CN114280201B

CN114280201B - 一种蒲公英中多酚类成分的高效分离方法

Info

Publication number: CN114280201B
Application number: CN202111676346.XA
Authority: CN
Inventors: 相宏杰; 刘炬; 希达悦·侯赛因
Original assignee: Shandong Qianfoshan Hospital
Current assignee: Shandong Qianfoshan Hospital
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2023-06-13
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114280201A

Abstract

本发明提供一种蒲公英中多酚类成分的高效分离方法，采用pH区带逆流色谱(pH‑ZRCCC)与高速逆流色谱(HSCCC)相结合的方式，从蒲公英中分离得到6个多酚类化合物。在pH‑ZRCCC分离中，选择溶剂体系为乙酸乙酯‑乙腈‑水(4:1:5，v/v/v)，上相加入三氟乙酸(10mM)作为固定相，下相加入氨水(10mM)作为流动相。从蒲公英乙酸乙酯粗提物中分离得到咖啡酸和羟基肉桂酸及混合物A。之后进一步利用HSCCC，选择溶剂体系为石油醚‑乙酸乙酯‑甲醇‑水(1:4:1:4，v/v/v/v)。从400mg混合物A中分离得到1‑O‑咖啡酰基甘油、3,4‑二羟基苯乙酸、原儿茶酸以及对羟基苯乙酸。该方法制备量大，重现性好，适合蒲公英多酚类化合物的分离纯化。

Description

一种蒲公英中多酚类成分的高效分离方法

技术领域

本发明属于化学分析技术领域，具体涉及一种蒲公英中多酚类成分的高效分离方法。

背景技术

蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.)为菊科多年生草本植物，具有清热解毒、消痈散结的功能。研究表明，蒲公英多酚类物质具有抗氧化、抗癌、抑菌、抗炎、降血糖等方面的药理活性。为进一步深入研究蒲公英多酚化合物的药理活性，需要分离制备出更多的单体化合物。蒲公英多酚类物质成分复杂，且分离制备难度大，目前常用的分离制备方法是以柱色谱为主，其样品制备效率低、耗时长。而逆流色谱具有制备量大，分离效果好，操作方便等特点，已广泛应用于天然产物的分离制备中。目现阶段采用逆流色谱对蒲公英多酚进行分离的研究报道相对较少。本发明以蒲公英药材为原材料，采用pH区带逆流色谱结合高速逆流色谱对蒲公英多酚进行分离纯化，并对其化学结构进行鉴定，为蒲公英药理活性和质量标准的研究提供技术支持。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种蒲公英中多酚类成分的高效分离方法。本发明采用pH区带逆流色谱(pH-ZRCCC)与高速逆流色谱(HSCCC) 相结合的方式，从蒲公英中分离得到6个多酚类化合物。该方法制备量大，重现性好，适合蒲公英多酚类化合物的分离纯化。

本发明提供一种蒲公英中多酚类成分的高效分离方法，其步骤如下：(1) 提取蒲公英多酚；将蒲公英粉碎，用溶剂加热回流提取，减压浓缩得到浓缩液；将浓缩液萃取，萃取后洗脱浓缩得到蒲公英样品；(2)配制pH区带逆流色谱溶剂体系、高速逆流色谱溶剂体系；(3)将蒲公英样品溶解于pH区带逆流色谱溶剂体系中，进行pH区带逆流色谱分离，分离得到化合物I、化合物II、以及混合物A；将混合物A溶解于高速逆流色谱溶剂体系中，进行高速逆流色谱分离，分离得到化合物Ⅲ、化合物Ⅳ、化合物Ⅴ；(4)将蒲公英样品以及分离纯化所得的化合物使用HPLC进行分析，计算纯度；经ESI-MS和NMR分析，鉴定其化学结构。

进一步的，所述提取蒲公英多酚具体为：取适量蒲公英粉碎，用60％的乙醇，料液比1:10(w/v)，加热回流提取，过滤后减压浓缩得浓缩液；浓缩液用水混悬，加等量石油醚萃取，取水相再加等量乙酸乙酯萃取；取乙酸乙酯相减压浓缩至膏状，用水和乙醇洗脱后，将30％洗脱部位减压浓缩至干即为蒲公英样品。

进一步的，配制pH区带逆流色谱溶剂体系前，需先测定样品在pH区带逆流色谱的K值。

进一步的，pH区带逆流色谱的K值的测定为：称取约5mg样品于10mL 试管中。配置好溶剂***，取上下相各5mL于装有样品的试管中，滴加氨水至pH值为10左右，震荡试管至样品完全溶解，静置分层；取上下相各10μL，分别用高效液相色谱(HPLC)进行检测；用上相的峰面积(A_U)比下相的峰面积(A_L)计算碱性条件下样品的分配系数K_base，计算公式如下：K_base＝A_U/A_L；再向该试管中滴加三氟乙酸至pH值约为2，震荡摇匀，静置分层，按同样的方法各取10μL上下相，利用HPLC计算分配系数K_acid。

进一步的，配制高速逆流色谱溶剂体系前，需先测定样品在高速逆流色谱的K值。

进一步的，样品在高速逆流色谱的K值测定为：称取约5mg样品于10mL 试管中。配置好溶剂***，取上下相各5mL于装有样品的试管中，剧烈震荡至样品完全溶解，静置分层，分别取上下相各10μL利用HPLC进行检测，上相的峰面积(A₁)比下相的峰面积(A₂)即为分配系数K，计算公式如下：K＝ A₁/A₂。

进一步的，pH区带逆流色谱溶剂体系的配制具体为：选用乙酸乙酯-乙腈 -水(4:1:5，v/v/v)作为两相溶剂体系，采用pH区带的方法进行分离；将乙酸乙酯、乙腈和水按比例置于分液漏斗中剧烈震荡后，静置分层并分离出上下相，在上相加入三氟乙酸，下相加入氨水，分别超声脱气用；称取样品，取等量酸化的上相与不加碱的下相溶解样品，用于后续逆流色谱分离。

进一步的，高速逆流色谱溶剂体系的配制具体为：选用石油醚-乙酸乙酯- 甲醇-水(1:4:1:4，v/v/v/v)作为溶剂体系，按比例至于分液漏斗中，震荡摇匀后静置分层，分离出上下相，分别超声脱气后备用；称取样品，取等量的上下相将样品溶解备用。

进一步的，pH区带逆流色谱分离具体为：将上相泵入高速逆流色谱仪作为固定相，待固定相充满色谱螺旋管后，将样品溶液注入分离柱内；开启速度控制器，使分离柱按顺时针方向旋转，同时泵入下相溶液；开启紫外检测器，将波长调为280nm，根据色谱图收集色谱峰组分，并使用pH计检测馏分的pH 值；分离结束后，使用压力泵将柱内剩余液体吹出，收集于量筒中，用尾吹中固定相的体积比尾吹总体积来计算固定相的保留率。

进一步的，高速逆流色谱分离具体为：泵入上相作为固定相，待固定相充满色谱螺旋管后，开启速度控制器，使分离柱按顺时针方向旋转，同时泵入下相；当体系达到流体动力学平衡后，将混合物A注入分离柱内；开启紫外检测器，在波长280nm下根据色谱图收集色谱峰组分；分离结束后，使用压力泵将柱内剩余液体吹出，收集于量筒中，用尾吹中固定相的体积比尾吹总体积来计算固定相的保留率；将分离出的各部分组分减压浓缩至干燥，密封保存于冰箱内。

进一步的，将蒲公英总样以及分离纯化所得的组分使用HPLC进行分析。色谱柱为C₁₈色谱柱(250×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，0～10min，20％～24％A，10～20min，24％A，20～21min， 24％～34％A，21～30min，34％～40％A，30～35min，40％～100％A，流速1.0 mL/min，检测波长280nm，进样量10μL。并采用归一化的方法计算样品纯度。

本发明具有如下有益效果：

本发明利用pH-ZRCCC和HSCCC相结合的方法对蒲公英多酚进行分离，成功地从蒲公英中分离出了6个多酚类化合物。在实验过程中首先利用 pH-ZRCCC将蒲公英中含量高的多酚类成分分离出来并对低含量成分进行富集，再利用HSCCC实现其他低含量多酚成分的分离，有效地缩短了分离制备的时间。该方法操作简单，快速高效，为分离多酚类化合物提供了新的高效制备方法，同时也为蒲公英的开发利用提供了技术支撑，具有较好的应用价值。

附图说明

构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。以下，结合附图来详细说明本公开的实施方案，其中：

图1：蒲公英多酚粗提物和纯组分的HPLC分析图。

图2：蒲公英粗提物的pH-ZRCCC分离图。

图3：蒲公英回收组分HSCCC分离图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。

实施例1

1 材料与方法

1.1 主要原料

蒲公英购于山东本地药材市场，经专家鉴定为Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.；实验使用正丁醇、正己烷、甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚、氨水、三氟乙酸等试剂均为分析纯；用于HPLC分析的甲醇为色谱纯。

1.2 仪器设备

高速逆流色谱***，配有输液泵、低温恒温槽、紫外检测器、便携式记录仪；其他设备分别有pH计、旋转蒸发仪、高效液相色谱仪、核磁共振波谱仪。

2 实验方法

2.1 蒲公英多酚的提取

取1kg蒲公英粉碎，用60％的乙醇，料液比1:10(w/v)，加热回流提取两次，每次2h，过滤，合并提取液减压浓缩。浓缩液用水混悬，加等量石油醚萃取三次，用于脱脂并除去叶绿素等杂质，取水相加等量乙酸乙酯萃取五次。取乙酸乙酯相减压浓缩至膏状。采用干法上样的方式将样品填入 30-80目聚酰胺常压柱。用水洗脱后，再用30％乙醇洗脱，将30％洗脱部位减压浓缩至干即为样品。将样品放入冰箱，保存备用。

2.2 目标化合物在两相溶剂***中的K值测定

2.2.1 pH区带逆流色谱的K值测定

称取约5mg样品于10mL试管中。配置好溶剂***，取上下相各5mL 于装有样品的试管中，滴加氨水至pH值为10左右，震荡试管至样品完全溶解，静置分层。取上下相各10μL，分别用高效液相色谱(HPLC)进行检测。用上相的峰面积(A_U)比下相的峰面积(A_L)计算碱性条件下样品的分配系数K_base，计算公式如下：K_base＝A_U/A_L。再向该试管中滴加三氟乙酸至pH值约为2，震荡摇匀，静置分层，按同样的方法各取10μL上下相，利用HPLC 计算分配系数K_acid。

2.2.2 高速逆流色谱的K值测定

称取约5mg样品于10mL试管中。配置好溶剂***，取上下相各5mL 于装有样品的试管中，剧烈震荡至样品完全溶解，静置分层，分别取上下相各10μL利用HPLC进行检测，上相的峰面积(A₁)比下相的峰面积(A₂) 即为分配系数K，计算公式如下：K＝A₁/A₂。

2.3 两相溶剂***的制备

2.3.1 pH区带逆流色谱溶剂体系的配制

选用乙酸乙酯-乙腈-水(4:1:5，v/v/v)作为两相溶剂体系，采用pH区带的方法进行分离。将乙酸乙酯、乙腈和水按比例置于分液漏斗中剧烈震荡后，静置分层并分离出上下相，在上相加入10mM的三氟乙酸，下相加入 10mM氨水，分别超声脱气3min备用。

称取样品，取等量酸化的上相与不加碱的下相溶解样品，用于后续逆流色谱分离。

2.3.2 高速逆流色谱溶剂体系的配制

选用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1:4:1:4，v/v/v/v)作为溶剂体系，按比例至于分液漏斗中，震荡摇匀后静置分层，分离出上下相，分别超声脱气后备用。

称取样品，取等量的上下相将样品溶解备用。

2.4 逆流色谱分离

2.4.1 pH区带逆流色谱分离

以30mL/min将上相泵入高速逆流色谱仪作为固定相，待固定相充满色谱螺旋管后，将样品溶液注入分离柱内。开启速度控制器，使分离柱按顺时针方向以800rpm的速度旋转，同时以2mL/min的速度泵入下相溶液。开启紫外检测器，将波长调为280nm，根据色谱图收集色谱峰组分，并使用 pH计检测馏分的pH值。分离结束后，使用压力泵将柱内剩余液体吹出，收集于量筒中，用尾吹中固定相的体积比尾吹总体积来计算固定相的保留率。

2.4.2 高速逆流色谱分离

以30mL/min速度泵入上相作为固定相，待固定相充满色谱螺旋管后，开启速度控制器，使分离柱按顺时针方向以800rpm的速度旋转，同时以2 mL/min的速度泵入下相。当体系达到流体动力学平衡后，将样品注入分离柱内。开启紫外检测器，在波长280nm下根据色谱图收集色谱峰组分。分离结束后，使用压力泵将柱内剩余液体吹出，收集于量筒中，用尾吹中固定相的体积比尾吹总体积来计算固定相的保留率。

将分离出的各部分组分减压浓缩至干燥，密封保存于冰箱内。

2.5 HPLC分析和结构鉴定

将蒲公英总样以及分离纯化所得的组分使用HPLC进行分析。色谱柱为 C₁₈色谱柱(250×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇(A)-0.1％甲酸水溶液(B)， 0～10min，20％～24％A，10～20min，24％A，20～21min，24％～34％A，21～30 min，34％～40％A，30～35min，40％～100％A，流速1.0mL/min，检测波长 280nm，进样量10μL。并采用归一化的方法计算样品纯度。将分离纯化的各组分用DMSO溶解，经ESI-MS和NMR分析，鉴定其化学结构。

3 结果与分析

3.1 HPLC分析结果

图1为蒲公英多酚粗提物和制备的纯品的HPLC分析图。在280nm下使用峰面积归一化法计算，目标化合物I-VI在总样中的峰面积比分别为4.50％ (化合物V)，1.34％(化合物IV)，8.37％(化合物VI)，40.01％(化合物I)，6.68％(化合物III)，9.07％(化合物II)。

3.2 pH区带逆流色谱的分离

pH-ZRCCC制备量大，适用于浓度大于0.1mM，最好高于1mM的组分。因此首先选用pH区带逆流色谱法对蒲公英中含量较高的多酚组分进行分离，同时将微量组分富集。

合适的分配系数(K)是pH区带逆流色谱法实现成功分离的关键，分离酸性物质时，要求溶剂体系的K_base＜＜1并且K_acid＞＞1，同时应满足样品在溶剂体系中具有良好的溶解度。根据文献报道以及本实验室的经验选择溶剂体系乙酸乙酯-正丁醇-水(4:1:5，v/v/v)，测定目标化合物在该溶剂体系中的分配系数K_acid和K_base，测定结果见表1。结果表明该溶剂体系适用于本样品的分离，因此使用乙酸乙酯-正丁醇-水(4:1:5，v/v/v)作为溶剂体系，上相加入三氟乙酸(10mM)作为固定相，下相加入氨水(10mM)作为流动相，对1.6g蒲公英粗提物进行分离，如图2所示目标化合物以不规则的矩形峰形式被洗脱出来，固定相保留率为61.1％。经HPLC检测化合物I、II在10h 实现成功分离，纯度分别为98.1％和98.8％，而其它化合物分离度较差，故合并为混合物A。各组分样品经冷冻干燥后，得到化合物I 60.2mg，化合物 II 6.3mg以及混合物A 590mg。

表1目标化合物I-Ⅵ在溶剂***中的分配系数K_acid和K_base

3.3 高速逆流色谱的分离

混合物A经pH区带逆流色谱法分离后未能达到分离的效果，推测其酸碱性可能相近或组分含量较少，适合应用高速逆流色谱法对其再次进行分离。

高速逆流色谱法分离的关键在于溶剂体系的选择，目标化合物在溶剂体系中的K值应在0.5～2.0之间。首先选择常用溶剂体系乙酸乙酯-乙腈-水 (4:1:5，v/v/v)，发现目标化合物在该溶剂体系中的K值远远大于2.0。由此推测目标化合物极性可能较低，故向溶剂体系中加入石油醚以调节溶剂体系的极性。最终选择石油醚-乙酸乙酯-乙腈-水(1:4:1:4，v/v/v/v)作为溶剂体系，经测定化合物III、IV、V、VI的K值分别为1.03、0.97、0.86、0.78，符合溶剂体系的选择范围。因此选用石油醚-乙酸乙酯-乙腈-水(1:4:1:4， v/v/v/v)作为HSCCC分离的溶剂体系对400mg混合物A进行分离，结果如图3所示，混合物A在6.5h内完成分离，固定相保留率为69.4％。经HPLC 检测，化合物Ⅲ(7.7mg，纯度82.2％)，化合物Ⅳ(5.4mg，纯度24.8％)，化合物Ⅴ(6.2mg，纯度95.3％)，化合物Ⅵ(3.4mg，纯度89.0％)。经半制备高效液相色谱纯化使其纯度达到90％以上，并多次富集用于后续结构鉴定。

3.4 化合物的结构鉴定

化合物I：ESI-MS，m/z 179.0332[M-H]^-。¹H-NMR(400MHz,DMSO)δ: 8.43(s,1H),7.33(d,J＝15.8Hz,1H),7.02(s,1H),6.90(d,J＝8.1Hz,1H),6.75(d,J＝8.1Hz,1H),6.18(d,J＝15.8Hz,2H).¹³C-NMR(100MHz,DMSO) δ169.35(s),148.64(s),146.30(s),143.50(s),126.40(s),121.16(s),117.61(s), 116.38(s),115.06(s)。与文献[Inhibitoryeffects of bioassay-guided isolation of anti-glycation components fromTaraxacum coreanum and simultaneous quantification.Molecules,2018,23(9):2148-2161]报道的咖啡酸数据一致，故鉴定化合物Ⅰ为咖啡酸。

化合物II：ESI-MS，m/z 163.0288[M-H]^-。¹H-NMR(400MHz,DMSO)δ: 7.49(t,J＝11.7Hz,3H),6.79(d,J＝8.5Hz,2H),6.29(d,J＝15.9Hz,1H),1.23 (s,1H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ159.88(s),144.27(s),130.48(s),116.20 (s)。与文献[Defuscin,a newphenolic ester from Dendrobium fuscescens:Conformation of shikimicacid.Phytochemistry,1989,28(1):290-291]报道的对羟基肉桂酸数据一致，故鉴定化合物Ⅱ为对羟基肉桂酸。

化合物III：ESI-MS，m/z 253.0653[M-H]^-。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ 7.49(d,J＝15.9Hz,1H),7.05(s,1H),7.00(d,J＝8.2Hz,1H),6.77(d,J＝8.1 Hz,1H),6.26(d,J＝15.9Hz,1H),4.15(dd,J＝11.2,4.0Hz,1H),4.00(dd,J＝ 11.1,6.5Hz,1H),3.75–3.66(m,1H),1.24(s,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO) δ167.09(s),148.92(s),146.08(s),145.55(s),125.96(s),121.80(s),116.24(s),115.23(s),114.46(s),69.90(s),66.08(s),63.17(s)。与文献[川西千里光中酚酸类化学成分研究.河南中医,2014,34(9):1847-1849]报道的1-O-咖啡酰基甘油数据一致，故鉴定化合物Ⅲ为1-O-咖啡酰基甘油。

化合物IV：ESI-MS，m/z 167.0277[M-H]^-。¹H NMR(600MHz,DMSO)δ 8.84(s,1H),6.64(d,J＝2.6Hz,2H),6.63(s,1H),6.48(dd,J＝8.0,2.1Hz,1H),3.32(s,3H).¹³C NMR(150MHz,DMSO)δ173.77(s),145.43(s),144.43(s), 126.32(s),120.46(s),117.13(s),115.79(s)。与文献[厚皮香酚性成分及其镇痛活性.中成药,2019,41(7):1582-1586]报道的3,4-二羟基苯乙酸数据一致，故鉴定化合物Ⅳ为3,4-二羟基苯乙酸。

化合物V：ESI-MS，m/z 153.0089[M-H]^-。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ 9.46(s,2H),7.33(s,1H),7.31–7.25(m,1H),6.78(d,J＝8.2Hz,1H).¹³C NMR (100MHz,DMSO)δ167.77(s),150.45(s),145.34(s),122.34(s),122.14(s),117.01(s),115.60(s)。与文献[骨碎补中的两个新酚酸类化合物.药学学报, 2010,45(7):874-878]报道的原儿茶酸数据一致，故鉴定化合物Ⅴ为原儿茶酸。

化合物VI：ESI-MS，m/z 151.0288[M-H]^-。¹H NMR(400MHz,DMSO)δ 12.15(s,1H),9.27(s,1H),7.03(d,J＝8.3Hz,1H),6.69(d,J＝8.3Hz,1H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ173.59(s),156.50(s),130.71(s),125.60(s),115.48(s)。与文献[复方三子养亲汤中酚酸类成分.沈阳药科大学学报,2007(11): 679-681]报道的对羟基苯乙酸数据一致，故鉴定化合物Ⅵ为对羟基苯乙酸。

本发明采用pH区带逆流色谱(pH-ZRCCC)与高速逆流色谱(HSCCC) 相结合的方式，从蒲公英中分离得到6个多酚类化合物。在pH-ZRCCC分离中，选择溶剂体系为乙酸乙酯-乙腈-水(4:1:5，v/v/v)，上相加入三氟乙酸(10 mM)作为固定相，下相加入氨水(10mM)作为流动相。从1.6g蒲公英乙酸乙酯粗提物中分离得到咖啡酸(60.2mg，纯度98.1％)和羟基肉桂酸(6.3mg，纯度98.8％)及590mg混合物A。之后进一步利用HSCCC，选择溶剂体系为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(1:4:1:4，v/v/v/v)。从400mg混合物A中分离得到 1-O-咖啡酰基甘油(4.0mg，纯度99.7％)、3,4-二羟基苯乙酸(0.4mg，纯度 93.3％)、原儿茶酸(6.2mg，纯度95.3％)以及对羟基苯乙酸(2.1mg，纯度 94.3％)。该方法制备量大，重现性好，适合蒲公英多酚类化合物的分离纯化。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种蒲公英中多酚类成分的高效分离方法，其特征在于，其步骤如下：

（1）提取蒲公英多酚；将蒲公英粉碎，用溶剂加热回流提取，减压浓缩得到浓缩液；将浓缩液萃取，萃取后洗脱浓缩得到蒲公英样品；

（2）配制pH区带逆流色谱溶剂体系、高速逆流色谱溶剂体系；

（3）将蒲公英样品溶解于pH区带逆流色谱溶剂体系中，进行pH区带逆流色谱分离，分离得到化合物I、化合物II以及混合物A；将混合物A溶解于高速逆流色谱溶剂体系中，进行高速逆流色谱分离，分离得到化合物Ⅲ、化合物Ⅳ和化合物Ⅴ；

（4）将蒲公英样品以及分离纯化所得的化合物使用HPLC进行分析，计算纯度；采用ESI-MS和NMR分析，鉴定分离纯化所得的化合物的化学结构；

pH区带逆流色谱溶剂体系的配制具体为：选用乙酸乙酯-乙腈-水=4:1:5，v/v/v作为两相溶剂体系，采用pH区带的方法进行分离；将乙酸乙酯、乙腈和水按比例置于分液漏斗中剧烈震荡后，静置分层并分离出上下相，在上相加入三氟乙酸，下相加入氨水，分别超声脱气用；称取样品，取等量酸化的上相与不加碱的下相溶解样品，用于后续逆流色谱分离；

高速逆流色谱溶剂体系的配制具体为：选用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水=1:4:1:4，v/v/v/v作为溶剂体系，按比例置于分液漏斗中，震荡摇匀后静置分层，分离出上下相，分别超声脱气后备用；称取样品，取等量的上下相将样品溶解备用；

pH区带逆流色谱分离具体为：将上相泵入高速逆流色谱仪作为固定相，待固定相充满色谱螺旋管后，将样品溶液注入分离柱内；开启速度控制器，使分离柱按顺时针方向旋转，同时泵入下相溶液；开启紫外检测器，将波长调为280 nm，根据色谱图收集色谱峰组分，并使用pH计检测馏分的pH值；分离结束后，使用压力泵将柱内剩余液体吹出，收集于量筒中，用尾吹中固定相的体积比尾吹总体积来计算固定相的保留率；

高速逆流色谱分离具体为：泵入上相作为固定相，待固定相充满色谱螺旋管后，开启速度控制器，使分离柱按顺时针方向旋转，同时泵入下相；当体系达到流体动力学平衡后，将混合物A注入分离柱内；开启紫外检测器，在波长280 nm下根据色谱图收集色谱峰组分；分离结束后，使用压力泵将柱内剩余液体吹出，收集于量筒中，用尾吹中固定相的体积比尾吹总体积来计算固定相的保留率；将分离出的各部分组分减压浓缩至干燥，密封保存于冰箱内。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）具体为：取适量蒲公英粉碎，用60%的乙醇，料液比1:10，w/v，加热回流提取，过滤后减压浓缩得浓缩液；浓缩液用水混悬，加等量石油醚萃取，取水相再加等量乙酸乙酯萃取；取乙酸乙酯相减压浓缩至膏状，采用干法上样的方式将样品填入30-80目聚酰胺常压柱，用水洗脱后，再用30%乙醇洗脱，将30%洗脱部位减压浓缩至干即为样品。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，配制pH区带逆流色谱溶剂体系、高速逆流色谱溶剂体系前，需先测定样品在pH区带逆流色谱、高速逆流色谱的K值。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，pH区带逆流色谱的K值的测定方法为：称取样品于试管中；配置好溶剂***，取上下相于装有样品的试管中，滴加氨水至pH值为10左右，震荡试管至样品完全溶解，静置分层；取上下相分别用高效液相色谱（HPLC）进行检测；用上相的峰面积AU比下相的峰面积AL计算碱性条件下样品的分配系数Kbase，计算公式如下：Kbase= AU/AL；再向该试管中滴加三氟乙酸至pH值约为2，震荡摇匀，静置分层，按同样的方法各取上下相，利用HPLC计算分配系数Kacid。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，样品在高速逆流色谱的K值测定为：称取样品于试管中；配置好溶剂***，取上下相于装有样品的试管中，剧烈震荡至样品完全溶解，静置分层，分别取上下相利用HPLC进行检测，上相的峰面积A1比下相的峰面积A2即为分配系数K，计算公式如下：K=A1/A2。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将蒲公英样品以及分离纯化所得的化合物使用HPLC进行分析；其中色谱柱为C18色谱柱250× 4.6 mm，5 μm，流动相为甲醇-0.1%甲酸水溶液，甲醇为A相，0.1%甲酸水溶液为B相，0~10 min，20%~24%A，10~20 min，24%A，20~21min，24%~34%A，21~30 min，34%~40%A，30~35 min，40%~100%A，流速1.0 mL/min，检测波长280 nm，进样量10 μL；并采用归一化的方法计算样品纯度。