CN114316624B - 一种对梯棱羊肚菌黑色素进行氨基酸修饰的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种对梯棱羊肚菌黑色素进行氨基酸修饰的方法。本发明对梯棱羊肚菌黑色素进行氨基酸修饰制备水溶性梯棱羊肚菌氨基酸‑黑色素的方法，包括如下步骤：梯棱羊肚菌黑色素和氨基酸在水中反应，反应完毕后分离得到所述水溶性梯棱羊肚菌氨基酸‑黑色素。本发明通过对梯棱羊肚菌黑色素进行氨基酸修饰制备氨基酸‑黑色素，以提高梯棱羊肚菌黑色素在水中的溶解度；通过氨基酸修饰后的黑色素进行结构和理化性质的测定，为梯棱羊肚菌黑色素的进一步精深加工提供参考和理论依据。

Description

一种对梯棱羊肚菌黑色素进行氨基酸修饰的方法

技术领域

本发明涉及一种对黑色素进行氨基酸修饰的方法，尤其涉及一种对梯棱羊肚菌黑色素进行氨基酸修饰的方法，属于食用菌深加工技术领域。

背景技术

羊肚菌俗称羊雀菌、蜂窝磨或羊肚，隶属子囊菌亚门(Ascomycotina)、盘菌纲(Discomycetes)、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellacea)、羊肚菌属(Morchella)。羊肚菌按照子实体颜色大致分为3个支系，分别为变红羊肚菌、黄羊肚菌、黑羊肚菌。梯棱羊肚菌(Morchella importuna)属于黑羊肚菌支系中的一种。梯棱羊肚菌(Morchellaimportuna)富含多种人体所需要的氨基酸、多糖、黑色素、皂苷类、酮、醛、酯等活性物质，其营养价值丰富，有明显的抗癌、补脑、增强人体免疫力的作用，且是我国人工栽培的主要品系。

黑色素是一种常见的生物色素，是吲哚类和酚类聚合而成的生物大分子，易与蛋白质、油脂和多糖类结合，不溶于水、酸性溶液及大多数有机溶剂。天然黑色素来源广泛，动物、植物以及微生物中均有黑色素的相关研究报道。黑色素具有抗肿瘤、抗辐射、提高免疫力等生理活性，因此黑色素在医药、化妆品、生物材料等方面的应用价值不言而喻。黑色素本身结构复杂，仅溶解于碱性溶液，不溶解于水。这在很大程度上限制了黑色素在食品、工业、农业、医学中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种对梯棱羊肚菌黑色素进行氨基酸修饰的方法，该方法通过对梯棱羊肚菌黑色素进行氨基酸修饰制备氨基酸-黑色素，以提高梯棱羊肚菌黑色素在水中的溶解度。

本发明提供的一种对梯棱羊肚菌黑色素进行氨基酸修饰制备水溶性梯棱羊肚菌氨基酸-黑色素的方法，包括如下步骤：使梯棱羊肚菌黑色素和氨基酸在水中反应，反应完毕后分离得到水溶性梯棱羊肚菌氨基酸-黑色素。

上述的制备方法中，所述氨基酸优选为赖氨酸。

上述的制备方法中，所述梯棱羊肚菌黑色素和所述氨基酸的质量比可为1： (1～3)，优选为1：2。

上述的制备方法中，所述反应的温度可为50～70℃，优选60℃，时间可为 50～70min，优选60min。

上述的制备方法中，所述分离的步骤如下：对所述反应完毕后的体系进行离心，收集上清液；将所述上清液置于截留分子量大于128Da的透析袋中进行透析，收集截留液液，冷冻干燥，得到所述梯棱羊肚菌黑色素。

进一步地，所述离心的转速具体可为12000r/min，离心的时间具体可为2min；

所述透析袋的截留分子量具体可为200Da。

所述透析的温度具体可为室温，时间具体可为48h。本发明所述室温可为15～40℃，如25℃。

本发明中，所述梯棱羊肚菌黑色素通过如下步骤制备得到：

(1)将梯棱羊肚菌子实体粉碎后溶于水中，加入纤维素酶进行酶解；

(2)对步骤(1)酶解后的体系进行超声处理；

(3)在步骤(2)超声处理后的体系中加入碱进行碱提，碱提结束后离心，收集上清液，得到黑色素提取液；在所述黑色素提取液中加入酸进行酸沉，将收集的沉淀清洗后干燥，得到梯棱羊肚菌黑色素粗品；

(4)将步骤(3)得到的梯棱羊肚菌黑色素粗品溶于水中，加入蛋白酶进行水解以去除蛋白质，然后去除油脂；在去除蛋白和油脂的体系中加入酸进行酸沉，将收集的沉淀清洗后干燥，得到所述梯棱羊肚菌黑色素。

本发明进一步提供了上述任一项所述的方法制备得到的水溶性梯棱羊肚菌氨基酸-黑色素。

本发明具有如下有益效果：

本发明通过对梯棱羊肚菌黑色素进行氨基酸修饰，确定了最适宜修饰梯棱羊肚菌黑色素的氨基酸修饰种类及最适浓度；通过氨基酸修饰后的黑色素进行紫外-可见光谱扫描，对氨基酸黑色素进行初步鉴定；通过扫描电子显微镜观察其结构特征，并对其进行色价、水溶性、溶解度、稳定性的测定，为梯棱羊肚菌黑色素的进一步精深加工提供参考和理论依据。

附图说明

图1为本发明实施例1中氨基酸种类对梯棱羊肚菌黑色素修饰的吸光度的影响的柱形图，不同小写英文字母表示差异显著(P<0.05)。

图2为本发明实施例2中黑色素与赖氨酸的质量比对梯棱羊肚菌黑色素溶液吸光值的影响的柱形图，不同小写英文字母表示差异显著(P<0.05)。

图3为本发明实施例3中修饰温度对梯棱羊肚菌黑色素溶液吸光值的影响曲线。

图4为本发明实施例4中修饰时间对梯棱羊肚菌黑色素溶液吸光值的影响曲线。

图5为本发明实施例5中梯棱羊肚菌黑色素的紫外-可见光谱图。

图6为本发明实施例5中赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素的紫外-可见光谱图。

图7为本发明实施例5中梯棱羊肚菌黑色素的不同放大倍数下的扫描电子显微镜图片(A×3000，B×4000)。

图8为本发明实施例5中赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素的不同放大倍数下的扫描电子显微镜图片(A×3000，B×4000)。

图9为本发明实施例5中pH对梯棱羊肚菌黑色素稳定性影响的曲线图。

图10为本发明实施例5中pH对赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素稳定性影响的曲线图。

图11为本发明实施例5中不同浓度的氯化钠溶液对梯棱羊肚菌黑色素稳定性影响的曲线图。

图12为本发明实施例5中不同浓度的蔗糖溶液对梯棱羊肚菌黑色素稳定性影响的曲线图。

图13为本发明实施例5中氯化钠浓度对赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素稳定性影响的曲线图，不同小写英文字母表示差异显著(P<0.05)。

图14为本发明实施例5中蔗糖浓度对赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响的曲线图，不同小写英文字母表示差异显著(P<0.05)。

图15为本发明实施例5中金属离子对梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响的曲线图，不同小写英文字母表示差异显著(P<0.05)。

图16为本发明实施例5中金属离子对赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响的曲线图，不同小写英文字母表示差异显著(P<0.05)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性的前提下获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另作定义，本公开所使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

本发明至少一实施例提供一种对梯棱羊肚菌黑色素进行氨基酸修饰制备水溶性梯棱羊肚菌氨基酸-黑色素的方法，包括如下步骤：使梯棱羊肚菌黑色素和氨基酸在水中反应，反应完毕后分离得到水溶性梯棱羊肚菌氨基酸-黑色素

通过对梯棱羊肚菌黑色素进行氨基酸修饰，确定了最适宜修饰梯棱羊肚菌黑色素的氨基酸修饰种类及最适浓度。赖氨酸修饰的黑色素水溶性达到1016g/L，色价为1771.183。通过对梯棱羊肚菌黑色素进行氨基酸修饰，可提高梯棱羊肚菌黑色素在水中的溶解度，获得水溶性梯棱羊肚菌氨基酸-黑色素。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、梯棱羊肚菌黑色素氨基酸修饰种类的确定

一、提取梯棱羊肚菌黑色素

按照如下步骤提取梯棱羊肚菌黑色素：

(1)准确称取5.00g梯棱羊肚菌子实体粉末溶于20mL蒸馏水中，加入纤维素酶进行酶解，纤维素酶添加量为20mg/g，纤维素酶酶解温度为40℃，酶解时间为78.6 min；

(2)酶解结束后，对酶解后的体系进行超声处理，超声功率为200W，时间为80 min；

(3)超声结束后，在超声后的体系加入NaOH溶液配制成150mL浓度为1.54mol/L 的NaOH溶液(料液比为1g：30mL)，60℃水浴2h进行碱提。碱提结束后，在10000 r/min离心5min，收集上清液，得到黑色素提取液，将提取液用7mol/L HCl调节pH 至1～2，80℃水浴10h，10000r/min离心3min，将沉淀用蒸馏水反复清洗至中性，烘干即为黑色素粗品。

(4)将黑色素粗品溶于20mL蒸馏水中，加入碱性蛋白酶，添加量为400000u/g，用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液调节溶液pH至10.5，于反应温度45℃下反应1h，去除杂蛋白。继续用0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L NaOH溶液调节pH至 14。使用乙酸乙酯去除油脂。用7mol/L HCl调节pH至1～2，80℃水浴2h，将沉淀水洗至中性并烘干，得到梯棱羊肚菌黑色素纯品。

二、氨基酸修饰

准确称取0.010g精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸、组氨酸分别溶解于2mL蒸馏水中，配制成5g/L的溶液。其中一份不加入氨基酸作为空白对照组。每个试验分别加入0.020g黑色素样品，40℃震荡40min，反应结束后冷却至室温，12000r/min离心2min。上清液于波长500nm处测定吸光度值。根据吸光度值判断氨基酸-黑色素的溶解度。吸光度值越大，说明溶解度越大，氨基酸修饰效果越好。室温(25℃)下，将获得的上清液置于截留分子量为200Da的透析袋中于蒸馏水中透析48h，收集截留液(袋子内部溶液)，冷冻干燥后获得氨基酸-黑色素。

实验结果见图1。由图1可知，七种氨基酸-黑色素吸光度值相差较大。精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、组氨酸修饰后的黑色素吸光度值有不同程度的提高。赖氨酸-黑色素的吸光度值最大(2.7767±0.02)，其次是精氨酸-黑色素、组氨酸-黑色素、天冬氨酸-黑色素。而甘氨酸、色氨酸和苏氨酸修饰后的黑色素吸光度值几乎趋于0，说明甘氨酸、色氨酸和苏氨酸对黑色素几乎没有修饰作用。由于赖氨酸-黑色素的吸光度值最大，因此赖氨酸为梯棱羊肚菌黑色素的最佳修饰氨基酸。

实施例2、氨基酸的最适修饰浓度的确定

根据实施例1结果，选择最适氨基酸进行黑色素修饰，并测定氨基酸的最适修饰浓度，具体步骤如下：

准确称取0.010g黑色素样品于1mL蒸馏水中。按黑色素与氨基酸质量比为1:1、 1:1.25、1:1.5、1:1.75、1:2、1:2.25、1:2.5、1:2.75、1:3分别加入0.0100g、0.0125g、0.0150g、0.0175g、0.0200g、0.0225g、0.0250g、0.0275g、0.0300g最适氨基酸。 37℃震荡40min，溶解完全后12000r/min离心2min。取上清液适当稀释，在波长500 nm处测定吸光度值。根据最大吸光度值确定氨基酸修饰的最适浓度。

实验结果见图2。由2可知，黑色素与赖氨酸质量比为1:2时，赖氨酸-黑色素溶液的吸光度值最大(6.0217±0.070)，说明此时黑色素的溶解度最大。当黑色素与赖氨酸质量比为1:1～1:1.75时，溶液的吸光度值呈逐渐增大的趋势，说明赖氨酸修饰黑色素的溶解度在逐渐增加。当黑色素与赖氨酸的质量比为1:2.25～1:3时，溶液的吸光度值在逐渐减小，说明赖氨酸-黑色素的溶解度在减小，修饰效果反而下降。

实施例3、最适修饰温度的确定

根据实施例1结果，在不同温度下选择赖氨酸进行黑色素修饰，并测定最适修饰温度，具体步骤如下：

准确称取0.010g黑色素样品于1mL蒸馏水中。按黑色素与氨基酸质量比为1:2 加入0.0200g赖氨酸，分别于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下震荡40min，溶解完全后12000r/min离心2min。取上清液适当稀释，在波长500nm处测定吸光度值。根据最大吸光度值确定赖氨酸修饰的最适温度。

实验结果见图3。由3可知，当修饰温度为60℃时，赖氨酸-黑色素溶液的吸光度值最大(2.812±0.082)，说明此时黑色素的溶解度最大。当修饰温度为30℃～50℃时，溶液的吸光度值呈逐渐增大的趋势，说明赖氨酸修饰黑色素的溶解度在逐渐增加。当修饰温度为60℃～70℃时，溶液的吸光度值在逐渐减小，说明赖氨酸-黑色素的溶解度在减小，修饰效果反而下降。

实施例4、最适修饰时间的确定

根据实施例1结果，选择赖氨酸对黑色素进行不同时长的修饰，并测定最适修饰时间，具体步骤如下：

准确称取0.010g黑色素样品于1mL蒸馏水中。按黑色素与氨基酸质量比为1:2 加入0.0200g赖氨酸，于60℃分别震荡30、40、50、60和70min，溶解完全后12000 r/min离心2min。取上清液适当稀释，在波长500nm处测定吸光度值。根据最大吸光度值确定氨基酸修饰的最适时间。

实验结果见图4。由4可知，当修饰时间为60min时，赖氨酸-黑色素溶液的吸光度值最大(1.582±0.114)，说明此时黑色素的溶解度最大。当修饰时间为30～50min 时，溶液的吸光度值呈逐渐增大的趋势，说明赖氨酸修饰黑色素的溶解度在逐渐增加。当修饰时间为60～70min时，溶液的吸光度值在逐渐减小，说明赖氨酸-黑色素的溶解度在减小，修饰效果反而下降。

实施例5、梯棱羊肚菌黑色素修饰前后的表征和理化性质

一、紫外-可见光谱扫描

取少量的实施例1制备得到的黑色素样品溶解于1.5mol/L NaOH溶液中。40℃水浴1h，12000r/min离心2min。以1.5mol/L NaOH溶液为背景基线，采用全波段紫外分光光度计对上清液在200～900nm范围内进行扫描，根据结果，确定梯棱羊肚菌黑色素的最大吸收波长。紫外可见光谱图如5所示。梯棱羊肚菌黑色素在230nm处有最大吸收峰。在260nm、280nm处没有明显的吸收峰，表明黑色素中核酸、蛋白质、脂肪含量较少。

取实施例2中最优条件下制备得到的赖氨酸-黑色素样品溶解于pH为8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中。40℃水浴1h，12000r/min离心2min。以pH值为8.0的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液为背景基线，采用全波段紫外分光光度计对上清液在200～900 nm范围内进行扫描。根据结果，确定梯棱羊肚菌氨基酸-黑色素的最大吸收波长。由图6可知，赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素的最大吸收波长为219nm，与梯棱羊肚菌黑色素的最大吸收波长相差11nm。

二、扫描电子显微镜扫描

分别取少量黑色素样品和赖氨酸-黑色素样品固定于导体胶上，放置于喷金台上进行真空喷金镀膜90s，并使用扫描电子显微镜进行扫描观察。

梯棱羊肚菌黑色素的扫描电子显微镜图片见图7。由图7可知，图A、B是较纯的黑色素晶体结构，可以明显看出，其为表面光滑，结构清晰的晶体结构。

赖氨酸-黑色素的扫描电子显微镜图片见图8。由图8可知，A、B是赖氨酸-黑色素的扫描电子显微镜图片。在不同放大倍数下，样品呈块状、表面不规则的结晶体结构，且相互粘连。赖氨酸-黑色素外层有物质包裹，可能是由于赖氨酸-黑色素样品更容易吸潮而出现的颗粒粘连。与梯棱羊肚菌黑色素相比，赖氨酸-黑色素样品颗粒结构更为明显，也更容易因吸潮而出现颗粒粘连的现象。

三、色价的测定

准确称取0.010g黑色素样品溶解于5mL pH为8.0的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液中，混合均匀，40℃水浴1h，12000r/min离心2min。上清液稀释4倍，在黑色素最大吸收波长处测定吸光度值。

色价的计算见公式(1)。

(1)式中：A为吸光度值；r为测定吸光度值时所吸取样品的稀释倍数；m为样品质量(g)。

色价是天然色素的主要质量指标之一，能从一定程度上反应色素含量的高低。根据公式(1)得出，梯棱羊肚菌黑色素的色价E1％1cm为480.24。赖氨酸-黑色素色价为1771.183，明显高于梯棱羊肚菌黑色素色价值(480.24)，提高了78.89％。

四、赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素水溶性、溶解性的测定

(1)修饰前

称取一定量的黑色素样品于2mL的蒸馏水中，30℃震荡1h。每隔20min上下颠倒一次，1h后仍有沉淀。12000r/min离心5min，上清液冷冻干燥，所得粉末进行称重并记录，计算溶解度。在30℃的水浴条件下，梯棱羊肚菌黑色素几乎不溶解于水。

准确称取0.002g黑色素样品分别于20mL 1mol/L NaOH溶液、20mL1 mol/L HCl、20mL蒸馏水、20mL无水乙醇、20mL75％乙醇、20mL正丁醇和20mL氯仿中，30℃震荡水浴1h，1200r/min离心2min，观察各组颜色变化及沉淀情况。由表1可知，黑色素只能溶解于碱性溶液，微溶于无水乙醇和75％乙醇，不溶于蒸馏水、 HCl、冰乙酸等酸性溶液和正丁醇、氯仿、异丙醇等有机溶剂。

表1、梯棱羊肚菌黑色素的溶解性

注：+表示微溶，++表示溶解，-表示不溶

(2)修饰后

称取一定量的氨基酸-黑色素样品于2mL的蒸馏水中，30℃震荡1h，每隔20min 上下颠倒一次，1h后仍有沉淀。12000r/min离心5min。上清液冷冻干燥，所得粉末进行称重并记录。溶解性的计算见公式(2)。

根据公式(2)得出，赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素的水溶性为1016g/L。而在该条件下，梯棱羊肚菌黑色素几乎不溶于水。该水溶性试验说明，梯棱羊肚菌黑色素经赖氨酸修饰，其水溶性显著增加。

由表2可知，赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素在不同溶剂中的溶解性是不同的。试验表明赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素可溶解于碱性溶液和蒸馏水，微溶于无水乙醇和75％乙醇，不溶于HCl、冰乙酸等酸性溶液和正丁醇、氯仿、异丙醇等有机溶剂。在无水乙醇、75％的乙醇溶液中的溶解性均有提升。

表2、赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素的溶解性

注：+表示微溶，++表示溶解，-表示不溶

五、稳定性

1、修饰前后温度对稳定性的影响

(1)修饰前

准确称取0.010g黑色素样品于100mL 0.2mol/L pH为8.0的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液中，于20、40、60、80、100℃进行反应。以pH为8.0的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液为空白对照，每隔20min在黑色素最大吸收波长处测定吸光度值。

由表3可知，梯棱羊肚菌黑色素溶液的吸光度值在不同温度(20～100℃)下差异很小，均保持在0.4～0.6之间。表明梯棱羊肚菌黑色素有良好的热稳定性。耐热能力强，高温条件下保存能力好。

表3、温度对梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响

(2)修饰后

准确称取0.001g赖氨酸-黑色素样品于10mL 0.2mol/L pH为8.0的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液中，于20、40、60、80、100℃进行反应。以pH为8.0的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液为空白对照，每隔20min在赖氨酸-黑色素最大吸收波长处测定吸光度值。

由表4可知，赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素溶液的吸光度值在不同温度(20～100℃)下差异很小，随着反应时间的延长，其吸光度值均保持在1.1～1.3之间。表明赖氨酸- 梯棱羊肚菌黑色素具有良好的热稳定性，耐热能力强，高温条件下保存能力较好。与梯棱羊肚菌黑色素趋势大致相同，赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素同样具有良好的热稳定性。

表4、温度对赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响

2、修饰前后光照对稳定性的影响

(1)修饰前

准确称取0.010g黑色素样品于100mL 0.2mol/L pH为8.0的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液中。分别置于自然光、避光和紫外光环境下反应0h、24h、48h、72h。以pH为 8.0的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液为空白对照，每隔24h在黑色素最大吸收波长处测定吸光度值。

由表5可知，梯棱羊肚菌黑色素溶液在自然光和避光条件下的吸光值均在 0.64～0.68的范围内波动，趋势稳定。在紫外光照射下，随着时间的延长，黑色素吸光度值逐渐降低，说明紫外光对梯棱羊肚菌黑色素的稳定性有一定的影响。表明在自然光和避光环境下，羊肚菌黑色素损失较小，成分稳定。黑色素在紫外光下稳定性较差，不适合长期紫外条件保存。

表5光照对梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响

(2)修饰后

准确称取0.010g赖氨酸-黑色素样品于100mL 0.2mol/L pH为8.0的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液中。分别置于自然光、避光和紫外光环境下反应0h、24h、48h、72h。以pH为8.0的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲溶液为空白对照，每隔24h在赖氨酸-黑色素最大吸收波长处测定吸光度值。

由表6可知，赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素溶液在自然光和避光环境下的吸光度值均在1.2～1.5的范围内波动，趋势较稳定。但是经紫外光的长时间辐射，赖氨酸-黑色素溶液的吸光度值呈下降趋势，表明紫外线对赖氨酸-黑色素的稳定性有很大的影响。试验表明，赖氨酸-黑色素对自然光和黑暗条件都比较稳定，色素损失较小。而在紫外光条件下稳定性较差。赖氨酸-黑色素与黑色素的光稳定性相一致。

表6光照对赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响

3、修饰前后pH值对稳定性的影响

(1)修饰前

准确称取0.010g黑色素样品分别溶于100mL pH为3.0、5.0、7.0、8.0、9.0、1.0 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液中。室温静置2h。以相应的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液为空白对照，在黑色素最大吸收波长处测定吸光度值。

由图9可知，pH对黑色素的稳定性影响较大。随着梯棱羊肚菌黑色素溶液pH值的增大，其溶液吸光度值呈上升趋势。在酸性环境中，即pH值在2.0～7.0的范围内，色素保存率较低。在pH值为2.0、3.0和5.0时，黑色素几乎不溶解。当溶液的pH大于8时，溶液的吸光度值快速升高，溶液颜色逐渐加深，黑色素的溶解度逐渐增大。试验表明，梯棱羊肚菌黑色素在酸性条件下不稳定，在碱性条件下溶解度较大，较稳定。

(2)修饰后

准确称取0.010g赖氨酸-黑色素样品分别溶于100mL pH为3.0、5.0、7.0、8.0、9.0、1.0的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液中。室温静置2h。以相应的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液为空白对照，在赖氨酸-黑色素最大吸收波长处测定吸光度值。

由图10可知，pH对赖氨酸-黑色素的稳定性影响较大。随着赖氨酸-羊肚菌黑色素溶液pH值的增大，其溶液吸光度值呈上升趋势。在酸性条件下，即pH值在2.0～7.0 的范围内，赖氨酸-黑色素保存率较低且差别不大。当溶液的pH大于8时，溶液的吸光度值快速升高，溶液颜色逐渐加深，说明赖氨酸-黑色素的溶解度显著增大。试验表明，赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素在酸性条件下不稳定，在碱性条件下溶解度较大，较稳定。赖氨酸-黑色素的酸碱特性与黑色素的酸碱特性相一致。

4、修饰前后氯化钠和蔗糖对稳定性的影响

(1)修饰前

配制pH为8.0，1g/L黑色素溶液，取10mL黑色素溶液于100mL容量瓶中，分别用浓度为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％的氯化钠溶液(g/mL)定容，充分混合。分别于室温静置24h、48h、72h。以相应的氯化钠溶液为空白对照，每隔24h在黑色素最大吸收波长处测定吸光度值。

取10mL黑色素溶液于100mL容量瓶中，分别用浓度为2％、4％、6％、8％、 10％、12％、14％的蔗糖溶液(g/ml)定容，充分混合。分别于室温静置24h、48h、 72h。以相应的蔗糖溶液为空白对照，每隔24h在黑色素最大吸收波长处测定吸光度值。

不同浓度的氯化钠溶液对梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响结果见图11。由图11可知，在氯化钠溶液浓度为0.2％～0.8％(g/mL)的范围内时，室温静置24h、48h 及36h后，溶液的吸光度值均保持在0.6～0.8的范围内，波动较小。表明梯棱羊肚菌黑色素在一定的氯化钠溶液浓度范围内有良好的稳定性。

不同浓度的蔗糖溶液对梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响结果见图12。由图12可知，在蔗糖溶液浓度为2％～12％(g/mL)的范围内时，室温静置24h、48h及36h 后，溶液的吸光度值均保持在0.5～0.7的范围内，波动较小。表明梯棱羊肚菌黑色素在一定的蔗糖溶液浓度范围内有良好的稳定性。

(2)修饰后

配制pH为8.0，1g/L赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素溶液，取10mL赖氨酸-黑色素溶液于100mL容量瓶中，分别用浓度为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％的氯化钠溶液(g/mL) 定容，充分混匀。分别于室温静置24h、48h、72h。以相应的氯化钠溶液为空白对照，每隔24h在赖氨酸-黑色素最大吸收波长处测定吸光度值。

取10mL赖氨酸-黑色素溶液于100mL容量瓶中，分别用浓度为2％、4％、6％、 8％、10％、12％、14％的蔗糖溶液(g/ml)定容，充分混匀。分别于室温静置24h、48h、72h。以相应的蔗糖溶液为空白对照，每隔24h在赖氨酸-黑色素最大吸收波长处测定吸光度值。

不同浓度的氯化钠溶液对赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素溶液稳定性的影响结果见图13。由图13可知，在氯化钠溶液浓度为0.2％～0.8％(g/mL)的范围内时，室温静置 24h、48h及36h后，溶液的吸光度值均保持在1.1～1.2的范围内，波动较小。表明赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素在一定的氯化钠溶液浓度范围内有良好的稳定性。与梯棱羊肚菌黑色素趋势大致相同。

不同浓度的蔗糖溶液对赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响结果见图14。由图 14可知，在蔗糖溶液浓度为2％～12％(g/mL)的范围内时，室温静置24h、48h及 36h后，溶液的吸光度值均保持在2.1～2.2的范围内，波动较小。表明赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素在一定的蔗糖溶液浓度范围内有良好的稳定性。与梯棱羊肚菌黑色素趋势大致相同。

5、修饰前后金属离子对稳定性的影响

(1)修饰前

配制pH为8.0，1g/L黑色素溶液，取10mL黑色素溶液于100mL容量瓶中，分别用浓度为0.01％的金属离子Fe³⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺和Zn²⁺的溶液(g/mL)定容，充分混合。每隔两个小时，即在混合均匀后2h和4h时，以相应的金属离子溶液为空白对照，在黑色素最大吸收波长处测定吸光度值。

金属离子对梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响结果见图15。由图15可知，向梯棱羊肚菌黑色素溶液中添加金属离子Fe³⁺后，与其他金属离子黑色素溶液相比，其吸光度值明显增高。且随着时间的延长，添加了Fe³⁺的色素溶液的吸光度值也有所增加。这可能是由于，Fe³⁺可能与梯棱羊肚菌你黑色素中的某个基团发生结合，增强了黑色素的结构，且有显著的增色效果。添加了Fe²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺和Zn²⁺的黑色素溶液，与对照组样品相比，吸光度值均没有明显的变化，说明Fe²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺和Zn²⁺对黑色素的稳定性没有显著影响。

(2)修饰后

配制pH为8.0，1g/L赖氨酸-黑色素溶液，取10mL赖氨酸-黑色素溶液于100mL 容量瓶中，分别用浓度为0.01％的金属离子Fe³⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺和Zn²⁺的溶液(g/mL)定容，充分混合。每隔两个小时，即在混合均匀后2h和4h时，以相应的金属离子溶液为空白对照，在赖氨酸-黑色素最大吸收波长处测定吸光度值。

金属离子对赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素稳定性的影响结果见图16。由图16可知，向赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素溶液中添加金属离子Fe³⁺后，与其他金属离子黑色素溶液相比，其吸光度值明显增高。且随着时间的延长，添加了Fe³⁺的色素溶液的吸光度值也有所增加。这可能是由于，Fe³⁺可能与赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素中的某个基团发生结合，增强了赖氨酸-黑色素的结构，且有显著的增色效果。添加了Fe²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、 Mg²⁺和Zn²⁺的黑色素溶液，与对照组样品相比，吸光度值均没有明显的变化，说明Fe²⁺、 Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺和Zn²⁺对赖氨酸-黑色素的稳定性没有显著影响。

本发明通过对梯棱羊肚菌黑色素进行氨基酸修饰，赖氨酸修饰效果最好，赖氨酸-黑色素色价达到1771.183，水溶性为1016g/L，在无水乙醇、75％的乙醇溶液中的溶解性均有提升；赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素有较好的热稳定性、光稳定性和碱性稳定性，在氯化钠溶液和蔗糖溶液中也有较好的稳定性，但不宜长时间置于紫外辐射下。金属离子Fe³⁺对赖氨酸-梯棱羊肚菌黑色素具有一定的增色作用，其他金属离子Fe²⁺、Cu²⁺、 Ca²⁺、Mg²⁺和Zn²⁺对赖氨酸-黑色素的稳定性没有显著影响。

Claims (5)

1.一种对梯棱羊肚菌黑色素进行氨基酸修饰制备水溶性梯棱羊肚菌氨基酸-黑色素的方法，包括如下步骤：使梯棱羊肚菌黑色素和氨基酸在水中反应，反应完毕后分离得到水溶性梯棱羊肚菌氨基酸-黑色素；

所述梯棱羊肚菌黑色素通过如下步骤制备得到：

（1）将梯棱羊肚菌子实体粉碎后溶于水中，加入纤维素酶进行酶解；

（2）对步骤（1）酶解后的体系进行超声处理；

（3）在步骤（2）超声处理后的体系中加入碱进行碱提，碱提结束后离心，收集上清液，得到黑色素提取液；在所述黑色素提取液中加入酸进行酸沉，将收集的沉淀清洗后干燥，得到梯棱羊肚菌黑色素粗品；

（4）将步骤（3）得到的梯棱羊肚菌黑色素粗品溶于水中，加入蛋白酶进行水解以去除蛋白质，然后去除油脂；在去除蛋白和油脂的体系中加入酸进行酸沉，将收集的沉淀清洗后干燥，得到所述梯棱羊肚菌黑色素；

所述氨基酸为赖氨酸；

所述梯棱羊肚菌黑色素和所述氨基酸的质量比为1：（1~3）；

所述分离的步骤如下：对所述反应完毕后的体系进行离心，收集上清液；将所述上清液置于截留分子量大于128 Da的透析袋中进行透析，收集截留液，冷冻干燥，得到所述梯棱羊肚菌黑色素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述梯棱羊肚菌黑色素和所述氨基酸的质量比为1：2。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于：所述反应的温度为50~70℃，时间为50~70min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述离心的转速为12000r/min，时间为2min。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于：所述透析的温度为室温，时间为48h。

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