CN114276999A - 黑素瘤细胞株及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黑素瘤细胞株,黑素瘤细胞株内含有Rosa26‑Stop‑tdTomato报告基因、Tyr‑creERT2基因、BrafV600E和Ptenf/f基因,该黑素瘤细胞株的分类命名为小鼠黑素瘤细胞株ATBP,已于2022年2月9日将该细胞株保藏至中国典型培养物保藏中心,保藏号为:CCTCC NO:C202233。同时提供了黑素瘤细胞株的制备方法。本发明能够制备出一种遗传功能稳定的可以表达红色荧光蛋白,且含有BrafV600E突变激活基因和Pten缺失基因的黑素瘤细胞株,便于医学研究。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,更具体地,涉及一种黑素瘤细胞株及其制备方法。
背景技术
皮肤恶性黑素瘤(简称MM)是皮肤科最致命的恶性肿瘤,由位于表皮基底层的黑素细胞发生恶变形成的。MM的产生是由遗传因素和环境因素相互作用导致的,通常黑素细胞容易发生突变形成MM的基因为BRAF、NRAS、TP53、PTEN、CDKN2A和KIT等,其中,黑素细胞中BRAF发生突变的概率为63%,PTEN发生缺失的概率为25%。
为了研究MM的发展过程,评估肿瘤药物治疗效果以及耐药机制等,常使用MM转基因小鼠进行研究。但是现有MM转基因小鼠的繁殖周期长,并且经过繁殖后其体内的黑素瘤基因并不稳定,影响研究的进程。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题,并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种黑素瘤细胞株及其制备方法,能够制备出一种遗传功能稳定的可以表达红色荧光蛋白,且含有BrafV600E突变激活基因和Pten缺失基因的黑素瘤细胞株,便于医学研究。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点,提供一种黑素瘤细胞株,黑素瘤细胞株内含有Rosa26-Stop-tdTomato基因、Tyr-creERT2基因、BrafV600E和Ptenf/f基因,所述黑素瘤细胞株的分类命名为小鼠黑素瘤细胞株ATBP,已于2022年2月9日将该细胞株保藏至中国典型培养物保藏中心,保藏号为:CCTCC NO:C202233。
黑素瘤细胞株的制备方法,包括以下步骤:
S1、选取同时携带Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/f基因的小鼠A,以及携带Rosa26-Stop-tdTomato基因的小鼠B,将所述小鼠A和所述小鼠B进行杂交,筛选得到携带Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/+基因的小鼠C;
S2、将所述小鼠C饲养至成年后与携带Ptenf/f基因的小鼠D进行杂交,筛选得到携带Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/f基因的小鼠E;
S3、通过对所述小鼠E进行诱导得到Rosa26-Stop-tdTomato表达、Tyr-creERT2激活、BrafV600E激活同时Pten基因缺失的小鼠F,所述小鼠F中即含有Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E同时缺失Pten基因的黑素瘤细胞株。
优选的是,步骤S3中使用4羟基他莫昔芬对所述小鼠E进行诱导。
优选的是,步骤S3中在对所述小鼠E诱导之前将其背部的毛剔除。
优选的是,步骤S3中对所述小鼠E的诱导时间为30天。
优选的是,在制备步骤S1中的所述小鼠A时,先选取含有Tyr-creERT2基因的小鼠G,以及含有BrafV600E和Ptenf/f基因的小鼠H进行杂交,即可筛选得到所述小鼠A。
优选的是,制备所述小鼠G时,选取FVB/NJ小鼠,通过转基因显微注射技术将融合基因注射到该小鼠的受精***内,构建出所述小鼠G。
本发明至少包括以下有益效果:
本发明通过先筛选后诱导的方法筛选出含有Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E和Ptenf/f基因的小鼠F,即筛选得到了含有Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E和Pten缺失基因的黑素瘤细胞株,该细胞具有稳定的遗传功能,便于医学实验研究。
同时本发明筛选出的黑素瘤细胞株里面含有Rosa26-Stop-tdTomato基因,能够表达出红色荧光,为黑素瘤细胞株在研究中提供了便于识别的标记符号,进一步便于医学实验的研究。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现,部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的其中一种技术方案所述具有BrafV600E基因和Pten缺失基因的黑素瘤细胞株传代至10代后的激光共聚焦显微镜下的10倍放大图;
图2为本发明的其中一种技术方案所述具有BrafV600E基因和Pten缺失基因的黑素瘤细胞株传代至10代后的激光共聚焦显微镜下的100倍放大图;
图3为本发明的其中一种技术方案所述黑素瘤细胞株移植成瘤图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
1、含有Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E和Ptenf/f基因的小鼠的制备
首先选取FVB/NJ小鼠,通过转基因显微注射技术将融合基因注射到该小鼠的受精***内,构建出含有Tyr-creERT2基因的小鼠,即构建出一种黑素细胞特异的cre酶活性小鼠,让含有Tyr-creERT2基因的小鼠与可在体内条件性驱动BrafV600E突变激活和Pten基因缺失(Ptenf/f)的小鼠杂交,即得到含有Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/f基因的小鼠,将含有Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/f基因的小鼠与含有Rosa26-Stop-tdTomato基因的小鼠进行杂交,通过筛选可获得含有Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/+基因的小鼠,其中,Ptenf/f基因为纯合子基因,Ptenf/+基因为杂合子基因,将含有Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/+基因的小鼠饲养到成年后与含有Ptenf/f基因的小鼠进行杂交,筛选获得含有Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/f基因的小鼠,将含有Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/f基因的小鼠的背部毛进行剔除后通过4羟基他莫昔芬诱导30天即获得含有Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E同时缺失Pten基因的目标小鼠,通过4羟基他莫昔芬的诱导使目标小鼠体内的Rosa26-Stop-tdTomato表达出了红色荧光蛋白,激活了BrafV600E基因的表达,同时敲除了Pten基因。其中,该申请已将该小鼠的黑素瘤细胞株,其分类命名为小鼠黑素瘤细胞株ATBP于2022年2月9日保藏至中国典型培养物保藏中心,保藏号为:CCTCC NO:C202233,保藏中心的具体地址为:中国 武汉 武汉大学。
2、稳定遗传实验
1、通过上述制备得到了背部长有黑素瘤肿瘤的小鼠,将小鼠背部的肿瘤切除后浸泡在75%酒精中1min,得到浸泡后的肿瘤,将浸泡后的肿瘤用无菌PBS冲洗干净,利用眼科剪刀将该肿瘤剪碎成0.1cm x 0.1cm的肿瘤块,将肿瘤块放进裂解液中,并在裂解液中裂解2小时,裂解的过程是在37℃的水浴锅中与90rpm的震速中进行震荡,其中,裂解液包括1mg/mL胶原酶Ⅰ、1mg/mL胶原酶Ⅳ、2U/mL DNaseⅠ、0.5%(wt)Trypsin-EDTA和0.4‰(wt)BSA HBSS溶液,完成裂解后加入与裂解液体积相等的10%FBS HBSS用以终止消化,终止消化后依次使用70μm和40μm的细胞筛网进行过滤,制得单细胞悬液。
2、利用1mg/mL 7AAD溶液对制备的单细胞悬液进行孵育10min,随后利用流式细胞仪分选出表达红色荧光蛋白的肿瘤细胞进行培养,培养液中含有10% FBS DMEM、青霉素/链霉素双抗,在含有5%CO2,温度为37℃培养箱内进行培养,肿瘤细胞贴壁生长,将贴壁生长的肿瘤细胞在0.5% Trypsin-EDTA溶液中37℃消化2min,随后利用安全培养基终止消化,将终止消化后的肿瘤细胞1000rpm,5min离心后用新鲜培养基进行重悬,并按照1:3比例进行传代培养,得到传代培养细胞。
3、成瘤能力的检测试验
将1x10^6个本发明制备的黑素瘤细胞株用100μl PBS重悬注射到裸鼠皮下,对照组100μl PBS注射到裸鼠皮下,饲养两个月后观察其身体特征。
结果
1、稳定遗传实验
经过传代至10代的细胞在显微镜下的形状呈长梭形,在荧光显微镜下可见红色荧光蛋白表达,图1为10倍显微镜下的细胞图,图2为100倍显微镜下的细胞图。
2、成瘤能力的检测试验
进过两个月的饲养实验组的小鼠的长出了2cm x 2cm大小的肿瘤,而对照组没有长出肿瘤,证明表明该黑素瘤细胞株具有明显的成瘤能力,结果如图3所示。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (7)
1.黑素瘤细胞株,其特征在于,黑素瘤细胞株内含有Rosa26-Stop-tdTomato基因、Tyr-creERT2基因、BrafV600E和Ptenf/f基因,所述黑素瘤细胞株的分类命名为小鼠黑素瘤细胞株ATBP,已于2022年2月9日将该细胞株保藏至中国典型培养物保藏中心,保藏号为:CCTCCNO:C202233。
2.根据权利要求1所述的黑素瘤细胞株的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、选取同时携带Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/f基因的小鼠A,以及携带Rosa26-Stop-tdTomato基因的小鼠B,将所述小鼠A和所述小鼠B进行杂交,筛选得到携带Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/+基因的小鼠C;
S2、将所述小鼠C饲养至成年后与携带Ptenf/f基因的小鼠D进行杂交,筛选得到携带Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E、Ptenf/f基因的小鼠E;
S3、通过对所述小鼠E进行诱导得到Rosa26-Stop-tdTomato表达、Tyr-creERT2激活、BrafV600E激活同时Pten基因缺失的小鼠F,所述小鼠F中即含有Rosa26-Stop-tdTomato、Tyr-creERT2、BrafV600E同时缺失Pten基因的黑素瘤细胞株。
3.根据权利要求2所述的黑素瘤细胞株的制备方法,其特征在于,步骤S3中使用4羟基他莫昔芬对所述小鼠E进行诱导。
4.根据权利要求2所述的黑素瘤细胞株的制备方法,其特征在于,步骤S3中在对所述小鼠E诱导之前将其背部的毛剔除。
5.根据权利要求2所述的黑素瘤细胞株的制备方法,其特征在于,步骤S3中对所述小鼠E的诱导时间为30天。
6.根据权利要求2所述的黑素瘤细胞株的制备方法,其特征在于,在制备步骤S1中的所述小鼠A时,先选取含有Tyr-creERT2基因的小鼠G,以及含有BrafV600E和Ptenf/f基因的小鼠H进行杂交,即可筛选得到所述小鼠A。
7.根据权利要求6所述的黑素瘤细胞株的制备方法,其特征在于,制备所述小鼠G时,选取FVB/NJ小鼠,通过转基因显微注射技术将融合基因注射到该小鼠的受精***内,构建出所述小鼠G。
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