CN114317561B - 基于CRISPR/Cas9的青花菜基因定点编辑方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9的青花菜基因定点编辑方法，涉及基因工程技术领域。本发明提供的方法，通过利用CRISPR/Cas9技术对青花菜BoMYB101基因进行定点敲除编辑，根据青花菜BoMYB101基因序列设计2个sgRNA靶位点、构建BoMYB101基因的敲除表达载体、农杆菌介导转化青花菜下胚轴及分子检测筛选突变植株，进而获得高效的青花菜基因编辑植株，为青花菜植株的抗病、耐寒、繁育等性状改良和基因功能研究提供了应用支持。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种基于CRISPR/Cas9的青花菜基因定点编辑方法。
背景技术
青花菜（Brassica oleracea L. var. italica）又名西兰花，原产地中海地区。青花菜是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种，因其营养丰富被誉为“蔬菜皇冠”。还富含硫代糖苷，具有抗癌功效，特别是该成分的代谢成份芥兰素（indole-3-carbinol）的抗癌机理已从分子水平被科学论证。青花菜还富含线型硫代糖苷莱菔硫烷能够有效的降低低脂肪密度胆固醇，从而达到降低心脏病的发病率，因此青花菜备受国内外消费者喜爱。青花菜是我国重要的大宗蔬菜种类之一，在全国各地均有种植，主要集中在云南、河北、浙江、湖北、江苏、广东等地，种植面积已超过 8.7 万公顷（130 万亩）。青花菜也是一种重要的出口创汇蔬菜，年出口量超 12 万吨。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9的青花菜基因定点编辑方法，用于解决现有技术存在的青花菜植株抗病、耐寒、繁育等综合性状较差的技术问题，从而达到提高青花菜品种综合性状的技术效果。本发明的技术方案如下：
根据本发明实施例的一个方面，提供一种基于CRISPR/Cas9的青花菜基因定点编辑方法，其特征在于，所述方法包括：
根据青花菜自交系2M基因组测序分析获得BoMYB101基因序列，在所述BoMYB101基因序列的第一外显子选取5’-GCCAAATCTAAGGACAGGAT-3’序列作为靶位点sgT1，在所述BoMYB101基因序列的第二外显子选取5’-GATTCACCTGCGGGGAACAG-3’序列作为靶位点sgT2，分别合成各个靶位点对应互补引物对，其中，所述靶位点sgT1对应互补引物对包括：
sgT1-F：5’-TGCAGCCAAATCTAAGGACAGGAT-3’、sgT1-R：5’-AAACATCCTGTCCTTAGATTTGGC-3’；
所述靶位点sgT2对应互补引物对包括：
sgT2-F：5’-TGCAGATTCACCTGCGGGGAACAG-3’、sgT2-R：5’-AAACCTGTTCCCCGCAGGTGAATC-3’；
对于每个互补引物对，按照引物F与引物R、ddH2O为1:1:8体积比配制所述互补引物对的反应体系，并利用PCR扩增仪对所述互补引物对的反应体系进行95℃变性5min，然后以0.2℃/s的降温速率降温至25℃，反应产物用ddH2O稀释250倍，得到各个靶位点DNA片段，所述引物F与所述引物R的浓度均为100μMol/L；
将各个靶位点DNA片段分别连接至sgRNA表达框中，构建得到含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒；
按照引物FW与引物RV、ddH2O为1:1:8体积比配制linker引物对的反应体系，并利用PCR扩增仪对所述linker引物对的反应体系进行95℃变性5min，然后以0.2℃/s的降温速率降温至25℃，反应产物用ddH2O稀释250倍，得到linker DNA片段，所述引物FW与所述引物RV的浓度均为100μMol/L，所述linker引物对包括：
FW：5’-CGTACCTGCAGGAAAGCGGCCGCGTCAGGCGCGCCTAACT-3’、RV：5’-CTAGAGTTAGGCGCGCCTGACGCGGCCGCTTTCCTGCAGGTACGAGCT-3’；
将所述linker DNA片段连接至表达载体pCAMBIA2301质粒的SacⅠ和XbaⅠ酶切位点之间，构建得到含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒；
利用限制性内切酶NotⅠ和AscⅠ，将Cas9表达框连接至将所述含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒的NotⅠ和AscⅠ酶切位点之间，得到含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒；
利用限制性内切酶NotⅠ和SbfⅠ，将所述含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒连接至所述含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒的NotⅠ和SbfⅠ酶切位点之间，得到BoMYB101基因编辑的表达载体质粒；
利用冻融法将所述BoMYB101基因编辑的表达载体质粒转化至EHA105农杆菌感受态细胞中，得到含有表达载体质粒的EHA105农杆菌菌株；
将所述含有表达载体质粒的EHA105农杆菌菌株对青花菜下胚轴外植体进行侵染，经过抗性筛选培养获得表达载体导入青花菜细胞的转基因植株。
优选的，所述将各个靶位点序列片段分别连接至sgRNA表达框中，构建得到含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒的步骤，包括：
按10×NEB Buffer 2.1与sgRNA表达框质粒、内切酶BsaⅠ、ddH2O为3:4:1:22的体积比配制sgT1靶位点对应的sgRNA表达框酶切反应体系，将所述sgRNA表达框质粒用typeII内切酶位点的内切酶BsaⅠ酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收得到BsaⅠ酶切后线性化的sgRNA表达框质粒；
按照BsaⅠ酶切后线性化的sgRNA表达框质粒与sgT1靶位点DNA片段、T4 DNAligase Buffer、T4 DNA ligase为15:2:2:1的体积比配制sgT1靶位点组装连接反应体系，将sgT1靶位点DNA片段和BsaⅠ酶切后线性化的sgRNA表达框质粒在T4 DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase的作用下4℃连接过夜，再将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养过夜，筛选阳性克隆，提取得到含有sgT1靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒；
按10×NEB Buffer 2.1与含有sgT1靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒、内切酶BbsⅠ、ddH2O为3:4:1:22的体积比配制sgT2靶位点对应的sgRNA表达框酶切反应体系，将所述含有sgT1靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒用type II内切酶位点的内切酶BbsⅠ酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收得到BbsⅠ酶切后线性化的sgRNA表达框质粒；
按照BbsⅠ酶切后线性化的sgRNA表达框质粒与sgT2靶位点DNA片段、T4 DNAligase Buffer、T4 DNA ligase为15:2:2:1的体积比配制sgT2靶位点组装连接反应体系，将sgT2靶位点DNA片段和BbsⅠ酶切后线性化的sgRNA表达框质粒在T4 DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase的作用下4℃连接过夜，再将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养过夜，筛选阳性克隆，提取得到含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒。
优选的，所述将所述linker DNA片段连接至表达载体pCAMBIA2301质粒的SacⅠ和XbaⅠ酶切位点之间，构建得到含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒的步骤，包括：
按照10×NEB Buffer与pCAMBIA2301质粒、限制性内切酶SacⅠ、限制性内切酶XbaⅠ、ddH2O为5:5:1:1:38的体积比配制第一pCAMBIA2301线性化酶切反应体系，将pCAMBIA2301质粒用限制性内切酶SacⅠ和XbaⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化的pCAMBIA2301质粒；
按照Linker DNA片段与所述线性化的pCAMBIA2301质粒、T4 DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase为6:20:3:1的体积比配制Linker DNA片段连接反应体系，将Linker DNA片段与所述线性化的pCAMBIA2301质粒在T4 DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase的作用下4℃连接过夜，再将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养过夜，筛选阳性克隆，提取得到含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒。
优选的，所述利用限制性内切酶NotⅠ和AscⅠ，将Cas9表达框连接至将所述含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒的NotⅠ和AscⅠ酶切位点之间，得到含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒的步骤，包括：
按照10×NEB Buffer与含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒、限制性内切酶NotⅠ、限制性内切酶AscⅠ、ddH2O为5:5:1:1:38的体积比配制第二pCAMBIA2301线性化酶切反应体系，利用限制性内切酶NotⅠ和AscⅠ同时对所述含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒和Cas9表达框进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化且含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒和线性化Cas9表达框片段；
按照线性化Cas9表达框片段与所述线性化且含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒、T4 DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase为6:20:3:1的体积比配制Cas9表达框片段连接反应体系，将所述线性化且含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒和所述线性化Cas9表达框片段在T4 DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase的作用下4℃连接过夜，再将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养过夜，筛选阳性克隆，提取得到含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒。
优选的，所述利用限制性内切酶NotⅠ和SbfⅠ，将所述含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒连接至所述含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒的NotⅠ和SbfⅠ酶切位点之间，得到BoMYB101基因编辑的表达载体质粒的步骤，包括：
按照10×NEB Buffer与含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒、限制性内切酶NotⅠ、限制性内切酶SbfⅠ、ddH2O为5:5:1:1:38的体积比配制第三pCAMBIA2301线性化酶切反应体系，利用限制性内切酶NotⅠ和SbfⅠ同时对所述含有linkerDNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒和所述含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化且含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒，以及线性化且含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框片段；
按照所述线性化且含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框片段与所述线性化且含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒、T4 DNA ligase Buffer、T4 DNAligase为6:20:3:1的体积比配制sgRNA表达框片段连接反应体系，将所述线性化且含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框片段和所述线性化且含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒在T4 DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase的作用下4℃连接过夜，再将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养过夜，筛选阳性克隆，提取得到BoMYB101基因编辑的表达载体质粒。
优选的，所述表达载体质粒对BoMYB101基因的编辑效率为75-80%。
与现有技术相比，本发明提供的一种基于CRISPR/Cas9的青花菜基因定点编辑方法具有以下优点：
本发明提供的一种基于CRISPR/Cas9的青花菜基因定点编辑方法，通过利用CRISPR/Cas9 技术对青花菜BoMYB101基因进行定点敲除编辑，根据青花菜BoMYB101基因序列设计2个sgRNA靶位点、构建BoMYB101基因的敲除表达载体、农杆菌介导转化青花菜下胚轴及分子检测筛选突变植株，进而获得高效的青花菜基因编辑植株，为青花菜植株的抗病、耐寒、繁育等性状改良和基因功能研究提供了应用支持。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并于说明书一起用于解释本发明的原理。
图1是本发明提供的一种BoMYB101基因编辑的表达载体质粒的示意图。
图2是本发明提供的一种青花菜转基因检测示意图。
图3是本发明提供的一种青花菜BoMYB101基因靶位点PCR产物直接测序峰图。
图4是本发明提供的一种青花菜BoMYB101基因靶位点sgT2单克隆测序分析统计图。
实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
青花菜的基因型决定了其在性状改良和分子生物学研究具备较大的困难，为了避免上述技术问题，发明人经过大量创造性实验研究及思考，提出了一种基于CRISPR/Cas9的青花菜基因定点编辑方法，具体如下所示。
一种基于CRISPR/Cas9的青花菜基因定点编辑方法，所述方法包括：
步骤（100）：根据青花菜自交系2M基因组测序分析获得BoMYB101基因序列，在所述BoMYB101基因序列的第一外显子选取5’-GCCAAATCTAAGGACAGGAT-3’序列作为靶位点sgT1，在所述BoMYB101基因序列的第二外显子选取5’-GATTCACCTGCGGGGAACAG-3’序列作为靶位点sgT2，分别合成各个靶位点对应互补引物对，其中，所述靶位点sgT1对应互补引物对包括：
sgT1-F：5’-TGCAGCCAAATCTAAGGACAGGAT-3’、sgT1-R：5’-AAACATCCTGTCCTTAGATTTGGC-3’；
所述靶位点sgT2对应互补引物对包括：
sgT2-F：5’-TGCAGATTCACCTGCGGGGAACAG-3’、sgT2-R：5’-AAACCTGTTCCCCGCAGGTGAATC-3’。
需要说明的是，MYB97、MYB101、MYB120为花粉转录因子可能通过转录调控下游基因的表达参与花粉管和助细胞之间的信息交流，myb97、myb101、myb120三元突变体花粉管进入胚囊后不能停止生长，也不能爆裂释放***，导致不能进行双受精，因此，研究MYB101基因功能为解析花粉管接受的分子机制有重要作用。
步骤（200）：对于每个互补引物对，按照引物F与引物R、ddH2O为1:1:8体积比配制所述互补引物对的反应体系，并利用PCR扩增仪对所述互补引物对的反应体系进行95℃变性5min，然后以0.2℃/s的降温速率降温至25℃，反应产物用ddH2O稀释250倍，得到各个靶位点DNA片段，所述引物F与所述引物R的浓度均为100μMol/L。
在一种可能的实施方式中，互补引物对的反应体系中引物F与引物R、ddH2O的体积分别为1μL、1μL、8μL。
步骤（300）：将各个靶位点DNA片段分别连接至sgRNA表达框中，构建得到含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒。
优选的，所述将各个靶位点序列片段分别连接至sgRNA表达框中，构建得到含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒的步骤，包括：
步骤（310）：按10×NEB Buffer 2.1与sgRNA表达框质粒、内切酶BsaI、ddH2O为3:4:1:22的体积比配制sgT1靶位点对应的sgRNA表达框酶切反应体系，将所述sgRNA表达框质粒用type II内切酶位点的内切酶BsaⅠ酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收得到BsaⅠ酶切后线性化的sgRNA表达框质粒。
在一种可能的实施方式中，sgT1靶位点对应的sgRNA表达框酶切反应体系中10×NEB Buffer 2.1与sgRNA表达框质粒、内切酶BsaⅠ、ddH2O的体积分别为3μL、4μL、22μL、1μL。
步骤（320）：按照BsaⅠ酶切后线性化的sgRNA表达框质粒与sgT1靶位点DNA片段、T4DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase为15:2:2:1的体积比配制sgT1靶位点组装连接反应体系，将sgT1靶位点DNA片段和BsaⅠ酶切后线性化的sgRNA表达框质粒在T4 DNA ligaseBuffer、T4 DNA ligase的作用下4℃连接过夜，再将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养过夜，筛选阳性克隆，提取得到含有sgT1靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒。
在一种可能的实施方式中，sgT1靶位点组装连接反应体系中BsaⅠ酶切后线性化的sgRNA表达框质粒与sgT1靶位点DNA片段、T4 DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase的体积分别为15μL、2μL、22μL、1μL。
步骤（330）：按10×NEB Buffer 2.1与含有sgT1靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒、内切酶BbsⅠ、ddH2O为3:4:1:22的体积比配制sgT2靶位点对应的sgRNA表达框酶切反应体系，将所述含有sgT1靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒用type II内切酶位点的内切酶BbsⅠ酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收得到BbsⅠ酶切后线性化的sgRNA表达框质粒。
在一种可能的实施方式中，sgT2靶位点对应的sgRNA表达框酶切反应体系中10×NEB Buffer 2.1与含有sgT1靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒、内切酶BbsⅠ、ddH2O的体积分别为3μL、4μL、1μL、22μL。
步骤（340）：按照BbsⅠ酶切后线性化的sgRNA表达框质粒与sgT2靶位点DNA片段、T4DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase为15:2:2:1的体积比配制sgT2靶位点组装连接反应体系，将sgT2靶位点DNA片段和BbsⅠ酶切后线性化的sgRNA表达框质粒在T4 DNA ligaseBuffer、T4 DNA ligase的作用下4℃连接过夜，再将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养过夜，筛选阳性克隆，提取得到含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒。
在一种可能的实施方式中，sgT2靶位点组装连接反应体系中BbsⅠ酶切后线性化的sgRNA表达框质粒与sgT2靶位点DNA片段、T4 DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase的体积分别为15μL、2μL、2μL、1μL。
其中，所述含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒的基因序列表如说明书末示出的SEQ ID NO .1。
步骤（400）：按照引物FW与引物RV、ddH2O为1:1:8体积比配制linker引物对的反应体系，并利用PCR扩增仪对所述linker引物对的反应体系进行95℃变性5min，然后以0.2℃/s的降温速率降温至25℃，反应产物用ddH2O稀释250倍，得到linker DNA片段，所述引物FW与所述引物RV的浓度均为100μMol/L，所述linker引物对包括：
FW：5’-CGTACCTGCAGGAAAGCGGCCGCGTCAGGCGCGCCTAACT-3’、RV：5’-CTAGAGTTAGGCGCGCCTGACGCGGCCGCTTTCCTGCAGGTACGAGCT-3’。
在一种可能的实施方式中，linker引物对的反应体系中引物FW与引物RV、ddH2O的体积分别为1μL、1μL、8μL。
步骤（500）：将所述linker DNA片段连接至表达载体pCAMBIA2301质粒的SacⅠ和XbaⅠ酶切位点之间，构建得到含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒。
优选的，所述将所述linker DNA片段连接至表达载体pCAMBIA2301质粒的SacⅠ和XbaⅠ酶切位点之间，构建得到含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒的步骤，包括：
步骤（510）：按照10×NEB Buffer与pCAMBIA2301质粒、限制性内切酶SacⅠ、限制性内切酶XbaⅠ、ddH2O为5:5:1:1:38的体积比配制第一pCAMBIA2301线性化酶切反应体系，将pCAMBIA2301质粒用限制性内切酶SacⅠ和XbaⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化的pCAMBIA2301质粒。
在一种可能的实施方式中，第一pCAMBIA2301线性化酶切反应体系中10×NEBBuffer与pCAMBIA2301质粒、限制性内切酶SacⅠ、限制性内切酶XbaⅠ、ddH2O的体积分别为5μL、5μL、1μL、1μL、38μL。
步骤（520）：按照Linker DNA片段与所述线性化的pCAMBIA2301质粒、T4 DNAligase Buffer、T4 DNA ligase为6:20:3:1的体积比配制Linker DNA片段连接反应体系，将linker DNA片段与所述线性化的pCAMBIA2301质粒在T4 DNA ligase Buffer、T4 DNAligase的作用下4℃连接过夜，再将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养过夜，筛选阳性克隆，提取得到含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒。
在一种可能的实施方式中，Linker DNA片段连接反应体系中Linker DNA片段与所述线性化的pCAMBIA2301质粒、T4 DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase的体积分别为6μL、20μL、3μL、1μL。
步骤（600）：利用限制性内切酶NotⅠ和AscⅠ，将Cas9表达框连接至将所述含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒的NotⅠ和AscⅠ酶切位点之间，得到含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒。
优选的，所述利用限制性内切酶NotⅠ和AscⅠ，将Cas9表达框连接至将所述含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒的NotⅠ和AscⅠ酶切位点之间，得到含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒的步骤，包括：
步骤（610）：按照10×NEB Buffer与含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒、限制性内切酶NotⅠ、限制性内切酶AscⅠ、ddH2O为5:5:1:1:38的体积比配制第二pCAMBIA2301线性化酶切反应体系，利用限制性内切酶NotⅠ和AscⅠ同时对所述含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒和Cas9表达框进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化且含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒和线性化Cas9表达框片段。
在一种可能的实施方式中，第二pCAMBIA2301线性化酶切反应体系中10×NEBBuffer与含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒、限制性内切酶NotⅠ、限制性内切酶AscⅠ、ddH2O分别为5μL、5μL、1μL、1μL、38μL。
步骤（620）：按照线性化Cas9表达框片段与所述线性化且含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒、T4 DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase为6:20:3:1的体积比配制Cas9表达框片段连接反应体系，将所述线性化且含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒和所述线性化Cas9表达框片段在T4 DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase的作用下4℃连接过夜，再将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养过夜，筛选阳性克隆，提取得到含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒。
在一种可能的实施方式中，Cas9表达框片段连接反应体系中线性化Cas9表达框片段与所述线性化且含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒、T4 DNA ligase Buffer、T4DNA ligase的体积分别为6μL、20μL、3μL、1μL。
步骤（700）：利用限制性内切酶NotⅠ和SbfⅠ，将所述含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒连接至所述含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒的NotⅠ和SbfⅠ酶切位点之间，得到BoMYB101基因编辑的表达载体质粒。
优选的，所述利用限制性内切酶NotⅠ和SbfⅠ，将所述含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒连接至所述含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒的NotⅠ和SbfⅠ酶切位点之间，得到BoMYB101基因编辑的表达载体质粒的步骤，包括：
步骤（710）：按照10×NEB Buffer与含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒、限制性内切酶NotⅠ、限制性内切酶SbfⅠ、ddH2O为5:5:1:1:38的体积比配制第三pCAMBIA2301线性化酶切反应体系，利用限制性内切酶NotⅠ和SbfⅠ同时对所述含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒和所述含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化且含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒，以及线性化且含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框片段。
在一种可能的实施方式中，第三pCAMBIA2301线性化酶切反应体系中10×NEBBuffer与含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒、限制性内切酶NotⅠ、限制性内切酶SbfⅠ、ddH2O分别为5μL、5μL、1μL、1μL、38μL。
步骤（720）：按照所述线性化且含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框片段与所述线性化且含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒、T4 DNA ligaseBuffer、T4 DNA ligase为6:20:3:1的体积比配制sgRNA表达框片段连接反应体系，将所述线性化且含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框片段和所述线性化且含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒在T4 DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase的作用下4℃连接过夜，再将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养过夜，筛选阳性克隆，提取得到BoMYB101基因编辑的表达载体质粒。
在一种可能的实施方式中，sgRNA表达框片段连接反应体系中线性化且含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框片段与所述线性化且含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒、T4 DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase的体积分别为6μL、20μL、3μL、1μL。
在一种可能的实施方式中，BoMYB101基因编辑的表达载体质粒的示意图可以如图1所示，在图1中，LB、RB为左右边界；p2×35-spCas9-Tcamv为Cas9表达框；pBoU6-trna-sgRNA1-trna-sgRNA2-Tsp为青花菜U6启动sgRNA表达框；Kan为卡那霉素抗性基因。
优选的，所述方法还包括：
步骤（800）：利用冻融法将所述BoMYB101基因编辑的表达载体质粒转化至EHA105农杆菌感受态细胞中，得到含有表达载体质粒的EHA105农杆菌菌株。
步骤（900）：将所述含有表达载体质粒的EHA105农杆菌菌株对青花菜下胚轴外植体进行侵染，经过抗性筛选培养获得表达载体导入青花菜细胞的转基因植株，具体包括：
（a）青花菜下胚轴的准备：
挑选籽粒饱满、均匀一致的青花菜自交系2M种子先用75% 酒精消毒45 s，再用10%次氯酸钠消毒15 min，之后无菌水漂洗5-6次；将消毒完毕的种子均匀的播种在1/2 MS固体培养基中（每瓶30粒为宜）；25℃、16h光照条件下培养7 天，将无菌苗的下胚轴剪成长约1cm的小段，置于青花菜分化培养基基(MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+3 .0mg/L 6-BA+0 .05mg/LNAA pH5.8)上预培养2 天。
（b）农杆菌培养与侵染：
用接种针挑取上述含有表达载体质粒的EHA105农杆菌菌株在含有Kan（50 mg/L）和Rif（50 mg/L）的YEB固体培养基平板上划线，并置于28℃烘箱培养2 天；挑取阳性克隆单菌落于5 ml 含有Kan（50 mg/L）和Rif（50 mg/L）液体培养基中，225 rpm摇床上28℃培养2天；侵染当天取600-700 μL菌液加到50 mL无抗生素的YEB液体中，28℃、225 rpm摇床振荡培养4 h至OD600值约为0.6~0.8，4℃、4000 rpm离心10 min，倒掉上清液，将菌体在20 ml冰冷的MS液体培养基(MS+20g/L蔗糖pH5 .8)悬浮；将预培养的下胚轴移至无菌瓶中，加入悬浮液侵染15 min；将下胚轴移至无菌滤纸上吸干下胚轴上的多余菌液，然后移至分化培养中暗培养2 天，得到侵染后的青花菜下胚轴。
（c）筛选培养与愈伤诱导：
把侵染后的青花菜下胚轴移至青花菜筛选培养基基(MS+3 .0mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+400mg/L Cb+30mg/L Kan)中培养，之后每隔14天更换一次培养基；将在筛选培养基中正常生长的不定芽，剪下***生根培养基(MS+0 .2mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+400mg/L Cb+30mg/L Kan)中进行生根；待根系长至1-2 cm即可移栽到土壤中，获得抗Kan转基因植株。
（d）转基因植株检测：
利用CTAB法提取抗Kan转基因植株的基因组DNA，用引物Cas9-F和Cas9-R（Cas9-F：5’-CGCAAGAACCGCATCTGCTACCTC-3’ 、Cas9-R：5’-TTCTCGAGACGCCTGGACTTGGAG-3’ ）进行PCR扩增，进行琼脂糖凝胶电泳得到的青花菜转基因检测示意图如图2所示，在图2中，字母“M”为DNA marker；数字“1-46”为抗Kan植株；“+”为表达载体质粒作阳性对照；“—”为未转化的青花菜自交系2M做阴性对照。
为了进一步检测获得的抗Kan转基因植株的BoMYB101基因是否发生突变，本发明分别在靶位点T1、T2的上下游设计合成引物对BoMYB101-F1+BoMYB101-R1、BoMYB101-F2+BoMYB101-R2（BoMYB101-F1：5’-ATGGACGGTGGTGAAGAGACGTC-3’、 BoMYB101-R1：5’-GAATAAAGGCAAACCAGCTCG-3’ 、 BoMYB101-F2：5’- CGTCGAATGAGTTATGTAATCC CGACC-3’ 、BoMYB101-R2：5’- GATTGATGAGAAGAGCTTAGATG-3’ ）PCR扩增，将43株转基因材料的PCR产物进行测序，与对应的野生型植株PCR产物序列比对，靶位点序列发生改变或测序峰图出现重峰现象判断为基因发生突变。对测序结果进行比对分析，发现43株T1靶位点序列未发生任何改变，编辑效率为0；靶位点T2序列有33株出现错峰或序列改变现象，编辑效率为76.7%，如图3所示的青花菜BoMYB101基因靶位点T1、T2序列PCR产物直接测序峰图，在图3中，靶位点T1未发生改变，靶位点T2出现重峰或碱基变化。
为进一步分析靶位点基因序列编辑的详细情况，选取#15、#19、#21、#41单株用引物对BoMYB101-F2+BoMYB101-R2扩增靶位点T2序列片段***pClone007 Simple Vector(北京擎科新业生物技术有限公司)。连接产物转化大肠杆菌后涂布在50 mg/L Amp的平板上进行37℃过夜培养，每棵单株挑选不少于5个阳性克隆进行测序分析，统计靶基因碱基突变类型及频率。其中，对#15单株随机挑选7个单克隆进行测序：6个单克隆发生1个碱基的***，1个单克隆出现较长片段（53个碱基）的删除，编辑频率为100%；#19单株有7个单克隆发生2个碱基的缺失，1个单克隆未发生突变；#21单株检测的10个单克隆全部是10个碱基的删除，编辑频率为100%，植株为纯合突变；#41单株随机挑选9个单克隆检测，3个单克隆发生单碱基的***，6个单克隆发生62个碱基的删除，编辑频率100%，如图4所示的青花菜BoMYB101基因靶位点T2单克隆测序分析统计图。
上述结果表明按照本发明提供的基于CRISPR/Cas9的青花菜基因定点编辑方法，可以高效的对青花菜基因进行编辑，甚至T0代即可获得纯合突变植株，对性状观察或基因功能研究都有很大帮助。
综上所述，本发明提供的一种基于CRISPR/Cas9的青花菜基因定点编辑方法，通过利用CRISPR/Cas9 技术对青花菜BoMYB101基因进行定点敲除编辑，根据青花菜BoMYB101基因序列设计2个sgRNA靶位点、构建BoMYB101基因的敲除表达载体、农杆菌介导转化青花菜下胚轴及分子检测筛选突变植株，进而获得高效的青花菜基因编辑植株，为青花菜植株的抗病、耐寒、繁育等性状改良和基因功能研究提供了应用支持。
此外，本发明利用的CRISPR/Cas9 技术通过具有特异性向导的 sgRNA 序列与靶序列进行碱基互补配对，引导 Cas9 蛋白结合到靶序列，进行 DNA 切割产生断裂，从而激活细胞的非同源性末端连接或同源重组修复机制，实现碱基删除、***、替换等突变。CRISPR/Cas9 技术只对靶位点序列进行修饰，T0 代植株中的表达载体序列可以通过后代自交分离获得不含任何外源DNA序列的非转基因植株，本质上和传统育种方法获得的突变体材料没有区别，为实现精准、高效、省时、省力和安全的农业育种技术革命提供了新契机，也为青花菜育种提供了新的技术。
虽然，前文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明做了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之进行修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里的发明的后，将容易想到本发明的其它实施方案。本发明旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。
序列表1中第1-8位的序列为NotI限制性内切酶识别位点；
序列表1中第537-556位的序列为type II 内切酶BsaI识别位点；
序列表1中第815-822位的序列为SbfI限制性内切酶识别位点；
序列表1中第710-731位的序列为type II 内切酶BbsI识别位点；
序列表2中第10826-10831位的序列为SacI限制性内切酶识别位点；
序列表2中第10847-10852位的序列为XbaI 限制性内切酶识别位点；
序列表3中第1-8位的序列为AscI限制性内切酶识别位点；
序列表3中第5336-5343位的序列为NotI限制性内切酶识别位点；
序列表4中第189-208位的序列为靶位点T1序列；
序列表4中第1168-1187位的序列为靶位点T2序列。
序列表
<110> 浙江美之奥种业股份有限公司
<120> 基于CRISPR/Cas9的青花菜基因定点编辑方法
<130> 2021.06.23
<150> 2021109424786
<151> 2021-08-17
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcggccgcct gataatataa aatctgttac ttctaaaact atacactatt tattctattt 60
tttgaatgaa agtatcttcg taaacacaca aaatattttg tgacgttgca attatacata 120
cacacaatat ctgcctcttc atactgacat tactgtgttc cctttcgtga ggtacgggcc 180
gagagagaac acagggtacg caccgattat gttcttatgc ccgcacaggg tacggaccgg 240
tcacctagta gtaactaaaa gctgatttac aaaaccatga atttttaaat gaatcacctt 300
ttgaataata ttaacgggcc agagagaaat cggagagagg cctgttagtg taataaacga 360
gcccattaat atgttgtaaa tgaagtgaaa cagtcccaca tcggttgtgt aagaagaaga 420
aactgtgttt atatagcgat ggagtgacga aggtgattga acaaagcacc agtggtctag 480
tggtagaata gtaccctgcc acggtacaga cccgggttcg attcccggct ggtgcaagag 540
accctgcagg gtctctgttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt 600
atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gcaacaaagc accagtggtc tagtggtaga 660
atagtaccct gccacggtac agacccgggt tcgattcccg gctggtgcag ggtcttcgtt 720
acagaagacc tgttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa 780
cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt ttttcctgca gg 822
<210> 2
<211> 11633
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catggtagat ctgagggtaa atttctagtt tttctccttc attttcttgg ttaggaccct 60
tttctctttt tatttttttg agctttgatc tttctttaaa ctgatctatt ttttaattga 120
ttggttatgg tgtaaatatt acatagcttt aactgataat ctgattactt tatttcgtgt 180
gtctatgatg atgatgatag ttacagaacc gacgactcgt ccgtcctgta gaaaccccaa 240
cccgtgaaat caaaaaactc gacggcctgt gggcattcag tctggatcgc gaaaactgtg 300
gaattgatca gcgttggtgg gaaagcgcgt tacaagaaag ccgggcaatt gctgtgccag 360
gcagttttaa cgatcagttc gccgatgcag atattcgtaa ttatgcgggc aacgtctggt 420
atcagcgcga agtctttata ccgaaaggtt gggcaggcca gcgtatcgtg ctgcgtttcg 480
atgcggtcac tcattacggc aaagtgtggg tcaataatca ggaagtgatg gagcatcagg 540
gcggctatac gccatttgaa gccgatgtca cgccgtatgt tattgccggg aaaagtgtac 600
gtatcaccgt ttgtgtgaac aacgaactga actggcagac tatcccgccg ggaatggtga 660
ttaccgacga aaacggcaag aaaaagcagt cttacttcca tgatttcttt aactatgccg 720
gaatccatcg cagcgtaatg ctctacacca cgccgaacac ctgggtggac gatatcaccg 780
tggtgacgca tgtcgcgcaa gactgtaacc acgcgtctgt tgactggcag gtggtggcca 840
atggtgatgt cagcgttgaa ctgcgtgatg cggatcaaca ggtggttgca actggacaag 900
gcactagcgg gactttgcaa gtggtgaatc cgcacctctg gcaaccgggt gaaggttatc 960
tctatgaact cgaagtcaca gccaaaagcc agacagagtc tgatatctac ccgcttcgcg 1020
tcggcatccg gtcagtggca gtgaagggcc aacagttcct gattaaccac aaaccgttct 1080
actttactgg ctttggtcgt catgaagatg cggacttacg tggcaaagga ttcgataacg 1140
tgctgatggt gcacgaccac gcattaatgg actggattgg ggccaactcc taccgtacct 1200
cgcattaccc ttacgctgaa gagatgctcg actgggcaga tgaacatggc atcgtggtga 1260
ttgatgaaac tgctgctgtc ggctttcagc tgtctttagg cattggtttc gaagcgggca 1320
acaagccgaa agaactgtac agcgaagagg cagtcaacgg ggaaactcag caagcgcact 1380
tacaggcgat taaagagctg atagcgcgtg acaaaaacca cccaagcgtg gtgatgtgga 1440
gtattgccaa cgaaccggat acccgtccgc aaggtgcacg ggaatatttc gcgccactgg 1500
cggaagcaac gcgtaaactc gacccgacgc gtccgatcac ctgcgtcaat gtaatgttct 1560
gcgacgctca caccgatacc atcagcgatc tctttgatgt gctgtgcctg aaccgttatt 1620
acggatggta tgtccaaagc ggcgatttgg aaacggcaga gaaggtactg gaaaaagaac 1680
ttctggcctg gcaggagaaa ctgcatcagc cgattatcat caccgaatac ggcgtggata 1740
cgttagccgg gctgcactca atgtacaccg acatgtggag tgaagagtat cagtgtgcat 1800
ggctggatat gtatcaccgc gtctttgatc gcgtcagcgc cgtcgtcggt gaacaggtat 1860
ggaatttcgc cgattttgcg acctcgcaag gcatattgcg cgttggcggt aacaagaaag 1920
ggatcttcac tcgcgaccgc aaaccgaagt cggcggcttt tctgctgcaa aaacgctgga 1980
ctggcatgaa cttcggtgaa aaaccgcagc agggaggcaa acaagctagc caccaccacc 2040
accaccacgt gtgaattaca ggtgaccagc tcgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg 2100
caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt 2160
ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga 2220
tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata 2280
tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa 2340
ttaaactatc agtgtttgac aggatatatt ggcgggtaaa cctaagagaa aagagcgttt 2400
attagaataa cggatattta aaagggcgtg aaaaggttta tccgttcgtc catttgtatg 2460
tgcatgccaa ccacagggtt cccctcggga tcaaagtact ttgatccaac ccctccgctg 2520
ctatagtgca gtcggcttct gacgttcagt gcagccgtct tctgaaaacg acatgtcgca 2580
caagtcctaa gttacgcgac aggctgccgc cctgcccttt tcctggcgtt ttcttgtcgc 2640
gtgttttagt cgcataaagt agaatacttg cgactagaac cggagacatt acgccatgaa 2700
caagagcgcc gccgctggcc tgctgggcta tgcccgcgtc agcaccgacg accaggactt 2760
gaccaaccaa cgggccgaac tgcacgcggc cggctgcacc aagctgtttt ccgagaagat 2820
caccggcacc aggcgcgacc gcccggagct ggccaggatg cttgaccacc tacgccctgg 2880
cgacgttgtg acagtgacca ggctagaccg cctggcccgc agcacccgcg acctactgga 2940
cattgccgag cgcatccagg aggccggcgc gggcctgcgt agcctggcag agccgtgggc 3000
cgacaccacc acgccggccg gccgcatggt gttgaccgtg ttcgccggca ttgccgagtt 3060
cgagcgttcc ctaatcatcg accgcacccg gagcgggcgc gaggccgcca aggcccgagg 3120
cgtgaagttt ggcccccgcc ctaccctcac cccggcacag atcgcgcacg cccgcgagct 3180
gatcgaccag gaaggccgca ccgtgaaaga ggcggctgca ctgcttggcg tgcatcgctc 3240
gaccctgtac cgcgcacttg agcgcagcga ggaagtgacg cccaccgagg ccaggcggcg 3300
cggtgccttc cgtgaggacg cattgaccga ggccgacgcc ctggcggccg ccgagaatga 3360
acgccaagag gaacaagcat gaaaccgcac caggacggcc aggacgaacc gtttttcatt 3420
accgaagaga tcgaggcgga gatgatcgcg gccgggtacg tgttcgagcc gcccgcgcac 3480
gtctcaaccg tgcggctgca tgaaatcctg gccggtttgt ctgatgccaa gctggcggcc 3540
tggccggcca gcttggccgc tgaagaaacc gagcgccgcc gtctaaaaag gtgatgtgta 3600
tttgagtaaa acagcttgcg tcatgcggtc gctgcgtata tgatgcgatg agtaaataaa 3660
caaatacgca aggggaacgc atgaaggtta tcgctgtact taaccagaaa ggcgggtcag 3720
gcaagacgac catcgcaacc catctagccc gcgccctgca actcgccggg gccgatgttc 3780
tgttagtcga ttccgatccc cagggcagtg cccgcgattg ggcggccgtg cgggaagatc 3840
aaccgctaac cgttgtcggc atcgaccgcc cgacgattga ccgcgacgtg aaggccatcg 3900
gccggcgcga cttcgtagtg atcgacggag cgccccaggc ggcggacttg gctgtgtccg 3960
cgatcaaggc agccgacttc gtgctgattc cggtgcagcc aagcccttac gacatatggg 4020
ccaccgccga cctggtggag ctggttaagc agcgcattga ggtcacggat ggaaggctac 4080
aagcggcctt tgtcgtgtcg cgggcgatca aaggcacgcg catcggcggt gaggttgccg 4140
aggcgctggc cgggtacgag ctgcccattc ttgagtcccg tatcacgcag cgcgtgagct 4200
acccaggcac tgccgccgcc ggcacaaccg ttcttgaatc agaacccgag ggcgacgctg 4260
cccgcgaggt ccaggcgctg gccgctgaaa ttaaatcaaa actcatttga gttaatgagg 4320
taaagagaaa atgagcaaaa gcacaaacac gctaagtgcc ggccgtccga gcgcacgcag 4380
cagcaaggct gcaacgttgg ccagcctggc agacacgcca gccatgaagc gggtcaactt 4440
tcagttgccg gcggaggatc acaccaagct gaagatgtac gcggtacgcc aaggcaagac 4500
cattaccgag ctgctatctg aatacatcgc gcagctacca gagtaaatga gcaaatgaat 4560
aaatgagtag atgaatttta gcggctaaag gaggcggcat ggaaaatcaa gaacaaccag 4620
gcaccgacgc cgtggaatgc cccatgtgtg gaggaacggg cggttggcca ggcgtaagcg 4680
gctgggttgt ctgccggccc tgcaatggca ctggaacccc caagcccgag gaatcggcgt 4740
gacggtcgca aaccatccgg cccggtacaa atcggcgcgg cgctgggtga tgacctggtg 4800
gagaagttga aggccgcgca ggccgcccag cggcaacgca tcgaggcaga agcacgcccc 4860
ggtgaatcgt ggcaagcggc cgctgatcga atccgcaaag aatcccggca accgccggca 4920
gccggtgcgc cgtcgattag gaagccgccc aagggcgacg agcaaccaga ttttttcgtt 4980
ccgatgctct atgacgtggg cacccgcgat agtcgcagca tcatggacgt ggccgttttc 5040
cgtctgtcga agcgtgaccg acgagctggc gaggtgatcc gctacgagct tccagacggg 5100
cacgtagagg tttccgcagg gccggccggc atggccagtg tgtgggatta cgacctggta 5160
ctgatggcgg tttcccatct aaccgaatcc atgaaccgat accgggaagg gaagggagac 5220
aagcccggcc gcgtgttccg tccacacgtt gcggacgtac tcaagttctg ccggcgagcc 5280
gatggcggaa agcagaaaga cgacctggta gaaacctgca ttcggttaaa caccacgcac 5340
gttgccatgc agcgtacgaa gaaggccaag aacggccgcc tggtgacggt atccgagggt 5400
gaagccttga ttagccgcta caagatcgta aagagcgaaa ccgggcggcc ggagtacatc 5460
gagatcgagc tagctgattg gatgtaccgc gagatcacag aaggcaagaa cccggacgtg 5520
ctgacggttc accccgatta ctttttgatc gatcccggca tcggccgttt tctctaccgc 5580
ctggcacgcc gcgccgcagg caaggcagaa gccagatggt tgttcaagac gatctacgaa 5640
cgcagtggca gcgccggaga gttcaagaag ttctgtttca ccgtgcgcaa gctgatcggg 5700
tcaaatgacc tgccggagta cgatttgaag gaggaggcgg ggcaggctgg cccgatccta 5760
gtcatgcgct accgcaacct gatcgagggc gaagcatccg ccggttccta atgtacggag 5820
cagatgctag ggcaaattgc cctagcaggg gaaaaaggtc gaaaaggtct ctttcctgtg 5880
gatagcacgt acattgggaa cccaaagccg tacattggga accggaaccc gtacattggg 5940
aacccaaagc cgtacattgg gaaccggtca cacatgtaag tgactgatat aaaagagaaa 6000
aaaggcgatt tttccgccta aaactcttta aaacttatta aaactcttaa aacccgcctg 6060
gcctgtgcat aactgtctgg ccagcgcaca gccgaagagc tgcaaaaagc gcctaccctt 6120
cggtcgctgc gctccctacg ccccgccgct tcgcgtcggc ctatcgcggc cgctggccgc 6180
tcaaaaatgg ctggcctacg gccaggcaat ctaccagggc gcggacaagc cgcgccgtcg 6240
ccactcgacc gccggcgccc acatcaaggc accctgcctc gcgcgtttcg gtgatgacgg 6300
tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc 6360
cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc 6420
catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag 6480
cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 6540
aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 6600
cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 6660
ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 6720
aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 6780
cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 6840
cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 6900
gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt 6960
tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 7020
cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 7080
ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 7140
gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc 7200
gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 7260
accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 7320
ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 7380
tcacgttaag ggattttggt catgcattct aggtactaaa acaattcatc cagtaaaata 7440
taatatttta ttttctccca atcaggcttg atccccagta agtcaaaaaa tagctcgaca 7500
tactgttctt ccccgatatc ctccctgatc gaccggacgc agaaggcaat gtcataccac 7560
ttgtccgccc tgccgcttct cccaagatca ataaagccac ttactttgcc atctttcaca 7620
aagatgttgc tgtctcccag gtcgccgtgg gaaaagacaa gttcctcttc gggcttttcc 7680
gtctttaaaa aatcatacag ctcgcgcgga tctttaaatg gagtgtcttc ttcccagttt 7740
tcgcaatcca catcggccag atcgttattc agtaagtaat ccaattcggc taagcggctg 7800
tctaagctat tcgtataggg acaatccgat atgtcgatgg agtgaaagag cctgatgcac 7860
tccgcataca gctcgataat cttttcaggg ctttgttcat cttcatactc ttccgagcaa 7920
aggacgccat cggcctcact catgagcaga ttgctccagc catcatgccg ttcaaagtgc 7980
aggacctttg gaacaggcag ctttccttcc agccatagca tcatgtcctt ttcccgttcc 8040
acatcatagg tggtcccttt ataccggctg tccgtcattt ttaaatatag gttttcattt 8100
tctcccacca gcttatatac cttagcagga gacattcctt ccgtatcttt tacgcagcgg 8160
tatttttcga tcagtttttt caattccggt gatattctca ttttagccat ttattatttc 8220
cttcctcttt tctacagtat ttaaagatac cccaagaagc taattataac aagacgaact 8280
ccaattcact gttccttgca ttctaaaacc ttaaatacca gaaaacagct ttttcaaagt 8340
tgttttcaaa gttggcgtat aacatagtat cgacggagcc gattttgaaa ccgcggtgat 8400
cacaggcagc aacgctctgt catcgttaca atcaacatgc taccctccgc gagatcatcc 8460
gtgtttcaaa cccggcagct tagttgccgt tcttccgaat agcatcggta acatgagcaa 8520
agtctgccgc cttacaacgg ctctcccgct gacgccgtcc cggactgatg ggctgcctgt 8580
atcgagtggt gattttgtgc cgagctgccg gtcggggagc tgttggctgg ctggtggcag 8640
gatatattgt ggtgtaaaca aattgacgct tagacaactt aataacacat tgcggacgtt 8700
tttaatgtac tgaattaacg ccgaattaat tcgggggatc tggattttag tactggattt 8760
tggttttagg aattagaaat tttattgata gaagtatttt acaaatacaa atacatacta 8820
agggtttctt atatgctcaa cacatgagcg aaaccctata ggaaccctaa ttcccttatc 8880
tgggaactac tcacacatta ttatggagaa actcgagctt gtcgatcgac tctagctaga 8940
ggatcgatcc gaaccccaga gtcccgctca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc 9000
gatgcgctgc gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc 9060
gccgccaagc tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc 9120
cacacccagc cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt 9180
cggcaagcag gcatcgccat gtgtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tgcgcgcctt 9240
gagcctggcg aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg 9300
atcgacaaga ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg 9360
gtcgaatggg caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat 9420
ggatactttc tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc 9480
caatagcagc cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac 9540
gcccgtcgtg gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc tggagttcat tcagggcacc 9600
ggacaggtcg gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc 9660
ggcatcagag cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca 9720
agcggccgga gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc cccatggtcg atcgacagat 9780
ctgcgaaagc tcgagagaga tagatttgta gagagagact ggtgatttca gcgtgtcctc 9840
tccaaatgaa atgaacttcc ttatatagag gaaggtcttg cgaaggatag tgggattgtg 9900
cgtcatccct tacgtcagtg gagatatcac atcaatccac ttgctttgaa gacgtggttg 9960
gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg tccatctttg ggaccactgt 10020
cggcagaggc atcttgaacg atagcctttc ctttatcgca atgatggcat ttgtaggtgc 10080
caccttcctt ttctactgtc cttttgatga agtgacagat agctgggcaa tggaatccga 10140
ggaggtttcc cgatattacc ctttgttgaa aagtctcaat agccctttgg tcttctgaga 10200
ctgtatcttt gatattcttg gagtagacga gagtgtcgtg ctccaccatg ttatcacatc 10260
aatccacttg ctttgaagac gtggttggaa cgtcttcttt ttccacgatg ctcctcgtgg 10320
gtgggggtcc atctttggga ccactgtcgg cagaggcatc ttgaacgata gcctttcctt 10380
tatcgcaatg atggcatttg taggtgccac cttccttttc tactgtcctt ttgatgaagt 10440
gacagatagc tgggcaatgg aatccgagga ggtttcccga tattaccctt tgttgaaaag 10500
tctcaatagc cctttggtct tctgagactg tatctttgat attcttggag tagacgagag 10560
tgtcgtgctc caccatgttg gcaagctgct ctagccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 10620
gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag 10680
tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt 10740
tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 10800
cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta gagtcgacct 10860
gcaggcatgc aagcttggca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg 10920
gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg 10980
aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatgctaga 11040
gcagcttgag cttggatcag attgtcgttt cccgccttca gtttagcttc atggagtcaa 11100
agattcaaat agaggaccta acagaactcg ccgtaaagac tggcgaacag ttcatacaga 11160
gtctcttacg actcaatgac aagaagaaaa tcttcgtcaa catggtggag cacgacacac 11220
ttgtctactc caaaaatatc aaagatacag tctcagaaga ccaaagggca attgagactt 11280
ttcaacaaag ggtaatatcc ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact 11340
ttattgtgaa gatagtggaa aaggaaggtg gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag 11400
gaaaggccat cgttgaagat gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca 11460
cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat 11520
gtgatatctc cactgacgta agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccctt 11580
cctctatata aggaagttca tttcatttgg agagaacacg ggggactctt gac 11633
<210> 3
<211> 5343
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcgcgcctt accggtcaac atgtggagca cgacacactt gtctactcca aaaatatcaa 60
agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat tgagactttt caacaaaggg taatatccgg 120
aaacctcctc ggattccatt gcccagctat ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa 180
ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc 240
ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga 300
agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gataacatgg tggagcacga 360
cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa gggcaattga 420
gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg 480
tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga 540
taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc 600
acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga 660
ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga 720
cccttcctct atataaggaa gttcatttca tttggagagg acgtcgagag ttctcaacac 780
aacatataca aaacaaacga atctcaagca atcaagcatt ctacttctat tgcagcaatt 840
taaatcattt cttttaaagc aaaagcaatt ttctgaaaat tttcaccatt tacgaacgat 900
agccatggct cctaagaaga agcggaaggt tggtattcac ggggtgcctg cggctgacaa 960
gaagtactcc atcggcctcg acatcggcac caacagcgtc ggctgggcgg tgatcaccga 1020
cgagtacaag gtcccgtcca agaagttcaa ggtcctgggc aacaccgacc gccactccat 1080
caagaagaac ctcatcggcg ccctcctctt cgactccggc gagacggcgg aggcgacccg 1140
cctcaagcgc accgcccgcc gccgctacac ccgccgcaag aaccgcatct gctacctcca 1200
ggagatcttc tccaacgaga tggcgaaggt cgacgactcc ttcttccacc gcctcgagga 1260
gtccttcctc gtggaggagg acaagaagca cgagcgccac cccatcttcg gcaacatcgt 1320
cgacgaggtc gcctaccacg agaagtaccc cactatctac caccttcgta agaagcttgt 1380
tgactctact gataaggctg atcttcgtct catctacctt gctctcgctc acatgatcaa 1440
gttccgtggt cacttcctta tcgagggtga ccttaaccct gataactccg acgtggacaa 1500
gctcttcatc cagctcgtcc agacctacaa ccagctcttc gaggagaacc ctatcaacgc 1560
ttccggtgtc gacgctaagg cgatcctttc cgctaggctc tccaagtcca ggcgtctcga 1620
gaacctcatc gcccagctcc ctggtgagaa gaagaacggt cttttcggta acctcatcgc 1680
tctctccctc ggtctgaccc ctaacttcaa gtccaacttc gacctcgctg aggacgctaa 1740
gcttcagctc tccaaggata cctacgacga tgatctcgac aacctcctcg ctcagattgg 1800
agatcagtac gctgatctct tccttgctgc taagaacctc tccgatgcta tcctcctttc 1860
ggatatcctt agggttaaca ctgagatcac taaggctcct ctttctgctt ccatgatcaa 1920
gcgctacgac gagcaccacc aggacctcac cctcctcaag gctcttgttc gtcagcagct 1980
ccccgagaag tacaaggaga tcttcttcga ccagtccaag aacggctacg ccggttacat 2040
tgacggtgga gctagccagg aggagttcta caagttcatc aagccaatcc ttgagaagat 2100
ggatggtact gaggagcttc tcgttaagct taaccgtgag gacctcctta ggaagcagag 2160
gactttcgat aacggctcta tccctcacca gatccacctt ggtgagcttc acgccatcct 2220
tcgtaggcag gaggacttct accctttcct caaggacaac cgtgagaaga tcgagaagat 2280
ccttactttc cgtattcctt actacgttgg tcctcttgct cgtggtaact cccgtttcgc 2340
ttggatgact aggaagtccg aggagactat caccccttgg aacttcgagg aggttgttga 2400
caagggtgct tccgcccagt ccttcatcga gcgcatgacc aacttcgaca agaacctccc 2460
caacgagaag gtcctcccca agcactccct cctctacgag tacttcacgg tctacaacga 2520
gctcaccaag gtcaagtacg tcaccgaggg tatgcgcaag cctgccttcc tctccggcga 2580
gcagaagaag gctatcgttg acctcctctt caagaccaac cgcaaggtca ccgtcaagca 2640
gctcaaggag gactacttca agaagatcga gtgcttcgac tccgtcgaga tcagcggcgt 2700
tgaggaccgt ttcaacgctt ctctcggtac ctaccacgat ctcctcaaga tcatcaagga 2760
caaggacttc ctcgacaacg aggagaacga ggacatcctc gaggacatcg tcctcactct 2820
tactctcttc gaggataggg agatgatcga ggagaggctc aagacttacg ctcatctctt 2880
cgatgacaag gttatgaagc agctcaagcg tcgccgttac accggttggg gtaggctctc 2940
ccgcaagctc atcaacggta tcagggataa gcagagcggc aagactatcc tcgacttcct 3000
caagtctgat ggtttcgcta acaggaactt catgcagctc atccacgatg actctcttac 3060
cttcaaggag gatattcaga aggctcaggt gtccggtcag ggcgactctc tccacgagca 3120
cattgctaac cttgctggtt cccctgctat caagaagggc atccttcaga ctgttaaggt 3180
tgtcgatgag cttgtcaagg ttatgggtcg tcacaagcct gagaacatcg tcatcgagat 3240
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gattgaggag ggtatcaagg agcttggttc tcagatcctt aaggagcacc ctgtcgagaa 3360
cacccagctc cagaacgaga agctctacct ctactacctc cagaacggta gggatatgta 3420
cgttgaccag gagctcgaca tcaacaggct ttctgactac gacgtcgacc acattgttcc 3480
tcagtctttc cttaaggatg actccatcga caacaaggtc ctcacgaggt ccgacaagaa 3540
caggggtaag tcggacaacg tcccttccga ggaggttgtc aagaagatga agaactactg 3600
gaggcagctt ctcaacgcta agctcattac ccagaggaag ttcgacaacc tcacgaaggc 3660
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cgacgagaac gacaagctca tccgcgaggt caaggtgatc accctcaagt ccaagctcgt 3840
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cgagcaggcc gagaacatca tccacctctt cacgctcacg aacctcggcg cccctgctgc 4920
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cgc 5343
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<211> 1914
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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Claims (5)
1.一种基于CRISPR/Cas9的青花菜基因定点编辑方法，其特征在于，所述方法包括：
根据青花菜自交系2M基因组测序分析获得BoMYB101基因序列，在所述BoMYB101基因序列的第一外显子选取5’-GCCAAATCTAAGGACAGGAT-3’序列作为靶位点sgT1，在所述BoMYB101基因序列的第二外显子选取5’-GATTCACCTGCGGGGAACAG-3’序列作为靶位点sgT2，分别合成各个靶位点对应互补引物对，其中，所述靶位点sgT1对应互补引物对包括：
sgT1-F：5’-TGCAGCCAAATCTAAGGACAGGAT-3’、sgT1-R：5’-AAACATCCTGTCCTTAGATTTGGC-3’；
所述靶位点sgT2对应互补引物对包括：
sgT2-F：5’-TGCAGATTCACCTGCGGGGAACAG-3’、sgT2-R：5’-AAACCTGTTCCCCGCAGGTGAATC-3’；
对于每个互补引物对，按照引物F与引物R、ddH2O为1:1:8体积比配制所述互补引物对的反应体系，并利用PCR扩增仪对所述互补引物对的反应体系进行95℃变性5min，然后以0.2℃/s的降温速率降温至25℃，反应产物用ddH2O稀释250倍，得到各个靶位点DNA片段，所述引物F与所述引物R的浓度均为100μMol/L；
将各个靶位点DNA片段分别连接至sgRNA表达框中，构建得到含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒；
按照引物FW与引物RV、ddH2O为1:1:8体积比配制linker引物对的反应体系，并利用PCR扩增仪对所述linker引物对的反应体系进行95℃变性5min，然后以0.2℃/s的降温速率降温至25℃，反应产物用ddH2O稀释250倍，得到linker DNA片段，所述引物FW与所述引物RV的浓度均为100μMol/L，所述linker引物对包括：
FW：5’-CGTACCTGCAGGAAAGCGGCCGCGTCAGGCGCGCC TAACT-3’、RV：5’-CTAGAGTTAGGCGCGCCTGACGCGGCCGCT TTCCTGCAGGTACGAGCT-3’；
将所述linker DNA片段连接至表达载体pCAMBIA2301质粒的SacⅠ和XbaⅠ酶切位点之间，构建得到含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒；
利用限制性内切酶NotⅠ和AscⅠ，将Cas9表达框连接至将所述含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒的NotⅠ和AscⅠ酶切位点之间，得到含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒；
利用限制性内切酶NotⅠ和SbfⅠ，将所述含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒连接至所述含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒的NotⅠ和SbfⅠ酶切位点之间，得到BoMYB101基因编辑的表达载体质粒，所述表达载体质粒对BoMYB101基因的编辑效率为75-80％；
利用冻融法将所述BoMYB101基因编辑的表达载体质粒转化至EHA105农杆菌感受态细胞中，得到含有表达载体质粒的EHA105农杆菌菌株；
将所述含有表达载体质粒的EHA105农杆菌菌株对青花菜下胚轴外植体进行侵染，经过抗性筛选培养获得表达载体导入青花菜细胞的转基因植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将各个靶位点序列片段分别连接至sgRNA表达框中，构建得到含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒的步骤，包括：
按10×NEB Buffer2.1与sgRNA表达框质粒、内切酶BsaⅠ、ddH2O为3:4:1:22的体积比配制sgT1靶位点对应的sgRNA表达框酶切反应体系，将所述sgRNA表达框质粒用type II内切酶位点的内切酶BsaⅠ酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收得到BsaⅠ酶切后线性化的sgRNA表达框质粒；
按照BsaⅠ酶切后线性化的sgRNA表达框质粒与sgT1靶位点DNA片段、T4 DNA ligaseBuffer、T4 DNA ligase为15:2:2:1的体积比配制sgT1靶位点组装连接反应体系，将sgT1靶位点DNA片段和BsaⅠ酶切后线性化的sgRNA表达框质粒在T4 DNAligase Buffer、T4DNAligase的作用下4℃连接过夜，再将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养过夜，筛选阳性克隆，提取得到含有sgT1靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒；
按10×NEB Buffer 2.1与含有sgT1靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒、内切酶BbsⅠ、ddH2O为3:4:1:22的体积比配制sgT2靶位点对应的sgRNA表达框酶切反应体系，将所述含有sgT1靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒用type II内切酶位点的内切酶BbsⅠ酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收得到BbsⅠ酶切后线性化的sgRNA表达框质粒；
按照BbsⅠ酶切后线性化的sgRNA表达框质粒与sgT2靶位点DNA片段、T4 DNA ligaseBuffer、T4 DNA ligase为15:2:2:1的体积比配制sgT2靶位点组装连接反应体系，将sgT2靶位点DNA片段和BbsⅠ酶切后线性化的sgRNA表达框质粒在T4 DNAligase Buffer、T4DNAligase的作用下4℃连接过夜，再将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养过夜，筛选阳性克隆，提取得到含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将所述linker DNA片段连接至表达载体pCAMBIA2301质粒的SacⅠ和XbaⅠ酶切位点之间，构建得到含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒的步骤，包括：
按照10×NEB Buffer与pCAMBIA2301质粒、限制性内切酶SacⅠ、限制性内切酶XbaⅠ、ddH2O为5:5:1:1:38的体积比配制第一pCAMBIA2301线性化酶切反应体系，将pCAMBIA2301质粒用限制性内切酶SacⅠ和XbaⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化的pCAMBIA2301质粒；
按照Linker DNA片段与所述线性化的pCAMBIA2301质粒、T4DNA ligase Buffer、T4DNA ligase为6:20:3:1的体积比配制Linker DNA片段连接反应体系，将Linker DNA片段与所述线性化的pCAMBIA2301质粒在T4 DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase的作用下4℃连接过夜，再将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养过夜，筛选阳性克隆，提取得到含有linkerDNA片段的pCAMBIA2301质粒。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用限制性内切酶NotⅠ和AscⅠ，将Cas9表达框连接至将所述含有linkerDNA片段的pCAMBIA2301质粒的NotⅠ和AscⅠ酶切位点之间，得到含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒的步骤，包括：
按照10×NEB Buffer与含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒、限制性内切酶NotⅠ、限制性内切酶AscⅠ、ddH2O为5:5:1:1:38的体积比配制第二pCAMBIA2301线性化酶切反应体系，利用限制性内切酶NotⅠ和AscⅠ同时对所述含有linkerDNA片段的pCAMBIA2301质粒和Cas9表达框进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化且含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒和线性化Cas9表达框片段；
按照线性化Cas9表达框片段与所述线性化且含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒、T4 DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase为6:20:3:1的体积比配制Cas9表达框片段连接反应体系，将所述线性化且含有linker DNA片段的pCAMBIA2301质粒和所述线性化Cas9表达框片段在T4 DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase的作用下4℃连接过夜，再将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养过夜，筛选阳性克隆，提取得到含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用限制性内切酶NotⅠ和SbfⅠ，将所述含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒连接至所述含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒的NotⅠ和SbfⅠ酶切位点之间，得到BoMYB101基因编辑的表达载体质粒的步骤，包括：
按照10×NEB Buffer与含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒、限制性内切酶NotⅠ、限制性内切酶SbfⅠ、ddH2O为5:5:1:1:38的体积比配制第三pCAMBIA2301线性化酶切反应体系，利用限制性内切酶NotⅠ和SbfⅠ同时对所述含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒和所述含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框质粒进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化且含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒，以及线性化且含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框片段；
按照所述线性化且含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框片段与所述线性化且含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒、T4 DNAligase Buffer、T4 DNAligase为6:20:3:1的体积比配制sgRNA表达框片段连接反应体系，将所述线性化且含有两个靶位点DNA片段的sgRNA表达框片段和所述线性化且含有linker DNA片段和Cas9表达框的pCAMBIA2301质粒在T4 DNA ligase Buffer、T4 DNA ligase的作用下4℃连接过夜，再将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上37℃培养过夜，筛选阳性克隆，提取得到BoMYB101基因编辑的表达载体质粒。
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2022
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Also Published As
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