CN114306747A - 一种小口径心血管植入物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小口径心血管植入物及其制备方法,属于生物医药技术领域,其技术方案要点是:包括心血管植入物本体和孵育在心血管植入物本体外表面的双层响应性凝胶;双层响应性凝胶的内层为ATP响应水凝胶;双层响应性凝胶的外层为ROS响应性水凝胶;小口径心血管植入物的制备方法的步骤包括构建小口径心血管植入物本体、制备ATP响应分子和ROS响应分子、制备ATP响应水凝胶混合液和ATP响应水凝胶混合液和ROS响应性水凝胶混合液依次在心血管植入物本体表面成胶,获得小口径心血管植入物。本发明主要用于制备小口径心血管植入物,该血管植入物在高糖环境下可以长期维持良好的内膜形态及厚度,提高糖尿病下小口径人工血管移植的成功率及长期通畅率。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,尤其涉及一种小口径心血管植入物及其制备方法。
背景技术
心血管疾病是对人类健康的严重威胁,每年大约有17万人死于心血管疾病。由于外周血管闭塞、冠状动脉旁路移植、血液透析、动静脉瘘等,在全世界小口径心血管植入物(<6mm)的需求量越来越大。然而,血栓形成和内膜增生增生是术后小口径心血管植入物移植后面临的严重问题。血栓形成主要由药物控制,但内膜增生导致血管移植物再狭窄,严重缩短它们的通畅时间,限制了小口径心血管植入物的进一步临床应用。
小口径心血管植入物移植是一种重要的治疗糖尿病并发中小型血管疾病的治疗方法。然而,脂质代谢紊乱和晚期糖基化终产物的积累会导致血管植入物中严重的内膜增生,进而导致移植物迅速狭窄。因此,预防内膜增生使它们在糖尿病中的长期通畅已成为一个亟待解决的关键问题。
内膜增生的特点是异常迁移和增生的血管平滑肌细胞。虽然很多研究集中于通过阻断血管平滑肌细胞增殖来抑制血管平滑肌细胞增殖相关信号通路,如 TGF-β,但这对内膜增生的控制仍然有限。血管平滑肌细胞可分为两种亚型:收缩型和合成型。从收缩到合成表型的转变是术后再狭窄的常见病理特征,这表明血管平滑肌细胞的异常表型转化是内膜增生研究的关键。从结构或功能的角度来看,神经和血管交织在一起。除了毛细血管,几乎所有的血管网络都由交感神经纤维支配。神经调节血管的活动和营养交换。有报道证明,神经纤维多次分支,以静脉曲张体的形态支配血管平滑肌细胞。此外,手指状轴突终末可以抓住血管平滑肌细胞通过形成突触小体,神经细胞通过突触小体释放含有活性物质的外泌体,这些外泌体同时被平滑肌细胞捕获吸收。然而,高血糖下相关基因表达变化诱导的生长抑制使得神经纤维结构紊乱、远端退行性神经病变和轴突损伤会抑制神经纤维的生长及长入血管植入物。并且,高血糖症降低了神经元内控制外泌体转运的蛋白Rab35的活性。
为了解决上述问题,在现有技术的基础上提供了一种小口径心血管植入物及其制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种小口径心血管植入物及其制备方法,该心血管植入物在高糖环境下可以长期维持良好的内膜形态及厚度,防止出现由于异常内膜增生导致的血管移植物管腔狭窄及堵塞的问题,提高糖尿病下小口径人工血管移植的成功率及长期通畅率。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的:
一种小口径心血管植入物,包括心血管植入物本体和孵育在心血管植入物本体外表面的双层响应性凝胶;所述双层响应性凝胶的内层为ATP响应水凝胶,所述ATP响应水凝胶包含有DENND1A蛋白;所述双层响应性凝胶的外层为ROS响应性水凝胶,所述ROS响应性水凝胶包含有神经轴突导向分子-1。
进一步地:所述ATP响应水凝胶的制备方法为:将八臂PEG叠氮化物和ATP 响应分子按照摩尔质量比1:3~1:5混合,再混入1%~10%DENND1A蛋白,在室温下反应5~20min即可成胶;
所述ROS响应水凝胶的制备方法为:将八臂PEG叠氮化物和ROS响应分子按照摩尔质量比1:3~1:5混合,再混入1%~10%神经轴突导向分子-1,在室温下反应5~20min即可成胶。
进一步地:所述小口径心血管植入物为管状,口径为0.5~4mm,长度为0.5~20cm。
本发明还提供了一种小口径心血管植入物的制备方法,步骤如下:
(1)构建小口径心血管植入物本体;
(2)制备ATP响应分子和ROS响应分子;
(3)使用八臂PEG叠氮化物、ATP响应分子和DENND1A蛋白制备ATP响应水凝胶混合液;使用八臂PEG叠氮化物、ROS响应分子和神经轴突导向分子-1 制备ROS响应性水凝胶混合液。
(4)使所述ATP响应水凝胶混合液和ROS响应性水凝胶混合液依次在所述心血管植入物本体表面成胶,获得小口径心血管植入物。
进一步地:步骤(1)所述的心血管植入物本体的制备方法如下:
先使用脱细胞液脱去离体血管中的细胞;然后使用核酸酶脱去所述离体血管中的核酸,获得血管基质材料;再在所述血管基质材料表面孵育胶原和血管内皮生长因子(VEGF),获得心血管植入物本体。
进一步地:所述心血管植入物本体的具体制备步骤为:
A.所述脱细胞液为0.025%~0.25%的胰蛋白酶,所述脱细胞液与离体血管在 0℃~37℃下振荡反应30min~90min完成脱细胞;所述核酸酶为DNA酶和RNA 酶,所述核酸酶与离体血管在0℃~37℃下振荡反应10min~45min,完成脱核酸,获得血管基质材料;
B.用PBS溶液洗涤所述血管基质材料后,再所述血管基质材料的表面孵育 10%-50%胶原;然后在0℃~37℃下与100~500ng/ml血管内皮生长因子((VEGF)) 交联12~36h,获得心血管植入物本体。
进一步地:步骤(2)所述的ATP响应分子由ATP核酸适配体、ssDNA1和ssDNA2 按照1:1:1~1:2:2的比例,在0℃~50℃下反应6h~24h而成。
进一步地:所述ATP核酸适配体的序列为CACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTT;所述ssDNA1的序列为5’-ACTCCCCCAGGTGTTTTTT-NH2-DBCO-3’;所述ssDNA2 的序列为5’-DBCO-NH2-TTTTTTAACCTTCCTCCGC-3’。
进一步地:步骤(3)述的ROS响应分子为氨基硫代缩酮和二苯并环辛炔 (DBCO)按照摩尔质量比1:1~1:3,在0℃~75℃,搅拌反应30min~2h而成。
进一步地:步骤(4)所述的ATP响应水凝胶混合液和ROS响应性水凝胶混合液依次在所述心血管植入物本体表面成胶的具体步骤如下:
a.先将心血管植入物本体的两端用1-0手术线扎住后,浸入所述ATP响应水凝胶混合液中,然后取出,使所述心血管植入物本体的表面覆盖一薄层混合液Ⅰ,等待所述薄层混合液Ⅰ反应成胶;
b.然后再将所述心血管植入物本体浸入所述ROS响应性水凝胶混合液中,再取出,使所述心血管植入物本体表面覆盖一薄层混合液Ⅱ,等待所述薄层混合液Ⅱ反应成胶后,将血管植入物两端手术线解开。
技术原理:在糖尿病的病理环境下,心血管移植物上的再生的平滑肌细胞受到高糖损伤,细胞内ROS水平升高,蛋白羰基化,细胞从分化表型转为去分化表型,出现异常增殖和迁移,且由于高糖环境的影响,外周神经修复减缓、停滞,神经难以参与血管再生与稳态维持的过程。
在本技术方案中,将DENND1A和神经轴突导向因子-1分别通过响应性水凝胶包裹修饰到心血管植入物外表面,利用周围生化环境的变化触发二者的释放,原位降低平滑肌细胞所受过高糖下过氧化物损伤,抑制内膜异常增生,促进在糖尿病环境下的长期通畅。神经轴突导向分子-1是通过血管植入物移植后炎症反应所产生的大量ROS触发释放,促进和诱导神经在移植早期快速修复并长入血管移植物;另一方面,也与血管移植物上预先孵育的血管内皮生长因子一起促进心血管移植物的早期内皮化,增加了血管植入物移植的成功率。
DENND1A是通过神经长入后释放的神经递质—ATP而触发释放,进入神经元后,通过转变Rab35为激活态来提高本来被高糖环境抑制的神经元外泌体分泌活动。神经元通过外泌体向平滑肌细胞运输过氧化物酶-1蛋白,消除平滑肌细胞内ROS,降低高糖损伤,维持平滑肌细胞为去分化表型,抑制内膜增生,提高小口径心血管植入物在糖尿病下的长期通畅率。
综上所述,本发明具有以下有益效果:
1.将双层响应性水凝胶完整均匀的覆盖在脱细胞血管植入物表面,制成的小口径心血管植入物具有良好的生物相容性和明显的生物学功能,外层ROS响应水凝胶先响应炎性反应产生的ROS,崩解释放出其中的神经轴突导向因子-1,诱导神经长入心血管植入物,内层ATP响应水凝胶则保护了其中的DENND1A活性。
2.神经长入后释放神经递质ATP,内层胶触发释放DENND1A,作用于神经元,提高了高糖下被抑制的神经元外泌体分泌水平,神经元外泌体被血管植入物上再生的平滑肌细胞摄取,其中含有的过氧化物酶-1降低了平滑肌细胞内的ROS水平,降低了高糖损伤,抑制了高糖下平滑肌细胞的过度增殖、迁移与内膜增生,维持平滑肌细胞分化表型和内膜正常形态,提高了糖尿病下小口径心血管植入物的移植成功率和远期通畅率。
3.在糖尿病心血管移植的临床治疗领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中的双层响应性水凝胶成胶与响应触发的结构示意图;
图2为本发明实施例1中的双层响应性水凝胶覆盖于脱细胞心血管植入物外表面的荧光显微结果;
图3为本发明的响应性水凝胶成胶的红外光谱的验证结果;
图4为本发明中的ROS响应水凝胶的成胶与水解;
图5为本发明中的水凝胶包裹荧光染料活性维持实验结果;
图6为本发明中的心血管植入物移植后的小动物活体成像实验结果;
图7为本发明中的两种响应性水凝胶的内部形貌(扫描电镜观察);
图8为本发明中的水凝胶的细胞毒实验结果;
图9为本发明中的神经轴突导向分子-1和DENND1A的细胞毒实验结果;
图10为本发明的水凝胶缓释蛋白实验结果;
图11为本发明中的血管植入物内的ROS水平变化结果图;
图12为本发明中的心血管移植物外观(植入后30d);
图13为本发明中的血管植入物内神经(横截面)的免疫荧光染色结果图 (PGP9.5为神经标志物);
图14为本发明中的血管植入物内神经(纵截面)的免疫荧光染色结果图 (PGP9.5和贝塔-tublin3为神经标志物);
图15为本发明中的心血管移植物的血液流速结果图(植入后30d);
图16为本发明中的心血管移植物的H&E染色切片结果图(植入后30d,放大图内虚线为各层膜界线);
图17为本发明中的心血管移植物的免疫荧光染色结果图(CD31为内皮细胞标志物);
图18为本发明中的心血管移植物的ATP含量检测结果图;
图19为本发明中的心血管移植物的Prdx-1免疫荧光染色结果图;
图20为本发明中的心血管移植物外观(植入后60d);
图21为本发明中的心血管移植物的血流流速结果图(植入后60d);
图22为本发明中的心血管移植物的Masson染色切片结果图。(植入后60d,放大图内虚线为各层膜界线);
图23为本发明中的心血管移植物的免疫组化染色图(植入后60d,箭头所指位置展示了内膜增生的平滑肌细胞);
图24为本发明中的心血管移植物外观(植入后90d);
图25为本发明中的血流流速结果图(植入后90d);
图26为本发明中的心血管移植物的CTA影像结果图(红色箭头所指展示了移植的心血管移植物);
图27为本发明中的心血管移植物的H&E染色结果图(植入后90d,放大图内虚线为各层膜界线);
图28为本发明中的心血管移植物的Masson染色切片结果图;(植入后90d,放大图内虚线为各层膜界线);
图29为本发明中的心血管移植物的免疫荧光染色结果图(Calponin为分化型平滑肌标志物,Thrombospondin为去分化型平滑肌标志物);
图30为本发明中的心血管移植物的一型胶原免疫组化染色结。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细说明:
实施例1:一种小口径心血管植入物的制备方法,如图1和图2所示,其步骤如下:
(1)构建小口径心血管植入物本体;
1)取同种或异种来源的小口径血管,本实施例的小孔径血管从大鼠颈动脉获取,并进行处理,首先将取材得到的血管剪成0.5~1cm的小段,在生理盐水中进行漂洗,洗净其中参与的血液。
2)进行脱细胞和去除残余核酸处理:用0.025%~0.05%胰蛋白酶0℃℃~ 37℃脱细胞40min;用RNA酶和DNA酶去除核酸,在0℃~37℃下振荡反应10min~ 45min,完成脱核酸,获得血管基质材料。
3)血管基质材料用10%-50%胶原修饰,再在0℃~37℃下与血管生长因子 (100~500ng/ml,体外)交联12~36h。
4)然后在小口径血管植入物两端结扎,并使用无菌滤纸将表面吸干,得到心血管植入物本体。
(2)制备ATP响应分子和ROS响应分子,步骤如下:
1)ATP响应分子由ATP核酸适配体、ssDNA1和ssDNA2按照1:1:1~1:2:2 的比例,在0℃~50℃下反应6h~24h而成;ATP核酸适配体的序列(SEQ ID NO: 1)为CACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTT;ssDNA1的序列(SEQ ID NO:2)为5’ -ACTCCCCCAGGTGTTTTTT-NH2-DBCO-3’;ssDNA2的序列(SEQ ID NO:3)为5’ -DBCO-NH2-TTTTTTAACCTTCCTCCGC-3’;
2)ROS响应分子为氨基硫代缩酮和二苯并环辛炔(DBCO)按照摩尔质量比 1:1~1:3,在0℃~75℃,搅拌反应30min~2h而成。
(3)使用八臂PEG叠氮化物、ATP响应分子和DENND1A蛋白制备ATP响应水凝胶混合液;使用八臂PEG叠氮化物、ROS响应分子和神经轴突导向分子-1 制备ROS响应性水凝胶混合液;
1)ATP响应水凝胶混合液的制备步骤为:将八臂PEG叠氮化物和ATP响应分子按照摩尔质量比1:3~1:5混合,再混入1%~10%DENND1A蛋白,在室温下反应5~20min即可成胶;
2)ROS响应水凝胶的制备方法为:将八臂PEG叠氮化物和ROS响应分子按照摩尔质量比1:3~1:5混合,再混入1%~10%神经轴突导向分子-1,在室温下反应5~20min即可成胶。
(4)使ATP响应水凝胶混合液和ROS响应性水凝胶混合液依次在心血管植入物本体表面成胶,获得小口径心血管植入物;ATP响应水凝胶混合液和ROS响应性水凝胶混合液依次在心血管植入物本体表面成胶的具体步骤如下:
a.先将心血管植入物本体的两端用1-0手术线进行结扎封闭,吸去表面水分后,浸入含有ATP响应分子、BSA-Alexa568(红色荧光,10微克~100微克/ml) 的混合液和DENND1A的混合液中,然后取出,使心血管植入物本体的表面覆盖一薄层混合液,心血管植入物本体的外表面覆盖一薄层混合液Ⅰ,等待薄层混合液Ⅰ在0℃~37℃下反应15~45min成胶;
b.然后再将心血管植入物本体浸入含有ROS响应分子、FITC(绿色荧光,10~ 100微克/ml)和神经轴突导向分子-1的混合液中,再取出,使心血管植入物本体表面覆盖一薄层混合液Ⅱ,等待薄层混合液Ⅱ在0℃~37℃下反应15~45min成胶后,将血管植入物两端手术线解开,即在血管植入物本体表面形成了双层响应性水凝胶,获得小口径心血管植入物。小口径心血管植入物为管状,口径为0.5~ 4mm,长度为0.5~20cm。
结果分析:取大鼠颈总动脉(长1cm,直径1mm)脱细胞后,细胞(蓝色) 被去除,胶原(红色)被完全保留。图2显示了包封荧光分子的内外水凝胶与外膜外表面结合情况。在荧光显微镜下观察血管横截面的双层凝胶结构,证明含有 BSA-FITC的内层ATP响应水凝胶和外层含BSA-Alexa568的ROS响应性水凝胶粘附在脱细胞血管基质的外膜上。
本发明对制备得到的小口径心血管植入物的性质进行了检测,检测结果如下:
(1)将八臂PEG叠氮化物、ROS响应性水凝胶和ATP响应性水凝胶冻干后,通过FT-IR光谱测量其功能基团的特征吸收带。图3表明,八臂PEG中的叠氮化物基团在2105处的特征吸收在分别添加两种交联剂后都消失,表明炔烃-叠氮化物反应在两种水凝胶中都是成功的。
(2)体外水凝胶的响应能力和缓释能力测定。在5ml EP管底部制备500 微升ROS响应性水凝胶,并拍摄照片。添加200μl 10mM H2O2并在37℃下反应 2h后,EP管倾斜约60°,然后拍照。在48孔板中制备ROS响应性水凝胶(每孔200μl水凝胶,含10mg/ml BSA)。对照组用去离子水(每孔100μl)处理,而实验组用过氧化氢(每孔100μl,3mm)处理。然后,使用BSA-ELISA检测试剂盒测量上清液中的BSA浓度0-30天。
结果如图4和图10显示,单体在25℃时形成水凝胶,在加入H2O2后水凝胶就再次变成了液体中。因此,使用3mM H2O2处理含有BSA的ROS响应性水凝胶。每日BSA释放量H2O2组30天内的释放率约为3.6%±0.7%,这表明水凝胶对过氧化氢的持续反应和稳定释放。
(3)水凝胶中蛋白质稳定性的测定。在制备用响应性水凝胶修饰的小口径血管的过程中,BSA-FITC和BSA-Alexa 568分别并入ATP和ROS响应性水凝胶中。血管植入物浸泡在PBS中。然后,我们在第0、9、14、21和30天切下8μm 冰冻组织切片。图像通过荧光显微镜拍摄。将水凝胶Dir(Dir,300μg/ml,瑞泰生物)修饰的小口径血管植入大鼠体内。在第0、9天、14天、21天和30天,麻醉大鼠,进行颈部皮肤准备,并用IVIS光谱(Perkinlemer)成像。滤波器参数设置为760nm发射和710nm激发。
结果如图5、图6所示,观察一段时间后的一段时间内,水凝胶修饰的小口径心血管植入物在第9天和第14天具有强烈的绿色荧光,并且在第30天这种荧光在体外和体内保持不变,表明水凝胶可在体内维持1个月以上的缓释,因此可为神经纤维生长到小口径血管植入物提供足够的时间。
(4)水凝胶的孔结构和细胞毒性。将两种响应性水凝胶浸泡在液氮中冷冻并断裂。喷涂金后,通过扫描电子显微镜(SEM,蔡司)观察水凝胶的内部结构。人脐静脉内皮(每孔1×104)接种于96孔培养板中培养。培养1天和3天的神经元细胞使用MTT分析试剂盒(Trevigen)评估24h凝胶水凝胶(30、50和100 mg/ml,每孔10μl)、神经轴突导向分子-1和DENND1A的细胞毒性。使用微孔板读取器测量570nm处的吸光度。
结果如图7、图8、图9所示,本发明合成的水凝胶具有均匀的疏松结构用于增加其响应接触面积,促进神经纤维的长入。PEG水凝胶对敏感的神经元几乎没有细胞毒性,神经轴突导向分子-1和DENND1A也没有显示出明显的细胞毒性,即使当他们的浓度分别达到500ng/ml和2000ng/ml。
本发明还对小口径心血管植入物在糖尿病环境下长期维持正常内膜形态和血流通畅进行了检测观察,结果如下:
(1)在Sprague-Dawley大鼠体内植入小口径血管植入物。所有动物操作和实验均由陆军医科大学动物伦理委员会审查和批准。用1%戊巴比妥钠(腹腔注射, 40mg/kg)麻醉雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠(等量,230-250g)。将室温保持在20℃。将大鼠的颈总动脉夹在两侧并在中心切开,然后将两侧的切口端穿过自制袖带并翻转。然后,将制备的小口径血管植入物(长度:1cm,直径: 1mm,浸泡在50U/ml肝素钠中)的两端与颈动脉端部吻合。结扎袖带处的血管接缝,然后松开血管夹。大鼠苏醒后,腹腔注射肝素钠(1000U/kg,阿拉丁)4天。第15天,通过注射链脲佐菌素建立实验性糖尿病大鼠模型。根据响应***和包含的功能因素在小口径血管植入物的水凝胶中,将大鼠分为以下几类5组:第1组:对照组(空白凝胶+空白凝胶);第2组:凝胶Netrin1+凝胶DEND1A;第3组:ROS凝胶-Netrin1+空凝胶;第4组:ROS-gel-Netrin1+gel-DENND1A;第5组:ROS-gel-Netrin1+ATP凝胶-d1A。
(2)在第1、3、7和14天,对照组去除小口径血管植入物,然后使用0.1%SDS 在室温下使其脱细胞2h。用PBS洗涤5次后,在玻璃均质器(150μl/cm)中均质。使用ROS检测试剂盒检测血管植入物中ROS含量。图14结果显示,由于不可避免的局部炎症而产生了活性氧,这些ROS可以触发糖尿病大鼠体内植入的小口径血管植入物外层水凝胶释放神经轴突导向分子-1。
(3)小口径血管植入物用抗PGP9.5和抗β-微管蛋白3抗体标记,以检测植入后30天外膜中生长的神经纤维。对各组的荧光信号进行统计分析。如图12、图13,植入后第30天第3组小口径血管植入物外膜可见大量神经特异性标记物 PGP9.5和β3-微管蛋白,确认神经纤维已被修复重建。第3组的神经纤维数量明显增多。与第2组相比,未经神经轴突导向分子-1修饰的小口径血管植入物第1组没有神经纤维。第3组中神经纤维密度最高。
(4)在第30、60和90天,将大鼠麻醉并进行颈部皮肤准备。用超声波凝胶均匀涂抹大鼠颈部。对于彩色多普勒超声(Esaote),频率设置为13.0MHz,深度设置为2.5cm,机械指数设置为M10.4,灰度设置为46。连续观察几个心动周期后,选择多普勒模式获取颈总动脉的超声频谱,并保存图像。测量颈动脉峰值流速和移植小口径心血管植入物的血流量。图15、图16显示,除去对照组,在第30天,其余4组血流速度均高于80.31±6.24cm/s。
(5)石蜡切片的H&E和Masson三色染色。在上述实验之后,将小口径心血管植入物在4℃下用4%多聚甲醛固定3小时,然后放置在30%蔗糖中过夜。随后,将小口径心血管植入物包埋在石蜡中,切片(5μm厚),在二甲苯中脱蜡并在乙醇梯度中再水化,然后进行Masson三色染色(60天,90天),H&E染色(30 天,60天,90天),以及免疫组织化学和免疫荧光染色。图17、图18显示,小口径心血管植入物在所有组中完成了内皮化,并且在血管上也形成了滋养血管。ROS响应性神经轴突导向分子-1释放***在诱导神经纤维整合到小口径心血管植入物中起到重要作用。确保小口径心血管植入物早期开放性内皮化是进一步研究神经重建与VSMC功能两者关系的基础。
(6)在第30天,各组的小口径心血管植入物被移除并处理成如上的组织匀浆。根据ATP检测试剂盒的说明,制备工作溶液并与血管组织匀浆以1:1的比例混合。发光强度(ATP含量)由具有光度计功能的酶标仪测量。图19结果显示第30天植入后,第3、4和5组的小口径心血管植入物ATP含量较高,且与神经纤维密度相关。这一结果表明,神经支配小口径心血管植入物中含有足够的ATP,以启动内部水凝胶的降解和DEND1A的释放。
(7)对于免疫荧光染色,小口径心血管植入物在4℃下用4%多聚甲醛固定1 小时。用PBS洗涤后,分别使用0.125%Triton X-100(Solarbio,20min,室温) 和10%山羊血清(Solarbio,1h,室温)进行渗透和封闭。然后,样品在4℃下与一级抗体孵育过夜,包括小鼠抗活性Rab35(Abcam,1:500)、兔抗β3-微管蛋白(Abcam,1:500)、小鼠抗α-SMA(Boster,1:300)、兔抗CD-31(Abcam, 1:500)、小鼠抗α-SMA(Boster,1:300)、兔抗prdx-1(KleanAB,1:500) 和小鼠抗PGP9.5(Bioss,1:200)。Alexa-Fluor 488-和Alexa-Fluor 568结合抗体(Invitrogen)用作二级抗体。与一级抗体孵育后,细胞和冰冻切片与二级抗体在37℃下孵育30min。4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI,Invitrogen) 在室温下对细胞核进行15分钟的染色。使用Leica SP8共焦显微镜获取共焦显微镜图像,并使用ImageJ进行分析。
在小口径心血管植入物的5μm石蜡切片上进行免疫组织化学染色(第60 天和第90天)。常规脱蜡和水合后,TEVG切片在室温下用3%H2O2孵育10min。用PBS洗涤后,按照上述方法进行渗透和封闭,然后用原代小鼠抗α-SMA (Boster,1:300)或抗COL1(Bioss,1:200)孵育切片抗体在4℃的湿箱中放置48h。HRP IgG山羊抗兔抗体(Invitrogen,1:800)用作二级抗体(在37℃下放置1h)。二氨基联苯胺(DAB,Boster)用于显色,然后苏木精(Boster) 用光学显微镜(Olympus)获得免疫组化图像,并用ImageJ进行分析。
图20结果显示,第5组的小口径心血管植入物上有更多的Prdx-1,高于第 4组和第3组的小口径心血管植入物,这证明了内层水凝胶降解导致了DENND1A 在体内高血糖环境下促进神经外泌体的分泌。图22、23、24显示,植入后60 天,第1组和第2组的小口径心血管植入物有更严重的内膜增生和坏死血流速度降低,内膜中膜比值增加至2.33±0.21和0.92±0.085。相反,第3、4和5组小口径心血管植入物血流速度大于76.25±6.47cm/s,内膜轻度增生,IMTR低于0.51±0.047,平滑肌细胞迁移到小口径心血管植入物中且保持通畅。
Masson染色试验表明第1组和第2组内膜胶原纤维的比例超过25.7±2.1%,而第3组、第4组和第5组中胶原纤维的比例的最大值下降至18.6±1.9%,提示神经重建抑制血管平滑肌细胞的增生和胶原纤维分泌。尤其是第5组内膜胶原的比例仅为15.8±1.3%,表明DENND1A促进的神经外泌体可抑制新生内膜的血管平滑肌细胞分泌胶原。在第60天,第3、4和5组的小口径心血管植入物几乎完成了血管平滑肌重建,这与小口径心血管植入物内的神经纤维密度呈正相关。然而,第3组和第4组有一定程度的内膜增生。同时,还观察到第1组和第2 组小口径心血管植入物中增厚新的生内膜内存在大量的无序混乱排列的血管平滑肌细胞。
(8)图26至图30显示的是各组小口径植入物在移植90d时的性质与结构。术后90天,在第1组小口径心血管植入物中观察到动脉瘤的产生,可能是由于缺乏血管平滑肌重建的小口径心血管植入物无法抵抗血流压力。H&E染色和颈动脉超声扫描显示在大鼠体内的第1组和第2组小口径心血管植入物的严重阻塞。 CT血管造影(CTA)结果显示颈动脉的血流状态,并显示第1组和第2组小口径心血管植入物的狭窄程度比其他组更严重。从第30天开始,第3组的小口径心血管植入物内膜增生和管腔阻塞逐渐加重,第90天血流速度降至41.90±5.22cm/s,IMTR为0.74±0.087。血流速度和IMTR的变化均小于对照组。第5组几乎未观察到明显的内膜增生。在第90天时,第5组内膜中胶原纤维的比例仍为15.8±1.3%,明显低于其他四组。上述结果表明,DENND1A激活的神经外泌体的分泌提高了小口径心血管植入物抵抗内膜增生和维持长期通畅的能力。此外,第3组的小口径心血管植入物内重建的血管平滑肌细胞具有明显的合成表型,血管内膜中也有大量I型胶原存在。相比之下,第4组血管植入物内平滑肌细胞的收缩表型标记物显著升高,Ⅰ型胶原含量显著降低。在第5组,血管平滑肌细胞表现出明显的收缩表型,Ⅰ型胶原分泌量呈正常水平。所有这些结果表明,小口径心血管植入物和按需可编程双层响应释放***可以改善在高血糖条件下血管植入物内的平滑肌细胞的神经调节,降低高糖损伤,预防血管平滑肌细胞异常表型转化及抑制血管内膜增生,促进糖尿病下小口径植入物的长期通畅。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释,其并不是对本发明的限制,本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改,但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学
<120> 一种小口径心血管植入物及其制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacctggggg agtattgcgg aggaaggtt 29
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actcccccag gtgtttttt 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttttttaacc ttcctccg 18
Claims (10)
1.一种小口径心血管植入物,其特征是:包括心血管植入物本体和孵育在心血管植入物本体外表面的双层响应性凝胶;所述双层响应性凝胶的内层为ATP响应水凝胶,所述ATP响应水凝胶包含有DENND1A蛋白;所述双层响应性凝胶的外层为ROS响应性水凝胶,所述ROS响应性水凝胶包含有神经轴突导向分子-1。
2.根据权利要求1所述的一种小口径心血管植入物,其特征是,所述ATP响应水凝胶的制备方法为:将八臂PEG叠氮化物和ATP响应分子按照摩尔质量比1:3~1:5混合,再混入1%~10%DENND1A蛋白,在室温下反应5~20min即可成胶;
所述ROS响应水凝胶的制备方法为:将八臂PEG叠氮化物和ROS响应分子按照摩尔质量比1:3~1:5混合,再混入1%~10%神经轴突导向分子-1,在室温下反应5~20min即可成胶。
3.根据权利要求1所述的一种小口径心血管植入物,其特征是:所述小口径心血管植入物为管状,口径为0.5~4mm,长度为0.5~20cm。
4.一种小口径心血管植入物的制备方法,其特征是,步骤如下:
(1)构建小口径心血管植入物本体;
(2)制备ATP响应分子和ROS响应分子;
(3)使用八臂PEG叠氮化物、ATP响应分子和DENND1A蛋白制备ATP响应水凝胶混合液;使用八臂PEG叠氮化物、ROS响应分子和神经轴突导向分子-1制备ROS响应性水凝胶混合液;
(4)使所述ATP响应水凝胶混合液和ROS响应性水凝胶混合液依次在所述心血管植入物本体表面成胶,获得小口径心血管植入物。
5.根据权利要求4所述的一种小口径心血管植入物的制备方法,其特征是,步骤(1)所述的心血管植入物本体的制备方法如下:
先使用脱细胞液脱去离体血管中的细胞;然后使用核酸酶脱去所述离体血管中的核酸,获得血管基质材料;再在所述血管基质材料表面孵育胶原和血管内皮生长因子(VEGF),获得心血管植入物本体。
6.根据权利要求5所述的一种小口径心血管植入物的制备方法,其特征是,所述心血管植入物本体的具体制备步骤为:
A.所述脱细胞液为0.025%~0.25%的胰蛋白酶,所述脱细胞液与离体血管在0℃~37℃下振荡反应30min~90min完成脱细胞;所述核酸酶为DNA酶和RNA酶,所述核酸酶与离体血管在0℃~37℃下振荡反应10min~45min,完成脱核酸,获得血管基质材料;
B.用PBS溶液洗涤所述血管基质材料后,再所述血管基质材料的表面孵育10%-50%胶原;然后在0℃~37℃下与100~500ng/ml血管内皮生长因子((VEGF))交联12~36h,获得心血管植入物本体。
7.根据权利要求4所述的一种小口径心血管植入物的制备方法,其特征是:步骤(2)所述的ATP响应分子由ATP核酸适配体、ssDNA1和ssDNA2按照1:1:1~1:2:2的比例,在0℃~50℃下反应6h~24h而成。
8.根据权利要求7所述的一种小口径心血管植入物的制备方法,其特征是:所述ATP核酸适配体的序列为CACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGTT;所述ssDNA1的序列为5’-ACTCCCCCAGGTGTTTTTT-NH2-DBCO-3’;所述ssDNA2的序列为5’-DBCO-NH2-TTTTTTAACCTTCCTCCGC-3’。
9.根据权利要求4所述的一种小口径心血管植入物的制备方法,其特征是:步骤(3)述的ROS响应分子为氨基硫代缩酮和二苯并环辛炔(DBCO)按照摩尔质量比1:1~1:3,在0℃~75℃,搅拌反应30min~2h而成。
10.根据权利要求4所述的一种小口径心血管植入物的制备方法,其特征是:步骤(4)所述的ATP响应水凝胶混合液和ROS响应性水凝胶混合液依次在所述心血管植入物本体表面成胶的具体步骤如下:
a.先将心血管植入物本体的两端用1-0手术线扎住后,浸入所述ATP响应水凝胶混合液中,然后取出,使所述心血管植入物本体的表面覆盖一薄层混合液Ⅰ,等待所述薄层混合液Ⅰ反应成胶;
b.然后再将所述心血管植入物本体浸入所述ROS响应性水凝胶混合液中,再取出,使所述心血管植入物本体表面覆盖一薄层混合液Ⅱ,等待所述薄层混合液Ⅱ反应成胶后,将血管植入物两端手术线解开。
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CN202111646402.5A CN114306747A (zh) | 2021-12-29 | 2021-12-29 | 一种小口径心血管植入物及其制备方法 |
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US20010044654A1 (en) * | 2000-04-28 | 2001-11-22 | Changyi Chen | Decellularized vascular prostheses resistant to thrombus occlusion and immunologic rejection |
CN111544658A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-08-18 | 中国人民解放军陆军军医大学 | 一种调控免疫反应和促进内膜再生的心血管植入物及其制备方法 |
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Non-Patent Citations (1)
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