CN114277150A - 适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法及应用，检测方法，包括如下步骤：引物探针设计：基于结直肠转录表达资源，选择了若干管家基因作为候选基因，并分别设计引物和探针，候选管家基因至少包括GAPDH和/或SDHA；反转录：针对目标样本和/或对照样本，提取RNA，反转录为对应的cDNA，本发明通过选择设计了适用于结直肠组织和/或肿瘤的特定的引物和探针，经实验测试证明具有更为良好的检测稳定性，无论在针对细胞系(含原代细胞)或者临床组织样本的检测中都具有明显的应用优势。

Description

适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法及应用

技术领域

本发明是关于生物检测技术领域，特别是关于一种适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法及应用。

背景技术

结直肠是人体消化道对营养物质做最后一次吸收的地方，是人体把食物残渣变成粪便，排除体外的器官。结肠包括升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠四个部分。大多数结直肠癌是由息肉引起，最终发展为结直肠癌，整个过程可长达5-15年。全球范围内，结直肠癌是第三位最常见的恶性肿瘤，也是第二位最常见的恶性肿瘤死亡原因。据WHO癌症研究中心的GLOBOCAN项目估计，2018年全球范围内结直肠癌新发病例数约为180万，死亡人数约为88万。

近年的研究表明，结直肠癌是一类多基因病，其发展过程复杂，临床表现多样，涉及到多个基因的变化，其发生与某些原癌基因的激活和抗癌基因的失活有关。结直肠癌病人基因组的异质性决定了每个病人对药物的不同反应性。基因组异质性指的是每个病人基因组的突变基因类型和数目、基因(或染色体片段)拷贝数变异、融合基因类型和基因表达水平等不完全相同。这些性质的不同导致“同治不同效”。要精确找到病人对哪种药物可能敏感，首先要了解病人基因组的各类信息，尤其是基因突变和表达异常；之后通过测序技术和生物信息学分析，推测关键靶标基因，选择所对应的药物，用于病人临床治疗。现有的胃肠靶向检测技术，如一种HER2检测试剂盒及其检测方法和应用(CN201910476081.5)、用于胃癌诊断及预后评估的生物标记物及应用和检测试剂盒(CN202010197122.X)和METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物治疗敏感性的试剂盒中的应用(CN202010424466.X)均选用了GAPDH作为内参对照等，在稳定性和检测准确性均有待提高。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法及应用，通过选择设计了特定的引物和探针，具有更为良好的检测稳定性，无论在针对细胞系或者临床组织样本的检测中都具有明显的应用优势。

为实现上述目的，本发明的实施例提供了适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法，包括如下步骤：引物探针设计：基于结直肠转录表达资源，选择了若干管家基因作为候选基因，并分别设计引物和探针，所述管家基因至少包括GAPDH和/或SDHA；反转录：针对目标样本和/或对照样本，提取RNA，反转录为对应的cDNA，所述目标细胞样本选自结直肠癌细胞系细胞、保存在RNAlatter溶液中的新鲜肿瘤组织样本、经液氮速冻且-80℃保存的肿瘤组织样本、经***固定后的肿瘤组织样本，所述对照细胞样本选自健康人的白细胞、保存在RNAlatter溶液中的新鲜正常组织样本、经液氮速冻且-80℃冻存的正常组织样本、经***固定后的正常组织样本。实时荧光定量PCR检测：在包括有所述引物、探针和cDNA的PCR反应体系中扩增反应，其中内参基因为SDHA，表达检测。优选的，其中内参基因为SDHA时表达检测结果相对其它候选管家基因最为稳定。

在本发明的一个或多个实施方式中，针对GAPDH，所述引物和探针包括：正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；反向引物核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；探针核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

在本发明的一个或多个实施方式中，针对GAPDH，所述探针核苷酸序列的5’端还标记有荧光报告基团，3’端还标记有荧光淬灭基团。

在本发明的一个或多个实施方式中，针对SDHA，所述引物和探针包括：正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.4或7所示；反向引物核苷酸序列如SEQ ID No:5或8所示；探针核苷酸序列如SEQ ID No.6或9所示。

在本发明的一个或多个实施方式中，针对SDHA，所述探针核苷酸序列的5’端还标记有荧光报告基团，3’端还标记有荧光淬灭基团。

在本发明的一个或多个实施方式中，荧光报告基团为FAM、HEX、VIC、ROX、Cy5中的至少一种，荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2、MGB中的至少一种。

在本发明的一个或多个实施方式中，结直肠癌细胞系细胞至少包括DLD-1、HCT116，具有显而易见的细胞系和原代细胞推广能力；组织样本包括保存在RNAlatter溶液中的肿瘤和正常样本、经液氮速冻且-80℃冻存的肿瘤和正常样本、经***固定后的肿瘤和正常样本；

在本发明的一个或多个实施方式中，PCR反应体系为qpcrmastermix(2X)10μL，cDNA 1μL，primerF 1μL，primer R 1μL，probe 0.5μL，超纯水6.5μL。

在本发明的一个或多个实施方式中，扩增反应的条件为：95℃热激活3分钟；95℃变性15秒，60℃退火40秒,共进行40个循环.

在本发明的一个或多个实施方式中，应用，应用了如前述的适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法的荧光定量PCR设备或数字PCR设备或荧光探针检测设备。

本发明方案可以被应用于荧光定量PCR、数字PCR、荧光探针检测等。

与现有技术相比，根据本发明实施方式的适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法及应用，基于TCGA和GTEx的结直肠转录表达资源，评估了常见的管家基因GAPDH、SDHA，数据显示内参基因SDHA在不同样本间表达稳定；而GAPDH在该队列的肿瘤组织和正常组织间表达存在显著差异。细胞系实验中，SDHA的Ct值变异系数小于GAPDH，且SDHA在肿瘤和正常组织间波动差异也小于GAPDH。组织学实验数据证明，在取自临床的正常组织样本和肿瘤样本中，相对GAPDH，SDHA样本间表达差异最小，相对稳定性最高。

综上所述，SDHA作为内参基因，在结直肠组织和/或肿瘤中表达稳定，基于SDHA表达值进行校正能够提高结直肠肿瘤样本和正常样本中其它目标基因的定量可靠性，进一步提高后期相关结直肠癌检测的灵敏度和特异性。本发明检测方法简单，操作便捷，大大提高了检测的灵敏度和特异性及定量可靠性。

附图说明

图1是本发明实施例1中基于队列转录组数据进行的目标内参基因在肿瘤和正常组织表达对比分析。

具体实施方式

下面结合本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，甘油醛-3-磷酸-脱氢酶。

SDHA:succinate dehydrogenase complex flavoprotein subunit A，琥珀酸脱氢酶。

DLD-1：人结直肠腺癌上皮细胞。来自结肠。

HCT 116：人结肠癌细胞。来自结肠。

实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。使用实时荧光定量PCR对特定的目的基因进行相对定量的计算时，需要结合相对稳定的内参基因进行校正和均一化。内参基因一般选择在细胞中稳定表达的管家基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必须的，理论上管家基因表达水平受环境影响因素较小，在个体各个生长阶段和各个组织中应持续稳定表达。

在包括而不限于如下实施例中，针对探针所采用的荧光报告基团可以选自FAM、HEX、VIC、ROX、Cy5，具体的选择与配合可以无特定要求，可以是组合物、试剂类型、检测条件等进行选择而定。同理的，针对探针所采用的荧光淬灭基团可以选自BHQ1、BHQ2、MGB，具体的选择与配合可以无特定要求，可以是组合物、试剂类型、检测条件等进行选择而定。

包括而不限于，如下所展示的实施例中，探针和引物可以选用如下序列。

基于TCGA和GTEx的结直肠转录表达资源，选择了2个管家基因作为候选基因，分别为GAPDH和SDHA。根据NCBI上的mRNA序列，分别对GAPDH、SDHA设计了引物，序列见下表：

其中荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1。

实施例1

选择2个结直肠癌细胞系细胞，分别为DLD-1、HCT116.进行RNA提取，提取方法按照RNA提取试剂盒说明书进行。选择一个健康人的白细胞进行RNA提取，提取方法按照RNA提取试剂盒说明书进行。按照反转录试剂盒说明书将上述3个样本的RNA反转录成cDNA，获得的cDNA用于后续的PCR反应中。PCR反应体系和反应条件如下：

反应体系主要为，其余如缓冲液、无机盐等均可以参照本领域现有技术而选择：

组分	体积
		PCR mix(2x)	12.5μL
Primer F/R	各1μL
		cDNA	1μL
超纯水	10.5μL
		反应总体积	25μL

反应程序

如图1所示的，各样本分别按照上述的条件扩增了SDHA的两对引物，将PCR产物进行凝胶电泳，电泳图显示SEQ ID No.4、5扩增效果优于SEQ ID No.7、8，将SEQ ID No.4、5的产物进行一代测序，在NCBI上进行BLAST，结果较好，优先选择SEQ ID No.4、5作为本次实验的引物。

实施例2

选择2个结直肠癌细胞系细胞，分别为DLD-1、HCT116进行RNA提取，提取方法按照RNA提取试剂盒说明书进行。选择一个健康人的白细胞进行RNA提取，提取方法按照RNA提取试剂盒说明书进行。按照反转录试剂盒说明书将上述3个样本的RNA反转录成cDNA，获得的cDNA用于后续的荧光定量PCR反应中。荧光定量PCR反应体系和反应条件如下：

反应体系主要为，其余如缓冲液、无机盐等均可以参照本领域现有技术而选择：

组分	体积
		qPCR master mix(2x)	10μL
Primer F/R	各1μL
		Probe	0.5μL
cDNA	1μL
		超纯水	6.5μL
反应总体积	20μL

反应程序

使用SEQ ID No.1～3以及SEQ ID No.4～6进行荧光定量PCR，5个细胞系RNA均进行了三次重复实验，同时每次实验中有三次复孔。

实验结果如下：

根据上述结果进行分析数据可以看出：所有内参基因在各自细胞系的CV系数平均值均低于0.01，整体还是比较稳定的；同一内参基因所有Ct，总体计算CV系数，GAPDH(0.051456)>SDHA(0.031331783)。SDHA在肿瘤和正常样本间差异(Ct值均值差异绝对值)小于GAPDH，相对稳定。因此，SDHA效果最好。

实施例3

选择6个结直肠组织样本，样本分别来源于3位志愿者的正常组织和肿瘤组织(当然还可以选择保存在RNAlatter溶液中的新鲜组织样本或经液氮速冻且-80℃保存的组织样本或经***固定后的组织样本等，这里就不一一举例)进行RNA提取，提取方法按照RNA提取试剂盒说明书进行。按照反转录试剂盒说明书将上述6个样本的RNA反转录成cDNA，获得的cDNA用于后续的实时荧光定量PCR中。实时荧光定量PCR反应体系和反应条件如下：反应体系主要为，其余如缓冲液、无机盐等均可以参照本领域现有技术而选择：

反应程序

6个样本的RNA均进行了三次重复实验，同时每次实验中有四次复孔。实验结果如下：

根据上述结果进行分析数据可以看出：在6个样本(1N/T,2N/T,3N/T)中，GAPDH的CV系数为0.038，SDHA的CV系数为0.036，SDHA略优于GAPDH。且TCGA-COAD队列层面，GAPDH在肿瘤和正常组织间存在差异表达，而SDHA表达稳定。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

引物探针设计：基于结直肠转录表达资源，选择了若干管家基因作为候选基因，并分别设计引物和探针，所述管家基因选自GAPDH、SDHA；

反转录：针对目标样本和/或对照样本，提取RNA，反转录为对应的cDNA，所述目标样本选自结直肠癌细胞系细胞、保存在RNA latter溶液中的新鲜肿瘤组织样本、经液氮速冻且-80℃保存的肿瘤组织样本、经***固定后的肿瘤组织样本，所述对照样本选自健康人的白细胞、保存在RNA latter溶液中的新鲜组织样本、经液氮速冻且-80℃冻存的组织样本、经***固定后的组织样本；

实时荧光定量PCR检测：在包括有所述引物、探针和cDNA的PCR反应体系中扩增反应。

2.如权利要求1所述的适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法，其特征在于，针对GAPDH，所述引物和探针包括：正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；反向引物核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；探针核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

3.如权利要求2所述的适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法，其特征在于，针对GAPDH，所述探针核苷酸序列的5’端还标记有荧光报告基团，3’端还标记有荧光淬灭基团。

4.如权利要求1所述的适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法，其特征在于，针对SDHA，所述引物和探针包括：正向引物核苷酸序列如SEQ ID No.4或7所示；反向引物核苷酸序列如SEQ ID No:5或8所示；探针核苷酸序列如SEQ ID No.6或9所示。

5.如权利要求4所述的适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法，其特征在于，针对SDHA，所述探针核苷酸序列的5’端还标记有荧光报告基团，3’端还标记有荧光淬灭基团。

6.如权利要求3或5所述的适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、HEX、VIC、ROX、Cy5中的至少一种，荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2、MGB中的至少一种。

7.如权利要求1所述的适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法，其特征在于，所述结直肠癌细胞系细胞(含原代细胞)，比如至少包括DLD-1、HCT116。

8.如权利要求1所述的适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系为qpcr master mix(2X)10μL，cDNA 1μL，primerF 1μL，primer R 1μL，probe 0.5μL，超纯水6.5μL。

9.如权利要求1所述的适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法，其特征在于，所述扩增反应的条件为：

95℃热激活3分钟；

95℃变性15秒，60℃退火40秒，共进行40个循环。

10.应用，应用了如权利要求1-9任一所述的适用于结直肠组织和/或肿瘤的内参检测方法的荧光定量PCR设备或数字PCR设备或荧光探针检测设备。

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