CN114292851B

CN114292851B - 抑制Cnr1基因表达的干扰序列、shRNA慢病毒载体及构建方法和应用

Info

Publication number: CN114292851B
Application number: CN202210030038.8A
Authority: CN
Inventors: 张咏梅; 王颖
Original assignee: Xuzhou Medical University
Current assignee: Xuzhou Medical University
Priority date: 2022-01-12
Filing date: 2022-01-12
Publication date: 2023-08-08
Anticipated expiration: 2042-01-12
Also published as: CN114292851A

Abstract

本发明公开一种抑制Cnr1基因表达的干扰序列、shRNA慢病毒载体及构建方法和应用，本发明针对Cnr1基因编码的1型***素受体CB1R设计了shRNA序列，并构建了相应的shRNA慢病毒载体。通过实验结果证实本发明的shRNA慢病毒能够显著抑制CB1 mRNA和蛋白的表达，同时能够缓解慢性内脏痛和抑郁样行为。鉴于CB1R参与应激反应和抑郁的调节，因此本发明提供的CB1R的shRNA及其相关生物制剂，可用于研究及制备治疗慢性内脏痛和抑郁症的相关疾病的药物。

Description

抑制Cnr1基因表达的干扰序列、shRNA慢病毒载体及构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种抑制Cnr1基因表达的干扰序列、shRNA慢病毒载体及构建方法和应用，属于分子生物学与生物医药技术领域。

背景技术

慢性内脏痛(chronic visceral pain)是一组以不明原因的腹痛或腹部不适，伴有排便习惯和大便性状改变为主要特征的肠道功能性疾病。其典型代表疾病是肠易激综合征(Irritable bowel syndrome，IBS)，最新流行病学显示IBS影响了全球约10％的人口。严重影响病人的健康和生活质量，并伴随着巨大的医疗费用。在IBS患者中，内脏超敏反应是其重要的病理生理特征，表现为机械性刺激引起的结直肠组织疼痛阈值降低，出现痛觉过敏。但由于对其发病机制的认识不足，尚不能对肠易激综合征进行针对性的治疗。因此，探索出新的慢性内脏痛治疗靶点对疾病的治疗，提高病人的生活质量具有非常重要的意义。

目前慢性内脏痛在临床上的治疗方法通常采用体表疼痛的治疗框架和方案，然而，由于内脏的神经支配及其疼痛发病机制与体表疼痛的差异，进行有针对性的治疗就显得十分重要。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性降低或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。miR30shRNA干扰载体***是用于多种哺乳动物细胞中，高效干扰靶基因表达的方法。与常规shRNA载体不同，基于miRNA的shRNA干扰载体***采用了标准RNA聚合酶II启动子，这使得可以运用组织特异性，诱导型或可变强度的启动子进行实验。RNA聚合酶II启动子会驱动包含目的基因和一个或多个基于miR30的靶向目的基因的shRNA(shRNAmiR)多顺反子的表达。shRNAmiR转录物通过胞内micro-RNA途径加工产生成熟的shRNA，促进靶基因mRNA的降解。已有研究证明，shRNAmiR干扰技术参与疼痛的调节。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种抑制Cnr1基因表达的干扰序列、shRNA慢病毒载体及构建方法和应用，可用于研究慢性内脏痛相关疾病的治疗，极具应用前景。

为了实现上述目的，本发明采用的一种抑制Cnr1基因表达的干扰序列，所述干扰序列为shCB1-1或shCB1-2或shCB1-3；

其中，shCB1-1靶位点序列为5’-CCACAGAAATTCCCTCTAA-3’；

shCB1-2靶位点序列为5’-CCATGTATTCCACCGTAAA-3’；

shCB1-3靶位点序列为5’-GCTTATCAAGACGGTGTTT-3’。

本发明的另一目的还提供了一种含有所述抑制Cnr1基因表达的干扰序列的shRNA慢病毒载体。

本发明的又一目的是提供一种所述的shRNA慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤：

S1、合成干扰序列shCB1-1或shCB1-2或shCB1-3；

S2、配制50ul酶切反应体系：质粒2ug、10×反应Buffer 5ul、限制性内切酶各1ul、去离子水补足50ul，于37℃水浴锅中孵育2h以上，得线性化表达载体；其中，表达载体的浓度为40ng/ul；

S3、配制20ul反应体系：1ul目的基因片段、3ul线性化载体、2ul 10×T4 DNAligase Buffer、1ul T4 DNAligase、ddH₂O补齐20ul，该反应体系在16℃中过夜；

S4、将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，挑取平板上长出的转化子重悬于10μlLB培养液中，取1μl做模板进行菌落PCR鉴定；

S5、将菌落PCR鉴定得到的阳性克隆进行测序验证，软件比对测序结果并分析；

S6、测序通过的阳性克隆，安排质粒抽提。

作为优选的，所述步骤S4中将连接产物转化到DH5α感受态细胞的具体步骤为：

(1)将1ul浓度大于10ng/ul的连接产物缓慢加入到感受态细胞中，冰浴30min；

(2)42℃水浴锅热激90s，冰浴2min；

(3)加入500ul无抗生素的培养基，于37℃、220rpm恒温振荡器培养60min；

(4)取80ul转化液，使用涂布棒均匀涂在固体培养基上，于37℃培养箱中过夜培养。

作为优选的，所述步骤S4中的PCR反应条件为：94℃、30s；55℃或60℃、30s；72℃、1min；98℃、10s；68℃、1min。

最后，本发明还提供了一种所述的干扰序列在制备抑制Cnr1基因表达的生物制剂中的应用。

作为优选的，所述干扰序列在制备防治慢性内脏痛和抑郁症的生物制剂中的应用。

与现有技术相比，本发明针对Cnr1基因编码的1型***素受体(CB1R)设计了shRNA干扰序列，并构建了相应的shRNA慢病毒载体。通过实验结果证实本发明的shRNA能够显著抑制CB1 mRNA和蛋白的表达，同时能够缓解慢性内脏痛和抑郁样行为。鉴于CB1R参与应激反应和抑郁的调节，因此本发明提供的CB1R的shRNA及其相关生物制剂，可用于研究及制备治疗慢性内脏痛和抑郁症的相关疾病的药物。

附图说明

图1为本发明实施例1中westernblot检测shRNA慢病毒抑制CB1蛋白表达水平；

图2为本发明实施例2中RT-qPCR检测shRNA慢病毒抑制CB1 mRNA表达；

图3为本发明实施例3中内脏痛阈测试检测内脏痛阈值的变化柱状图；

图4为本发明实施例4中糖水偏好实验的柱状图；

图5为本发明实施例5中强迫游泳测试的柱状图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

一种抑制Cnr1基因表达的干扰序列，干扰序列为shCB1-1或shCB1-2或shCB1-3；

其中，shCB1-1的靶位点序列为5’-CCACAGAAATTCCCTCTAA-3’；

shCB1-2的靶位点序列为5’-CCATGTATTCCACCGTAAA-3’；

shCB1-3的靶位点序列为5’-GCTTATCAAGACGGTGTTT-3’。

一种含有上述干扰序列的能够抑制Cnr1基因表达的shRNA慢病毒载体。

一种上述抑制Cnr1基因表达的shRNA慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤：

S1、人工合成上述的干扰序列shCB1-1或shCB1-2或shCB1-3；

其中，将连接产物转化到DH5α感受态细胞的具体步骤为：

(1)将1ul(浓度大于10ng/ul)的连接产物缓慢加入到感受态细胞中，冰浴30min；

(2)42℃水浴锅热激90s，冰浴2min；

(3)加入500ul无抗生素的培养基，37℃，220rpm恒温振荡器培养60min；

(4)取80ul转化液，使用涂布棒均匀涂在固体培养基上，于37℃培养箱中过夜培养；

另外，PCR反应条件为：94℃、30s；55℃或60℃、30s；72℃、1min；98℃、10s；68℃、1min；

测序结果如下：

shCB1-1表达质粒测序结果如下(SEQ ID NO.1)：

5’-aattttgtaatccagaggttgattatcgataaccggtagtgatttaatttataccattttaattcagctttgtaaaaatgtatcaaagagatagcaaggtattcagttttagtaaacaagataattgctcctaaagtagccccttgaattccgaggcagtaggcatcccacagaaattccctctaactacatctgtggcttcactagttagagggaatttctgtggggcgctcactgtcaacagcaatataccttctcgagccttctgttgggttaacctgaagaagtaatcccagcaagtgtttccaagatgtgcaggcaacgattctgtaaagtactgaagcctcattcaaacaaagcttttatttgtcgtcatcatccttatagtccttatcatcgtcgtctttgtaatccttgtcatcgtcatccttgt-3’；

shCB1-2表达质粒测序结果如下(SEQ ID NO.2)：

5’-catagcgtnaggagcaacatagttaagaataccagtcaatctttcacaaattttgtaatccagaggttgattatcgataaccggtagtgatttaatttataccattttaattcagctttgtaaaaatgtatcaaagagatagcaaggtattcagttttagtaaacaagataattgctcctaaagtagccccttgaattccgaggcagtaggcattccatgtattccaccgtaaagtacatctgtggcttcactactttacggtggaatacatggagcgctcactgtcaacagcaatataccttctcgagccttctgttgggttaacctgaagaagtaatcccagcaagtgtttccaagatgtgcaggcaacgattctgtaaagtactgaagcctcattcaaacaaagcttttatttgtcgtcatcatccttatagtccttatcatcgtcgtctttgtaatccttgtcatcgtcatccttgtagtctccggagcccttgtacagctcgtccatgccgccggtggagtggcggccctcggcgcgttcgtactgttccacgatggtgtagtcctcgttgtgggaggtgatgtccaacttgatgttgacgttgtaggcgccgggcagctgcacgggcttcttggccttgtaggtggtcttgacctcagc-3’；

shCB1-3表达质粒测序结果如下(SEQ ID NO.3)：

5’-aggagcaacatagttaagaataccagtcaatctttcacaaattttgtaatccagaggttgattatcgataaccggtagtgatttaatttataccattttaattcagctttgtaaaaatgtatcaaagagatagcaaggtattcagttttagtaaacaagataattgctcctaaagtagccccttgaattccgaggcagtaggcaaagcttatcaagacggtgtttgtacatctgtggcttcactacaaacaccgtcttgataagctgcgctcactgtcaacagcaatataccttctcgagccttctgttgggttaacctgaagaagtaatcccagcaagtgtttccaagatgtgcaggcaacgattctgtaaagtactgaagcctcattcaaacaaagcttttatttgtcgtcatcatccttatagtccttatcatcgtcgtctttgtaatccttgtcatcgtcatccttgtagtctccggagcccttgtacagctcgtccatgccgccggtggagtggcggccctcggcgcgttcgtactgttccacg-3’；

S6、测序通过的阳性克隆，安排质粒抽提。

实施例1

Western Blot检测，包括以下步骤：

一、组织蛋白样本制备：

1)提取新鲜组织，放入已经预冷的2ml EP管中，做好标记；

2)加入适量预冷的RIPA裂解液和PMSF酶抑制剂，用匀浆器于冰上充分匀浆组织；

3)匀浆后的组织4℃，12000rpm，离心15分钟，取上清液；

4)用BCA法测定样本蛋白浓度后配平，按比例加入蛋白上样缓冲液loadingbuffer(5×)，振荡混匀，沸水煮5min，-20℃冰箱存放备用；

二、聚丙酰胺凝胶的制备：

1)根据碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒，分别配制10％的分离胶和5％的浓缩胶；

2)加入配制好的分离胶后，在其表面加入无水乙醇覆盖，待胶凝固，倒出无水乙醇；

3)配制浓缩胶并尽快加于分离胶上，***样梳，待浓缩胶凝固后，取下夹板，装入电泳槽；

三、上样与电泳：

1)电泳槽中加入电泳液，拔出梳子，电泳液清洗上样孔，将准备好的样本上样；

2)设置参数：第一阶段，80V，40min；第二阶段，100V，1h；溴酚蓝跑至底部，停止电泳；

四、转膜：用湿转转膜仪，将蛋白条带转到PVDF膜上，100V，冰浴转膜1小时；

五、漂洗封闭：转膜结束的PVDF膜用Washing Buffer(1×)漂洗3次，每次5分钟，再放入5％脱脂牛奶封闭液中，室温下，慢速摇床封闭2小时；

六、一抗孵育：PVDF膜从脱脂牛奶中取出，用Washing Buffer(1×)漂洗3次，用1％BSA将一抗稀释，放置于摇床中，4℃孵育过夜；

七、二抗孵育：第二天，用Washing Buffer(1×)将膜漂洗3次，每次5分钟，用1％BSA将二抗稀释，室温下孵育1小时；

八、曝光：用Washing Buffer(1×)在室温下洗4次，每次5分钟；用BIO-RAD成像仪曝光。

结果如图1所示，与shRNA的病毒对照组(病毒对照组序列如SEQ ID NO.4)相比，shCB1-1和shCB1-2的CB1蛋白质表达量明显下降，表明靶点对Cnr1基因的表达在蛋白质水平有显著的敲低作用，是有效靶位点。

实施例2

RT-qPCR检测CB1 mRNA表达：

采用的引物设计如下表1；

表1 RT-qPCR检测中引物设计

RatCnr1F	5’-CACCACAGACCTCCTCTACGT-3’
		RatCnr1R	5’-CATCTTTTCTTGGAAGGGACTAC-3’
RatactinF	5’-TGAGAGGGAAATCGTGCGTG-3’
		RatactinR	5’-AGGGAGGAAGAGGATGCGG-3’

总RNA的提取：

1)用预冷的1.5ml RNase free离心管收集新鲜组织，加入450ul Buffer Rlysis-AG，匀浆器充分匀浆后，静置3min；

2)12000rpm，4℃，离心3min，将上清移至新的1.5ml离心管中，加入上清体积一半的无水乙醇，充分混匀；

3)将吸附柱放入收集管中，将溶液全部转移至吸附柱中，静置1min，室温，12000rpm，离心1min，倒掉废液；

4)将吸附柱放回收集管中，加入500ul GT Solution，静置1min，室温，10000rpm，离心1min，倒掉废液；

5)将吸附柱放回收集管中，加入500ul NT Solution，静置2min，室温，10000rpm，离心1min，倒掉废液；

6)将吸附柱放回收集管中，室温，12000rpm，离心2min；

7)将吸附柱放入1.5ml离心管，在吸附膜中央加入30ul DEPC-treated ddH₂O，静置2min；室温，12000rpm，离心2min；将得到的RNA溶液转移至新的离心管中；

8)测定RNA浓度。

反转录：

组分	体积
		5×PrimScript Buffer	4ul
PrimScript RT Enzyme Mix1	1ul
		Oligo dT Primer	1ul
Random 6mers	1ul
		Total RNA	13ul
RNase Free dH₂O	Upto20ul

反转录反应条件：37℃15min，85℃5sec；

Real-time PCR分析：

(1)Real-time PCR反应体系

组分	体积
		TB Green Premix ExTaqⅡ	7.5ul
PCR Forward Primer(10uM)	0.6ul
		PCR Reverse Primer(10uM)	0.6ul
ROX Reference Dye	0.3ul
		DNA模板	1.5ul
灭菌水	4.5ul
		Total	15ul

(2)Real-time PCR反应条件

95℃，1min；

95℃，10sec；60℃，30sec；72℃，30sec；

95℃，5sec；60℃，1min；50℃，30sec。

结果如图2所示，与shRNA的病毒对照组相比，shCB1-1和shCB1-2的CB1mRNA表达量明显下降，表明靶点对Cnr1基因的表达在mRNA水平有显著的敲低作用，是有效靶位点。

实施例3

内脏痛阈测试，具体步骤如下：

(1)将未充气的球囊涂石蜡油后置于结直肠内，球囊末端距离肛缘0.5cm，胶布固定；

(2)导管经三通连接注射器和血压计，将大鼠放置在清洁台面上观察，约15min后开始实验；

(3)压力从0开始，匀速递增压力，观察使下腹壁明显收缩变直或抬离桌面的最小压力值，记录为痛阈；每个压力测定3次，间隔4min，取平均值；

结果如图3所示，与注射shRNA的病毒对照组相比，shCB1-1和shCB1-2的内脏痛阈值明显升高，表明抑制Cnr1基因能够缓解慢性内脏痛。

实施例4

糖水偏好实验(SPT)，具体步骤如下：

(1)进行适应性训练48h：前24h每笼给予两瓶1％的蔗糖水，随后24h每笼给予1％蔗糖水和纯水各1瓶；

(2)禁食禁水24h后，每笼放1％蔗糖水和纯水各1瓶，允许大鼠自由饮水1h；

(3)收集水瓶称重，记录1h内纯水和蔗糖水的饮用量。糖水偏好百分比＝[蔗糖水饮用量/(蔗糖水饮用量+纯水饮用量)]×100％。

结果如图4所示，与注射shRNA的病毒对照组相比，shCB1-1和shCB1-2的糖水偏好百分比明显升高，表明抑制Cnr1基因能够改善抑郁样行为。

实施例5

强迫游泳测试(FST)，具体步骤如下：

(1)采用高50cm、直径25cm的透明玻璃缸进行强迫游泳测试，将水装至30cm高，水温控制在23-25℃，并用温度计检查；

(2)测试前24h提前进行预测试，共15min；

(3)正式测试5min，记录大鼠在水中漂浮不动的时间。

结果如图5所示，与注射shRNA的病毒对照组相比，shCB1-1和shCB1-2的不动时间明显减少，表明抑制Cnr1基因能够改善抑郁样行为。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> 抑制Cnr1基因表达的干扰序列、shRNA慢病毒载体及构建方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 433

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aattttgtaa tccagaggtt gattatcgat aaccggtagt gatttaattt ataccatttt 60

aattcagctt tgtaaaaatg tatcaaagag atagcaaggt attcagtttt agtaaacaag 120

ataattgctc ctaaagtagc cccttgaatt ccgaggcagt aggcatccca cagaaattcc 180

ctctaactac atctgtggct tcactagtta gagggaattt ctgtggggcg ctcactgtca 240

acagcaatat accttctcga gccttctgtt gggttaacct gaagaagtaa tcccagcaag 300

tgtttccaag atgtgcaggc aacgattctg taaagtactg aagcctcatt caaacaaagc 360

ttttatttgt cgtcatcatc cttatagtcc ttatcatcgt cgtctttgta atccttgtca 420

tcgtcatcct tgt 433

<210> 2

<211> 665

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catagcgtna ggagcaacat agttaagaat accagtcaat ctttcacaaa ttttgtaatc 60

cagaggttga ttatcgataa ccggtagtga tttaatttat accattttaa ttcagctttg 120

taaaaatgta tcaaagagat agcaaggtat tcagttttag taaacaagat aattgctcct 180

aaagtagccc cttgaattcc gaggcagtag gcattccatg tattccaccg taaagtacat 240

ctgtggcttc actactttac ggtggaatac atggagcgct cactgtcaac agcaatatac 300

cttctcgagc cttctgttgg gttaacctga agaagtaatc ccagcaagtg tttccaagat 360

gtgcaggcaa cgattctgta aagtactgaa gcctcattca aacaaagctt ttatttgtcg 420

tcatcatcct tatagtcctt atcatcgtcg tctttgtaat ccttgtcatc gtcatccttg 480

tagtctccgg agcccttgta cagctcgtcc atgccgccgg tggagtggcg gccctcggcg 540

cgttcgtact gttccacgat ggtgtagtcc tcgttgtggg aggtgatgtc caacttgatg 600

ttgacgttgt aggcgccggg cagctgcacg ggcttcttgg ccttgtaggt ggtcttgacc 660

tcagc 665

<210> 3

<211> 549

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggagcaaca tagttaagaa taccagtcaa tctttcacaa attttgtaat ccagaggttg 60

attatcgata accggtagtg atttaattta taccatttta attcagcttt gtaaaaatgt 120

atcaaagaga tagcaaggta ttcagtttta gtaaacaaga taattgctcc taaagtagcc 180

ccttgaattc cgaggcagta ggcaaagctt atcaagacgg tgtttgtaca tctgtggctt 240

cactacaaac accgtcttga taagctgcgc tcactgtcaa cagcaatata ccttctcgag 300

ccttctgttg ggttaacctg aagaagtaat cccagcaagt gtttccaaga tgtgcaggca 360

acgattctgt aaagtactga agcctcattc aaacaaagct tttatttgtc gtcatcatcc 420

ttatagtcct tatcatcgtc gtctttgtaa tccttgtcat cgtcatcctt gtagtctccg 480

gagcccttgt acagctcgtc catgccgccg gtggagtggc ggccctcggc gcgttcgtac 540

tgttccacg 549

<210> 4

<211> 559

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

catagcgtna ggagcaacat agttaagaat accagtcaat ctttcacaaa ttttgtaatc 60

cagaggttga ttatcgataa ccggtaagtg atttaattta taccatttta attcagcttt 120

gtaaaaatgt atcaaagaga tagcaaggta ttcagtttta gtaaacaaga taattgctcc 180

taaagtagcc ccttgaattc cgaggcagta ggcaaggaag tcgtgagaag tagaattaca 240

tctgtggctt cactaattct acttctcacg acttccgcgc tcactgtcaa cagcaatata 300

ccttctcgag ccttctgttg ggttaacctg aagaagtaat cccagcaagt gtttccaaga 360

tgtgcaggca acgattctgt aaagtactga agcctcattc aaacaaactt aaagctttta 420

tttgtcgtca tcatccttat agtccttatc atcgtcgtct ttgtaatcct tgtcatcgtc 480

atccttgtag tctccggagc ccttgtacag ctcgtccatg ccgccggtgg agtggcggcc 540

ctcggcgcgt tcgtactgt 559

Claims

1.一种抑制Cnr1基因表达的干扰序列，其特征在于，所述干扰序列为shCB1-1或shCB1-2或shCB1-3；

其中，shCB1-1靶位点序列为5’-CCACAGAAATTCCCTCTAA-3’；

shCB1-2靶位点序列为5’-CCATGTATTCCACCGTAAA-3’；

shCB1-3靶位点序列为5’-GCTTATCAAGACGGTGTTT-3’。

2.一种含有权利要求1所述的抑制Cnr1基因表达的干扰序列的shRNA慢病毒载体。

3.一种如权利要求2所述的shRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、合成干扰序列shCB1-1或shCB1-2或shCB1-3；

S3、配制20ul反应体系：1ul目的基因片段、3ul线性化载体、2ul 10×T4 DNA ligaseBuffer、1ul T4 DNA ligase、dd H₂O补齐20ul，该反应体系在16℃中过夜；

S4、将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，挑取平板上长出的转化子重悬于10μl LB培养液中，取1μl做模板进行菌落PCR鉴定；

S6、测序通过的阳性克隆，安排质粒抽提。

4.如权利要求3所述的一种shRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中将连接产物转化到DH5α感受态细胞的具体步骤为：

(2)42℃水浴锅热激90s，冰浴2min；

5.如权利要求3所述的一种shRNA慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中的PCR反应条件为：94℃、30s；55℃或60℃、30s；72℃、1min；98℃、10s；68℃、1min。

6.一种如权利要求1所述的干扰序列在制备抑制Cnr1基因表达的生物制剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述干扰序列在制备防治慢性内脏痛和抑郁症的生物制剂中的应用。