CN114317593A - 一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单分子超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法，包括步骤一，转基因材料的获得；步骤二，原生质体的提取；步骤三，结构光照明显微镜成像观察；步骤四，参数信息的计算；其中在上述步骤一中，首先通过PCR技术扩增目的基因条带，然后通过双酶切的方法与真核表达载体35S::pCAMBIA2300‑GFP进行连接，通过筛选获得转基因拟南芥植株；使用结构光照明显微镜进行成像，结构光照明显微镜具有时间分辨率高、光毒性和光漂白性小等众多优点，能够在活体状态下，实时观察细胞膜蛋白的动态变化等特征；通过结构光照明显微镜的观察，可以真实地反映植物细胞膜蛋白分子的运动状态，并可以获得膜蛋白运动参数等信息。
Description
技术领域
本发明涉及一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法，属于植物学技术领域。
背景技术
植物原生质体是指植物细胞通过酶解法、机械法等手段去除细胞壁，形成由单层细胞膜包裹的细胞质。去除了细胞壁的植物原生质体，不仅保持着细胞全能性，而且容易接受外源遗传物质，使外源DNA在原生质体中快速表达。因此，原生质体被广泛用于遗传转化、细胞融合及细胞无性系和突变体的选育。细胞膜作为原生质体的一部分，承担着重要的生物学功能，而其上的质膜蛋白是生物膜功能的主要承担者，因此质膜蛋白的时空动态必然与很多基础细胞学过程密切相关。现有技术中缺少一种实时观测原生质体膜蛋白分布的方法，尤其缺少一种高分辨率并且能够快速对原生质体膜蛋白分布进行动态观测的方法。
结构光照明显微技术(Structured Illumination Microscopy,SIM)，通过结构化照明在频率域以空间混频的方式将物体高频信息载入光学***的探测通带内实现突破衍射极限的超分辨光学显微成像。SIM凭借其较低的激发光强、对荧光染料的非特异性需求以及快速的宽场成像优势已成为活细胞超分辨光学显微成像方面应用最多的技术。原生质体没有细胞壁保护十分脆弱，极易破碎，因此要在短时间内对其进行观察，结构光照明显微镜因为具有时间分辨率高、光毒性和光漂白性小，并可以在短时间内大量采集图像等优点，对在活体状态下实时观察原生质体膜蛋白的动态变化等特征很有优势，所以采用结构光照明显微技术来观察植物原生质体膜蛋白动态。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法，其提供利用结构光照明显微技术实时观察原生质体膜蛋白的方法，以解决上述背景技术中提出的问题
1、本发明提供一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法，步骤一：转基因材料的获得；步骤二：原生质体的提取；步骤三：结构光照明显微镜成像观察；步骤四：参数信息的计算；其特征在于：
基因材料获得包括以下步骤：
(1)利用PCR技术将目的基因从拟南芥基因组中扩增出来，然后通过双酶切-T4连接酶的方法，将目的基因片段与真核表达载体35S::pCAMBIA2300-GFP进行连接，获得带有绿色荧光融合蛋白的真核表达载体；
(2)再通过农杆菌转化的方法侵染到拟南芥野生型植株中，通过含有相应抗生素的1/2×MS固体平板筛选出T1代转基因植株；
原生质体的提取包括以下步骤：
(1)组织培养：将所述转基因拟南芥种子消毒，并播种于1/2MS固体培养基上，4℃春化24h后，置于培养温度为22℃，光照：黑暗为16：8的培养箱中进行培养；
(2)试剂选择：采用北京酷来博科技有限公司的拟南芥原生质体制备及转化试剂盒进行拟南芥原生质体制备；
(3)选取在培养皿中生长15天左右的拟南芥幼苗，去除根部，留取叶片，用刀片将叶片切碎并放入酶解液(10mL)，使其在摇床(26.6℃，55rpm)上室温避光酶解3h左右至叶片完全消化；待酶解完成后加入与酶解液等体积的溶液II-W5 solution稀释原生质体，然后用ddH2O冲洗尼龙筛网，并用其过滤原生质体于一个50mL离心管中以去除没有溶解完全的叶片残渣；采用长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司生产的H2100R离心机对样品进行离心(水平转头，18℃，100Xg离心2min，升降速7)，完成后弃上清；用5mL预冷的溶液II-W5 solution温柔重悬位于底部的原生质体，用剪尖的蓝枪头轻轻将原生质体悬起，100Xg离心1min，升降速7，弃去上清；加入5mL预冷的溶液II-W5 solution重悬，冰上30min沉降原生质体；100Xg离心1min，升降速7，加入溶液II-W5 solution；
结构光照明显微镜成像观察包括以下步骤：
(1)制备样本：取所得原生质体并进行重悬，取1微升滴在载玻片上，并轻轻盖上玻片，动作尽量轻柔，避免破坏原生质体；
(2)观察：采用DeltaVisionTM OMX SR超分辨率显微镜进行成像，观察时，滴加镜油，设置参数，其中激发波长设置为488nm，收集波长设置为500～560nm；曝光时间为40ms，激光强度选择25％，Readout为Fast 272MHz，对原生质体质膜蛋白进行成像，连续采集20帧图像并保留观察结果和备份；
(3)图像导出：将拍摄获得图像进行Deconvolution处理，即对图像点进行叠加；接着进行OMX SI Reconstruction处理，即对图像去卷积，获得较为清晰图像；
参数信息的计算包括以下步骤：采用Image J软件对所获得的时间序列图像的感兴趣部分进行截取、Subtract Background处理以及对亮度和对比度进行调整，通过ImarisX64 9.0.1对目的蛋白进行单颗粒追踪分析，并获取蛋白动态的不同参数数据信息；通过Origin 8对目的蛋白的运动速率，荧光强度等参数进行拟合，从而确定目的蛋白的动态速率变化。
(1)在Image J软件中打开TIF格式的时间序列图像，选择并截取感兴趣的区域，选择“框型”图标->框出感兴趣部分图像->Image->Crop；去背景，选择process->SubtractBackground-设置“Rolling Ball Radius”设置为50Pixels；运行Image->Adjust->Brightness/Contrast，调整图像的亮度和对比度；Apply，保存；
(2)在Imaris X64 9.0.1软件中，将截取并处理后待分析TIFF格式的图片直接拖入Imaris软件；调整Z和T，选择Image processing->swap Time and Z；选择Edit-Imageproperties->voxel size修改为0.16μm->all equidistant；加斑点，选择Add new spots，选中Track Spots实现单分子追踪->点击右下角前进按钮；选中Track Spots实现单分子追踪->点击右下角前进按钮；选中需要追踪的通道，Estimated XY diameters为0.2μm；右下角点击前进->all visible Channels->前进；选择追踪方式为Autoregressive motion，最大距离：0.64μm，完成追踪；导出Excel数据表，选中Spots->statistics->detailed->Allvalues中选择需要的参数,例如Track Intensity Mean和Track Speed Mean->底部“堆叠的文件夹样式”的按钮可以导出；
(3)将导出的数据在OriginPro8软件中进行分析，右击之后选择Frequencycount，Track Intensity Mean间隔设置为65，Track Speed Mean间隔设置为0.22,然后选择FreqsY列的数据对其进行分析，得到柱形图。
步骤一中获得转基因材料为在植物细胞膜上大量表达，并具有重要功能的绿色荧光融合蛋白GFP。
所述步骤二中将拟南芥种子放入培养箱中，长出4片子叶后使用。
选用酶解液去除植物细胞细胞壁以获得原生质体，所述原生质体极易破碎，在提取过程中动作要十分轻柔，以免其破碎，影响提取效果，重悬时要选用已剪尖的蓝枪头，减少吸取液体时的冲力，避免原生质体破碎。
步骤三中观察时，要滴加镜油，设置参数，GFP标记的蛋白激发波长设置为488nm，收集波长设置为500～560nm；曝光时间为40ms，激光强度选择25％，Readout为Fast272MHz，对原生质体质膜蛋白进行成像。
所述步骤四中采用Image J软件对所获得的时间序列图像的感兴趣部分进行截取、Subtract Background处理以及对亮度和对比度进行调整，通过Imaris X64 9.0.1对目的蛋白进行单颗粒追踪分析，并获取蛋白动态的不同参数数据信息；通过Origin 8对目的蛋白的运动速率，荧光强度等参数进行拟合，从而确定目的蛋白的动态速率变化。
本发明的有益效果：
1、通过本发明中的实验装置及参数设定可以较光学显微镜及透射电子显微镜在一定程度上提高对原生质体膜蛋白超微结构成像的信噪比，因此可以对原生质体膜蛋白质进行快速、高分辨率的成像观察；
2、采用本发明中的仪器进行观察对细胞损伤小，能够在活体状态下、实时观察原生质体膜蛋白的动态及运动特征；
3、本发明中采用的成像仪器成像速度快，能够真实地反映原生质体膜蛋白分子的运动状态，并能对膜蛋白的运动参数进行分析；
4、可重复性高。
附图说明
图1为本发明一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法的整体流程示意图。
图2为本发明一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法的提取原生质体镜检效果图像。
图3为本发明一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法通过结构光照明显微镜在Light Path为Conventional时观察原生质体的图像。
图4为本发明一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法在LightPath为TIRF-SIM时观察得到的原生质体膜蛋白的图像。
图5为本发明一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态方法的目的蛋白在质膜上的平均荧光强度和运动速率的高斯拟合柱状图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
如图1至图5所示：本发明提供一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法，其包括步骤一，转基因材料的获得；步骤二，原生质体的提取；步骤三，结构光照明显微镜成像观察；步骤四，参数信息的计算；
其中在上述步骤一中，转基因材料获得包括以下步骤：
(1)重组载体的构建：首先通过PCR技术从拟南芥基因组中扩增出目的基因条带，然后通过双酶切、T4连接酶连接到真核表达载体35S::pCAMBIA2300-GFP中，并将连接产物转化大肠杆菌，得到的阳性克隆经测序验证正确，即为带有绿色荧光融合蛋白的真核表达载体；
(2)最后通过农杆菌转化的方法侵染到拟南芥植株，并通过抗性筛选得到转基因植株，获得转基因材料为在细胞膜上大量表达，并具有重要功能的绿色荧光蛋白GFP；
其中在上述步骤二中，原生质体的提取包括以下步骤：
(1)组织培养：在超净台中，将绿色荧光蛋白标记膜蛋白的转基因拟南芥的种子置于滤纸上，将消毒液(85％乙醇：H2O2＝3：1)洒到拟南芥种子上进行消毒，晾干后，将其播种于由0.1％蔗糖、pH为5.8-6.0的1/2MS固体培养基上。将培养皿放于4℃冰箱春化复苏24h后置于培养温度为22℃，光照条件为16小时光照/8小时暗培养循环的智能光照培养箱中进行培养；
(2)试剂选择：采用北京酷来博科技有限公司的拟南芥原生质体制备及转化试剂盒进行拟南芥原生质体制备。
(3)实验操作过程：选取在培养皿中生长15天左右的拟南芥幼苗，去除根部，留取叶片，用刀片将叶片切碎并放入酶解液(10mL)，使其在摇床(26.6℃，55rpm)上室温避光酶解3h左右至叶片完全消化；待酶解完成后加入与酶解液等体积的溶液II-W5 solution稀释原生质体，然后用ddH2O冲洗尼龙筛网，并用其过滤原生质体于一个50mL离心管中以去除没有溶解完全的叶片残渣；采用长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司生产的H2100R离心机对样品进行离心(水平转头，18℃，100Xg离心2min，升降速7)，完成后弃上清；用5mL预冷的溶液II-W5 solution温柔重悬位于底部的原生质体，用剪尖的蓝枪头轻轻将原生质体悬起，100Xg离心1min，升降速7，弃去上清；加入5mL预冷的溶液II-W5 solution重悬，冰上30min沉降原生质体；100Xg离心1min，升降速7，加入溶液II-W5 solution；
其中在上述步骤三中，结构光照明显微镜观察包括以下步骤：
(1)制备样本：取所得原生质体并进行重悬，取1微升滴在载玻片上，并轻轻盖上玻片，动作尽量轻柔，避免破坏原生质体；
(2)观察：采用DeltaVisionTM OMX SR超分辨率显微镜进行成像。观察时，滴加镜油，设置参数，其中激发波长设置为488nm，收集波长设置为500～560nm；曝光时间为40ms，激光强度选择25％，Readout为Fast 272MHz，对原生质体质膜蛋白进行成像。连续采集20帧图像并保留观察结果和备份；
(3)图像导出：将拍摄获得图像进行Deconvolution处理，即对图像点进行叠加；接着进行OMX SI Reconstruction处理，即对图像去卷积，获得较为清晰图像；
其中在上述步骤四中，采用Image J软件对所获得的时间序列图像的感兴趣部分进行截取、Subtract Background处理以及对亮度和对比度进行调整，通过Imaris X649.0.1对目的蛋白进行单颗粒追踪分析，并获取蛋白动态的不同参数数据信息；通过Origin8对目的蛋白的运动速率，荧光强度等参数进行拟合，从而确定目的蛋白的动态速率变化，具体包括以下步骤：
在Image J软件中打开TIF格式的时间序列图像，选择并截取感兴趣的区域，选择“框型”图标->框出感兴趣部分图像->Image->Crop；去背景，选择process->SubtractBackground-设置“Rolling Ball Radius”设置为50Pixels；运行Image->Adjust->Brightness/Contrast，调整图像的亮度和对比度；Apply，保存；
在Imaris X64 9.0.1软件中，将截取并处理后待分析TIFF格式的图片直接拖入Imaris软件；调整Z和T，选择Image processing->swap Time and Z；选择Edit-Imageproperties->voxel size修改为0.16μm->all equidistant；加斑点，选择Add new spots，选中Track Spots实现单分子追踪->点击右下角前进按钮；选中Track Spots实现单分子追踪->点击右下角前进按钮；选中需要追踪的通道，Estimated XY diameters为0.2μm；右下角点击前进->all visible Channels->前进；选择追踪方式为Autoregressive motion，最大距离：0.64μm，完成追踪；导出Excel数据表，选中Spots->statistics->detailed->Allvalues中选择需要的参数,例如Track Intensity Mean和Track Speed Mean->底部“堆叠的文件夹样式”的按钮可以导出；
将导出的数据在OriginPro8软件中进行分析，右击之后选择Frequency count，Track Intensity Mean间隔设置为65，Track Speed Mean间隔设置为0.22,然后选择FreqsY列的数据对其进行分析，得到柱形图。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法，其特征在于：步骤一：转基因材料的获得；步骤二：原生质体的提取；步骤三：结构光照明显微镜成像观察；步骤四：参数信息的计算；其特征在于：
基因材料获得包括以下步骤：
(1)利用PCR技术将目的基因从拟南芥基因组中扩增出来，然后通过双酶切-T4连接酶的方法，将目的基因片段与真核表达载体35S::pCAMBIA2300-GFP进行连接，获得带有绿色荧光融合蛋白的真核表达载体；
(2)再通过农杆菌转化的方法侵染到拟南芥野生型植株中，通过含有相应抗生素的1/2×MS固体平板筛选出T1代转基因植株；
原生质体的提取包括以下步骤：
(1)组织培养：将所述转基因拟南芥种子消毒，并播种于1/2MS固体培养基上，4℃春化24h后，置于培养温度为22℃，光照：黑暗为16：8的培养箱中进行培养；
(2)试剂选择：采用北京酷来博科技有限公司的拟南芥原生质体制备及转化试剂盒进行拟南芥原生质体制备；
(3)选取在培养皿中生长15天左右的拟南芥幼苗，去除根部，留取叶片，用刀片将叶片切碎并放入酶解液(10mL)，使其在摇床(26.6℃，55rpm)上室温避光酶解3h左右至叶片完全消化；待酶解完成后加入与酶解液等体积的溶液II-W5 solution稀释原生质体，然后用ddH2O冲洗尼龙筛网，并用其过滤原生质体于一个50mL离心管中以去除没有溶解完全的叶片残渣；采用长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司生产的H2100R离心机对样品进行离心(水平转头，18℃，100Xg离心2min，升降速7)，完成后弃上清；用5mL预冷的溶液II-W5 solution温柔重悬位于底部的原生质体，用剪尖的蓝枪头轻轻将原生质体悬起，100Xg离心1min，升降速7，弃去上清；加入5mL预冷的溶液II-W5 solution重悬，冰上30min沉降原生质体；100Xg离心1min，升降速7，加入溶液II-W5 solution；
结构光照明显微镜成像观察包括以下步骤：
(1)制备样本：取所得原生质体并进行重悬，取1微升滴在载玻片上，并轻轻盖上玻片，动作尽量轻柔，避免破坏原生质体；
(2)观察：采用DeltaVisionTM OMX SR超分辨率显微镜进行成像，观察时，滴加镜油，设置参数，其中激发波长设置为488nm，收集波长设置为500～560nm；曝光时间为40ms，激光强度选择25％，Readout为Fast 272MHz，对原生质体质膜蛋白进行成像，连续采集20帧图像并保留观察结果和备份；
(3)图像导出：将拍摄获得图像进行Deconvolution处理，即对图像点进行叠加；接着进行OMX SI Reconstruction处理，即对图像去卷积，获得较为清晰图像；
参数信息的计算包括以下步骤：采用Image J软件对所获得的时间序列图像的感兴趣部分进行截取、Subtract Background处理以及对亮度和对比度进行调整，通过Imaris X649.0.1对目的蛋白进行单颗粒追踪分析，并获取蛋白动态的不同参数数据信息；通过Origin8对目的蛋白的运动速率，荧光强度等参数进行拟合，从而确定目的蛋白的动态速率变化。
2.根据权利要求1所述的一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法，其特征在于：参数信息的计算具体包括以下步骤
(1)在Image J软件中打开TIF格式的时间序列图像，选择并截取感兴趣的区域，选择“框型”图标->框出感兴趣部分图像->Image->Crop；去背景，选择process->SubtractBackground-设置“Rolling Ball Radius”设置为50Pixels；运行Image->Adjust->Brightness/Contrast，调整图像的亮度和对比度；Apply，保存；
(2)在Imaris X64 9.0.1软件中，将截取并处理后待分析TIFF格式的图片直接拖入Imaris软件；调整Z和T，选择Image processing->swap Time and Z；选择Edit-Imageproperties->voxel size修改为0.16μm->all equidistant；加斑点，选择Add new spots，选中Track Spots实现单分子追踪->点击右下角前进按钮；选中Track Spots实现单分子追踪->点击右下角前进按钮；选中需要追踪的通道，Estimated XY diameters为0.2μm；右下角点击前进->all visible Channels->前进；选择追踪方式为Autoregressive motion，最大距离：0.64μm，完成追踪；导出Excel数据表，选中Spots->statistics->detailed->Allvalues中选择需要的参数,例如Track Intensity Mean和Track Speed Mean->底部“堆叠的文件夹样式”的按钮可以导出；
(3)将导出的数据在OriginPro8软件中进行分析，右击之后选择Frequency count，Track Intensity Mean间隔设置为65，Track Speed Mean间隔设置为0.22,然后选择FreqsY列的数据对其进行分析，得到柱形图。
3.根据权利要求1所述的一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法，其特征在于：步骤一中获得转基因材料为在植物细胞膜上大量表达，并具有重要功能的绿色荧光融合蛋白GFP。
4.根据权利要求1所述的一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法，其特征在于：所述步骤二中将拟南芥种子放入培养箱中，长出4片子叶后使用。
5.根据权利要求1所述的一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法，其特征在于：选用酶解液去除植物细胞细胞壁以获得原生质体，所述原生质体极易破碎，在提取过程中动作要十分轻柔，以免其破碎，影响提取效果，重悬时要选用已剪尖的蓝枪头，减少吸取液体时的冲力，避免原生质体破碎。
6.根据权利要求1所述的一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法，其特征在于：步骤三中观察时，要滴加镜油，设置参数，GFP标记的蛋白激发波长设置为488nm，收集波长设置为500～560nm；曝光时间为40ms，激光强度选择25％，Readout为Fast272MHz，对原生质体质膜蛋白进行成像。
7.根据权利要求1所述的一种超分辨显微技术观察植物原生质体膜蛋白动态的方法，其特征在于：所述步骤四中采用Image J软件对所获得的时间序列图像的感兴趣部分进行截取、Subtract Background处理以及对亮度和对比度进行调整，通过Imaris X64 9.0.1对目的蛋白进行单颗粒追踪分析，并获取蛋白动态的不同参数数据信息；通过Origin 8对目的蛋白的运动速率，荧光强度等参数进行拟合，从而确定目的蛋白的动态速率变化。
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