CN114316022A - 结合pd-1抗体的肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结合抗PD‑1抗体或其抗原结合片段的肽，其包含结构单元1和2，其中结构单元1包含PD‑1蛋白的58位‑85位的氨基酸，结构单元2包含PD‑1蛋白的130‑132位的氨基酸。

Description

结合PD-1抗体的肽及其应用
技术领域
本发明属于免疫学领域。具体涉及结合PD-1抗体的肽及其应用。
背景技术
细胞表面聚糖在癌症中起着重要作用，例如细胞信号和通讯，肿瘤细胞的解离和侵袭，细胞与基质的相互作用，肿瘤血管生成，免疫调节和转移形成以及免疫监测(VarkiA.(2017).Glycobiology，27，3-49.)。糖基化有助于肿瘤细胞逃脱免疫监视(Okada M.etal.(2017).Cell Rep.，20，1017-1028.)(Liu CY.et al.(2011).Proc.Natl.Acad.Sci.USA，108，11332-11337.)(Potapenko O.I.et al.(2010).Mol.Oncol.，4，98-118.)。
PD-1的细胞外免疫球蛋白可变(IgV)域中有四个报道的糖基化位点，分别是N49，N58，N74和N116(Chen D.et al.(2019).iScience，14，113-124.)(Na Z.et al.(2017).Cell Res.，27，147-150.)(Okada M.et al.(2017).Cell Rep.，20，1017-1028)。据报道，在哺乳动物(Tan SH.et al.(2017).Nat Commun.，8，14369)细胞的PD-1的N58氨基酸残基位于PD-1的BC环上，其糖基化程度很高，多数情况下其核心部分的聚糖是由两个N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNac，NAG)和一个岩藻糖(Fucose，FUC)组成。岩藻糖糖基化与癌症有关(Pinho，2015)，肿瘤中耗竭T细胞往往为高度核心岩藻糖基化的(Okada M.et al.(2017).Cell Rep.，20，1017-1028)。在一些癌症，例如肺癌和乳腺癌中，观察到核心岩藻糖基化(FUT8)的过表达(Liu CY.et al.(2011).Proc.Natl.Acad.Sci.USA，108，11332-11337)(Potapenko O.I.et a1.(2010).Mol.Oncol.，4，98-118)。核心岩藻糖基化的丧失可降低细胞表面PD-1的表达，进而增强T细胞活化(Okada M.et al.(2017).Cell Rep.，20，1017-1028)。
PD-1表面的糖基可能会与抗PD-1抗体相互作用，增强的两者的结合活性，进而表现为更好的临床结果(Fessas H.et al.(2017).Semin.Oncol.，44，136-140)。
发明内容
本发明人发现，PD-1蛋白(PD-1Genbank ID：NP_005009，SEQ ID NO：1)的T59、E61、S62、E84、D85位氨基酸与抗PD-1抗体例如14C12H1L1-Fab重链的Y32、D33、S52、G54、Y57、Y100位氨基酸，PD-1蛋白的P130、K131、A132位氨基酸与抗PD-1抗体例如14C12H1L1-Fab轻链的F325、E324、D323位氨基酸发生相互作用。由此完成了本发明。
具体地，本发明涉及以下几个方面：
1.肽，优选结合抗PD-1抗体或其抗原结合片段，所述肽包含结构单元1和结构单元2，其中结构单元1包含选自以下各项组成的组的PD-1蛋白片段：PD-1蛋白的28位-86位的氨基酸(如SEQ ID NO：10所示)，28位-85位的氨基酸(如SEQ ID NO：11所示)，29位-86位的氨基酸(如SEQ ID NO：12所示)，29位-85位的氨基酸(如SEQ ID NO：13所示)，58位-86位的氨基酸(如SEQ ID NO：14所示)、58位-85位的氨基酸(如SEQ ID NO：15所示)，59位-86位的氨基酸(如SEQ ID NO：16所示)和59位-85位的氨基酸(如SEQ ID NO：17所示)，
结构单元2包含选自以下各项组成的组的PD-1蛋白片段：PD-1蛋白的127位-133位的氨基酸(如SEQ ID NO：18所示)，127位-132位的氨基酸(如SEQ ID NO：19所示)，128位-133位的氨基酸(如SEQ ID NO：20所示)，和128位-132位的氨基酸(如SEQ ID NO：21所示)。
2.权利要求1所述的肽，所述肽包含结构单元1和结构单元2，其中结构单元1包含PD-1蛋白的29位-85位的氨基酸(如SEQ ID NO：11所示)或58位-85位的氨基酸(如SEQ IDNO：15所示)，结构单元2包含PD-1蛋白的128位-132位的氨基酸(如SEQ ID NO：21所示)或130-132位的氨基酸(如SEQ ID NO：3所示)，优选结构单元1包含PD-1蛋白的58位-85位的氨基酸(如SEQ ID NO：15所示)，结构单元2包含PD-1蛋白的130-132位的氨基酸(如SEQ IDNO：3所示)。
3.项目1或2所述的肽，其中PD-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.项目1-3任一项所述的肽，其中结构单元1包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10-17任一项所示的序列，结构单元2包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：18-21任一项所示的序列，优选结构单元1包含SEQ ID NO：2所示的序列，结构单元2包含SEQ ID NO：3所示的序列。
5.项目1-4任一项所述的肽，其中所述抗PD-1抗体的抗原结合片段为Fab片段、Fab’、(Fab’)2、Fab’-SH、Fab/c、Fv、单链抗体(例如，scFv)。
6.项目5所述的肽，其中所述Fab片段的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
7.项目1-6任一项所述的肽，其中PD-1蛋白的T59、E61、S62、E84、D85氨基酸与抗PD-1抗体(例如14C12H1L1-Fab)重链的Y32、D33、S52、G54、Y57、Y100位氨基酸结合，PD-1蛋白的P130、K131、A132氨基酸与抗PD-1抗体轻链的F325、E324、D323位氨基酸结合，PD-1蛋白的N58糖基化侧链与抗PD-1抗体(例如14C12H1L1-Fab)重链氨基酸(例如S31、G53、G54和R56)结合。
8.项目7所述的肽，其中所述糖基化侧链包含甘露糖，N-乙酰氨基葡萄糖；岩藻糖和β-D-甘露糖。
9.项目1-8任一项所述的肽在筛选结合PD-1的抗体或其抗原结合片段中的用途。
10.SEQ ID NO：1所示的PD-1蛋白的D29，T59，E61，S62，K78，E84，D85，L128，P130，A132或其组合在筛选结合PD-1的抗体或其抗原结合片段中的用途。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987 and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人(1989)Nature 342：878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature，256：495，1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.Patent 4,816,567)。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的构架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al.，Nature，321：522525(1986)；Reichmann etal.，Nature，332：323329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593 596(1992)；和Clark，Immunol.Today 21：397 402(2000)。
在本发明中，抗原结合片段包括，但不限于：Fab片段、Fab’、(Fab’)2、Fab/c、Fv、Fab’-SH、单链抗体(例如，scFv)。
如本发明中所使用的，术语“Fab片段”由一条轻链和CH1以及一条重链的可变区组成。Fab分子的重链不能与另一条重链分子形成二硫键。
如本发明中所使用的，术语“Fab’片段”含有一条轻链和一条重链的部分(其含有VH结构域和CH1结构域以及还有CH1与CH2结构域之间的区域的部分)，以便可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)2分子。
如本发明中所使用的，术语“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条含有CH1与CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，以便在两条重链之间形成链间二硫键。F(ab’)2片段从而由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。
如本发明中所使用的，术语“Fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但缺乏恒定区。
如本发明中所使用的，术语“Fab’-SH”是本文对Fab’的命名，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基携带游离硫醇基团。
附图说明：
图1：PD-1蛋白与14C12H1L1-Fab复合物的整体结构模型图。FAB-HC：14C12H1L1-Fab重链部分；FAB-LC：14C12H1L1-Fab轻链部分。
图2：PD-1蛋白与14C12H1L1-Fab重链氨基酸相互作用示意图。FAB-HC：14C12H1L1-Fab重链部分。
图3：PD-1蛋白与14C12H1L1-Fab轻链氨基酸相互作用示意图。FAB-LC：14C12H1L1-Fab轻链部分。
图4：PD-1蛋白Asn58糖基化侧链与14C12H1L1-Fab重链氨基酸相互作用示意图。MAN：mannose，甘露糖；NAG：NAcetyl Glucosamine，乙酰氨基葡萄糖；FUC：Fucose，岩藻糖；BMA：β-D-mannose，β-D-甘露糖。FAB-HC：14C12H1L1-Fab重链部分；FAB-LC：14C12H1L1-Fab轻链部分。
图5：PD-1与14C12H1L1-Fab，Pembrolizumab或nivolumab的结合表面。PD-1蛋白中，与14C12H1L1-Fab接触的残基是E61、S62位氨基酸残基，而与nivolumab接触的残基是V64、N66、Y68、Q75、T76、D77、K78、P83位氨基酸残基，由14C12H1L1-Fab和nivolumab结合的重叠残基是E84位氨基酸残基。与pembrolizumab接触的残基是L128、A129位氨基酸残基，由14C12H1L1-FAB和pembrolizumab结合的重叠残基是T59、P130、A131、K132位氨基酸残基。D85位氨基酸残基由于立体结构遮挡未能显示。
图6：结合ELISA方法检测抗PD-1抗体与人PD-1蛋白突变体hPD1(D29A)-mFc、hPD1(E61A)-mFc的结合活性。
图7：结合ELISA方法检测抗PD-1抗体与人PD-1蛋白突变体hPD1(K78A)-mFc、hPD1(E84A)-mFc的结合活性。
图8：结合ELISA方法检测抗PD-1抗体与人PD-1蛋白突变体hPD1(L128A)-mFc的结合活性。
图9：抗PD-1抗体与人PD-1蛋白hPD1-mFc结合的动力学特征参数检测结果。
图10：抗PD-1抗体与人PD-1蛋白突变体hPD1(D29A)-mFc结合的动力学特征参数检测结果。
图11：抗PD-1抗体与人PD-1蛋白突变体hPD1(E61A)-mFc结合的动力学特征参数检测结果。
图12：抗PD-1抗体与人PD-1蛋白突变体hPD1(K78A)-mFc结合的动力学特征参数检测结果。
图13：抗PD-1抗体与人PD-1蛋白突变体hPD1(E84A)-mFc结合的动力学特征参数检测结果。
图14：抗PD-1抗体与人PD-1蛋白突变体hPD1(L128A)-mFc结合的动力学特征参数检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，为可以通过市场购买获得的常规产品。
主要仪器与试剂
PD-1-his(康方生物生产)
14C12H1L1-Fab-his(康方生物生产)
14C12H1L1(hG1TM)(康方生物生产)
hPD1-mFc：康方生物生产，批号：20181025(hPD-1的Genbank ID：NP_005009，mFc的Genbank ID：P01863)。
hPD1(D29A)-mFc：康方生物生产，批号20191113。
hPD1(E61A)-mFc：康方生物生产，批号20191113。
hPD1(K78A)-mFc：康方生物生产，批号20191113。
hPD1(E84A)-mFc：康方生物生产，批号20191113。
hPD1(L128A)-mFc：康方生物生产，批号20191113。
制备例1.人PD1-his融合蛋白的制备
通过NCBI蛋白质数据库查找人PD-1的序列(PD-1Genbank ID：NP_005009)，将人PD-1胞外区氨基酸序列(1位氨基酸-170位氨基酸)与his纯化标签序列(SEQ ID NO：6)进行融合设计，融合蛋白简写命名为“PD1-his”(SEQ ID NO：7)，也表示为“hPD1-his”。
编码融合蛋白的cDNA序列来源于委托南京金斯瑞生物进行的氨基酸密码子优化和基因合成，参照《分子克隆实验指南(第二版)》介绍的标准技术，采用PCR、酶切、胶回收、连接转化、菌落PCR或酶切鉴定等标准的分子克隆技术将目的基因亚克隆到哺乳动物细胞表达载体，并进一步对重组表达载体的目的基因进行测序分析。测序验证正确后，中大量制备去内毒素级别的表达质粒并将质粒瞬时转染HEK293细胞进行蛋白表达。培养7天后收集细胞培养液，采用MabSelect SuRe柱料(GE Healthcare)进行亲和纯化。
实施例1.人PD-1抗原与抗PD-1抗体结合表位分析
发明人基于已报道的PD-1-nivolumab Fab(Tan SH，et al.(2017).Nat Commun.，8，14369)和PD-1-Pembrolizumab Fab(Horita S et al.(2016).Sci Rep.，6，35297)的复杂结构，采用X线晶体衍射的方法，以
Figure BDA0003288971770000083
的分辨率研究了抗体14C12H1 L1的Fab部分(14C12H1L1-Fab)和PD-1抗原相互作用，并比较了三者的差异。
抗体14C12H1L1-Fab中的重链部分的氨基酸序列如下，下划线部分为CH1，加粗黑体的为CDR区域，下划线粗斜体的为组氨酸标签(his-tag)：
Figure BDA0003288971770000081
抗体14C12H1L1-Fab中的轻链的氨基酸序列如下，下划线部分为CL，加粗黑体的为CDR区域：
Figure BDA0003288971770000082
发明人出乎意料地发现，14C12H1L1-Fab通过区别于pembrolizumab和nivolumab的方式与PD-1结合。尽管三者都阻断了PD-1和PD-L1之间的结合，但是，根据文献报道，pembrolizumab和nivolumab以不依赖糖基化的方式结合至PD-1(Tan SH，et al.(2017).Nat Commun.，8，14369.)和PD-1-Pembrolizumab Fab(Horita S et al.(2016).SciRep.，6，35297)，14C12H1L1-Fab在PD-1的BC环上显示出与N58位链接的糖侧链的大量相互作用。
实验方法：将PD1蛋白，如PD-1-His，与14C12H1L1-Fab-his按照1∶2摩尔比混合，冰上孵育2小时。混合物随后进行分子筛(Superdex 200 10/300column，GE Healthcare)纯化得到PD-1蛋白与14C12H1L1-Fab-his的复合物，所使用的缓冲液条件为20mM HEPEs，pH7.5，100mM NaCl，5mM DTT。收取复合物峰进行离心浓缩(Millipore，MWCO 10kDa)，最终复合物浓度约为10mg/ml。将浓缩后的复合物用于晶体初筛，于20°晶体房静置。两周后，在显微镜下观察晶体板，选取晶体外形较好的条件进行结晶条件的重复及优化。晶体的生长条件为PEG II suit F2(0.1M MES，pH 6.5，20％PEG4000,0.6M sodium chloride)，防冻剂为30％EG。SDS-PAGE显示晶体内容物为PD1-His+14C12H1L1-Fab-His复合物。在获取可用晶体后，通过使用上海同步辐射光源收集分辨率数据为衍射到
Figure BDA0003288971770000091
的衍射图形。
数据解析流程如下：采用DIALS对数据进行指标化、积分处理。用Aimless分析、合并处理数据，随机选取5％数据进行Rfree估测。采用Molrep分子置换程序分两步来寻找相位解。经过序列比对，14C12H1L1-Fab与PDB数据库中6foe的序列同源性高达85％，所以用6foe寻找14C12H1L1-Fab-his的解，然后固定14C12H1L1-Fab-his的位置，用PD-1单体的结构(PDB：3rre)来寻找PD-1的解。解析结果为一个不对称单位里包含一个PD1-his单体和一个14C12H1L1-Fab-his片段。随后采用REFMAC5在倒易空间中进行模型修正。采用COOT对蛋白模型在实空间进行修正。模型与电子密度图吻合良好，晶体学R因子和Rfree分别为0.21和0.27(图5)，结构模型的立体化学参数处在合理范围内。
结构分析结果如图1-5所示。
实施例2.抗PD-1抗体14C12H1L1(hG1TM)抗原结合表位的氨基酸定点突变研究
根据Nivolumab抗体结合位点，选择了人PD-1蛋白29位天冬氨酸、61位谷氨酸、78位赖氨酸、84位谷氨酸、128位亮氨酸5个氨基酸位点突变为丙氨酸[Lee，J.Y.，et al.，Structural basis of checkpoint blockade by monoclonal antibodies in cancerimmunotherapy.Nature Communications，2016.7(1)：p.13354.]，这些突变体分别记为hPD1(D29A)-mFc、hPD1(E61A)-mFc、hPD1(K78A)-mFc、hPD1(E84A)-mFc、hPD1(L128A)-mFc采用结合ELISA以及Fortebio Kinetics方法检测抗PD-1抗体与这些突变体的结合活性，实验用未突变的PD1-mFc蛋白作为对照对比。
1、结合ELISA方法检测抗PD-1抗体14C12H1L1(hG1TM)与人PD-1蛋白突变体的结合活性
用包被缓冲液将PD-1抗原稀释成1μg/mL，每孔50μL加入酶标板中，置于4℃孵育过夜。用PBST洗板后每孔加入300μL 1％BSA(PBS)，37℃封闭2h。洗板后用PBST将抗PD-1抗体(14C12H1L1(hG1TM))稀释成0.3333μg/mL作为起始浓度，在酶标板上进行1∶3往下稀释为0.1111μg/mL，0.0370μg/mL，0.0123μg/mL，0.0041μg/mL，0.0014μg/mL，0.0005μg/mL共7个梯度浓度，另设空白对照，均做2个复孔，每孔100μL，混匀后置于37℃孵育30min。洗板后每孔加入50μL辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG(H+L)二抗(Jackson)工作液，置于37℃孵育30min，用PBST洗板后加入每孔50μL TMB，置于室温避光显色5min后，每孔加入50μL终止液(2M H2SO4溶液)终止显色反应。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值。用SoftMax Pro6.2.1软件对数据进行分析处理。以抗体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标进行4-parameter拟合曲线作图，得到抗体的结合EC50值。
检测结果见表1和图6-8所示，人PD-1蛋白五个突变体D29A、E61A、K78A、E84A、L128A与抗PD-1抗体结合EC50分别为0.021nM、2.47×1012nM、0.023nM、0.022nM、4.207nM。E61A和L128A两个突变体与抗PD-1抗体的结合能力明显降低。
表1抗PD-1抗体与人PD-1突变体的结合ELISAEC50结果
Figure BDA0003288971770000101
2.Fortebio Kinetics方法检测抗PD-1抗体14C12H1L1(hG1TM)与人PD-1蛋白突变体的结合活性
首先将抗PD-1抗体用PBS(含0.02％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4)稀释至5μg/mL后固定于AHC传感器(Fortebio)表面，时间为120s，传感器在缓冲液中平衡60s，固定在传感器上的抗PD-1抗体与各PD1-mFc突变体结合，浓度为1.24-100nM(三倍稀释)，时间120s，蛋白在缓冲液中解离，时间300s。检测温度为37℃，检测频率为0.3Hz，样品板震动速率为1000rpm。数据以1∶1模型拟合分析，得到亲和力常数。
抗PD-1抗体与各PD-1突变体结合结果见图9-14和表2所示，人PD-1蛋白五个突变体D29A、E61A、K78A、E84A、L128A与抗PD-1抗体结合亲和力常数分别为4.25E-10M、3.30E-08M、1.31E-10M、6.65E-10M、7.68E-09M。与结合ELISA结果一致，E61A和L128A两个突变体与抗PD-1抗体的结合能力明显降低。
表2抗PD-1抗体与人PD-1突变体的Fortebio Kinetics结果
Figure BDA0003288971770000111
序列表：
<110>正大天晴康方(上海)生物医药科技有限公司
<120>结合PD-1抗体的肽及其应用
<130>IB206166
<160>21
<170>PatentIn version 3.3
PD-1(SEQ ID NO：1)：人PD1(1-170)序列
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLV
结构单元1(SEQ ID NO：2)：人PD1(58-85)
NTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPED
结构单元1(SEQ ID NO：10)人PD1(28-86)
PDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR
结构单元1(SEQ ID NO：11)人PD1(28-85)
PDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPED
结构单元1(SEQ ID NO：12)人PD1(29-86)
DRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPFDR
结构单元1(SEQ ID NO：13)人PD1(29-85)
DRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPED
结构单元1(SEQ ID NO：14)人PD1(58-86)
NTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR
结构单元1(SEQ ID NO：15)人PD1(58-85)
NTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPED
结构单元1(SEQ ID NO：16)人PD1(59-86)
TSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR
结构单元1(SEQ ID NO：17)人PD1(59-85)
TSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPED
结构单元2(SEQ ID NO：3)：人PD1(130-132)
PKA
结构单元2(SEQ ID NO：18)：人PD1(127-133)
SLAPKAQ
结构单元2(SEQ ID NO：19)：人PD1(127-132)
SLAPKA
结构单元2(SEQ ID NO：20)：人PD1(128-133)
LAPKAQ
结构单元2(SEQ ID NO：21)：人PD1(128-132)
LAPKA
14C12H1L1(hG1TM)-Fab-HC-his(SEQ ID NO：4)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGG SHHHHHH
注：下划线为CDR序列
14C12H1L1(hG1TM)-Fab-LC(SEQ ID NO：5)：
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEOLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV OWKVDNALOSGNSOESVTEODSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
注：下划线为CDR序列
His-tag(SEQ ID NO：6)：
HHHHHH
人PD1(1-170)-His*6融合蛋白序列(SEQ ID NO：7)：
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVHHHHHH
14C12H1L1(hG1TM)重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYDMSWVRQAPGKGLDWVATISGGGRYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNNLYLQMNSLRAEDTALYYCANRYGEAWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
14C12H1L1(hG1TM)轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)：
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTFTCRASQDINTYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVSGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDMATYYCLQYDEFPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Claims (10)

1.肽，优选结合抗PD-1抗体或其抗原结合片段，所述肽包含结构单元1和结构单元2，其中结构单元1包含选自以下各项组成的组的PD-1蛋白片段：PD-1蛋白的28位-86位的氨基酸(如SEQ ID NO：10所示)，28位-85位的氨基酸(如SEQ ID NO：11所示)，29位-86位的氨基酸(如SEQ ID NO：12所示)，29位-85位的氨基酸(如SEQ ID NO：13所示)，58位-86位的氨基酸(如SEQ ID NO：14所示)、58位-85位的氨基酸(如SEQ ID NO：15所示)，59位-86位的氨基酸(如SEQIID NO：16所示)和59位-85位的氨基酸(如SEQ ID NO：17所示)，
结构单元2包含选自以下各项组成的组的PD-1蛋白片段：PD-1蛋白的127位-133位的氨基酸(如SEQ ID NO：18所示)，127位-132位的氨基酸(如SEQ ID NO：19所示)，128位-133位的氨基酸(如SEQ ID NO：20所示)，和128位-132位的氨基酸(如SEQ ID NO：21所示)。
2.权利要求1所述的肽，所述肽包含结构单元1和结构单元2，其中结构单元1包含PD-1蛋白的29位-85位的氨基酸(如SEQ ID NO：11所示)或58位-85位的氨基酸(如SEQ ID NO：15所示)，结构单元2包含PD-1蛋白的128位-132位的氨基酸(如SEQ ID NO：21所示)或130-132位的氨基酸(如SEQ ID NO：3所示)，优选结构单元1包含PD-1蛋白的58位-85位的氨基酸(如SEQ ID NO：15所示)，结构单元2包含PD-1蛋白的130-132位的氨基酸(如SEQ ID NO：3所示)。
3.权利要求1或2所述的肽，其中PD-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.权利要求1-3任一项所述的肽，其中结构单元1包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10-17任一项所示的序列，结构单元2包含SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：18-21任一项所示的序列，优选结构单元1包含SEQ ID NO：2所示的序列，结构单元2包含SEQ ID NO：3所示的序列。
5.权利要求1-4任一项所述的肽，其中所述抗PD-1抗体的抗原结合片段为Fab片段、Fab’、(Fab’)2、Fab’-SH、Fab/c、Fv、单链抗体(例如，scFv)。
6.权利要求5所述的肽，其中所述Fab片段的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
7.权利要求1-6任一项所述的肽，其中PD-1蛋白的T59、E61、S62、E84、D85氨基酸与抗PD-1抗体(例如14C12H1L1-Fab)重链的Y32、D33、S52、G54、Y57、Y100位氨基酸结合，PD-1蛋白的P130、K131、A132氨基酸与抗PD-1抗体轻链的F325、E324、D323位氨基酸结合，PD-1蛋白的N58糖基化侧链与抗PD-1抗体(例如14C12H1L1-Fab)重链氨基酸(例如S31、G53、G54和R56)结合。
8.权利要求7所述的肽，其中所述糖基化侧链包含甘露糖，N-乙酰氨基葡萄糖；岩藻糖和β-D-甘露糖。
9.权利要求1-8任一项所述的肽在筛选结合PD-1的抗体或其抗原结合片段中的用途。
10.SEQ ID NO：1所示的PD-1蛋白的D29，T59，E61，S62，K78，E84，D85，L128，P130，A132或其组合在筛选结合PD-1的抗体或其抗原结合片段中的用途。
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