，步骤d所述共挤出过程中，外层纺丝液速率为0.2mL/min，内层纺丝液速率为0.8mL/min，芯液速率为0.3mL/min，喷头温度为75℃，冷凝温度为15℃，冷凝源为自来水；芯液为甲基吡咯烷酮和去离子水按体积比95:5混合。
进一步的，步骤(7)所述喷雾冷冻干燥的冷浸温度为-85℃，进料量为13mL/min。
对比例4
一种利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法，所述利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法主要包括以下制备步骤：
(1)将牛心脉管、牛心脉管质量4.2倍的纯化水置于胶体磨粉碎机中，粉碎4min，得浆液；
(2)将浆液置于玻璃容器，加入质量分数为5％的氢氧化钠至溶液pH为7.2，置于微波炉中，微波功率为630W，加热60s后，冷却至室温，得加热提取液；
(3)将加热提取液置于超声波清洗机，超声波功率为150W，加入牛心脉管质量0.03倍的水解蛋白酶，提取50min，得酶解提取液；
(4)将酶解提取液置于离心机中，4350rpm下离心13min后，置于50℃恒温水浴锅中，加入牛心脉管质量0.01倍的中性蛋白酶，酶解10min后，加入牛心脉管质量0.1倍的大孔树脂，吸附43min，过滤得上清液；
(5)将上清液置于红外发生器，红外能强度为4kW/m2，灭酶7min，加入质量分数为5％的盐酸至溶液pH为4.9；然后置于离心机中，6150rpm下离心14min，得弹性蛋白；
(6)将弹性蛋白过聚偏氟乙烯膜进行杀菌；
(7)将杀菌后的弹性蛋白进行喷雾冷冻干燥，完成利用牛心脉管提取弹性蛋白。
进一步的，步骤(1)所述胶体磨粉碎机中转子线速度为25m/s。
进一步的，步骤(5)所述红外发生器使用前预热20min，温度达到180℃。
进一步的，步骤(7)所述喷雾冷冻干燥的冷浸温度为-85℃，进料量为13mL/min。
对比例5
一种利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法，所述利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法主要包括以下制备步骤：
(1)将牛心脉管、牛心脉管质量4.2倍的纯化水置于胶体磨粉碎机中，粉碎4min，得浆液；
(2)将浆液置于玻璃容器，加入牛心脉管质量0.03倍的水解蛋白酶，酶解8h，得酶解提取液，加热升温至88℃，灭酶20min，加入质量分数为5％的盐酸至溶液pH为4.9，得弹性蛋白；
(3)将弹性蛋白静置4h，取上清液；将上清液用棉饼过滤机过滤，然后加入上清液质量0.0001倍的活性炭，加热升温至80℃，保温90min后，用板框过滤机过滤，得脱色蛋白；
(4)将脱色蛋白通过聚偏氟乙烯膜进行杀菌；
(5)将杀菌后的弹性蛋白进行喷雾冷冻干燥，完成利用牛心脉管提取弹性蛋白。
进一步的，步骤(1)所述胶体磨粉碎机中转子线速度为25m/s。
进一步的，步骤(5)所述喷雾冷冻干燥的冷浸温度为-85℃，进料量为13mL/min。
效果例
下表1给出了采用本发明实施例1至2与对比例1至6的利用牛心脉管提取弹性蛋白的性能分析结果。
表1
| 实施例1 | 实施例2 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 | 对比例5 | |
| 提取率(％) | 89.1 | 89.0 | 77.3 | 70.6 | 76.1 | 75.0 | 70.1 |
| 纯度(％) | 96.1 | 96.0 | 89.9 | 81.7 | 83.1 | 81.2 | 80.9 |
| 菌落总数(g) | 5.1 | 5.0 | 7.3 | 7.5 | 7.2 | 90.6 | 92.2 |
| 大肠菌群(g) | 0.7 | 0.6 | 1.9 | 2.1 | 2.1 | 12.6 | 13.7 |
| 霉菌(g) | 1.2 | 1.1 | 3.3 | 3.9 | 4.4 | 31.9 | 33.0 |
从实施例1、2与对比例5的实验数据比较可发现，在提取过程中利用超声波辅助酶提取，用时短，提取率高；再利用中性蛋白酶结合大孔树脂脱色，高效快速，减少弹性蛋白质损失；利用自制除菌膜，通过物理和化学共同作用，减少弹性蛋白质中的细菌含量；从实施例1、2与对比例1的实验数据比较可发现，在提取过程中若不用超声波加以辅助，无法利用超声波的空化效应和机械效应，无法使细胞壁破碎，弹性蛋白溶出速率降低，无法与水解蛋白酶充分接触，使弹性蛋白提取不充分，且提取工艺耗时过长；从实施例1、2与对比例2的实验数据比较可发现，在提取过程中若使用棉饼和活性炭除色，活性炭易破坏弹性蛋白结构，导致弹性蛋白损失，同时在吸附脱色过程中，棉饼中的棉絮和活性炭易留在弹性蛋白中，降低弹性蛋白的纯度；从实施例1、2与对比例3的实验数据比较可发现，若提取过程中不使用红外灭酶，采用高温灭酶，不仅耗时长，同时高温易导致弹性蛋白变形，降低弹性蛋白的纯度；从实施例1、2与对比例4的实验数据比较可发现，在提取过程中不使用自制除菌膜，无法通过抗菌基团对弹性蛋白质进行高效杀菌，单单依靠物理过滤作用，只能除去部分细菌，其微生物含量达不到标准，并且不使用自制除菌膜，无法利用其高疏水性，浓缩弹性蛋白质，影响其浓度。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (6)
1.一种利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法，其特征在于，主要包括以下制备步骤：
(1)将牛心脉管、牛心脉管质量3～5倍的纯化水置于胶体磨粉碎机中，粉碎3～5min，得浆液；
(2)将浆液置于玻璃容器，加入质量分数为5％的氢氧化钠至溶液pH为7.0～7.5，置于微波炉中，微波功率为600～700W，加热50～70s后，冷却至室温，得加热提取液；
(3)将加热提取液置于超声波清洗机，超声波功率为140～160W，加入牛心脉管质量0.03倍的水解蛋白酶，提取40～60min，得酶解提取液；
(4)将酶解提取液置于离心机中，4000～4500rpm下离心10～15min后，置于50℃恒温水浴锅中，加入牛心脉管质量0.01倍的中性蛋白酶，酶解9～11min后，加入牛心脉管质量0.1倍的大孔树脂，吸附40～50min，过滤得上清液；
(5)将上清液置于红外发生器，红外能强度为3～5kW/m2，灭酶6～8min，加入质量分数为5％的盐酸至溶液pH为4.8～5.0；然后置于离心机中，6000～6200rpm下离心13～15min，得弹性蛋白；
(6)将弹性蛋白通过自制除菌膜进行杀菌；
(7)将杀菌后的弹性蛋白进行喷雾冷冻干燥，完成利用牛心脉管提取弹性蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)所述胶体磨粉碎机中转子线速度为20～30m/s。
3.根据权利要求2所述的一种利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法，其特征在于，步骤(5)所述红外发生器使用前预热20min，温度达到180℃。
4.根据权利要求3所述的一种利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法，其特征在于，步骤(6)所述自制除菌膜的制备方法为：
a、将纤维素溶于纤维素质量40～45倍的去离子水，200～250W下超声溶解3～5min后，升温至80～100℃，加入纤维素质量1.2～1.5倍的十二烷基邻苯二甲酸酯，200～300rpm下搅拌20～30min后，在200～300W超声功率下反应50～60min，冷却至室温，300rpm、80℃下旋蒸3～5h得芳基化纤维素；
b、将芳基化纤维素加入三颈烧瓶中，边以50rpm的速度搅拌边加入芳基化纤维素质量7.5～8倍的质量分数为65％的盐酸、芳基化纤维素质量0.35～0.4倍的多聚甲醛，控制温度在15～25℃，以0.5～0.7mL/min的速度滴加芳基化纤维素质量0.4～0.5倍的三氯氧磷，300～400rpm下反应16～20h，抽滤，依次用去离子水、碳酸氢钠水溶液洗涤7～10次，碳酸氢钠水溶液中碳酸氢钠和去离子水的质量比为1:32，再用蒸馏水洗涤至溶液pH为6～7、60℃、0.02MPa下真空干燥2～3h，得氯化纤维素；
c、将氯化纤维素、氯化纤维素质量3～3.5倍的乙酸乙酯加入反应瓶，搅拌溶解，0～2℃冰水浴冷却下，加入氯化纤维素质量0.6～0.7倍的十二烷基二甲胺，室温下反应20～24h后，过滤，得改性纤维素；
d、将聚偏氟乙烯置于100℃、0.08MPa的真空烘箱中干燥20～24h，加入聚偏氟乙烯质量2～3倍的磷酸三乙酯，200～300rpm下搅拌4～5h，置入外层纺丝料液罐内，静置脱泡12～14h；将改性纤维素、二甲基甲酰胺、丙酮和甘油按质量比1:1.45:0.88:3加入内层纺丝料液罐内；200～300rpm下搅拌2～4h，静置脱泡8～10h，共挤出制得中空纤维膜；
e、145～155℃下，中空纤维膜在300～400W功率的超声辐照下处理5～10min后，室温下静置2～3h得自制除菌膜。
5.根据权利要求4所述的一种利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法，其特征在于，步骤d所述共挤出过程中，外层纺丝液速率为0.2mL/min，内层纺丝液速率为0.8mL/min，芯液速率为0.3mL/min；喷头温度为75℃，冷凝温度为15℃，冷凝源为自来水；芯液为甲基吡咯烷酮和去离子水按体积比95:5混合。
6.根据权利要求5所述的一种利用牛心脉管提取弹性蛋白的方法，其特征在于，步骤(7)所述喷雾冷冻干燥的冷浸温度为-90～-80℃，进料量为10～15mL/min。
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