CN114277023A

CN114277023A - 重组腈水合酶及其在耦合离子交换树脂制备烟酰胺中的应用

Info

Publication number: CN114277023A
Application number: CN202111633257.7A
Authority: CN
Inventors: 郑建永; 王祎丁; 宋问; 孙杰; 于欣君
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2041-12-29
Also published as: CN114277023B

Abstract

本发明提供了一种重组腈水合酶及其在耦合离子交换树脂制备烟酰胺中的应用，将重组腈水合酶基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体经超声波破碎后得到的上清液的浓缩液为催化剂，以3‑氰基吡啶为底物，加入离子交换树脂，以pH6‑9的磷酸缓冲溶液为反应介质构成反应体系，在20‑30℃、100‑1000rpm条件下进行水合反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得产物烟酰胺。本发明重组腈水合酶耦合离子交换树脂具有条件温和、效率高，高度的化学选择性、区域选择性选择性等优点，而且生物催化过程具有无毒、无污染和能耗低等特点，是一种环境友好的合成方法，吸附了95％以上的烟酸杂质，得到了纯度99.99％以上的烟酰胺产品。

Description

重组腈水合酶及其在耦合离子交换树脂制备烟酰胺中的应用

技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及一种重组腈水合酶及其催化水合3-氰基吡啶耦合离子交换树脂制备高纯度烟酰胺的应用。

背景技术

尼克酰胺(nicotinamide，商品名烟酰胺)，是一种水溶性、稳定、易穿透角质层的小分子维生素。其作为一种医药成分来说具有很高的安全性，也是临床皮肤科治疗中的一种基础性维生素类补充剂。近年来的研究证明，烟酰胺作为化妆品的功效成分，在抑制黑色素沉着、抗炎、抗衰老、治疗痤疮等方面都有很好的效果。一般来说，烟酰胺的添加量要达到3％以上才能发挥美白效果，高含量的烟酰胺可能会对皮肤产生一定的刺激性，其主要原因可能是烟酰胺中的少量烟酸引起的。烟酰胺在酸性条件下会分解产生烟酸，使皮肤出现泛红、痒、刺痛等，也就是常说的不耐受现象。

传统的酰胺生产方法大致可分为三类：羧酸与胺类物质缩合；腈类的水解反应；以及硫代酸和叠氮的酰胺化反应。这些化学合成法需要200-400℃高温高压的苛刻反应条件，且反应过程冗长，需要添加骨架铜等金属催化剂，在反应过程中伴有毒副产物的生成，很难满足当今绿色化学的要求。与化学合成法相比，生物催化合成酰胺具有反应条件温和，无毒害副产物生成，并具有优异的区域和立体选择性等优势。

腈水合酶(EC4.2.1.84)是一种可催化腈类物质转化成相应酰胺类物质的酶。腈水合酶以硫原子和半胱氨酸-亚磺酸残基为活性中心，最小功能单元一般由两个亚基(α和β亚基)和一个金属离子组成，根据其所螯合的金属离子不同，腈水合酶分为Co型腈水合酶和Fe型腈水合酶。腈水合酶是一种催化效率高、专一性强(包括底物特异性，立体异构特异性和化学特异性)的生物催化剂。但是由于腈水合酶基因簇特性具有部分腈水解酶的特点，同样由于酶的蛋白质特征，凡是能够引起蛋白质变性的因素都可能会造成酶的失活，如pH、重金属盐、热、紫外线、剧烈震荡等。即使在最适的催化条件下，随着反应时间的延长，酶催化反应速度也会逐渐下降。另外，游离酶在催化水合水解反应后产生杂质，给产物分离和提纯工艺造成困难，导致生产成本提高。这些因素都极大地限制了腈水合酶催化剂在现代工业中的应用。因此进行烟酰胺合成工艺和有关物质研究，开发成本低廉、适合产业化放大工艺路线，制备高纯度、低烟酸含量的烟酰胺产品，具有极大的科研意义和经济价值。

发明内容

本发明目的是为了解决现有合成方法的不足，提供一种重组腈水合酶及其在耦合离子交换树脂制备高纯度烟酰胺中的应用，通过改造优化产腈水合酶工程菌得到廉价高效的腈水合酶，同时耦合离子交换树脂生物法制备高纯度烟酰胺，降低腈水合酶成本，提高酶活，热稳定性，同时得到高纯度产物。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种重组腈水合酶，所述重组腈水合酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述重组腈水合酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。

本发明根据NCBI检索获得源自玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous J1) 的腈水合酶基因簇序列Nitrile hydrataseH-Nhase(GenBank:D67027.1)，包含β亚基(NHase-B)、α亚基(NHase-A)和激活蛋白基因(NHase-G)三部分，将其基因簇中的β亚基(NHase-B)、α亚基(NHase-A)和激活蛋白基因(NHase-G)经大肠杆菌密码子优化后重组，获得所述的重组腈水合酶。

本发明还涉及所述重组经水合酶编码基因，含有腈水合酶编码基因的重组载体，以及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌，所述工程菌将合成基因连接至载体pET-28a⁺的T7阅读框中，并且转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得重组大肠杆菌基因工程菌。

本发明提供一种所述重组腈水合酶耦合离子交换树脂制备烟酰胺的应用，具体应用方法为：将重组腈水合酶基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体经超声波破碎后得到的上清液的浓缩液为催化剂，以3-氰基吡啶为底物，加入离子交换树脂，以pH6-9(优选pH7.0)磷酸缓冲溶液为反应介质构成反应体系，在20-30℃、 100-1000rpm条件下进行水合反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得产物烟酰胺。所述反应体系中，催化剂用量以破碎前湿菌体重量计为1-10g/L(优选 2g/L)，所述底物终浓度为50-200mM(优选100mM)，所述离子交换树脂加入量为100-400g/L(优选100g/L)。

进一步，优选反应时间为5min-180min，更优选反应条件为20-25℃、800-1000rpm反应30min。

进一步，所述缓冲液为pH 7.0，0.2mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液。

进一步，所述离子交换树脂为阴离子交换树脂(D101、D201、D301、D311、 A764、JKA915)，优选D201强碱性阴离子交换树脂。

进一步，所述催化剂按如下方法制备：将重组腈水合酶基因工程菌接种在含终浓度50μg/mL卡那霉素(Kan)抗性的液体LB培养基中，37℃培养10h；培养后的种子液以体积浓度1％接种量转接至新的含终浓度50μg/mL卡那霉素(Kan) 抗性的液体LB培养基中，37℃培养OD₆₀₀至为0.6-0.8，加IPTG至终浓度0.5mM，再加入100mM的CoCl₂水溶液至CoCl₂终浓度0.4-0.5mM，28℃培养12-16h，菌液8000-9000rpm，4℃离心10min，收集菌体，再用pH7.0的PBS缓冲液洗涤菌体2次，8000-9000rpm，4℃离心10min，收集湿菌体；湿菌体用PBS缓冲液重悬后超声破碎，离心(12000rpm 4℃下离心10min)，取上清液，浓缩至破碎混合液体积的10-30％(优选20％)，得到粗酶液；超声破碎条件为300W超声破碎5min，每次超声持续1s，间隔2s；LB培养基组成：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH值为7。

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.4所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有70％以上同源性、且具有相同的功能，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或***，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。

另外，可与SEQ ID NO：4所示多核苷酸序列杂交的多核苷酸(至少具有 50％同源性，优选具有70％同源性)，也在本发明保护范围之列，特别是在严格条件下可与本发明所述核苷酸序列杂交的多核苷酸。所述“严格条件”是指：(1) 在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2SSC，0.1％SDS，60℃；或 (2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清，0.1％Ficoll， 42℃；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO：1所示的蛋白有相同的生物学功能和活性。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种重组腈水合酶，该重组腈水合酶编码基因由不同亚基组合后可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌。相对于野生菌株，其表达强度、腈水合酶活性、热稳定性、底物及产物耐受性得到了显著的提高。

同样，采用本发明中重组腈水合酶催化耦合离子交换树脂的吸附方法，在不影响转化率的基础上，吸附了95％以上的烟酸杂质，得到了纯度99.99％以上的烟酰胺产品，本发明重组腈水合酶耦合离子交换树脂具有条件温和、效率高，高度的化学选择性、区域选择性选择性等优点，而且生物催化过程具有无毒、无污染和能耗低等特点，是一种环境友好的合成方法。

附图说明

图1为腈水合酶催化3-氰基吡啶制备烟酰胺反应示意图。

图2为腈水合酶翻译起始区域mRNA二级结构预测图。

图3为实施例1构建的腈水合酶重组质粒构建图，a为pET28a-NHaseYpB₁， b为pET28a-NHaseYpB₂，c为pET28a-NHaseYpB₃，d为pET28a-NHaseYpB₄。

图4为实施例4酶催化耦合离子交换树脂吸附反应液的液相色谱图。

图5为实施例4酶催化耦合树脂反应进程及副产物烟酸含量图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的方法上的变换均包含在本发明的保护范围内。

实施例1、腈水合酶基因克隆和工程菌构建

1、工程菌pET28a-NHaseYpB₁

(1)野生型腈水合酶

根据NCBI中来自玫瑰色红球菌(R.rhodochrous J1)的腈水合酶(nitrilehydratase H-Nhase，GenBank:D67027.1)，包含β亚基(NHase-B)、α亚基(NHase-A) 和激活蛋白基因(NHase-G)三部分，根据大肠杆菌偏好性经密码子优化后由北京擎科生物科技有限公司合成上述三个片段，β亚基(NHase-B)核苷酸序列如SEQ ID NO.2中1-690位所示，α亚基(NHase-A)核苷酸序列如SEQ ID NO.2中 691-1302位所示，激活蛋白基因(NHase-G)核苷酸序列如SEQ ID NO.2中1303-1617位所示。

(2)片段

β亚基片段：以步骤(1)合成腈水合酶基因β亚基(NHase-B)片段为模板，以表1中B_1-1和B_1-2为引物，采用表2所示体系进行PCR扩增，获得PCR产物即为β亚基片段。

α亚基片段：以步骤(1)合成腈水合酶基因α亚基(NHase-A)片段为模板，以表1中B_1-3和B_1-4为引物，采用表2所示体系进行PCR扩增，获得PCR产物即为α亚基片段。

激活蛋白片段：以步骤(1)合成腈水合酶基因激活蛋白(NHase-G)片段为模板，以表1中B_1-5和B_1-6为引物，采用表2所示体系进行PCR扩增，获得PCR 产物即为激活蛋白片段。

(3)采用载体pET-28a，将α亚基片段、β亚基片段和激活蛋白片段，按表 3所列体系，采用“诺唯赞ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit C115”快速克隆试剂盒，50℃反应15min进行多片段同源重组，核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示(其中1-690位核苷酸为β亚基(NHase-B)编码基因、691-1302位核苷酸为α亚基(NHase-A)编码基因、1303-1617位核苷酸为激活蛋白基因(NHase-G)编码基因)，获得重组质粒pET28a-NHaseYpB₁(图3中a)；降至4℃保温。

SEQ ID NO.2：

(4)重组腈水合酶基因工程菌

将步骤(3)一步克隆产物pET28a-NHaseYpB₁转化E.coil BL21(DE3)感受态细胞后，挑取转化子接种至5mL LB培养基，37℃培养12h后，菌液由北京擎科生物科技有限公司测序，测序结果正确即得到表达来自R.rhodochrous J1的重组腈水合酶基因工程菌，记为工程菌E.coil BL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₁。

PCR反应条件：①98℃预变性5min。②98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸20s，循环30次。③72℃延伸5min。④4℃保温。

表1重组质粒NHaseYpB₁构建引物

表2、PCR扩增体系

注：PCR验证时用20μL体系，基因克隆时用50μL体系。

表3同源重组体系

多片段同源重组：最适克隆载体使用量＝[0.02*克隆载体碱基对数]ng、每个片段最适使用量[0.02*克隆载体碱基对数]ng。

2、工程菌E.coilBL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₂

以工程菌E.coil BL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₁基因组为模板，以表4中 B_2-1和B_2-2为引物(将核糖体结合位点(RBS)替换为TAAGGAGGATATAG，替换后翻译起始区域mRNA二级结构如图2所示)，采用表2扩增体系进行PCR 扩增，获得获得PCR产物，即为β亚基片段。

以工程菌E.coil BL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₁基因组为模板，以表4中 B_2-3和B_2-4为引物(将RBS替换为TAAGGAGGATATAG)，采用表2所示体系进行PCR扩增，获得PCR产物，即为α亚基片段。

以工程菌E.coil BL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₁基因组为模板，以表4中 B_2-5和B_2-6为引物(将RBS替换为TAAGGAGGATATAG)，采用表2所示体系进行PCR扩增，获得PCR产物，即为激活蛋白片段。

采用载体pET-28a，将α亚基片段、β亚基片段和激活蛋白片段，按表3所列体系，采用“诺唯赞ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit C115”快速克隆试剂盒，50℃反应15min进行多片段同源重组，获得重组质粒pET28a-NHaseYpB₂ (图3中b)；降至4℃保温。

将一步克隆产物pET28a-NHaseYpB₂转化E.coil BL21(DE3)感受态细胞后，挑取转化子接种至5mL LB培养基，37℃培养12h后，菌液由北京擎科生物科技有限公司测序，测序结果正确即得到表达来自R.rhodochrous J1的重组腈水合酶基因工程菌，记为工程菌E.coil BL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₂，核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，SEQ ID NO.3所示核苷酸序列中1-14、705-718、1331-1344 位核苷酸均为RBS，15-704位核苷酸为β亚基(NHase-B)，719-1330位核苷酸为α亚基(NHase-A)，1345-1659位核苷酸为激活蛋白基因(NHase-G)。

SEQ ID NO.3：

3、工程菌E.coilBL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₃

以工程菌E.coil BL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₂基因组为模板，以表5中 B_3-1和B_3-2为引物(***融合标签SKIK：TCTAAAATAAAA)，采用表2扩增体系进行PCR扩增，获得获得PCR产物，即为β亚基片段。

以工程菌E.coil BL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₂基因组为模板，以表5中 B_3-3和B_3-4为引物(***融合标签SKIK：TCTAAAATAAAA)，采用表2所示体系进行PCR扩增，获得PCR产物，即为α亚基片段。

以工程菌E.coil BL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₂基因组为模板，以表5中 B_3-5和B_3-6为引物(***融合标签SKIK：TCTAAAATAAAA)，采用表2所示体系进行PCR扩增，获得PCR产物，即为激活蛋白片段。

采用载体pET-28a，将α亚基片段、β亚基片段和激活蛋白片段，按表3所列体系，采用“诺唯赞ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit C115”快速克隆试剂盒，50℃反应15min进行多片段同源重组，获得重组质粒pET28a-NHaseYpB₃ (图3中c)；降至4℃保温。

将一步克隆产物pET28a-NHaseYpB₃转化E.coil BL21(DE3)感受态细胞后，挑取转化子接种至5mL LB培养基，37℃培养12h后，菌液由北京擎科生物科技有限公司测序，测序结果正确即得到表达来自R.rhodochrous J1的重组腈水合酶基因工程菌，记为工程菌E.coil BL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₃，核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示，其中1-14、705-718、1343-1356位核苷酸均为RBS，15-704 位核苷酸为β亚基(NHase-B)，719-1342位核苷酸为α亚基(NHase-A)，1356-1683 位核苷酸为激活蛋白基因(NHase-G)，722-733、1360-1371位核苷酸为融合标签。氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(其中1-229位氨基酸为β亚基(NHase-B)、 230-436位氨基酸为α亚基(NHase-A)、437-544位氨基酸为激活蛋白(NHase-G))。

SEQ ID NO.4：

SEQ ID NO.1：

MDGIHDTGGMTGYGPVPYQKDEPFFHYEWEGRTLSILTWMHLKGISWWDKSRFFRE SMGNENYVNEIRNSYYTHWLSAAERILVADKIITEEERKHRVQEILEGRYTDRKPSRKFDP AQIEKAIERLHEPHSLALPGAEPSFSLGDKIKVKSMNPLGHTRCPKYVRNKIGEIVAYHGC QIYPESSSAGLGDDPRPLYTVAFSAQELWGDDGNGKDVVCVDLWEPYLISAMSKIKSEHV NKYTEYEARTKAIETLLYERGLITPAAVDRVVSYYENEIGPMGGAKVVAKSWVDPEYRK WLEEDATAAMASLGYAGEQAHQISAVFNDSQTHHVVVCTLCSCYPWPVLGLPPAWYKS MEYRSRVVADPRGVLKRDFGFDIPDEVEVRVWDSSSEIRYIVIPERPAGTDGWSEEELTKL VSRDSMIGVSNALTPQEVIVMSKIKSEDTLTDRLPATGTAAPPRDNGELVFTEPWEATAFGV AIALSDQKSYEWEFFRQRLIHSIAEANGCEAYYESWTKALEASVVDSGLISEDEIRERMES MAIID。

4、工程菌E.coilBL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₄

以工程菌E.coil BL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₃基因组为模板，以表6中 B_4-1和B_4-2为引物(柔性短肽链Linker：GGSGGGSGGGSG)，采用表2扩增体系进行PCR扩增，获得获得PCR产物，即为β亚基片段。

以工程菌E.coil BL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₃基因组为模板，以表6中 B_4-3和B_4-4为引物(柔性短肽链Linker：GGSGGGSGGGSG)，采用表2所示体系进行PCR扩增，获得PCR产物，即为α亚基片段。

以工程菌E.coil BL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₃基因组为模板，以表6中 B_4-5和B_4-6为引物，采用表2所示体系进行PCR扩增，获得PCR产物，即为激活蛋白片段。

采用载体pET-28a，将α亚基片段、β亚基片段和激活蛋白片段，按表3所列体系，采用“诺唯赞ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit C115”快速克隆试剂盒，50℃反应15min进行多片段同源重组，获得重组质粒pET28a-NHaseYpB₄ (图3中d)；降至4℃保温。

将一步克隆产物pET28a-NHaseYpB₄转化E.coil BL21(DE3)感受态细胞后，挑取转化子接种至5mL LB培养基，37℃培养12h后，菌液由北京擎科生物科技有限公司测序，测序结果正确即得到表达来自R.rhodochrous J1的重组腈水合酶基因工程菌，记为工程菌E.coil BL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₄，核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，其中1-14、1359-1372位核苷酸均为RBS，15-701位核苷酸为β亚基(NHase-B)，750-1358位核苷酸为α亚基(NHase-A)，1373-1699位核苷酸为激活蛋白基因(NHase-G)，738-749、1376-1387位核苷酸为融合标签SKIK， 702-737位核苷酸为Linker。

SEQ ID NO.5：

表4重组质粒NHaseYpB₂构建引物

表5重组质粒NHaseYpB₃构建引物

表6重组质粒NHaseYpB₄构建引物

实施例2、重组腈水合酶基因工程菌的诱导表达

将实施例1测序正确的重组大肠杆菌工程菌E.coil BL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₁、E.coil BL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₂、E.coil BL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₃、E.coil BL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₄分别接种于10mL含Kan(终浓度50μg/mL)液体LB培养基中，于37℃培养10h。培养后的种子液以体积浓度1％接种量转接至新的100mL含Kan(终浓度50μg/mL) 液体LB培养基中，相同条件下培养至菌液OD600为0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，再加入400μL的100mM的CoCl₂水溶液(终浓度0.4mM)，28℃诱导12h；9000rpm离心10min收集菌体。菌体用pH 7的PBS缓冲液洗涤2次， 9000rpm离心10min收集湿菌体。取0.2g湿菌体用10mLpH 7的PBS缓冲液重悬，将重悬菌液置于10mL离心管中，将离心管置于冰上，300W超声破碎5min，每次超声持续1s，间隔2s，即得到细胞破碎悬液。取1mL细胞破碎悬液12000rpm 4℃下离心10min，将上清转移至新离心管浓缩得粗酶液200μL。分别测定比酶活，结果见表7所示，其中重组大肠杆菌工程菌E.coil BL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₃活性最高。

酶活性检测方法：以3-氰基吡啶作为模式底物对重组腈水合酶工程菌进行酶活性检测。酶活检测反应体系为1mL：100mM的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液(pH 7.0) 为反应介质，终浓度100mM的3-氰基吡啶为底物，添加20μL粗酶液(相当于破碎前湿菌体0.002g)，25℃下700rpm搅拌反应5min，取200μL反应液加入 1mL甲醇终止反应。以高效液相色谱法检测产物烟酰胺峰面积、副产物烟酸峰面积以及底物3-氰基吡啶峰面积，根据标准曲线(烟酰胺：y＝8237596x+6312、3- 氰基吡啶：y＝8714288x+4062、烟酸：y＝13882x-361)，获得产物中烟酰胺含量。

液相检测方法：色谱柱：WelchromC18柱(250×4.6mm)浙江月旭材料科技有限公司，流动相：甲醇-磷酸氢二钠溶液(20mmol/L)＝8:92(v/v)；波长： 268nm；流速：1.0mL/min，紫外可见光检测器Waters 2487美国沃特世公司。

酶活单位(U)定义：在该反应条件下，每分钟催化3-氰基吡啶产生1μmol 烟酰胺所需要的酶量为一个酶活单位，用U表示。比酶活定义：单位体积粗酶蛋白具有的酶活，表示为U/mL。

表7重组菌的比酶活力

实施例3、树脂对酶催化反应的影响

树脂预处理：(1)将表8中树脂D201、D301、JKA915、BA765、D101、 D311(均购自江苏金凯树脂化工有限公司)，用约2倍于树脂体积的质量浓度 10％NaCl水溶液在烧杯中浸泡，以20rpm的低转速搅拌树脂层1h，将液面放至树脂层上200-300mm处浸泡20小时，然后用清水冲洗，直到出水无色为止。(2) 接着进行反洗，以除去混在树脂中的微小杂质，用约等于2倍于树脂体积的4％ HCl水溶液，浸泡树脂层1h后，将液面放至树脂层上200-300mm处浸泡2-4小时，用清水冲洗至出水pH值5-6为止。(3)用约2倍于树脂体积的质量浓度 2％NaOH水溶液，浸泡树脂层1h后，将液面放至树脂层上200-300mm处浸泡 2-4小时，然后用去离子水冲洗，直至出水pH值7-9为止。

酶耦合树脂制备烟酰胺：取20μL(相当于破碎前湿菌体0.002g)实施例2 方法得到的重组大肠杆菌E.coil BL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₃粗酶液于2mL EP管中，加入880μLPB缓冲液(pH7.0、0.2mM)作为反应溶剂，然后加入100μL 底物3-氰基吡啶(加入终浓度100mM)，再分别加入预处理后的D201、D301、 JKA915、BA765、D101、D311树脂(均购自江苏金凯树脂化工有限公司)0.2g 构成1mL反应体系，置于20℃，1000rpm恒温混匀仪中反应30min。以不添加树脂为空白对照。反应结束后，反应液先用1mL的甲醇终止反应。取10μL反应液，加入1mL流动相溶解，使用实施例2所述高效液相色谱方法检测底物3-氰基吡啶残留量、产物烟酰胺生成量、副产物烟酸生产量，从而推算酶催化水解活性及产物纯度，实验结果如表8所示。D201树脂对反应体系影响最小，并且可选择性吸附副产物烟酸，耦合体系下烟酰胺纯度可以达到99.99％，副产物烟酸含量0.004％，反应结果最佳。

表8不同树脂吸附条件下的腈水合酶催化反应结果

实施例4、重组腈水合酶催化耦合离子交换树脂吸附制备高纯度烟酰胺在恒温水浴反应釜中，扩大酶催化反应体系至1L：反应溶剂为pH7.0、0.2mM 的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液，加入终浓度为100mM底物3-氰基吡啶，加入 20mL(相当于破碎前湿菌体2g)实施例2方法得到的重组大肠杆菌E.coil BL21(DE3)-pET28a-NHaseYpB₃粗酶液，再加入100g的实施例3方法预处理后的D201强碱性阴离子交换树脂，于25℃恒温水浴反应釜中，搅拌转速150rpm，反应30min。每5min取反应液按照实施例2所述高效液相色谱方法检测，推算底物转化率，以及副产物烟酸的含量，结果如图4所示。重组腈水合酶催化耦合离子交换树脂吸附制备高纯度烟酰胺的反应进程图如图5所示。在耦合体系下转化率达到99.99％以上，杂质烟酸含量0.004％。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 重组腈水合酶及其在耦合离子交换树脂制备烟酰胺中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 544

<212> PRT

<213> 玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)

<400> 1

Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val

1 5 10 15

Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg

20 25 30

Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Ile Ser Trp Trp

35 40 45

Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val

50 55 60

Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu

65 70 75 80

Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His

85 90 95

Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Lys Pro Ser

100 105 110

Arg Lys Phe Asp Pro Ala Gln Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His

115 120 125

Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu

130 135 140

Gly Asp Lys Ile Lys Val Lys Ser Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg

145 150 155 160

Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Ala Tyr His

165 170 175

Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp

180 185 190

Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly

195 200 205

Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro

210 215 220

Tyr Leu Ile Ser Ala Met Ser Lys Ile Lys Ser Glu His Val Asn Lys

225 230 235 240

Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr

245 250 255

Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala Val Asp Arg Val Val Ser Tyr

260 265 270

Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly Gly Ala Lys Val Val Ala Lys

275 280 285

Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr

290 295 300

Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala Gly Glu Gln Ala His Gln Ile

305 310 315 320

Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr His His Val Val Val Cys Thr

325 330 335

Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp

340 345 350

Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg Val Val Ala Asp Pro Arg Gly

355 360 365

Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp Ile Pro Asp Glu Val Glu Val

370 375 380

Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu

385 390 395 400

Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser Glu Glu Glu Leu Thr Lys Leu

405 410 415

Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln

420 425 430

Glu Val Ile Val Met Ser Lys Ile Lys Ser Glu Asp Thr Leu Thr Asp

435 440 445

Arg Leu Pro Ala Thr Gly Thr Ala Ala Pro Pro Arg Asp Asn Gly Glu

450 455 460

Leu Val Phe Thr Glu Pro Trp Glu Ala Thr Ala Phe Gly Val Ala Ile

465 470 475 480

Ala Leu Ser Asp Gln Lys Ser Tyr Glu Trp Glu Phe Phe Arg Gln Arg

485 490 495

Leu Ile His Ser Ile Ala Glu Ala Asn Gly Cys Glu Ala Tyr Tyr Glu

500 505 510

Ser Trp Thr Lys Ala Leu Glu Ala Ser Val Val Asp Ser Gly Leu Ile

515 520 525

Ser Glu Asp Glu Ile Arg Glu Arg Met Glu Ser Met Ala Ile Ile Asp

530 535 540

<210> 2

<211> 1617

<212> DNA

<213> 玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)

<400> 2

atggatggta ttcatgatac aggtggtatg accggttatg gtccggtgcc gtatcagaaa 60

gatgaaccgt tttttcatta tgaatgggaa ggtcgtacgc tgagcattct gacctggatg 120

catctgaaag gtattagctg gtgggataaa agtcgttttt ttcgtgaaag catgggtaat 180

gaaaattatg ttaacgaaat ccgtaacagt tattataccc attggctgag cgcggcggaa 240

cgtatcctgg ttgcagataa aattattacc gaagaagaac gcaaacatcg tgtgcaggaa 300

atcctggaag gtcgttatac agatcgcaaa ccgagccgta aatttgatcc tgcacagatt 360

gaaaaagcaa ttgaacgcct gcatgaaccg catagcctgg cactgcctgg tgcagaacca 420

tcttttagtc tgggtgataa aattaaagtg aaaagcatga acccactggg tcatacccgt 480

tgtccgaaat atgttcgtaa caaaattggt gaaatcgttg catatcatgg ttgtcagatc 540

tatccggaaa gtagcagcgc aggtctgggt gatgatccac gcccgctgta taccgttgcc 600

tttagcgccc aggaactgtg gggtgatgat ggtaatggta aagatgtggt ttgtgttgat 660

ctgtgggaac cgtatctgat tagcgcataa atgagcgaac acgtgaacaa atataccgaa 720

tatgaagcac gcaccaaagc cattgaaacc ctgctgtacg aacgcggcct gatcaccccg 780

gcagcggttg accgcgttgt gagctactac gaaaatgaaa ttggcccgat gggcggagca 840

aaagttgttg caaaaagctg ggtggatccg gaatatcgta aatggctgga agaagatgca 900

accgcagcaa tggcaagcct ggggtatgca ggggaacagg cgcatcagat tagcgcagtg 960

tttaatgata gccagacgca tcatgttgtt gtttgtaccc tgtgtagttg ttatccgtgg 1020

ccggttctgg gtctgcctcc ggcatggtat aaaagcatgg aatatcgcag ccgtgttgtt 1080

gccgatccac gtggtgttct gaaacgtgat tttggctttg atattccgga cgaggttgaa 1140

gttcgtgttt gggatagtag tagcgaaatt cgttatattg ttatcccgga acgtccggca 1200

gggaccgatg ggtggagcga ggaagaactg acaaaactgg ttagccgtga tagtatgatt 1260

ggtgtgagca atgcactgac accgcaggaa gtgatcgttt aaatgagcga agacacgctg 1320

accgaccgcc tgccggcaac cggaaccgca gcaccaccgc gtgacaacgg tgaactggtt 1380

tttaccgaac cgtgggaagc aaccgcattt ggcgttgcaa ttgcactgag cgaccaaaaa 1440

tcatatgaat gggaattttt ccgccaacgt ctgatccata gcattgcgga ggcaaatggt 1500

tgcgaggcat attatgaaag ctggacgaaa gcactggagg caagcgttgt tgatagcggt 1560

ctgattagcg aagatgaaat tcgtgaacgt atggaaagca tggcaattat tgattaa 1617

<210> 3

<211> 1659

<212> DNA

<213> 玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)

<400> 3

taaggaggat atagatggat ggtattcatg atacaggtgg tatgaccggt tatggtccgg 60

tgccgtatca gaaagatgaa ccgttttttc attatgaatg ggaaggtcgt acgctgagca 120

ttctgacctg gatgcatctg aaaggtatta gctggtggga taaaagtcgt ttttttcgtg 180

aaagcatggg taatgaaaat tatgttaacg aaatccgtaa cagttattat acccattggc 240

tgagcgcggc ggaacgtatc ctggttgcag ataaaattat taccgaagaa gaacgcaaac 300

atcgtgtgca ggaaatcctg gaaggtcgtt atacagatcg caaaccgagc cgtaaatttg 360

atcctgcaca gattgaaaaa gcaattgaac gcctgcatga accgcatagc ctggcactgc 420

ctggtgcaga accatctttt agtctgggtg ataaaattaa agtgaaaagc atgaacccac 480

tgggtcatac ccgttgtccg aaatatgttc gtaacaaaat tggtgaaatc gttgcatatc 540

atggttgtca gatctatccg gaaagtagca gcgcaggtct gggtgatgat ccacgcccgc 600

tgtataccgt tgcctttagc gcccaggaac tgtggggtga tgatggtaat ggtaaagatg 660

tggtttgtgt tgatctgtgg gaaccgtatc tgattagcgc ataataagga ggatatagat 720

gagcgaacac gtgaacaaat ataccgaata tgaagcacgc accaaagcca ttgaaaccct 780

gctgtacgaa cgcggcctga tcaccccggc agcggttgac cgcgttgtga gctactacga 840

aaatgaaatt ggcccgatgg gcggagcaaa agttgttgca aaaagctggg tggatccgga 900

atatcgtaaa tggctggaag aagatgcaac cgcagcaatg gcaagcctgg ggtatgcagg 960

ggaacaggcg catcagatta gcgcagtgtt taatgatagc cagacgcatc atgttgttgt 1020

ttgtaccctg tgtagttgtt atccgtggcc ggttctgggt ctgcctccgg catggtataa 1080

aagcatggaa tatcgcagcc gtgttgttgc cgatccacgt ggtgttctga aacgtgattt 1140

tggctttgat attccggacg aggttgaagt tcgtgtttgg gatagtagta gcgaaattcg 1200

ttatattgtt atcccggaac gtccggcagg gaccgatggg tggagcgagg aagaactgac 1260

aaaactggtt agccgtgata gtatgattgg tgtgagcaat gcactgacac cgcaggaagt 1320

gatcgtttaa taaggaggat atagatgagc gaagacacgc tgaccgaccg cctgccggca 1380

accggaaccg cagcaccacc gcgtgacaac ggtgaactgg tttttaccga accgtgggaa 1440

gcaaccgcat ttggcgttgc aattgcactg agcgaccaaa aatcatatga atgggaattt 1500

ttccgccaac gtctgatcca tagcattgcg gaggcaaatg gttgcgaggc atattatgaa 1560

agctggacga aagcactgga ggcaagcgtt gttgatagcg gtctgattag cgaagatgaa 1620

attcgtgaac gtatggaaag catggcaatt attgattaa 1659

<210> 4

<211> 1683

<212> DNA

<213> 玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)

<400> 4

taaggaggat atagatggat ggtattcatg atacaggtgg tatgaccggt tatggtccgg 60

tgccgtatca gaaagatgaa ccgttttttc attatgaatg ggaaggtcgt acgctgagca 120

ttctgacctg gatgcatctg aaaggtatta gctggtggga taaaagtcgt ttttttcgtg 180

aaagcatggg taatgaaaat tatgttaacg aaatccgtaa cagttattat acccattggc 240

tgagcgcggc ggaacgtatc ctggttgcag ataaaattat taccgaagaa gaacgcaaac 300

atcgtgtgca ggaaatcctg gaaggtcgtt atacagatcg caaaccgagc cgtaaatttg 360

atcctgcaca gattgaaaaa gcaattgaac gcctgcatga accgcatagc ctggcactgc 420

ctggtgcaga accatctttt agtctgggtg ataaaattaa agtgaaaagc atgaacccac 480

tgggtcatac ccgttgtccg aaatatgttc gtaacaaaat tggtgaaatc gttgcatatc 540

atggttgtca gatctatccg gaaagtagca gcgcaggtct gggtgatgat ccacgcccgc 600

tgtataccgt tgcctttagc gcccaggaac tgtggggtga tgatggtaat ggtaaagatg 660

tggtttgtgt tgatctgtgg gaaccgtatc tgattagcgc ataataagga ggatatagat 720

gtctaaaata aaaagcgaac acgtgaacaa atataccgaa tatgaagcac gcaccaaagc 780

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gagctactac gaaaatgaaa ttggcccgat gggcggagca aaagttgttg caaaaagctg 900

ggtggatccg gaatatcgta aatggctgga agaagatgca accgcagcaa tggcaagcct 960

ggggtatgca ggggaacagg cgcatcagat tagcgcagtg tttaatgata gccagacgca 1020

tcatgttgtt gtttgtaccc tgtgtagttg ttatccgtgg ccggttctgg gtctgcctcc 1080

ggcatggtat aaaagcatgg aatatcgcag ccgtgttgtt gccgatccac gtggtgttct 1140

gaaacgtgat tttggctttg atattccgga cgaggttgaa gttcgtgttt gggatagtag 1200

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aatggttgcg aggcatatta tgaaagctgg acgaaagcac tggaggcaag cgttgttgat 1620

agcggtctga ttagcgaaga tgaaattcgt gaacgtatgg aaagcatggc aattattgat 1680

taa 1683

<210> 5

<211> 1699

<212> DNA

<213> 玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)

<400> 5

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atccacgtgg tgttctgaaa cgtgattttg gctttgatat tccggacgag gttgaagttc 1200

gtgtttggga tagtagtagc gaaattcgtt atattgttat cccggaacgt ccggcaggga 1260

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ggcaagcgtt gttgatagcg gtctgattag cgaagatgaa attcgtgaac gtatggaaag 1680

catggcaatt attgattaa 1699

Claims

1.一种重组腈水合酶，其特征在于所述重组腈水合酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述重组腈水合酶编码基因。

3.一种权利要求1所述编码基因构建的重组载体。

4.一种权利要求3所述重组载体转化宿主菌制备的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述重组腈水合酶在耦合离子交换树脂制备烟酰胺中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用方法为：将重组腈水合酶基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体经超声波破碎后得到的上清液的浓缩液为催化剂，以3-氰基吡啶为底物，加入离子交换树脂，以pH6-9的磷酸缓冲溶液为反应介质构成反应体系，在20-30℃、100-1000rpm条件下进行水合反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得产物烟酰胺。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述反应体系中，催化剂用量以破碎前湿菌体重量计为1-10g/L，所述底物终浓度为50-200mM，所述离子交换树脂加入量为100-400g/L。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述缓冲液为pH 7.0，0.2mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述离子交换树脂型号为D101、D201、D301、D311、A764、JKA915。

10.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将重组腈水合酶基因工程菌接种在含终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的液体LB培养基中，37℃培养10h；培养后的种子液以体积浓度1％接种量转接至新的含终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的液体LB培养基中，37℃培养OD₆₀₀为0.6-0.8，加IPTG至终浓度0.5mM，再加入100mM的CoCl₂水溶液至CoCl₂终浓度0.4-0.5mM，28℃培养12-16h，菌液离心并用pH7.0的PBS缓冲液洗涤后重悬，超声破碎，离心，取上清液浓缩至破碎混合液体积的10-30％，得到粗酶液；超声破碎条件为300W超声破碎5min，每次超声持续1s，间隔2s；LB培养基组成：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH值为7。