CN114288476B - 一种人工硬脑膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人工硬脑膜及其制备方法,所述人工硬脑膜包括I型胶原、抗生素和梯度复合层;所述梯度复合层包括朝向脑组织侧的致密层和朝向颅骨侧的疏松层,且所述I型胶原和所述抗生素分布于所述疏松层内;其中,所述梯度复合层为通过静电纺丝制得的一体结构;所述致密层和所述疏松层均为聚己内酯纤维膜;所述疏松层的孔径大于所述致密层的孔径;在将所述I型胶原、所述抗生素和所述梯度复合层复合后,还对复合后的材料进行交联处理,以得到所述人工硬脑膜。本发明提供的人工硬脑膜具有良好的组织修复性的前提下,其力学性能更佳,可降解且降解产物安全、其降解速度与硬脑膜生成速度更匹配。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域,特别涉及一种人工硬脑膜及其制备方法。
背景技术
硬脑膜是位于人脑组织表面的一道重要屏障,位于颅骨之下,覆盖于脑组织和脊柱之上,是一种厚而坚韧的双层膜,主要作用是保护大脑,防止脑脊液渗漏、维持脑神经稳定。恶性肿瘤硬脑膜转移、肿瘤侵犯以及术中切除受累等是造成硬脑膜损伤的主要原因,同时硬脑膜损伤的患者常伴有广泛的脑肿胀,导致患者的硬脑膜缺损,甚至引发颅内感染、脑膨出、癫痫等严重并发症,因此及时、有效的修复缺损的硬脑膜组织,能够避免上述相关并发症的发生,减少住院时间和成本。目前,常采取硬脑膜重建的方法,将人工脑膜补片用于覆盖脑膜缺损部位,保持颅脑稳定,诱导周边正常脑膜细胞在脑膜补片上生长并向内迁移,分泌胶原及糖类,以形成新生硬脑膜。
理想的人工硬脑膜材料具有以下特点:(1)安全无毒,无炎症反应,不传播病毒性疾病;(2)组织相容性好,无免疫反应;(3)柔性好,细胞粘附性能好;(4)防渗漏性好;(5)无脑组织粘连;(6)可吸收性,新生脑组织形成的同时,人工硬脑膜应逐渐降解吸收;(7)便于手术操作。
近年来,常用的人工硬脑膜的不可吸收材料,如涤纶硅橡胶、膨胀体聚四氟乙烯等,这类材料因具有惰性可防止脑组织粘连,但也同样因其惰性而不可降解,存在二次取出的风险。而可用于人工硬脑膜的可吸收材料,同样存在降解速度与硬脑膜生成速度不匹配,会造成脑脊液渗漏的情况发生;而且降解产物的生物相容性和安全性较差,会产生局部炎症反应,对脑组织产生刺激甚至诱发癫痫等。
发明内容
本发明实施例提供了一种人工硬脑膜及其制备方法,该人工硬脑膜具有良好的组织修复性的前提下,其力学性能更佳,可降解且降解产物安全、其降解速度与硬脑膜生成速度更匹配。
第一方面,本发明提供了一种人工硬脑膜,
所述人工硬脑膜包括I型胶原、抗生素和梯度复合层;
所述梯度复合层包括朝向脑组织侧的致密层和朝向颅骨侧的疏松层,且所述I型胶原和所述抗生素分布于所述疏松层内;其中,所述梯度复合层为通过静电纺丝制得的一体结构;
所述致密层和所述疏松层均为聚己内酯纤维膜;所述疏松层的孔径大于所述致密层的孔径;
在将所述I型胶原、所述抗生素和所述梯度复合层复合后,还对复合后的材料进行交联处理,以得到所述人工硬脑膜。
优选地,所述致密层的孔径为3~5μm,所述致密层的纤维直径为0.1~1μm。
优选地,所述疏松层的孔径为15~25μm,所述疏松层的纤维直径为5~10μm。
优选地,所述I型胶原和所述抗生素的质量比为(10~30):1。
优选地,所述抗生素为亚胺培南-西司他丁钠或盐酸万古霉素。
优选地,所述致密层与所述疏松层的厚度之比为1:(2~5)。
优选地,所述交联处理时所用的交联液浓度为2~30mmol/L,所述交联液为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液。
优选地,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:4。
第二方面,本发明提供了上述第一方面所述的人工硬脑膜的制备方法,所述制备方法包括:
(1)通过静电纺丝制得包括致密层和疏松层的梯度复合层;其中,所述疏松层的孔径大于所述致密层的孔径;
(2)利用I型胶原和抗生素制备胶原涂层液,将所述胶原涂层液涂覆在所述梯度复合层的疏松层上,得到涂覆有I型胶原和抗生素的梯度复合层;
(3)将所述涂覆有I型胶原和抗生素的梯度复合层进行交联处理,得到所述人工硬脑膜。
优选地,在步骤(1)中,所述致密层的纺丝液为质量浓度为60~140g/L的聚己内酯溶液;
所述疏松层的纺丝液为质量浓度为200~300g/L的聚己内酯溶液;
其中,所述聚己内酯溶液中聚己内酯的重均分子量为2~20万,溶剂为体积比为5:1的氯仿和甲醇的混合溶液。
优选地,所述梯度复合层由下而上依次包括所述致密层和所述疏松层;所述致密层通过静电纺丝接收在静电纺丝设备的接收器上,所述疏松层通过静电纺丝接收在所述致密层上。
优选地,所述步骤(1)包括如下子步骤:
(11)将铝箔铺覆在静电纺丝设备的接收器上,将所述铝箔作为接收基底材料,在所述铝箔上采用所述致密层的纺丝液通过静电纺丝形成致密层;
(12)将所述致密层作为接收基底材料,在所述致密层上采用所述疏松层的纺丝液通过静电纺丝形成疏松层,得到所述梯度复合层。
优选地,在步骤(11)中,所述静电纺丝中的注射泵流速为0.5~3mL/h,接收距离为12~25cm,电压为15~19.5KV,接收器转速为100~140r/min;
在步骤(12)中,所述静电纺丝中的注射泵流速为2~6mL/h,接收距离为20~30cm,电压为8~15KV,接收器转速为100~140r/min;
步骤(11)与步骤(12)中的纺丝时间之比为1:(0.5~2.5)。
优选地,步骤(11)中的纺丝时间为30min,步骤(12)中的纺丝时间为60min。
优选地,所述步骤(2)包括如下子步骤:
(21)将I型胶原配制成固含量为0.1~0.8%的胶原凝胶液,在所述胶原凝胶液中加入所述抗生素,得到所述胶原涂层液;其中,所述胶原涂层液中所述I型胶原和所述抗生素的质量比为(10~30):1;所述抗生素为亚胺培南-西司他丁钠或盐酸万古霉素;
(22)将所述梯度复合层置于35~42℃的真空烘箱中干燥18~36h,并将所述胶原涂层液涂覆在干燥后的所述梯度复合层的疏松层上,直至填满所述疏松层,然后进行冷冻干燥处理,得到所述涂覆有I型胶原和抗生素的梯度复合层。
优选地,所述步骤(3)包括如下子步骤:
将所述涂覆有I型胶原和抗生素的梯度复合层置于浓度为2~30mmol/L的交联液中并于-5~0℃下交联30~120min,然后用纯化水进行清洗后,再进行冷冻干燥处理,得到所述人工硬脑膜;其中,所述交联液为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液。
优选地,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:4。
优选地,所述冷冻干燥包括预冻阶段、第一升华阶段、第二升华阶段和降温阶段,各个阶段的工艺条件如下:
预冻阶段:目标温度为-12~-8℃,降温速率为3~4℃/min,恒温时长为250~280min;
第一升华阶段进行抽真空,真空度为50~120Pa,包括四个升温阶梯,分别为:
-4~-2℃,升温速率为0.2~0.3℃/min,恒温时长为200~220min;
1~2℃,升温速率为0.1~0.2℃/min,恒温时长为200~220min;
4~6℃,升温速率为0.3~0.4℃/min,恒温时长为160~180min;
8~10℃,升温速率为0.4~0.5℃/min,恒温时长为160~180min;
第二升华阶段进行抽真空,真空度为50~120Pa,包括五个升温阶梯,分别为:
14~16℃,升温速率为1~1.2℃/min,恒温时长为120~140min;
20~22℃,升温速率为1~1.2℃/min,恒温时长为120~140min;
36~38℃,升温速率为1.6~1.8℃/min,恒温时长为70~80min;
42~45℃,升温速率为1.6~1.8℃/min,恒温时长为70~80min;
55~60℃,升温速率为0.8~1℃/min,恒温时长:每隔1小时进行终点判断,至终点判断合格为止;终点≤0.5Pa/10min;
降温阶段:目标温度为室温,降温速率为4~6℃/min。
本发明与现有技术相比至少具有如下有益效果:
(1)本发明利用聚己内酯采用静电纺丝一体化制得了梯度复合层,将具有致密层和疏松层的该梯度复合层作为支架基底材料,由于该梯度复合层的致密层和疏松层均为聚己内酯纤维膜,因此该梯度复合层的双层结构更稳定更牢固,不易分层;同时,由于聚己内酯(PCL)具有良好的生物相容性并且降解产物无毒,因此与作为骨组织主要有机成分的Ⅰ型胶原,以及防止细菌感染的抗生素一起复合后得到的人工硬脑膜,不仅具有双层结构,一定的抗拉伸强度和柔韧性,可降解,能够促进硬脑膜的修复,还能有效防止感染。
(2)在本发明中,经实验证实,聚己内酯的降解速度与硬脑膜生成速度相匹配,因而随着硬脑膜的生成,聚己内酯也会在8个月左右发生降解,不会造成脑脊液渗漏的情况发生,同时也无二次取出的风险,而且降解产物无毒。
(3)在本发明中,Ⅰ型胶原具有良好的生物相容性、低免疫原性、优越的渗透性以及生物可降解性,可以调节细胞形态,促进细胞黏附、迁移和分化。如此,本发明通过双层结构设计和缓慢释放抗生素,达到力学、细胞迁移、分化、组织再生和抗急性感染均相宜的人工硬脑膜。
(4)本发明提供的人工硬脑膜靠近脑组织侧的致密层为致密的聚己内酯纳米结构纤维,具有与天然硬脑膜相似的微观结构,能够有效防止脑脊液的溢出,而且其孔径较小,不仅具有极强的力学性能,且一般细菌不易通过孔径低于5μm的孔隙,因此该致密层便能成为一道抑菌屏障。
(5)本发明提供的人工硬脑膜靠近颅骨侧的疏松层为聚己内酯微米结构纤维,能够允许硬脑膜成纤维细胞通过,且内部含有大量的胶原和抗生素,不仅为细胞的爬行和增殖提供了附着点,还可有效防止炎症反应。
(6)本发明提供的人工硬脑膜的疏松层内含有抗生素,且抗生素包裹在I型胶原内部,随着胶原的降解,抗生素缓慢释放出来,使其成为最基础的屏障。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的一种人工硬脑膜的结构示意图;
图2是本发明实施例提供的一种梯度复合层的结构示意图;
图3是本发明实施例提供的一种人工硬脑膜的制备方法的流程图;
图4是本发明实施例1提供的朝向脑组织侧的人工硬脑膜的电镜图;
图5是本发明实施例1提供的朝向颅骨侧的梯度复合层的电镜图;
图6是本发明实施例1提供的朝向颅骨侧的人工硬脑膜的电镜图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例,基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
如图1和图2所示,本发明实施例提供了一种人工硬脑膜,
所述人工硬脑膜包括I型胶原101、抗生素102和梯度复合层103;
所述梯度复合层103包括朝向脑组织侧的致密层1031和朝向颅骨侧的疏松层1032,且所述I型胶原和所述抗生素分布于所述疏松层内;其中,所述梯度复合层为通过静电纺丝制得的一体结构;
所述致密层1031和所述疏松层1032均为聚己内酯纤维膜;所述疏松层1032的孔径大于所述致密层1031的孔径;
在将所述I型胶原101、所述抗生素102和所述梯度复合层103复合后,还对复合后的材料进行交联处理,以得到所述人工硬脑膜。
在本发明中,利用聚己内酯采用静电纺丝一体化制得了梯度复合层,将具有致密层和疏松层的该梯度复合层作为支架基底材料,由于该梯度复合层的致密层和疏松层均为聚己内酯纤维膜,因此该梯度复合层的双层结构更稳定更牢固,不易分层;同时,由于聚己内酯(PCL)具有良好的生物相容性并且降解产物无毒,获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于临床,因此与作为骨组织主要有机成分的Ⅰ型胶原,以及防止细菌感染的抗生素一起复合后得到的人工硬脑膜,不仅具有双层结构,一定的抗拉伸强度和柔韧性,可降解,能够促进硬脑膜的修复,还能有效防止感染。
现有技术中,单纯的胶原等亲水性物质构成的亲水层,一是水化后易发生形变,不利于维持内部三维结构;二是降解较快,不利于组织的修复。然而在本发明中,I型胶原和抗生素是分布于疏松层内的,而疏松层的聚己内酯本身可以起到支架的作用,初期细胞在其内部的I型胶原上黏附增殖;由于胶原的降解周期约为1~3个月,短于聚己内酯的降解周期(8个月左右),因而后期随着胶原的降解,聚己内酯支架仍能维持一个空间使细胞继续黏附增殖。
根据一些优选的实施方式,所述致密层的孔径为3~5μm(例如,可以为3μm、3.2μm、3.4μm、3.5μm、3.6μm、3.8μm、4μm、4.2μm、4.4μm、4.5μm、4.6μm、4.8μm或5μm),所述致密层的纤维直径为0.1~1μm(例如,可以为0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm或1μm)。
本发明提供的人工硬脑膜靠近脑组织侧的致密层为致密的聚己内酯纳米结构纤维,具有与天然硬脑膜相似的微观结构,能够有效防止脑脊液的溢出,而且其孔径较小,不仅具有极强的力学性能,且一般细菌不易通过孔径低于5μm的孔隙,因此该致密层便能成为一道抑菌屏障。同时,聚己内酯为疏水性材料,不利于细胞的粘附,从而达到防粘连的目的。
根据一些优选的实施方式,所述疏松层的孔径为15~25μm(例如,可以为15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm或25μm),所述疏松层的纤维直径为5~10μm(例如,可以为5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm)。
本发明提供的人工硬脑膜靠近颅骨侧的疏松层为聚己内酯微米结构纤维,尽管聚己内酯为疏水性材料,但微米结构的孔径足够大,能够允许硬脑膜成纤维细胞通过,而且疏松层的内部分散有大量的I型胶原和抗生素,不仅为细胞的爬行和增殖提供了附着点,还可有效防止炎症反应。
根据一些优选的实施方式,所述I型胶原和所述抗生素的质量比为(10~30):1(例如,可以为10:1、12:1、15:1、18:1、20:1、22:1、25:1、28:1或30:1)。
根据一些更优选的实施方式,所述抗生素为亚胺培南-西司他丁钠或盐酸万古霉素。
在本发明中,为了使I型胶原和抗生素的混合物的降解周期与I型胶原的降解周期相匹配,抗生素可在降解周期内缓慢释放,故而选择I型胶原和抗生素的质量比为(10~30):1。经实验证实,若I型胶原和抗生素的质量比低于10:1,则会因抗生素超量引起副反应;若I型胶原和抗生素的质量比高于30:1,则抗生素含量过低,则无法有效防止感染和炎症反应。
根据一些优选的实施方式,所述致密层与所述疏松层的厚度之比为1:(2~5)(例如,可以为2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1或5:1)。
需要说明的是,人工硬脑膜的厚度具体根据实际使用需要进行设计,包括但不限于0.5~1mm(例如,可以为0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm或1mm)。
根据一些优选的实施方式,所述交联处理时所用的交联液浓度为2~30mmol/L(例如,可以为2mmol/L、5mmol/L、8mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、28mmol/L或30mmol/L),所述交联液为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液。
根据一些优选的实施方式,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:4。
在本发明中,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(即EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(即NHS)搭配使用使能够增加偶联反应的效率,而且交联后能够使人工硬脑膜遇水不易溶胀,且表面防粘连,同时相比于研究团队以往所用的戊二醛,还具有如下优点:制成的产品生物相容性好,碳化二亚胺盐酸盐本身不成为实际交联的一部分,而是形成了可溶于水的脲衍生物,可以通过冲洗除去,避免引入有毒物质导致细胞毒性;而且能提高胶原蛋白的结构稳定性,增强产品的力学性能。
本发明还提供了上述所提供的人工硬脑膜的制备方法,所述制备方法包括:
(1)通过静电纺丝制得包括致密层和疏松层的梯度复合层;其中,所述疏松层的孔径大于所述致密层的孔径;
(2)利用I型胶原和抗生素制备胶原涂层液,将所述胶原涂层液涂覆在所述梯度复合层的疏松层上,得到涂覆有I型胶原和抗生素的梯度复合层;
(3)将所述涂覆有I型胶原和抗生素的梯度复合层进行交联处理,得到所述人工硬脑膜。
根据一些优选的实施方式,在步骤(1)中,
所述致密层的纺丝液为质量浓度为60~140g/L(例如,可以为60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L或140g/L)的聚己内酯溶液;
所述疏松层的纺丝液为质量浓度为200~300g/L(例如,可以为200g/L、210g/L、220g/L、230g/L、240g/L、250g/L、260g/L、270g/L、280g/L、290g/L或300g/L)的聚己内酯溶液;
其中,所述聚己内酯溶液中聚己内酯的重均分子量为2~20万(例如,可以为2万、5万、8万、10万、12万、15万、18万或20万),溶剂为体积比为5:1的氯仿和甲醇的混合溶液。
需要说明的是,疏松层的纺丝液中还可以加入抗生素(亚胺培南-西司他丁钠或盐酸万古霉素),随着疏松层的聚己内酯的降解仍有抗生素随之释放出来,以确保在胶原完全降解后的硬脑膜的生长阶段仍能有效防止感染和炎症反应。但硬脑膜中的总的抗生素含量不应超出引起副反应的抗生素上限用量。
需要说明的是,为了保证用于静电纺丝的纺丝液能够均匀成丝,且保证纺丝得到的聚己内酯纤维膜具有一定的力学性能,并能够在预期时间内降解,故选择应用静电纺丝的聚己内酯的重均分子量为2~20万。同时,为了保证喷丝均匀且连续,选择纺丝液的溶剂为体积比为5:1的氯仿和甲醇的混合溶液。
在本发明中,通过设置致密层的纺丝液的质量浓度为60~140g/L,能够在保证喷丝均匀连续的情况下,喷出直径较小的纤维;而疏松层的纺丝液的质量浓度为200~300g/L,高于致密层的纺丝液的质量浓度,则能够喷出直径较大的纤维。静电纺丝纤维得到的孔径大小分布很大程度上依赖于纤维直径,已知纤维直径减小时,孔径也同时减小,因此纤维直径越大静电纺丝得到的膜越疏松,纤维直径越小得到的膜越致密,如此有利于通过控制纺丝液的质量浓度得到具有双层结构的梯度复合层。
根据一些优选的实施方式,所述梯度复合层由下而上依次包括所述致密层和所述疏松层;所述致密层通过静电纺丝接收在静电纺丝设备的接收器上,所述疏松层通过静电纺丝接收在所述致密层上。
在本发明中,利用聚己内酯采用静电纺丝一体化制得了梯度复合层,由于两种结构为同种物质、且为同种试剂做静电纺丝介质,故该梯度复合层的双层结构结合十分牢固,不易分层。
根据一些优选的实施方式,所述步骤(1)包括如下子步骤:
(11)将铝箔铺覆在静电纺丝设备的接收器上,将所述铝箔作为接收基底材料,在所述铝箔上采用所述致密层的纺丝液通过静电纺丝形成致密层;
(12)将所述致密层作为接收基底材料,在所述致密层上采用所述疏松层的纺丝液通过静电纺丝形成疏松层,得到所述梯度复合层。
在本发明中,先通过静电纺丝得到致密层,再继续静电纺丝得到疏松层,能够保证疏松层维持其多孔结构。
根据一些优选的实施方式,在步骤(11)中,所述静电纺丝中的注射泵流速为0.5~3mL/h(例如,可以为0.5mL/h、0.8mL/h、1mL/h、1.2mL/h、1.5mL/h、1.8mL/h、2mL/h、2.2mL/h、2.5mL/h、2.8mL/h或3mL/h),接收距离为12~25cm(例如,可以为12cm、15cm、18cm、20cm、22cm、24cm或25cm),电压为15~19.5KV(例如,可以为15KV、16KV、17KV、18KV、19KV或19.5KV),接收器转速为100~140r/min(例如,可以为100r/min、110r/min、120r/min、130r/min或140r/min);
在步骤(12)中,所述静电纺丝中的注射泵流速为2~6mL/h(例如,可以为2mL/h、2.2mL/h、2.5mL/h、3mL/h、3.5mL/h、4mL/h、4.5mL/h、5mL/h、5.5mL/h或6mL/h),接收距离为20~30cm(例如,可以为20cm、21cm、22cm、23cm、24cm、25cm、26cm、27cm、28cm、29cm或30cm),电压为8~15KV(例如,可以为8KV、9KV、10KV、11KV、12KV、13KV、14KV或15KV),接收器转速为100~140r/min(例如,可以为100r/min、110r/min、120r/min、130r/min或140r/min);
步骤(11)与步骤(12)中的纺丝时间之比为1:(0.5~2.5)(例如,可以为1:0.5、1:1、1:1.5、1:2或1:2.5)。
根据一些更优选的实施方式,步骤(11)中的纺丝时间为30min,步骤(12)中的纺丝时间为60min。
需要说明的是,纺丝采用的针头为21#不锈钢钝头针。进行静电纺丝时的纺丝环境的温度为室温(例如,可以为25℃),相对湿度为40~50%(例如,可以为40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%或50%),如此既可以防止相对湿度较高时,溶剂会浓缩在纤维表面,从而影响纤维形态;又可防止相对湿度较低时,挥发溶剂可能会迅速干燥而在静电力的作用下出现纤维乱飞的现象。
在本发明中,在控制纺丝液的质量浓度的基础上,通过进一步调节注射泵流速、电压、接收距离、接收器转速等静电纺丝参数,以进一步控制纤维的直径以及各层纤维膜的孔径,以确保致密层的孔径为5~6μm,致密层的纤维直径为0.1~1μm;疏松层的孔径为15~25μm,疏松层的纤维直径为5~10μm。
根据一些优选的实施方式,所述步骤(2)包括如下子步骤:
(21)将I型胶原配制成固含量为0.1~0.8%(例如,可以为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%或0.8%)的胶原凝胶液,在所述胶原凝胶液中加入所述抗生素,得到所述胶原涂层液;其中,所述胶原涂层液中所述I型胶原和所述抗生素的质量比为(10~30):1;所述抗生素为亚胺培南-西司他丁钠或盐酸万古霉素;
(22)将所述梯度复合层置于35~42℃(例如,可以为35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃)的真空烘箱中干燥18~36h(例如,可以为18h、20h、24h、28h、30h、32h或36h),并将所述胶原涂层液涂覆在干燥后的所述梯度复合层的疏松层上,直至填满所述疏松层,然后进行冷冻干燥处理,得到所述涂覆有I型胶原和抗生素的梯度复合层。
需要说明的是,为了确保涂覆时胶原涂层液能够流延渗透入疏松层内部,因此选自I型胶原的固含量为0.1~0.8%的胶原凝胶液。
根据一些优选的实施方式,步骤(2)胶原凝胶液通常采用现有方法制备得到。
具体地,在步骤(22)中,首先将步骤(1)得到的梯度复合层进行真空干燥,以进一步去除纺丝液中残留的溶剂,然后再涂覆胶原涂层液,将I型胶原和抗生素填满疏松层。更具体地,涂覆时,将胶原涂层液均匀地涂抹在梯度复合层的疏松层,静置两小时后再涂抹一层,如此反复,直至饱和(即填满疏松层)。
在本发明中,通过步骤(21)能够将抗生素包裹在I型胶原内部,以使抗生素随着胶原的降解缓慢释放出来。步骤(22)中,通过反复涂覆能够使胶原涂层液渗透到疏松层的内部,在疏松层中填满胶原涂层液虽然会降低疏松层的孔隙率,但经冷冻干燥后,胶原涂层液中的水被去除后仍能保留其多孔结构,能够允许细胞爬行和增殖;而且即便此时疏松层的孔隙率仍较低,但由于胶原涂层液中的I型胶原会先降解,聚己内酯降解较慢,可在较长时间里充当支架,故而随着I型胶原的降解,疏松层便能恢复其原有的孔隙率,同时I型胶原的存在更有利于组织再生。
根据一些优选的实施方式,所述步骤(3)包括如下子步骤:
将所述涂覆有I型胶原和抗生素的梯度复合层置于浓度为2~30mmol/L的交联液中并于-5~0℃(例如,可以为-5℃、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃或0℃)下交联30~120min(例如,可以为30min、40min、50min、60min、80min、100min或120min),然后用纯化水进行清洗后,再进行冷冻干燥处理,得到所述人工硬脑膜;其中,所述交联液为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液。
根据一些优选的实施方式,步骤(3)中,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:4。
针对步骤(3)的清洗,更具体地,进行清洗时,用流动的纯化水冲洗10~60s,重复3~5次。
现有技术在进行交联反应时,因胶原遇水易溶胀,会选择在乙醇溶液中进行交联反应,以保护胶原的三维结构。然而,在本发明中,I型胶原是流延渗透入疏松层内部的,不存在规格的三维结构,故用水作介质更能提高交联反应的效率。在本发明中,为了防止EDC失活,设置交联处理的温度为-5~0℃。
根据一些优选的实施方式,步骤(22)和步骤(3)中的冷冻干燥均包括预冻阶段、第一升华阶段、第二升华阶段和降温阶段,各个阶段的工艺条件如下:
预冻阶段:目标温度为-12~-8℃,降温速率为3~4℃/min,该目标温度下的保温时长为250~280min;
第一升华阶段进行抽真空,真空度为50~120Pa,包括四个升温阶梯,分别为:
-4~-2℃,升温速率为0.2~0.3℃/min,恒温时长为200~220min;
1~2℃,升温速率为0.1~0.2℃/min,恒温时长为200~220min;
4~6℃,升温速率为0.3~0.4℃/min,恒温时长为160~180min;
8~10℃,升温速率为0.4~0.5℃/min,恒温时长为160~180min;
第二升华阶段进行抽真空,真空度为50~120Pa,包括五个升温阶梯,分别为:
14~16℃,升温速率为1~1.2℃/min,恒温时长为120~140min;
20~22℃,升温速率为1~1.2℃/min,恒温时长为120~140min;
36~38℃,升温速率为1.6~1.8℃/min,恒温时长为70~80min;
42~45℃,升温速率为1.6~1.8℃/min,恒温时长为70~80min;
55~60℃,升温速率为0.8~1℃/min,恒温时长:每隔1小时进行终点判断,至终点判断合格为止;终点判断为≤0.5Pa/10min;
降温阶段:目标温度为室温(例如,可以为25℃),降温速率为4~6℃/min。
需要说明的是,针对冷冻干燥,预冻阶段:目标温度为-12~-8℃(例如,可以为-12℃、-11℃、-10℃、-9℃或-8℃),降温速率为3~4℃/min(例如,可以为3℃/min、3.2℃/min、3.4℃/min、3.6℃/min、3.8℃/min或4℃/min),保温时长为250~280min(例如,可以为250min、260min、270min或280min)。
真空度为50~120Pa,例如,可以为50Pa、55Pa、60Pa、65Pa、70Pa、75Pa、80Pa、85Pa、90Pa、95Pa、100Pa、105Pa、110Pa、115Pa、或120Pa;
第一升华阶段的四个升温阶段中,-4~-2℃可以为-4℃、-3.5℃、-3℃、-2.5℃或-2℃;1~2℃可以为1℃、1.5℃或2℃;4~6℃可以为4℃、5℃或6℃;8~10℃可以为8℃、9℃或10℃;
升温速率为0.2~0.3℃/min,例如,可以为0.2℃/min、0.25℃/min或0.3℃/min;
升温速率为0.1~0.2℃/min,例如,可以为0.1℃/min、0.15℃/min或0.2℃/min;
升温速率为0.3~0.4℃/min,例如,可以为0.3℃/min、0.35℃/min或0.4℃/min;
升温速率为0.4~0.5℃/min,例如,可以为0.4℃/min、0.45℃/min或0.5℃/min;
恒温时长为200~220min,例如,可以为200min、205min、210min、215min或220min;
恒温时长为160~180min,例如,可以为160min、165min、170min、175min或180min。
第二升华阶段的五个升温阶段中,14~16℃可以为14℃、15℃或16℃;20~22℃可以为20℃、21℃或22℃;36~38℃可以为36℃、37℃或38℃;42~45℃可以为42℃、43℃、44℃或45℃;55~60℃可以为55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃;
升温速率为1~1.2℃/min,例如,可以为1℃/min、1.05℃/min、1.1℃/min、1.15℃/min或1.2℃/min;
升温速率为0.2~0.3℃/min,例如,可以为0.2℃/min、0.25℃/min或0.3℃/min;
升温速率为1.6~1.8℃/min,例如,可以为1.6℃/min、1.65℃/min、1.7℃/min、1.75℃/min或1.8℃/min;
升温速率为0.8~1℃/min,例如,可以为0.8℃/min、0.9℃/min或1℃/min;
恒温时长为120~140min,例如,可以为120min、125min、130min、135min或140min;
恒温时长为70~80min,例如,可以为70min、75min或80min。
降温阶段的降温速率为4~6℃/min,例如,可以为4℃/min、4.5℃/min、5℃/min、5.5℃/min或6℃/min。
在本发明中,采用这一冷冻干燥方式对材料进行冷冻干燥具有如下优点:干燥效果好,能排除95%~99%以上的水分;冷冻干燥在低温下进行,胶原不会发生变性或失去生物活力;冻干后产品体积几乎不变,保持了原来多孔的三维结构,不会发生缩皱现象;疏松层在冻干后能疏松多孔,呈海绵状,性状良好。
为了更加清楚地说明本发明的技术方案及优点,下面通过几个实施例对一种人工硬脑膜及其制备方法进行详细说明。
以下实施例中,胶原凝胶液均通过如下方法制备得到:
(a)剔除牛跟腱上多余的筋膜、脂肪、肌肉等,用自来水冲洗干净后置于冷冻盒中进行冷冻;
(b)将冷冻的牛跟腱切薄片进行翻洗至液体澄清;
(c)酶解:将清洗干净的牛跟腱薄片进行酶解,充分搅拌,酶解时间不少于72h;
(d)盐析:将酶解后的溶液离心,取其上清液,将上清液加入到氯化钠溶液中,析出白色絮状胶原蛋白,过滤清洗后沥干水分;
(e)透析:将盐析后的材料灌入透析袋中,将透析袋置于0.05mol/L的乙酸溶液中透析液6天;再将透析袋置于0.0005mol/L的乙酸溶液中透析5天;从第12天开始将透析袋置于0.000005mol/L的乙酸溶液中透析至pH为5~6之间,根据需要可每天换一次透析液;
(f)将透析袋中的材料作为胶原凝胶液,并测试胶原凝胶液中I型胶原的固含量。
实施例1
(1)制备梯度复合层:
选择重均分子量为8万的聚己内酯,配制体积比为5:1的氯仿和甲醇的混合溶液作为纺丝液的溶剂;
a.称取一定质量的聚己内酯(Mw = 80,000),加入至上述溶剂中搅拌溶解,得到质量浓度为100g/L的聚己内酯溶液,并作为致密层的纺丝液;
b.称取一定质量的聚己内酯(Mw = 80,000),加入至上述溶剂中搅拌溶解,得到质量浓度为250g/L的聚己内酯溶液,并作为疏松层的纺丝液;
c.将步骤a、b配制好的聚己内酯溶液分别装入10mL的注射器中,注射器上均连接有一个21#不锈钢钝头针,将装有步骤a配制的聚己内酯溶液的注射器固定在静电纺丝设备的A注射泵上,将装有步骤b配制的聚己内酯溶液的注射器固定在静电纺丝设备的B注射泵上;
d.将铝箔铺覆在静电纺丝设备的接收器上,将铝箔作为接收基底材料,将连接高压直流电源的夹头与A注射泵上的注射器针头相连,调节静电纺丝参数,打开A注射泵,在铝箔上纺丝30min后,关闭A注射泵及其他相关运行按钮,得到致密层;
静电纺丝参数包括:A注射泵的流速为2mL/h,接收距离为18cm,电压为17.5KV,接收器转速为120r/min;
e.将步骤d得到的致密层作为接收基底材料,将连接高压直流电源的夹头与B注射泵上的注射器针头相连,调节静电纺丝参数,打开B注射泵,在致密层上纺丝60min后,关闭B注射泵及其他相关运行按钮,再将铝箔去除,得到梯度复合层;
静电纺丝参数包括:B注射泵的流速为4mL/h,接收距离为25cm,电压为15KV,接收器转速为120r/min;
(2)制备涂覆有I型胶原和抗生素的梯度复合层:
(21)将I型胶原配制成固含量为0.5%的胶原凝胶液,在胶原凝胶液中加入亚胺培南-西司他丁钠,得到胶原涂层液;其中,胶原涂层液中I型胶原和亚胺培南-西司他丁钠的质量比为20:1;
(22)将步骤(1)得到的梯度复合层置于42℃的真空烘箱中干燥24h,并将胶原涂层液均匀地涂覆在干燥后的梯度复合层的疏松层上,静置两小时后再涂抹一层,如此反复涂覆,直至填满疏松层,然后进行冷冻干燥处理,得到涂覆有I型胶原和抗生素的梯度复合层;
(3)制备人工硬脑膜:
将步骤(2)得到的涂覆有I型胶原和亚胺培南-西司他丁钠的梯度复合层置于浓度为30mmol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(质量比为1:4)的水溶液中,并于0℃下交联30min,然后用纯化水进行清洗3次后,再次进行冷冻干燥处理,得到人工硬脑膜;
上述步骤中的冷冻干燥工艺均如下:
将填满胶原涂层液的疏松层或交联处理后的膜材料放入冻干机中,经预冻、第一升华、第二升华和降温四个阶段后,即完成冷冻干燥;其中,四个阶段的参数设置如表1所示。
实施例2
(1)制备梯度复合层:
选择重均分子量为2万的聚己内酯,配制体积比为5:1的氯仿和甲醇的混合溶液作为纺丝液的溶剂;
a.称取一定质量的聚己内酯(Mw = 20,000),加入至上述溶剂中搅拌溶解,得到质量浓度为140g/L的聚己内酯溶液,并作为致密层的纺丝液;
b.称取一定质量的聚己内酯(Mw = 20,000),加入至上述溶剂中搅拌溶解,得到质量浓度为300g/L的聚己内酯溶液,并作为疏松层的纺丝液;
c.将步骤a、b配制好的聚己内酯溶液分别装入10mL的注射器中,注射器上均连接有一个21#不锈钢钝头针,将装有步骤a配制的聚己内酯溶液的注射器固定在静电纺丝设备的A注射泵上,将装有步骤b配制的聚己内酯溶液的注射器固定在静电纺丝设备的B注射泵上;
d.将铝箔铺覆在静电纺丝设备的接收器上,将铝箔作为接收基底材料,将连接高压直流电源的夹头与A注射泵上的注射器针头相连,调节静电纺丝参数,打开A注射泵,在铝箔上纺丝120min后,关闭A注射泵及其他相关运行按钮,得到致密层;
静电纺丝参数包括:A注射泵的流速为0.5mL/h,接收距离为12cm,电压为15KV,接收器转速为100r/min;
e.将步骤d得到的致密层作为接收基底材料,将连接高压直流电源的夹头与B注射泵上的注射器针头相连,调节静电纺丝参数,打开B注射泵,在致密层上纺丝120min后,关闭B注射泵及其他相关运行按钮,再将铝箔去除,得到梯度复合层;
静电纺丝参数包括:B注射泵的流速为2mL/h,接收距离为20cm,电压为8KV,接收器转速为100r/min;
(2)制备涂覆有I型胶原和抗生素的梯度复合层:
(21)将I型胶原配制成固含量为0.1%的胶原凝胶液,在胶原凝胶液中加入亚胺培南-西司他丁钠,得到胶原涂层液;其中,胶原涂层液中I型胶原和亚胺培南-西司他丁钠的质量比为10:1;
(22)将步骤(1)得到的梯度复合层置于35℃的真空烘箱中干燥36h,并将胶原涂层液均匀地涂覆在干燥后的梯度复合层的疏松层上,静置两小时后再涂抹一层,如此反复涂覆,直至填满疏松层,然后进行冷冻干燥处理,得到涂覆有I型胶原和抗生素的梯度复合层;
(3)制备人工硬脑膜:
将步骤(2)得到的涂覆有I型胶原和亚胺培南-西司他丁钠的梯度复合层置于浓度为2mmol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(质量比为1:4)的水溶液中,并于-2℃下交联120min,然后用纯化水进行清洗3次后,再次进行冷冻干燥处理,得到人工硬脑膜;
上述步骤中的冷冻干燥工艺均如下:
将填满胶原涂层液的疏松层或交联处理后的膜材料放入冻干机中,经预冻、第一升华、第二升华和降温四个阶段后,即完成冷冻干燥;其中,四个阶段的参数设置如表2所示。
实施例3
(1)制备梯度复合层:
选择重均分子量为20万的聚己内酯,配制体积比为5:1的氯仿和甲醇的混合溶液作为纺丝液的溶剂;
a.称取一定质量的聚己内酯(Mw = 200,000),加入至上述溶剂中搅拌溶解,得到质量浓度为60g/L的聚己内酯溶液,并作为致密层的纺丝液;
b.称取一定质量的聚己内酯(Mw =200,000),加入至上述溶剂中搅拌溶解,得到质量浓度为200g/L的聚己内酯溶液,并作为疏松层的纺丝液;
c.将步骤a、b配制好的聚己内酯溶液分别装入10mL的注射器中,注射器上均连接有一个21#不锈钢钝头针,将装有步骤a配制的聚己内酯溶液的注射器固定在静电纺丝设备的A注射泵上,将装有步骤b配制的聚己内酯溶液的注射器固定在静电纺丝设备的B注射泵上;
d.将铝箔铺覆在静电纺丝设备的接收器上,将铝箔作为接收基底材料,将连接高压直流电源的夹头与A注射泵上的注射器针头相连,调节静电纺丝参数,打开A注射泵,在铝箔上纺丝20min后,关闭A注射泵及其他相关运行按钮,得到致密层;
静电纺丝参数包括:A注射泵的流速为3mL/h,接收距离为25cm,电压为19.5KV,接收器转速为140r/min;
e.将步骤d得到的致密层作为接收基底材料,将连接高压直流电源的夹头与B注射泵上的注射器针头相连,调节静电纺丝参数,打开B注射泵,在致密层上纺丝40min后,关闭B注射泵及其他相关运行按钮,再将铝箔去除,得到梯度复合层;
静电纺丝参数包括:B注射泵的流速为6mL/h,接收距离为30cm,电压为15KV,接收器转速为140r/min;
(2)制备涂覆有I型胶原和抗生素的梯度复合层:
(21)将I型胶原配制成固含量为0.8%的胶原凝胶液,在胶原凝胶液中加入盐酸万古霉素,得到胶原涂层液;其中,胶原涂层液中I型胶原和盐酸万古霉素的质量比为30:1;
(22)将步骤(1)得到的梯度复合层置于40℃的真空烘箱中干燥24h,并将胶原涂层液均匀地涂覆在干燥后的梯度复合层的疏松层上,静置两小时后再涂抹一层,如此反复涂覆,直至填满疏松层,然后进行冷冻干燥处理,得到涂覆有I型胶原和抗生素的梯度复合层;
(3)制备人工硬脑膜:
将步骤(2)得到的涂覆有I型胶原和盐酸万古霉素的梯度复合层置于浓度为20mmol/L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(质量比为1:4)的水溶液中,并于-5℃下交联40min,然后用纯化水进行清洗5次后,再次进行冷冻干燥处理,得到人工硬脑膜;
上述步骤中的冷冻干燥工艺均如下:
将填满胶原涂层液的疏松层或交联处理后的膜材料放入冻干机中,经预冻、第一升华、第二升华和降温四个阶段后,即完成冷冻干燥;其中,四个阶段的参数设置如表3所示。
实施例4
实施例4与实施例1基本相同,其不同之处在于:
聚己内酯的重均分子量为10万;
步骤d中的纺丝时间为30min,步骤e中的纺丝时间为75min。
实施例5
实施例5与实施例1基本相同,其不同之处在于:
步骤b中配制疏松层的纺丝液时,还在纺丝液中加入了亚胺培南-西司他丁钠,得到聚己内酯的质量浓度为100g/L,且亚胺培南-西司他丁钠的质量浓度为50mg/mL的纺丝液。
对比例1
对比例1与实施例1基本相同,其不同之处在于:
胶原涂层液中未加入亚胺培南-西司他丁钠。
对比例2
对比例2与实施例1基本相同,其不同之处在于:
在步骤b中,称取一定质量的亲水性材料(亲水性聚氨酯),加入至上述溶剂中搅拌溶解,得到质量浓度为250g/L的聚己内酯溶液,并作为疏松层的纺丝液。
将实施例1至5以及对比例1至2所制备的人工硬脑膜进行拉伸强度测试,得到拉伸强度、断裂伸长率数据和抗缝线拉张强度如表4所示。该拉伸强度测试依据ASTM-D882-02(中文)塑料薄板材抗拉伸性能的标准方法,将样品薄膜修剪成150mm×20mm的矩形试样,将试样置于试验机上进行拉伸强度测试,实验条件为:夹具间距为100mm,夹具分离速度:50mm/min,初始应变速度是50mm/min。抗缝线拉张强度测试条件为:夹具间距100mm,夹具分离速度:50mm/min,初始应变速度:0.5mm/min。使用3-0#的不可吸收性缝合线,样品正中间穿双股线,单股线长75mm。
将实施例1至5以及对比例1至2所制备的人工硬脑膜进行Co60灭菌,剂量为15KGy,在灭菌后分别进行上述测试。
由表4可以看出,采用本发明的方法制备的人工硬脑膜均具有优异的力学强度。与实施例1相比,对比例1中由于未加入抗生素,在进行动物临床实验时,易出现感染甚至炎症反应。对比例2与实施例1相比,疏松层未采用与致密层相同的同种材料,而是采用了亲水性材料,使得制备的人工硬脑膜易出现分层现象,双层结构不牢固。
具体地,图4至图6分别对应实施例1制备得到的人工硬脑膜的电镜图;图4为朝向脑组织侧的人工硬脑膜(即致密层)的电镜图,从电镜图中可看出,致密层的纤维直径为纳米级,且孔径小;图5为朝向颅骨侧的梯度复合层(即疏松层)的电镜图,从电镜图中可看出,致密层的纤维直径为微米级,且孔径大于致密层孔径;图6为涂覆胶原涂层液后的疏松层经冷冻干燥得到朝向颅骨侧的人工硬脑膜的电镜图,从电镜图中可看出,疏松层内部充满了胶原涂层液冷冻干燥后形成的胶原纤维。另外,经检测,该人工硬脑膜的厚度为0.8mm。
综上所述,采用本发明的方法制备的人工硬脑膜具有优异的力学强度,而且该人工硬脑膜的降解速度与硬脑膜生成速度相匹配,该人工硬脑膜的且降解产物的生物相容性好和安全性高,同时不会产生局部炎症反应。
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (13)
1.一种人工硬脑膜,其特征在于,
所述人工硬脑膜包括I型胶原、抗生素和梯度复合层;
所述梯度复合层包括朝向脑组织侧的致密层和朝向颅骨侧的疏松层,且所述I型胶原和所述抗生素分布于所述疏松层内;其中,所述梯度复合层为通过静电纺丝制得的一体结构;
所述致密层和所述疏松层均为聚己内酯纤维膜;所述疏松层的孔径大于所述致密层的孔径;
在将所述I型胶原、所述抗生素和所述梯度复合层复合后,还对复合后的材料进行交联处理,以得到所述人工硬脑膜。
2.根据权利要求1所述的人工硬脑膜,其特征在于,
所述致密层的孔径为3~5μm,所述致密层的纤维直径为0.1~1μm;和/或
所述疏松层的孔径为15~25μm,所述疏松层的纤维直径为5~10μm。
3.根据权利要求1所述的人工硬脑膜,其特征在于,
所述I型胶原和所述抗生素的质量比为(10~30):1;和/或
所述抗生素为亚胺培南-西司他丁钠或盐酸万古霉素。
4.根据权利要求1至3中任一所述的人工硬脑膜,其特征在于,
所述致密层与所述疏松层的厚度之比为1:(2~5);和/或
所述交联处理时所用的交联液浓度为2~30mmol/L,所述交联液为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液。
5.根据权利要求4所述的人工硬脑膜,其特征在于,
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:4。
6.一种根据权利要求1至5中任一所述的人工硬脑膜的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:
(1)通过静电纺丝制得包括致密层和疏松层的梯度复合层;其中,所述疏松层的孔径大于所述致密层的孔径;
(2)利用I型胶原和抗生素制备胶原涂层液,将所述胶原涂层液涂覆在所述梯度复合层的疏松层上,得到涂覆有I型胶原和抗生素的梯度复合层;
(3)将所述涂覆有I型胶原和抗生素的梯度复合层进行交联处理,得到所述人工硬脑膜。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,在步骤(1)中,
所述致密层的纺丝液为质量浓度为60~140g/L的聚己内酯溶液;
所述疏松层的纺丝液为质量浓度为200~300g/L的聚己内酯溶液;
其中,所述聚己内酯溶液中聚己内酯的重均分子量为2~20万,溶剂为体积比为5:1的氯仿和甲醇的混合溶液;和/或
所述梯度复合层由下而上依次包括所述致密层和所述疏松层;所述致密层通过静电纺丝接收在静电纺丝设备的接收器上,所述疏松层通过静电纺丝接收在所述致密层上。
8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,
所述步骤(1)包括如下子步骤:
(11)将铝箔铺覆在静电纺丝设备的接收器上,将所述铝箔作为接收基底材料,在所述铝箔上采用所述致密层的纺丝液通过静电纺丝形成致密层;
(12)将所述致密层作为接收基底材料,在所述致密层上采用所述疏松层的纺丝液通过静电纺丝形成疏松层,得到所述梯度复合层。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,
在步骤(11)中,所述静电纺丝中的注射泵流速为0.5~3mL/h,接收距离为12~25cm,电压为15~19.5kV,接收器转速为100~140r/min;
在步骤(12)中,所述静电纺丝中的注射泵流速为2~6mL/h,接收距离为20~30cm,电压为8~15kV,接收器转速为100~140r/min;
步骤(11)与步骤(12)中的纺丝时间之比为1:(0.5~2.5)。
10.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,
步骤(11)中的纺丝时间为30min,步骤(12)中的纺丝时间为60min。
11.根据权利要求6至10中任一所述的制备方法,其特征在于,
所述步骤(2)包括如下子步骤:
(21)将I型胶原配制成固含量为0.1~0.8%的胶原凝胶液,在所述胶原凝胶液中加入所述抗生素,得到所述胶原涂层液;其中,所述胶原涂层液中所述I型胶原和所述抗生素的质量比为(10~30):1;所述抗生素为亚胺培南-西司他丁钠或盐酸万古霉素;
(22)将所述梯度复合层置于35~42℃的真空烘箱中干燥18~36h,并将所述胶原涂层液涂覆在干燥后的所述梯度复合层的疏松层上,直至填满所述疏松层,然后进行冷冻干燥处理,得到所述涂覆有I型胶原和抗生素的梯度复合层;
和/或
所述步骤(3)包括如下子步骤:
将所述涂覆有I型胶原和抗生素的梯度复合层置于浓度为2~30mmol/L的交联液中并于-5~0℃下交联30~120min,然后用纯化水进行清洗后,再进行冷冻干燥处理,得到所述人工硬脑膜;其中,所述交联液为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液。
12.根据权利要求11所述的制备方法,其特征在于,
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:4。
13.根据权利要求11所述的制备方法,其特征在于,
所述冷冻干燥包括预冻阶段、第一升华阶段、第二升华阶段和降温阶段,各个阶段的工艺条件如下:
预冻阶段:目标温度为-12~-8℃,降温速率为3~4℃/min,恒温时长为250~280min;
第一升华阶段进行抽真空,真空度为50~120Pa,包括四个升温阶梯,分别为:
-4~-2℃,升温速率为0.2~0.3℃/min,恒温时长为200~220min;
1~2℃,升温速率为0.1~0.2℃/min,恒温时长为200~220min;
4~6℃,升温速率为0.3~0.4℃/min,恒温时长为160~180min;
8~10℃,升温速率为0.4~0.5℃/min,恒温时长为160~180min;
第二升华阶段进行抽真空,真空度为50~120Pa,包括五个升温阶梯,分别为:
14~16℃,升温速率为1~1.2℃/min,恒温时长为120~140min;
20~22℃,升温速率为1~1.2℃/min,恒温时长为120~140min;
36~38℃,升温速率为1.6~1.8℃/min,恒温时长为70~80min;
42~45℃,升温速率为1.6~1.8℃/min,恒温时长为70~80min;
55~60℃,升温速率为0.8~1℃/min,恒温时长:每隔1小时进行终点判断,至终点判断合格为止;终点≤0.5Pa/10min;
降温阶段:目标温度为室温,降温速率为4~6℃/min。
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