CN114304150A

CN114304150A - 一种烟蚜忌避、毒杀抑制剂及其制备方法

Info

Publication number: CN114304150A
Application number: CN202210019840.7A
Authority: CN
Inventors: 赖荣泉; 杨晨; 李馨; 米月娥
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2022-01-10
Filing date: 2022-01-10
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2042-01-10
Also published as: CN114304150B

Abstract

本发明公开了一种烟蚜忌避、毒杀抑制剂及其制备方法。活性成分邻苯二甲酸二丁酯、二烯丙基二硫和2，6‑二叔丁基对甲酚复配使用时，对烟蚜的触杀和忌避活性显著提高，且可显著抑制羧酸酯酶的活性。本发明所述抑制剂可直接用于控制烟蚜的发生、危害及蚜传病毒病害对烟叶的损失。同时，可有效减少化学农药的使用，减少环境污染和提高烟叶及其它植物的安全性。

Description

一种烟蚜忌避、毒杀抑制剂及其制备方法

技术领域

本发明具体涉及一种利用大蒜根系分泌物主要成分及其混合物对烟蚜忌避、毒杀抑制的方法。

背景技术

烟蚜Myzus persicae（Sulzer），隶属于半翅目Hemiptera，蚜科Aphididae，又被称为桃蚜，是我国重要的农业害虫，主要危害烟草以及多种十字花科蔬菜等植物（G. Weber,1985），在我国的各大烟草生产地区都有发生，且危害性较大。烟蚜分泌蜜露诱发煤污病，阻碍光合作用的进行，对烟草的品质和产量产生了极大的影响，减少烤烟的产量，降低烤烟的品质，并传播多种烟草病毒病从而间接危害烟株，给烟草经济产业带来了很大的损失，1头烟蚜造成的经济损失率=0.0695%（袁锋等，1994；蔺忠龙等，2011）。近年来，伴随着化学农药的大面积使用，诱导烟蚜对化学农药产生免疫进而产生抗药性，如贵州大部分烟草产区的烟蚜对啶虫脒产生了中等水平抗性，少部分地区对溴氰菊酯产生了极高水平抗性（孟建玉等，2017；徐继伟等，2018），同时造成烟蚜天敌数量减少，生态平衡失调等问题（朱秀珍等，2011），随着人们环保意识的提高，生物合成农药的使用值得人们商榷。根系分泌物被定义为在一定的环境条件下，活植物通过不同根系部位释放到根系环境中的有机物的总称（肖蓉等，2021），大蒜（Allium sativum L.）隶属于大蒜百合科，具有一定的抑菌杀菌功效，此外大蒜中所含的精油的对昆虫有明显的毒杀作用，如大蒜精油对锈赤扁谷盗的熏蒸毒杀作用明显，24h处理时间下，大蒜精油对锈赤扁谷盗成虫的LC₅₀为0.7827uL/L（源丽枫等，2017）。目前已有许多研究和报道：大蒜轮作对控制烟草炭疽病有一定作用，大蒜茎叶、根系提取物浓度在0.5g/mL时，对烟草炭疽病菌的抑制率均为100%（王军等，2018）；大蒜对许多蔬菜都具有化感作用，如大蒜与黄瓜轮作后，黄瓜疫病的发生得到了有效降低，紫皮蒜蒜瓣浸提液浓度为0.25mg/mL时，对甜瓜疫霉的游动孢子萌发的抑制率为98%（吴家庆等，2019）；大蒜根系分泌物对烟草的根长和鲜重有明显的促进作用，但对苗高有一定的抑制作用（郭萍婷等，2019；吴晓婷等，2019）。利用大蒜提取物中的有效成分防治烟蚜，已经成为我国对防治烟蚜植物源农药的研究热点。但大蒜根系分泌物中的有效成分，特别是其混配对烟蚜的触杀和忌避作用目前尚未见报道。

烟蚜的羧酸酯酶（CarE）和乙酰胆碱酯酶（AchE）活性水平与其耐药性和抗药性水平相关（William et al., 2000）。稻纵卷叶螟的解毒酶活性越高，其对农药的敏感性越低（王彩云等，2017）。提高羧酸酯酶的活性可以增强烟蚜的解毒能力，羧酸酯酶与药剂结合后可以降低药剂对于乙酰胆碱酯酶的抑制（王开运等，2000；宋春满和李天飞，2011）。

因此，本发明在对大蒜根系分泌物成分分析的基础上，选取邻苯二甲酸二丁酯、2，6-二叔丁基对甲酚、二烯丙基二硫3种试剂进行试验。采用叶碟法测定了该3种试剂及其混配对烟蚜的忌避、毒杀活性的影响；以及采用ELISA检测试剂盒测定了这3种试剂及其混配对烟蚜解毒酶的影响，为研制含有该混合物试剂控制烟蚜及其对烟蚜控制作用的生理生化机制提供科学参考。

发明内容

本发明的目的是为了探索大蒜根系分泌物主要成分（邻苯二甲酸二丁酯、二烯丙基二硫和2，6-二叔丁基对甲酚）及其混合物对烟蚜Myzus persicae（Sulzer）的忌避、毒杀作用及其解毒酶的影响。【方法】采用叶碟法测定了邻苯二甲酸二丁酯、二烯丙基二硫和2，6-二叔丁基对甲酚及其混配对烟蚜的忌避、触杀活性影响，并采用ELISA检测试剂盒测定了其对烟蚜解毒酶的影响。【结果】邻苯二甲酸二丁酯、二烯丙基二硫和2，6-二叔丁基对甲酚3种试剂单独使用，在体积比为1:10时，其对烟蚜的忌避和触杀效果较显著（P<0.05）。其中，二烯丙基二硫和邻苯二甲酸二丁酯对烟蚜的忌避活性较高，分别达到97.00%和93.00%；邻苯二甲酸二丁酯和2，6-二叔丁基对甲酚对烟蚜的触杀活性均较高，其校正死率分别达93%和92.00%。当三种试剂混配时，混配比邻苯二甲酸二丁酯、二烯丙基二硫、2，6-二叔丁基对甲酚单独使用的试剂对烟蚜有更显著的忌避活性（P<0.05）和触杀活性（P<0.05）。其中，三种试剂同时混配对烟蚜的触杀和忌避活性均较好，其忌避率在81.00%-93.00%之间；其死亡率在95.00%-98.00%之间。【结论】本研究表明三种试剂混配比使用单种试剂对烟蚜具有更显著的忌避、触杀作用。三种试剂及其混合物对烟蚜的解毒酶活性为：乙酰胆碱酯酶>羧酸酯酶>谷胱甘肽S-转移酶。这为研制含有该混合物试剂控制烟蚜及其对烟蚜控制作用的生理生化机制提供科学参考。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种烟蚜忌避、毒杀抑制剂，所述抑制剂的活性成分由邻苯二甲酸二丁酯、二烯丙基二硫和2，6-二叔丁基对甲酚组成。其中，邻苯二甲酸二丁酯、2，6-二叔丁基对甲酚、二烯丙基二硫的体积比为1：0.2-1：1，优选为1：1：1。

进一步的，将活性成分邻苯二甲酸二丁酯、二烯丙基二硫、2，6-二叔丁基对甲酚分别与乙醇溶液按体积比配置成1:10、1:20、1:30、1:40、1:50的梯度溶液；3种活性物质混配时，选用体积比为1：10的邻苯二甲酸二丁酯、二烯丙基二硫和体积比为1：10-50的2，6-二叔丁基对甲酚按照1：1：1进行混配。

所述的烟蚜忌避、毒杀抑制剂的制备方法：将活性成分邻苯二甲酸二丁酯、二烯丙基二硫和2，6-二叔丁基对甲酚溶于溶剂乙醇溶液中，并加入适量吐温80，搅拌混合均匀。

进一步的，溶剂乙醇溶液的浓度为8wt%。

进一步的，吐温80的用量为0.1ml。

本发明的优点在于：

乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶是昆虫体内重要的解毒代谢酶。本方法发现，在邻苯二甲酸二丁酯、二烯丙基二硫和2，6-二叔丁基对甲酚三种试剂同时混配后对4龄无翅烟蚜进行处理，发现烟蚜体内的羧酸酯酶活性受到了显著抑制，导致烟蚜对有毒物质的解毒能力下降，引起烟蚜死亡，但三种试剂单独使用时对羧酸酯酶活性没有抑制作用，而是促进作用。羧酸酯酶可以与进入昆虫体内的有毒物质迅速结合，将有毒物质在到达靶标作用位点前阻隔或降解。当三种试剂混配后对4龄无翅烟蚜进行处理后，羧酸酯酶活性降低，降解毒素能力下降，因此毒素迅速到达靶标作用位点而发挥作用。谷胱甘肽S-转移酶是昆虫对农药或者有毒物质代谢中重要的共轭酶系之一，它能使外源的亲电基团与体内的还原型谷胱甘肽发生共轭代谢，而保护体内其他亲核的中心。三种试剂混配后对烟蚜谷胱甘肽S-转移酶活性有一定的抑制作用，可能会使谷胱甘肽S-转移酶对内源或外源毒素的降解能力下降。综上所述，三种试剂混配后对烟蚜羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶的活性抑制与其毒杀作用有关，昆虫的解毒代谢能力变弱，最终死亡。羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶是昆虫体内重要的解毒代谢酶，其可能是三种试剂混配后对烟蚜的作用靶标之一。

附图说明

图1为乙酰胆碱酯酶检测结果；

图2为羧酸酯酶检测结果；

图3为谷胱甘肽S-转移酶检测结果。

具体实施方式

为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，作详细说明。本发明的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。

．材料与方法

1.1 试验材料

烟草：烤烟K326品种，在室内盆栽，期间不使用任何农药，备用。

烟蚜：采自三明市烟草公司泰宁分公司试验站田间烟株上的无翅烟蚜，室内饲养2-3代后进行试验。

试剂：邻苯二甲酸二丁酯（纯度99.5%，天津市恒兴化学试剂制造有限公司生产）、2，6-二叔丁基对甲酚（AR，上海麦克林生化科技有限公司生产）、二烯丙基二硫（纯度85%，上海麦克林生化科技有限公司生产）、乙醇（AR，国药集团化学试剂有限公司生产）和吐温80（西陇科学股份有限公司生产）。

其他材料：微量点滴仪（PDE0003型号，上海瑾瑜科学仪器有限公司生产）、培养皿（直径9cm）、滤纸、吸水棉、蒸馏水、电子天平（AUY120日本SHIMADUZA公司生产)、离心管（1.5mL）、毛笔、叶碟；高速冷冻离心机（CR22，德国IKE公司生产）、电热恒温水槽（DK-80，上海恒科技有限公司生产）、乙酰胆碱酯酶ELISA检测试剂盒（江苏博深生物公司生产）、谷胱甘肽 S-转移酶ELISA检测试剂盒（江苏博深生物公司生产）和羧酸酯酶ELISA检测试剂盒（江苏博深生物公司生产）等。

试验方法

1.2.1 单种试剂对烟蚜的生物活性测定

1.2.1.1 单种试剂对烟蚜的忌避活性测定

采用叶片涂抹法（蒋恩顺等，2009），将邻苯二甲酸二丁酯、2，6-二叔丁基对甲酚、二烯丙基二硫试剂用8%乙醇和0.1mL吐温80溶液分别溶解后，稀释为体积比为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50的梯度溶液作为处理。取未受污染、新鲜干净且大小相近的烟叶（长×宽=8cm×5cm）以中间的主叶脉为界，叶片的左右画出相似的区域。用毛笔刷将1 mL不同浓度的处理液均匀地涂抹在一边叶碟正反两面，另一边叶碟用1 mL等量8%乙醇加吐温溶液涂抹（对照）。叶片晾干后，置于具烟草叶片的培养皿（直径为9cm）中，同时用湿棉花在叶柄处保湿。每个培养皿中放置处理和对照各1半烟叶即2半叶碟（8cm×5cm）。然后将试验前已饥饿处理过4 h的大小一致4龄无翅烟蚜依次接入培养皿中（2半烟叶中间）。每皿接入10头烟蚜，每个处理重复5次。及时将培养皿用保鲜膜封口，之后并用针扎50个大小一致的通气孔，目的是保证烟蚜正常呼吸并防止其逃逸。之后将其放置在25±2℃的温室内饲养。分别于处理12 h、24 h和48 h后，观察并记录各培养皿中烟叶对照区、处理区上烟蚜栖息数量（商显坤等，2008），然后根据公式1计算其忌避率。

单种试剂对烟蚜的触杀活性测定

采用点滴法（蒋恩顺等，2009），采用1.2.1.1中的方法分别配置体积比为1:10的三种试剂溶液作为处理。经过仔细挑选出生长健康、大小一致的4龄无翅烟蚜，然后用微量点滴仪（PDE0003型号，上海瑾瑜科学仪器有限公司生产）分别在烟蚜的前胸背板处点滴1μL供试液，然后将试虫转入25±2℃的温室内具有新鲜烟叶叶片的培养皿（直径为9cm）中饲养。每个处理10头烟蚜，重复5次。于处理12h、24h和48h后，观察记录烟蚜的死亡情况（备注：用毛笔轻触蚜虫，不能爬行、翻转或足微抖动虫体均为死亡）。然后根据公式2、3计算烟蚜的死亡率和校正死亡率。

三种试剂混配对烟蚜的生物活性测定

在1.2.1的基础上，筛选出邻苯二甲酸二丁酯、二烯丙基二硫在体积比为1:10时的效果较好，2，6-二叔丁基对甲酚体积比为1:50时的效果较好。因此，进一步探索在此浓度下两两混配是否会有更好的效果。

三种试剂混配对烟蚜的忌避活性测定

采用8%的乙醇和两滴吐温依次对邻苯二甲酸二丁酯、二烯丙基二硫按体积比1:10和2，6-二叔丁基对甲酚按体积比1:50的比例将其配置为相同体积的溶液，配置好后各吸取等量5mL的试剂，两两（体积比1：1）混配和三种（体积比1：1：1）混配。对照滴加等量8%的乙醇加吐温。其它方法同“1.2.1.1”中。

三种试剂混配对烟蚜触杀活性测定

采用8%的乙醇和两滴吐温依次对邻苯二甲酸二丁酯、2，6-二叔丁基对甲酚、二烯丙基二硫按体积比为1:10的比例配置为相同浓度相同体积的溶液，配置好后各吸取等量5mL的试剂，两两（体积比1：1）混配和三种（体积比1：1：1）混配。对照滴等量8%的乙醇加吐温。其它方法同“1.2.1.2”中。

三种试剂及混配对烟蚜解毒酶的影响

在1.2.2试验的基础上，筛选出试验效果较好的体积比为1:10的溶液两两（体积比1：1）混配和三种（体积比1：1：1）混配。其它方法同“1.2.1.2”中。

酶源制备

采用带虫浸液法（袁家瑜等，2020），每个处理或对照选取30头大小一致、活性相同的4龄蚜虫，在7个处理中（如表6）中分别浸渍5s后取出，并用滤纸吸干其药液，放入离心管准备研磨。每个处理设置3个重复。（1）乙酰胆碱酯酶 (AChE）酶源制备：每个离心管中都加0.2mol/ML预冷的磷酸缓冲液（PH 7.0）1.5ml并将其匀浆，之后在温度为：4℃、10 000 r·min^-1下离心20 min，离心后取其上清液作为酶源。(2) 谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）酶源制备：分别加入已经提前预冷好的0.05 mol·l^-1 pH 7.5的Tris-HCl1.5 mL然后进行匀浆操作，在温度4℃、10000r·min^-1下离心15 min，取其上清液作为酶源。（3）羧酸酯酶（CES）酶源制备：分别加入预冷的0.04mol·L^-1 pH 7.5 的Tris-HCl1.5 mL匀浆，在4℃、10000r·min^-1下离心15 min，取其上清液作为酶源。

乙酰胆碱酯AChE酶活力测定

按照江苏博深生物公司试剂盒乙酰胆碱酯酶操作说明书，取一个96孔酶标板，依次设置好标准品孔和样本孔，依次在各标准品孔加入不同浓度的标准品40μL，将配置好的乙酰胆碱酯酶取10μL加入样本孔，然后再加入样本稀释液40μL，特别注意的是空白孔不加任何溶液。样本品孔和标准品孔每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记好的检测抗体100μL，待操作完成后及时用封板膜封住反应孔，37℃恒温箱反应60min。待试验充分反应后撕去封板膜，拍去液体，部分残留液体则在吸水纸上拍干，然后再每一孔加入洗涤液，静置大概1min之后，则快速甩去洗涤液，并在吸水纸上拍干，依次重复5次。待洗板完成之后，每孔依次加入底物A和B各50μL，在15min内，在波长为450nm处测定各孔的OD值并记录乙酰胆碱酯酶AChE酶活力值。

谷胱甘肽S-转移酶GSTs酶活力测定

参照江苏博深生物公司试剂盒谷胱甘肽S-转移酶操作说明书。方法和操作步骤同“1.2.3.2”中，最后计算谷胱甘肽S-转移酶GSTs酶活力。

羧酸酯酶CarE酶活力测定

参照江苏博深生物公司试剂盒羧酸酯酶操作说明书。方法和操作步骤同“1.2.3.2”中，最后计算羧酸酯酶CarE酶活力。

数据处理

使用Excel2010及SPSS22软件进行统计、然后进行单因素方差分析（α=0.05）LSD法比较，所有数据均采用平均值±标准误。

．结果与分析

2.1 单种试剂对烟蚜的生物活性

单种试剂对烟蚜的生物活性，如表1-3。

单种试剂对烟蚜的忌避活性

单种试剂对烟蚜的忌避活性，如表1。

表1 三种试剂对烟蚜的忌避活性

注：表中数据为平均值±标准误；同列数据后不同小写字母表示差异显著性（one-way ANOVA, LSD检验, P<0.05），下同。

从表1可以看出：三种试剂均对烟蚜的忌避活性都较好。同一种试剂不同稀释倍数间，在12h内，其忌避活性最高的是1:10浓度下的二烯丙基二硫，差异极显著（F4,20=2.418,P<0.01），其对烟蚜的忌避率达到97.98%；在24h、48h内，其忌避活性较好的仍然是二烯丙基二硫，其忌避率分别为98.60%和100%，且其差异均达显著水平（F4,20=66.75, P<0.05；F4,20=777.39, P<0.01）。其次，对烟蚜忌避活性较好的是邻苯二甲酸二丁酯，最低是2，6-二叔丁基对甲酚。此外，在同一时间的不同浓度处理下，邻苯二甲酸二丁酯和二烯丙基二硫两种试剂都是随着稀释倍数的减小，其对烟蚜的忌避活性越强。在浓度为1:10时，忌避效果最显著。总体来说，三种试剂的忌避活性由强至弱顺序为：二烯丙基二硫>邻苯二甲酸二丁酯>2，6-二叔丁基对甲酚。

单种试剂对烟蚜的触杀活性

单种试剂对烟蚜的触杀活性，如表2。

表2 三种试剂对烟蚜的触杀活性

从表2可以看出：三种试剂均对烟蚜的触杀活性都较强。同一种试剂不同稀释倍数间，在12h、24h内，触杀活性较高的是1:10浓度下的2，6-二叔丁基对甲酚，其校正死亡率分别达到89.08%和90.90%，且差异显著（F _4,20=2095.54, P<0.01；F _4,20=3727.90, P<0.05）；在48h内，触杀活性较好的二烯丙基二硫，对烟蚜的校正死亡率达到100.00%，差异极显著（F _4,20=39.23, P<0.01）。因此，在同一时间的不同浓度处理下，其死亡率随着稀释倍数的减小而逐渐增强；而在不同时间相同的浓度处理下，时间越长，死亡率越高。总体来说，三种试剂对烟蚜触杀活性由强至弱顺序为：邻苯二甲酸二丁酯>2，6-二叔丁基对甲酚>二烯丙基二硫。

三种不同浓度试剂对烟蚜的触杀和忌避活性回归分析

三种不同浓度试剂对烟蚜的触杀和忌避活性回归分析，如表3。

从表3可以看出：三种不同试剂浓度与其对烟蚜的触杀、忌避活性间存在显著相关（P<0.05）。其中，除2，6-二叔丁基对甲酚对烟蚜的忌避活性与试剂浓度成负相关外，其余的忌避活性和触杀活性均分别与试剂浓度成正相关。

表3 三种不同浓度试剂触杀和忌避活性回归分析结果

注：Y1、Y4分别代表邻苯二甲酸二丁酯的忌避和触杀活性方程；Y₂、Y₅分别代表2，6-二叔丁基对甲酚的忌避和触杀活性方程；Y₃、Y₆分别代表二烯丙基二硫的忌避和触杀活性方程。

三种试剂混配对烟蚜的生物活性测定

2.2.1 三种试剂混配对烟蚜的忌避活性

三种试剂混配对烟蚜的忌避活性，如表4。

表4 三种试剂混配对烟蚜的忌避活性

从表4可以看出：不同试剂混配对烟蚜的忌避活性均较强。在12h、24h和48h内，对烟蚜的忌避活性最高的均是三种试剂同时使用时，其对烟蚜的忌避活性分别达到94.84%、88.92%和81.96%，且差异极显著(F _3,16=852.277, P<0.01；F _3，16=536.215, P<0.01；F _3，16=155.625, P<0.01）。其中，在两两混配的试剂中，对烟蚜忌避率最高的是邻苯二甲酸二丁酯+二烯丙基二硫，最低的是邻苯二甲酸二丁酯+2，6-二叔丁基对甲酚。三种试剂混配对烟蚜的忌避活性都是随着时间增加而逐渐减弱。综上所述，不同试剂混配的忌避活性由强至弱顺序为：邻苯二甲酸二丁酯+二烯丙基二硫+2，6-二叔丁基对甲酚>邻苯二甲酸二丁酯+二烯丙基二硫>二烯丙基二硫+2，6-二叔丁基对甲酚>邻苯二甲酸二丁酯+2，6-二叔丁基对甲酚。

三种试剂混配对烟蚜触杀活性

三种试剂混配对烟蚜的触杀活性，如表5。

表5 三种试剂混配对烟蚜的触杀活性

从表5可以看出：不同试剂混配对烟蚜的触杀活性均较强。在12h、24h和48h内，对烟蚜的触杀活性最高的均是三种试剂同时混配使用，其对烟蚜的校正死亡率为95.14%、97.16%和98.60%，且其差异极显著（F _3，16=18.594, P<0.01；F _3，16=701.459, P<0.01；F _3，16=187.035, P<0.01）。在两两混配的试剂中，对烟蚜触杀活性最高的是邻苯二甲酸二丁酯+2，6-二叔丁基对甲酚，最低的是邻苯二甲酸二丁酯+二烯丙基二硫。不同试剂混配对烟蚜的触杀活性都是随着时间增加而触杀活性逐渐增强。不同试剂混配的触杀活性由强至弱顺序为：邻苯二甲酸二丁酯+二烯丙基二硫+2，6-二叔丁基对甲酚>邻苯二甲酸二丁酯+2，6-二叔丁基对甲酚>二烯丙基二硫+2，6-二叔丁基对甲酚>邻苯二甲酸二丁酯+二烯丙基二硫。

三种试剂及混配对烟蚜解毒酶活力的影响

三种试剂及混配对烟蚜解毒酶活力的影响，如表6。

从表6可以看出，不同试剂及其混配对烟蚜解毒酶乙酰胆碱酯酶（F _6,13=4.837，P<0.01）、羧酸酯酶（F _6,13=3.216，P<0.05）和谷胱甘肽S-转移酶（F _6,13=2.013，P<0.05）均有显著影响。与对照相比，不同处理后的烟蚜乙酰胆碱酯酶活性均显著增高。其中，邻苯二甲酸二丁酯的最高，其酶活力为1.066U/mg；其次是邻苯二甲酸二丁酯+二丙烯基二硫，酶活力为0.91U/mg；最低的是邻苯二甲酸二丁酯+2，6二叔丁基对甲酚+二丙烯基二硫，酶活力仅为0.748U/mg。3种试剂及其组合对烟蚜乙酰胆碱酯酶表现为诱增作用。与对照相比，不同处理后的烟蚜羧酸酯酶中，除邻苯二甲酸二丁酯+2，6二叔丁基对甲酚+二丙烯基二硫组合的酶活力为仅0.609 U/mg外，另外六处试剂组合对烟蚜羧酸酯酶活性均高于对照。其中，羧酸酯酶活性最高的是二丙烯基二硫，其酶活力为0.944 U/mg；其次是邻苯二甲酸二丁酯+二丙烯基二硫，其酶活力为0.912 U/mg；最低的是邻苯二甲酸二丁酯+2，6二叔丁基对甲酚，其酶活力为仅0.677 U/mg。3种试剂及其组合对烟蚜羧酸酯酶表现为诱增作用。与对照相比，不同处理后烟蚜谷胱甘肽S-转移酶活性有四个试验组合高于对照，且与对照相比差异很小，最高的是邻苯二甲酸二丁酯+二丙烯基二硫，其酶活力为0.410 U/mg，其次是邻苯二甲酸二丁酯，其酶活力为0.408 U/mg；最低是邻苯二甲酸二丁酯+2，6二叔丁基对甲酚+二丙烯基二硫，其酶活力为0.345 U/mg。3种试剂及其组合对烟蚜谷胱甘肽S-转移酶表现为抑制作用。综上所述，不同试剂及其混配对烟蚜的解毒酶活性表现为：对烟蚜的乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶表现为诱增作用，而对谷胱甘肽转移酶则表现为抑制作用。

表6 三种试剂及其混配对烟蚜不同解毒酶的酶活力

3．小结与讨论

本试验的试验结果表明：大蒜根系分泌物中的3种试剂邻苯二甲酸二丁酯、二烯丙基二硫、2，6-二叔丁基对甲酚对烟蚜有较显著的忌避、触杀活性，且除2，6-二叔丁基对甲酚对烟蚜的忌避效果外，其他两种试剂浓度越高，对烟蚜的触杀效果越好。在试验浓度中，不同试剂在两两、三种混配时对烟蚜的忌避、触杀效果均比一种试剂单独使用的效果要好特别是当三种试剂同时使用时对烟蚜的忌避、触杀活性最佳。

三种主要试剂及其混配用对烟蚜的忌避活性由强至弱顺序为：邻苯二甲酸二丁酯+二烯丙基二硫+2，6-二叔丁基对甲酚>邻苯二甲酸二丁酯+二烯丙基二硫>二烯丙基二硫+2，6-二叔丁基对甲酚>二烯丙基二硫+2，6-二叔丁基对甲酚>二烯丙基二硫>邻苯二甲酸二丁酯>2，6-二叔丁基对甲酚；而触杀活性由强至弱顺序为：邻苯二甲酸二丁酯+二烯丙基二硫+2，6-二叔丁基对甲酚>邻苯二甲酸二丁酯+二烯丙基二硫>二烯丙基二硫+2，6-二叔丁基对甲酚>邻苯二甲酸二丁酯>2，6-二叔丁基对甲酚>二烯丙基二硫。但关于大蒜根系分泌物主要成分混配使用目前暂未见报道，这对利用大蒜根系分泌物主要成分研制植物源农药提供了一定参考依据。

昆虫在与植物相互进化的过程中，形成了一定的自我调节和反应机制，以对抗不利因素。昆虫体内的解毒酶在自身的生理生化平衡代谢反应方面具有重要的作用，除了参与水解、氧化、还原等酶促反应，还能够将其排除体外，维持体内的生理平衡（刘畅等，2019）。三种试剂及其混配时，烟蚜的解毒酶活性大小为：乙酰胆碱酯酶>羧酸酯酶>谷胱甘肽S-转移酶。三种试剂混配可显著抑制羧酸酯酶的活性乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶是昆虫体内重要的解读代谢酶。本方法发现，在邻苯二甲酸二丁酯、二烯丙基二硫和2，6-二叔丁基对甲酚三种试剂同时混配后对4龄无翅烟蚜进行处理，发现烟蚜体内的羧酸酯酶活性受到了显著抑制，导致烟蚜对有毒物质的解毒能力下降，引起烟蚜死亡，但三种试剂单独使用时对羧酸酯酶活性没有抑制作用，而是促进作用。羧酸酯酶可以与进入昆虫体内的有毒物质迅速结合，将有毒物质在到达靶标作用位点前阻隔或降解。当三种试剂混配后对4龄无翅烟蚜进行处理后，羧酸酯酶活性降低，降解毒素能力下降，因此毒素迅速到达靶标作用位点而发挥作用。谷胱甘肽S-转移酶是昆虫对农药或者有毒物质代谢中重要的共轭酶系之一，它能使外源的亲电基团与体内的还原型谷胱甘肽发生共轭代谢，而保护体内其他亲核的中心。三种试剂混配后对烟蚜谷胱甘肽S-转移酶活性有一定的抑制作用，可能会使谷胱甘肽S-转移酶对内源或外源毒素的降解能力下降。综上所述，三种试剂混配后对烟蚜羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶的活性抑制与其毒杀作用有关，昆虫的解毒代谢能力变弱，最终死亡。羧酸酯酶和谷胱甘肽S-转移酶是昆虫体内重要的解毒代谢酶，其可能是三种试剂混配后对烟蚜的作用靶标之一。昆虫体内相应酶活性可被外源物质激活或抑制，导致害虫对杀虫剂的敏感性产生变化，因此研究烟蚜解毒酶活性，对其抗药性具有重要意义，对农药的研究可提供一定的参考价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种烟蚜忌避、毒杀抑制剂，其特征在于，所述抑制剂的活性成分由邻苯二甲酸二丁酯、二烯丙基二硫和2，6-二叔丁基对甲酚组成。

2.根据权利要求1所述的烟蚜忌避、毒杀抑制剂，其特征在于，邻苯二甲酸二丁酯、2，6-二叔丁基对甲酚、二烯丙基二硫的体积比为1：0.2-1：1。

3.根据权利要求1所述的烟蚜忌避、毒杀抑制剂，其特征在于，邻苯二甲酸二丁酯、2，6-二叔丁基对甲酚、二烯丙基二硫的体积比为1：1：1。

4.根据权利要求1所述的烟蚜忌避、毒杀抑制剂的制备方法，其特征在于，将活性成分邻苯二甲酸二丁酯、二烯丙基二硫和2，6-二叔丁基对甲酚溶于溶剂乙醇溶液中，并加入适量吐温80，搅拌混合均匀。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，溶剂乙醇溶液与活性成分的体积比为10：1。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，溶剂乙醇溶液的浓度为8wt%。