CN114317381A - 一种t级微生物复合菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种T级微生物复合菌剂及其制备方法与应用，属于高效木质纤维素复合菌剂制备技术领域。本发明提供的T级微生物复合菌剂的制备方法，将有效活菌数为1×10⁷～1×10⁹CFU/mL的具有不同温度特点的微生物培养液等体积混合，按照梯度升温方式培养，使总有效活菌数为1×10⁷～1×10⁹CFU/mL，传代培养，将传代所得的复合菌剂按照堆肥温度进行发酵培养，筛选获得复合菌剂。本发明制备方法制备所得的复合菌剂，具有高效降解木质纤维素作用，确保优势菌株在相应的堆肥温度发挥最大化的活性并产生降解能力，使不同温度下优势菌株产生的效果犹如火箭引燃时的“T”级，不仅避免微生物之间的竞争排斥作用，而且可以快速降解堆肥各时期有机组分。

Description

一种T级微生物复合菌剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于高效木质纤维素复合菌剂制备技术领域，尤其涉及一种T级微生物复合菌剂及其制备方法与应用。

背景技术

随着人口的增长和社会经济的发展，我国人民生活水平不断提高，农业废弃物产量也大幅度增加。若不恰当的处理农业废弃物，不仅造成资源的流失，而且对环境造成很大的影响。好氧发酵是处理农业废弃物资源化利用的主要方式，但由于微生物存在活性较弱以及微生物产酶量较低等问题，严重影响农业废弃物降解及高质资源化利用。

农业废弃物一般包含较高的木质纤维素生物质，主要是由纤维素、木质素及半纤维素连接结构组成。木质素包裹在木质纤维素生物质最外层，这不仅限制了内部纤维素和半纤维素的利用，而且较高分子量的木质纤维素酶分子很难进入纤维素内部进行利用。好氧发酵是木质纤维素组分在微生物的作用下进行分解并形成腐殖酸的过程。微生物在好氧发酵木质纤维素降解过程中扮演重要角色。筛选出具有特殊功能性微生物能打破顽固的木质纤维素结构并对外层木质素解聚，有利于酶分子与底物的结合。但是现有技术并未有关如何利用微生物解决堆肥过程中木质纤维素废弃物难降解以及降解效率低等问题的有关研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种制备T级微生物复合菌剂的方法，具有高效降解木质纤维素的作用，本发明方法能够确保优势菌株在相应的堆肥温度发挥最大化的活性并产生降解能力，不仅避免微生物之间的竞争排斥作用，而且可以快速降解堆肥各时期有机组分。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种高效降解木质纤维素复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：将有效活菌数为1×10⁷～1×10⁹CFU/mL的具有不同温度特点的微生物培养液等体积混合，按照梯度升温方式培养，使总有效活菌数为1×10⁷～1×10⁹CFU/mL，传代培养，将传代所得的复合菌剂按照堆肥温度进行发酵培养，筛选获得复合菌剂。

优选的，所述梯度升温方式培养是20℃-35℃-45℃-50℃-55℃-60℃共培养5-8天。

优选的，所述不同温度特点的微生物包括耐低温微生物、常温微生物、嗜中温微生物和耐高温微生物，所述低温为20℃以下，所述常温为30℃～35℃，所述中温为40℃～50℃，所述高温为55℃以上。

优选的，耐低温特点的微生物包括耐冷杆菌和嗜冷杆菌，常温特点的微生物包括烟曲霉和解淀粉芽孢杆菌，嗜中温特点的微生物包括耐盐芽胞杆菌和产黄青霉，耐高温特点的微生物包括枯草芽孢杆菌和耐盐芽胞杆菌。

优选的，所述传代培养为按照20℃-35℃-45℃-50℃-55℃-60℃梯度升温的方式传代培养10～20代。

优选的，所述筛选包括酶活筛选和降解率筛选。

优选的，所述发酵培养为以水稻秸秆为碳源的发酵培养基进行培养。

优选的，按照堆肥温度进行发酵培养具体为在30℃培养1天，35℃培养1天，40℃培养2天，45℃培养2天，50℃培养2天，55℃培养2天，60℃培养7天，55℃培养5天，50℃培养2天，45℃培养5天，40℃培养5天，35℃培养7天。

本发明还提供了一种按照上述制备方法制备所得的复合菌剂。

本发明还提供了一种上述复合菌剂在农业废弃物降解中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种基于温度优势互补制备T级微生物复合菌剂的方法，采用本发明制备方法制备所得的复合菌剂具有高效降解木质纤维素作用，进行农业废弃物的堆肥降解处理时，可确保堆肥各时期优势菌株各有不同，各时期优势菌株可以在相应的温度发挥最大化的活性并产生降解的能力，进而使不同温度下优势菌株产生的效果犹如火箭引燃时的“T”级，最大化的促进微生物酶的产生，不仅避免微生物之间的竞争排斥作用，而且可以快速降解堆肥各时期有机组分，最终达到木质纤维素废弃物降解及转化的作用。

附图说明

图1为传15代后在LB培养基中各优势复合菌剂终木质纤维素、纤维素酶活的结果，其中横坐标FPase代表滤纸酶活，CMCase代表纤维素酶活，EG代表β-葡萄糖甘酶，Xylanase代表木聚糖酶活，Lac代表漆酶酶活，MnP代表锰过氧化物酶活，LiP代表木质素过氧化物酶活；

图2为四种复合菌以水稻秸秆发酵培养基进行培养对木质纤维素酶活结果，横坐标代码所对应的酶活同图1；

图3为以水稻秸秆发酵培养基培养后纤维素、半纤维素、木质素的含量结果。

具体实施方式

本发明提供了一种高效降解木质纤维素复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：将有效活菌数为1×10⁷～1×10⁹CFU/mL的具有不同温度特点的微生物培养液等体积混合，按照梯度升温方式培养，使总有效活菌数为1×10⁷～1×10⁹CFU/mL，传代培养，将传代所得的复合菌剂按照堆肥温度进行发酵培养，筛选获得复合菌剂。

在本发明中，所述具有不同温度特点的微生物优选的包括耐低温特点、常温特点、嗜中温特点和耐高温特点微生物，所述具有不同温度特点的微生物本身并不存在竞争排斥作用，所述低温优选的为20℃以下，所述常温优选的为30℃～35℃，所述中温优选的为40℃～50℃，所述高温优选的为55℃以上。本发明对于上述具有不同温度特点的具体微生物种类没有特殊限定，采用本领域常规符合上述温度特点的微生物种类均可。在本发明具体实施例中，所述耐低温特点的微生物优选的包括耐冷杆菌(Psychrobactersp.)和嗜冷杆菌(Psychrobacterpulmonisstrain)，更优选的包括耐冷杆菌和嗜冷杆菌；所述常温特点的微生物优选的包括烟曲霉(Aspergillusfumigatus)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，更优选的包括烟曲霉；所述嗜中温特点的微生物优选的包括耐盐芽胞杆菌(Bacillus halotolerans)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)；所述耐高温特点的微生物优选的包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、耐盐芽胞杆菌(Bacillushalotolerans)。

在本发明中，优选的将具有不同温度特点的微生物分别在相应合适温度的LB培养基中培养至使每种功能微生物总有效活菌数为1×10⁷～1×10⁹CFU/mL，再将具有不同温度特点的微生物培养液等体积混合培养。本发明限定初始有效活菌数的目的是确保在培养基中生长的菌株都能够更有效的发挥作用，保证所有初始株的浓度所执行的功能都是一致的。本发明对于LB培养基的具体来源没有特殊限定，可自行按照LB培养基的配方配制，也可选择常规市售产品。

在本发明中，所述梯度升温方式培养优选的是按照20℃-35℃-45℃-50℃-55℃-60℃的梯度升温方式共培养5-8天，所述梯度升温方式更优选的为20℃培养1天，35℃培养1天，45℃培养1天，50℃培养2天，55℃培养天2天，60℃培养1天。待梯度升温方式培养获得的菌液中有效活菌数为1×10⁷～1×10⁹CFU/mL时，进行传代培养。本发明所述传代培养的目的是使目的菌株在各自优势温度下达到稳定化的状态，并使各优势菌株发挥作用，最终获得能够在堆肥中稳定存在且发挥“T”级最佳效果的复合菌剂。在本发明中，所述传代培养优选的为按照20℃-35℃-45℃-50℃-55℃-60℃梯度升温的方式传代培养10～20代，更优选的是按照所述梯度升温方式传代培养15～20代。在本发明传代过程中，优选的在每次传代结束后，均需检测酶活或者按照分子生物学方法筛选出分解能力强的复合菌剂，所述酶活检测优选的包括蛋白酶、纤维素酶、木质素酶、半纤维素酶和过氧化氢酶等检测；所述分子生物学方法指的是DNA提取，用实时定量分析鉴定木质纤维素降解相关基因以及电镜等形态学鉴定方法。

传代培养结束后，将传代所得的复合菌剂按照堆肥温度进行发酵培养，所述发酵培养所用的发酵培养基优选的是以水稻秸秆为碳源，以确保后续农业废弃物堆肥发酵使用时，具有相应的分解能力。本发明对于发酵培养基的其他具体组分和用量没有特殊限定，采用本领域常规发酵培养基均可。在本发明中，所述按照堆肥温度进行发酵培养优选的为在30℃培养1天，35℃培养1天，40℃培养2天，45℃培养2天，50℃培养2天，55℃培养2天，60℃培养7天，55℃培养5天，50℃培养2天，45℃培养5天，40℃培养5天，35℃培养7天。发酵培养结束后，进行筛选，所述筛选优选的为按照酶活筛选和木质纤维素降解率进行筛选。所述酶活优选的包括纤维素内切酶、滤纸酶、β-葡萄糖甘酶、木聚糖酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶等，所述降解率优选的包括纤维素、半纤维素、木质素及有机质降解率。本发明通过测定发酵培养过程中木质纤维素酶活、木质纤维素降解率等多种指标确定最终具有高效降解木质纤维素功能的复合菌剂。

本发明还提供了一种按照上述制备方法制备所得的复合菌剂，以及上述复合菌剂在农业废弃物降解中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将编号分别为Z1、B4、H41、D3的四种嗜中温特点菌，编号分别为D2、D8、A1的三种耐高温特点菌和编号为B4、H61、H41的常温特点菌(其中B4和H41两种菌既有嗜中温特点又有常温特点)分别在18℃、32℃、45℃和58℃条件下在LB培养基中培养48h，使每种菌的有效活菌数为1×10⁷～1×10⁹CFU/mL，然后按照Z1*D3*D2*A1*B4、Z1*D2*H61、Z1*H41*A1*D3、Z1*B4*H41*D3、D3*H41*A1、A1*B4、D2*D3*D8*A1*B4、D2*H61*A1、H61*A1*B4的分组(各组中均按照等体积混合方式)将上述菌接种至LB培养基中，按照20℃培养1天，35℃培养1天，45℃培养1天，50℃培养2天，55℃培养天2天，60℃培养1天的方式培养，使总有效活菌数为1×10⁷～1×10⁹CFU/mL，按照20℃培养1天，35℃培养1天，45℃培养1天，50℃培养2天，55℃培养天2天，60℃培养1天的传代培养方式进行传代培养，每传代一次进行纤维素酶、木质素酶和半纤维素酶酶活检测，结果表明传15代之后，复合菌剂的纤维素酶、木质素酶和半纤维素酶的酶活趋于稳定且酶活性最高。传15代后在LB培养基中各个优势复合菌剂终木质纤维素、纤维素酶活的结果如图1所示。

选择图1中效果较好的四种复合菌剂接种在以水稻秸秆粉为碳源的发酵培养基中进行培养，接种量为秸秆粉干重的10％，培养温度按照典型的堆肥温度变化，30℃培养1天，35℃培养1天，40℃培养2天，45℃培养2天，50℃培养2天，55℃培养2天，60℃培养7天，55℃培养5天，50℃培养2天，45℃培养5天，40℃培养5天，35℃培养7天，分别在45℃，55℃，40℃，35℃对发酵培养基中的液体以及水稻秸秆残渣进行取样，检测木质纤维素酶含量以及发酵培养基培养后纤维素、半纤维素、木质素的含量。结果如图2和图3所示。将最终确定的复合菌剂接种至水稻秸秆中，进行堆肥，接种量为干重的3％的菌丝体，以未接种处理作为对照组，结果显示：本发明方法能在短时间内能快速降解木质纤维素，产生较高的胞外酶的活性，制备的复合菌剂中木质纤维素降解率明显比单菌提升24％，纤维素酶活提升20％，半纤维素酶活提升25％，木质素酶活提升15％。

实施例2

与实施例1不同的之处在于在实施例1各组复合菌种的基础上添加了嗜冷杆菌作为耐冷功能性菌株，其它步骤均同实施例1。

结果表明本发明方法能在短时间内能快速降解木质纤维素，制备的复合菌剂木质纤维素降解率明显比单菌提升20％，纤维素酶活提升25％，半纤维素酶活提升20％，木质素酶活提升20％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种T级微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将有效活菌数为1×10⁷～1×10⁹CFU/mL的具有不同温度特点的微生物培养液等体积混合，按照梯度升温方式培养，使总有效活菌数为1×10⁷～1×10⁹CFU/mL，传代培养，将传代所得的复合菌剂按照堆肥温度进行发酵培养，筛选获得复合菌剂。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述梯度升温方式培养是20℃-35℃-45℃-50℃-55℃-60℃共培养5-8天。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述不同温度特点的微生物包括耐低温微生物、常温微生物、嗜中温微生物和耐高温微生物，所述低温为20℃以下，所述常温为30℃～35℃，所述中温为40℃～50℃，所述高温为55℃以上。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，耐低温微生物包括耐冷杆菌和嗜冷杆菌，常温微生物包括烟曲霉和解淀粉芽孢杆菌，嗜中温微生物包括耐盐芽胞杆菌和产黄青霉，耐高温微生物包括枯草芽孢杆菌和耐盐芽胞杆菌。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述传代培养为按照20℃-35℃-45℃-50℃-55℃-60℃梯度升温的方式传代培养10～20代。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述筛选包括酶活筛选和降解率筛选。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养为以水稻秸秆为碳源的发酵培养基进行培养。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，按照堆肥温度进行发酵培养具体为在30℃培养1天，35℃培养1天，40℃培养2天，45℃培养2天，50℃培养2天，55℃培养2天，60℃培养7天，55℃培养5天，50℃培养2天，45℃培养5天，40℃培养5天，35℃培养7天。

9.权利要求1-8任意一项制备方法制备所得的复合菌剂。

10.权利要求9所述复合菌剂在农业废弃物降解中的应用。

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