CN114306620A - 基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物及其制备方法和应用 - Google Patents

基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物(IDNPs)及其制备方法和应用。通过化学键酰胺化反应偶联吲哚胺‑2，3‑双加氧酶抑制剂(IDOi)和代谢重编程剂DON得到的前药分子IDOi‑DON，能够在肿瘤微环境中酶解断裂，外面包覆天然生物相容的血清白蛋白，能够提高药物的稳定性，降低药物的毒副作用，在肿瘤部位富集，通过两个药物的协同作用，可以达到抑制肿瘤细胞的IDO活性、抑制Treg细胞增殖同时激活CD8+T细胞的作用，协同增强抗肿瘤免疫治疗效果。

Description

基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗通过激发机体抗肿瘤免疫应答来杀伤或抑制肿瘤生长，是近年来肿瘤领域革命性的突破。但仍存在一个重要问题就是无法克服肿瘤微环境形成的免疫耐受，肿瘤代谢旺盛导致的免疫微环境形成了对免疫细胞的代谢抑制，无法对肿瘤细胞进行有效的识别和杀伤。因此针对肿瘤免疫抑制的代谢靶点，开发诱导可控免疫反应的功能型的代谢检查调节剂，对癌症免疫治疗具有重要意义。
肿瘤免疫治疗通过激活免疫细胞来识别并清除肿瘤细胞，以此来达到抑制肿瘤进展。肿瘤免疫抑制微环境是导致肿瘤生长、转移的关键因素，肿瘤微环境中的多种免疫抑制性细胞可以抑制抗肿瘤免疫反应，例如白细胞介素-10(IL-10)，吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)等。肿瘤微环境中免疫抑制因子严重抑制免疫细胞的活化、迁移和分化，限制了抗肿瘤免疫治疗响应性。1-MT、NLG919等IDO抑制剂能够抑制色氨酸的降解，扭转树突状细胞对T细胞的抑制，激活T细胞产生免疫反应最终抑制或消灭肿瘤。但由于免疫抑制微环境的复杂性，仅抑制一条免疫抑制的通路很难实现T 细胞的重新激活，IDOi在临床研究中表现出微弱的抗肿瘤作用和明显的药物副作用。因此，亟需设计同时靶向多个靶点的制剂或分子，提高免疫治疗效果。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物及其制备方法和应用。通过化学键酰胺化反应偶联吲哚胺 -2，3-双加氧酶抑制剂(IDOi)和代谢重编程剂DON得到前药分子IDOi-DON，再在外面包覆天然生物相容人血清白蛋白，得到所述基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物。
本发明提供一种基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物，包括前药分子内核和外面包覆的人血清白蛋白，所述前药分子为吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂和代谢重编程剂的偶联分子，所述偶联方式为酰胺键偶联。
进一步的，所述代谢重编程剂为谷氨酰胺拮抗剂。
进一步的，所述代谢重编程剂选自6-重氮-5-氧代-正亮氨酸、5-重氮-4- 氧代-L-正缬氨酸、L-(α-S,5S)-α-氨基-3-氯-4,5-二氢-5-异噁唑乙酸、氮杂丝氨酸中的任意一种，其连接原理相同。
进一步的，所述吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂为免疫活化剂。
进一步的，所述免疫活化剂为1-甲基色氨酸。
进一步的，所述人血清白蛋白通过疏水作用包覆所述前药分子内核。
进一步的，所述前药分子内核的结构如式(I)所示：
Figure BDA0003397696210000021
其中，n为0、1、2、3、4、5、6、7中的任意一种；R1和R2选自H或烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、烯基、取代的烯基、环烯基、取代的环烯基、杂芳基、取代的杂芳基；R3是H或能够与相邻于R3的氮形成酰胺键、氨基甲酸酯键、氨基磷酸酯键、二氨基磷酸酯键；R3'选自H或C1-C8烷基、取代的C1-C8 烷基，或R3和R3'一起形成包含-C(＝O)-G-C(＝O)-的环结构，其中G选自由以下组成的组：C1-C8亚烷基、C1-C8杂亚烷基、C5-C8环亚烷基、C6-C12 亚芳基、C5-C12杂亚芳基、二价C4-C10杂环，其各自可任选地被取代。
本发明还提供所述的基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物的制备方法，包括如下步骤：
(1)合成9-芴基甲氧基羰基保护的(吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂)- 代谢重编程剂；
(2)脱去9-芴基甲氧基的羰基制备(吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂)- 代谢重编程剂前药分子；
(3)(吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂)-代谢重编程剂的人血清白蛋白纳米药物的制备。
进一步的，所述步骤(1)中异丙基-代谢重编程剂和9-芴基甲氧基羰基-吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂在苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和二异丙基乙胺存在条件下，偶联生成9-芴基甲氧基羰基保护的吲哚胺 -2，3-双加氧酶抑制剂-代谢重编程剂。
进一步的，所述步骤(2)中将步骤(1)得到的产物在哌啶的作用下过夜反应脱去9-芴基甲氧基的羰基获得所述前药分子。
进一步的，所述步骤(3)中(1)将步骤(2)得到的前药分子溶解于有机溶剂中，在外力持续作用下，缓慢把所述前药分子溶液滴入人血清白蛋白的水溶液中，诱导人血清白蛋白分子自组装，纯化、过滤，得到所述的基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物。
本发明还提供所述的基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物在肿瘤免疫治疗中的应用。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
(1)本发明通过通过化学偶联IDOi和代谢重编程剂制备前药分子，能够在肿瘤微环境酶解断裂成两个作用药物分子，时空协同作用肿瘤细胞，抑制肿瘤生长。
(2)本发明利用疏水药物诱导的人血清白蛋白分子自组装技术，制备IDOi-DON的白蛋白纳米药物(IDNPs)，可以提高药物的稳定性，降低药物的毒副作用，提高肿瘤部位富集，提高肿瘤治疗效率，并具有很好的生物安全性，克服IDOi和DON在临床应用面临的毒性挑战。
(3)本发明的IDOi抑制Treg细胞增殖和DON激活CD8+T细胞协同增强抗肿瘤免疫应答，有效提高免疫治疗效应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为IDOi-DON的核磁共振氢谱。
图2为IDOi-DON的质谱图。
图3为IDNPs的粒径分布和透射电镜图像。
图4为IDNPs对SPCA1肺癌细胞的生长抑制评价。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
吲哚胺-2，3-双加氧酶(Indoleamine-2,3-dioxygenase，IDO)介导的色氨酸代谢产物是抗肿瘤免疫抑制的重要生理物质，因而IDO是肿瘤免疫治疗的重要的代谢靶点(代谢检查点)。IDO具有催化色氨酸降解的能力，通过IDO介导的代谢产物犬尿氨酸不但能够促新血管生成，还能抑制免疫细胞的功能，从而逃逸机体对肿瘤细胞的监控和清除能力。IDO在肿瘤和肿瘤转移***中高表达，并且参与了肿瘤的免疫耐受机制。以1-甲基色氨酸(1-MT)为代表的IDO抑制剂(IDO inhibitor，IDOi)可以通过增强抗肿瘤免疫应答来抑制肿瘤细胞的生长。但在临床前的研究中，IDOi只表现出中等的体内抗肿瘤活性，且联合给药受到复杂的药代动力学和药物-药物相互作用的限制，因此需要设计可以靶向多个代谢检查点的一个分子，克服这些固有的挑战性问题。
代谢重编程也是恶性肿瘤的标志，癌症进展依赖于代谢重编程，通过抑制肿瘤某些代谢途径也是治疗癌症的一种重要方法。谷氨酰胺代谢与肿瘤生长和生存也密切相关，谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的作用下生成谷氨酸，随后谷氨酸转化为α-酮戊二酸，进入三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循环，对合成代谢起到重要的作用。一种谷氨酰胺的结构类似物6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(DON)可以非常广谱且有效的抑制以谷氨酰胺为底物的酶的活性，DON阻断谷氨酰胺代谢，会抑制肿瘤细胞的氧化磷酸化，同时可以促进CD8+T细胞的增殖和激活，进而与IDOi协同作用以确保强烈、持续的免疫响应的发生。但氧化磷酸化代谢途径在T细胞中却是升高的，可以激活CD8+T细胞，增强抗肿瘤免疫治疗。但DON由于其毒性太大而终止于临床II期试验，被限制了应用。通过简单的联合用药会面临复杂的药物动力学问题，并且不能规避药物副作用，因此，通过化学偶联的IDOi和 DON，是能靶向两条免疫代谢途径、抑制肿瘤细胞代谢同时增强T细胞活性、减弱药物副作用的可行方法，有望全面提高对肿瘤生长抑制。
人血清白蛋白(Human SerumAlbumin，HSA)包裹制备纳米颗粒可以增加药物的生物利用率，并利用HSA的生物相容性和实体瘤的高通透性和滞留(Enhanced Permeabilityand Retention，EPR)效应的被动靶向，增加纳米药物在肿瘤部位的富集，并可以克服临床毒性的挑战。
纳米技术的迅猛发展使得肿瘤的靶向治疗和体内诊断有了一个飞跃的发展。纳米材料作为药物载体，可以提高药物的稳定性，降低药物的毒副作用，使药物在肿瘤部位精确释放或者达到缓释和控制释放的效果，克服传统药物生物利用度低和不良反应严重等缺点。
基于以上原因，本发明设计了一种包封代谢重编程剂-免疫活化剂前药的蛋白纳米药物，其抗肿瘤作用的机理为：该纳米药物的抗肿瘤作用内核为双代谢靶点的IDOi-DON前药分子。该前药分子IDOi-DON通过IDOi和DON的酰胺化偶联、脱保护基团所得。通过化学偶联IDOi和代谢重编程剂DON制备的前药分子，能够在肿瘤微环境酶响应断裂，外面包覆天然生物相容血清白蛋白，这种功能蛋白纳米药物能够在肿瘤部位富集，抑制肿瘤细胞的氧化磷酸化、抑制Treg细胞增殖同时激活CD8+T细胞，增强抗肿瘤免疫治疗效应。
本发明的基于代谢检查点的纳米前药是一种双药物偶联前药分子，是代谢重编程剂-免疫活化剂偶联的前药分子(IDOi-DON)。
所述代谢重编程剂-免疫活化剂偶联的前药分子(IDOi-DON)具有式(I) 的结构。
所述代谢重编程剂是谷氨酰胺拮抗剂。
所述代谢重编程剂选自6-重氮-5-氧代-正亮氨酸(DON)、5-重氮-4-氧代 -L-正缬氨酸(L-DONV)、阿西维辛(acivicin)(L-(α-S,5S)-α-氨基-3-氯-4,5- 二氢-5-异噁唑乙酸)和氮杂丝氨酸中的任意一种。
所述免疫活化剂是吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂(IDOi)1-甲基色氨酸。
所述双药物偶联前药分子的制备方法包括：将Fmoc基团保护的1-甲基色氨酸(1-MT)和异丙基-DON通过酰胺键偶联，将所获得的偶联分子通过水解反应脱离Fmoc基团得到双药物偶联前药分子，具体包括如下步骤：
(1)异丙基-DON和9-芴基甲氧基羰基-1-甲基色氨酸在苯并三氮唑 -N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和二异丙基乙胺存在条件下，偶联生成Fmoc保护的IDOi-DON；
(2)步骤(1)得到的Fmoc保护的IDOi-DON在哌啶的作用下过夜反应脱去Fmoc保护基团获得目标产物IDOi-DON；
本发明还提供一种基于谢检查点-免疫活化剂前药的人血清白蛋白纳米药物(IDNPs)的制备方法，利用IDOi-DON疏水性诱导人血清白蛋白(HSA) 分子自组装制备出功能蛋白纳米药物。
所述蛋白纳米药物的制备方法，利用所得到的IDOi-DON分子具有疏水性，可以在外力作用下，诱导白蛋白分子自组装，制备得到IDNPs功能蛋白纳米药物。包括以下步骤：
(1)将化学合成得到的IDOi-DON分子溶解于少量有机溶剂中，在外力持续作用下，如超声、搅拌、涡旋振荡，缓慢把IDOi-DON溶液滴入HSA 的水溶液中，诱导白蛋白分子自组装。所述有机溶剂包括易挥发有机溶剂和不易挥发有机溶剂。
(2)纯化第一步所得纳米颗粒溶液，除去游离药物分子，得到功能蛋白纳米颗粒溶液经过220nm的滤膜过滤后得到IDNPs功能蛋白纳米药物溶液。所述纯化手段包括透析、超滤、离心。
本发明还提供体外IDOi-DON的白蛋白纳米药物(IDNPs)抗肿瘤治疗的验证实验，在体外CD19+SPCA1肿瘤模型中，肿瘤细胞与IDNPs纳米颗粒共孵育72小时，在肿瘤细胞内谷胱甘肽作用下，IDNPs分解成IDOi和 DON，协同杀伤肿瘤细胞。
以下实施例中的吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂以1-甲基色氨酸(1-MT) 为例，代谢重编程剂以6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(DON)为例，来展示本发明的基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物(IDNPs)的制备方法，由于吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂之间具有类似的结构，代谢重编程剂之间也具有类似的结构，本领域技术人员根据本发明实施例中的方法能够推及使用其他的吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂和代谢重编程剂也能够实现制备出所述纳米药物的目的。
实施例1 9-芴基甲氧基羰基保护的IDOi-DON的合成
具体制备方法如下：
称取880mg的9-芴基甲氧基羰基-1-甲基色氨酸(2.06mmol，1.1当量) 和854mg的HBTU(2.25mmol，1.2当量)溶解于14mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后依次加入980μL二异丙基乙胺(727mg，5.63mmol， 3当量)和异丙基-DON(400mg，1.88mmol，1当量)的干燥DMF溶液，在惰性气体氛围下搅拌4小时。
旋转蒸发除去DMF，加入100mL二氯甲烷(DCM)，所得有机溶液分别依次用100mL饱和碳酸氢钠(NaHCO3)溶液、水、1mol/L盐酸(HCl)、水和饱和氯化钠(NaCl)溶液洗涤，并用无水硫酸镁干燥。蒸发掉DCM柱层析(分离溶剂：二氯甲烷/乙酸乙酯＝5/1)分离提纯得到淡黄色固体产物，即为9-芴基甲氧基羰基-IDOi-DON，合成路线如下所示。
Figure BDA0003397696210000081
实施例2脱去9-芴基甲氧基的羰基制备IDOi-DON
称取9-芴基甲氧基羰基-IDOi-DON(900mg，2.07mmol，1当量)溶解在10mL干燥的DCM中，缓慢逐滴加入哌啶(514μL，5.17mmol，2.5 当量)，然后持续在常温下搅拌4小时。
旋转蒸发和真空泵抽除有机溶剂，柱层析分离(分离溶剂：氯仿/甲醇＝ 30/1)纯化得到黄色产物IDOi-DON，合成路线如下所示。
Figure BDA0003397696210000091
对所得到的IDOi-DON进行表征，其核磁共振氢谱如图1所示，其中～3.7ppm的峰属于吲哚环上的-CH3，～1.3ppm的峰归属于异丙基的两个 -CH3。IDOi-DON的质谱如图2所示，其中414m/z归属于所述制得IDOi-DON的质子化峰。
实施例3 IDOi-DON的人血清白蛋白纳米药物(IDNPs)的制备具体包括如下步骤：
(1)将化学合成得到的IDOi-DON分子溶解于少量有机溶剂中，人血清白蛋白(HSA)的水溶液使用VCX130超声破碎仪超声5min，期间逐滴加入IDOi-DON溶液，诱导白蛋白分子自组装。
(2)将步骤(1)得到的溶液转移到10kDa超滤管中，离心，去离子水洗涤多次除去游离药物分子，得到功能蛋白纳米颗粒溶液经过220 nm的滤膜过滤后得到IDNPs功能蛋白纳米药物溶液。
本实施例对纳米颗粒进行了表征与鉴定，如图3所示，IDNPs透射电镜图展现出完整的球形结构，动态光散射检测结果表面粒径在100nm左右，符合电镜结果。
实施例4 IDNPs对肿瘤细胞杀伤实验
将1×106个培养的SPCA1细胞种到96孔培养板中，在37℃，5％CO2的条件下孵育24h，分组加入不同浓度的IDNPs溶液和1mM、2mM的谷胱甘肽(GSH)，继续共孵育72h后，利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖。如图4所示，在GSH的作用下，IDNPs纳米药物展示了对肿瘤细胞的生长抑制，抑制效率与IDNPs中IDOi-DON浓度呈正比。
本发明公开了一种基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物(IDNPs) 及其制备方法和应用。通过化学键酰胺化反应偶联吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂(IDOi)和代谢重编程剂DON得到的前药分子IDOi-DON，能够在肿瘤微环境中酶解断裂，外面包覆天然生物相容血清白蛋白，能够提高药物的稳定性，降低药物的毒副作用，在肿瘤部位富集，通过两个药物的协同作用，可以达到抑制肿瘤细胞的IDO活性、抑制Treg细胞增殖同时激活 CD8+T细胞的作用，协同增强抗肿瘤免疫治疗效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物，其特征在于，包括前药分子内核和外面包覆的人血清白蛋白，所述前药分子为吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂和代谢重编程剂的偶联分子，所述偶联方式为酰胺键偶联。
2.根据权利要求1所述的基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物，其特征在于，所述代谢重编程剂为谷氨酰胺拮抗剂。
3.根据权利要求2所述的基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物，其特征在于，所述代谢重编程剂选自6-重氮-5-氧代-正亮氨酸、5-重氮-4-氧代-L-正缬氨酸、L-(α-S,5S)-α-氨基-3-氯-4,5-二氢-5-异噁唑乙酸、氮杂丝氨酸中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物，其特征在于，所述吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂为免疫活化剂。
5.根据权利要求4所述的基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物，其特征在于，所述免疫活化剂为1-甲基色氨酸。
6.根据权利要求1所述的基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物，其特征在于，所述人血清白蛋白通过疏水作用包覆所述前药分子内核。
7.根据权利要求1所述的基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物，其特征在于，所述前药分子内核的结构如式(I)所示：
Figure FDA0003397696200000011
其中，n为0、1、2、3、4、5、6、7中的任意一种；R1和R2选自H或烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、烯基、取代的烯基、环烯基、取代的环烯基、杂芳基、取代的杂芳基；R3是H或能够与相邻于R3的氮形成酰胺键、氨基甲酸酯键、氨基磷酸酯键、二氨基磷酸酯键；R3'选自H或C1-C8烷基、取代的C1-C8烷基，或R3和R3'一起形成包含-C(＝O)-G-C(＝O)-的环结构，其中G选自由以下组成的组：C1-C8亚烷基、C1-C8杂亚烷基、C5-C8环亚烷基、C6-C12亚芳基、C5-C12杂亚芳基、二价C4-C10杂环，其各自可任选地被取代。
8.权利要求1所述的基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)合成9-芴基甲氧基羰基保护的(吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂)-代谢重编程剂；
(2)脱去9-芴基甲氧基的羰基制备(吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂)-代谢重编程剂前药分子；
(3)(吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂)-代谢重编程剂的人血清白蛋白纳米药物的制备。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中异丙基-代谢重编程剂和9-芴基甲氧基羰基-吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂在苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和二异丙基乙胺存在条件下，偶联生成9-芴基甲氧基羰基保护的吲哚胺-2，3-双加氧酶抑制剂-代谢重编程剂。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中将步骤(1)得到的产物在哌啶的作用下过夜反应脱去9-芴基甲氧基的羰基获得所述前药分子。
11.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中(1)将步骤(2)得到的前药分子溶解于有机溶剂中，在外力持续作用下，缓慢把所述前药分子溶液滴入人血清白蛋白的水溶液中，诱导人血清白蛋白分子自组装，纯化、过滤，得到所述的基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物。
12.权利要求1-7任一项所述的基于代谢检查点的人血清白蛋白纳米药物在肿瘤免疫治疗中的应用。
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