CN114276410B - 一种从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,包括如下步骤:将抗体偶联药物的母液上样于非极性大孔吸附树脂,对缀合物进行吸附;对吸附有缀合物的非极性大孔吸附树脂依次用除杂液进行除杂、用洗脱液进行解吸附,收集含有缀合物的洗脱液经浓缩、溶析结晶,得所述缀合物;其中,所述非极性大孔吸附树脂为苯乙烯系或苯乙烯‑二乙烯苯系。该方法通过采用特定填料的非极性大孔吸附树脂,结合后续的溶析结晶步骤,可显著提高从抗体偶联药物的母液中回收得到的缀合物的产率和纯度,产率可达59%以上,纯度可达到95%以上,大大提高了原料的利用率,降低抗体偶联药物的制备成本。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,尤其涉及一种从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法。
背景技术
抗体偶联药物(Antibody-Drug Conjugate,ADC)是由抗体、细胞毒药物以及偶联链三部分组成,即通过偶联链将细胞毒药物与具有肿瘤靶向性的抗体偶联形成一个整体,以充分利用抗体对肿瘤细胞相关抗原的特异性和靶向性,并将细胞毒药物靶向输送至肿瘤病灶部位,是新一代肿瘤靶向药物。
由于ADC中的细胞毒药物要求高毒性、亲和性,同时要对多药耐药蛋白(MDR1)介导的外排的低敏感性,导致适用的细胞毒药物较少,这使得抗体偶联药物开发难度较大,上市的抗体偶联药物较少,且价格昂贵。在抗体偶联药物的制备过程中,一步法虽然简单、直接,但是副产物多,收率低。为了提高收率,现有的制备方法一般是分两步进行:先采用过量的偶联链与小分子细胞毒药物进行反应进而合成偶联链与细胞毒药物偶联形成的缀合物,然后将合成的缀合物再与具有肿瘤靶向性的抗体进行偶联反应得到ADC。
上述两步法在制备过程中,体系中会残留一些缀合物,这些缀合物最终存在于通过物理方法提纯抗体偶联药物后得到的母液中,并直接作为废液排放。如果能够将该缀合物从抗体偶联药物的母液中进行回收,会大大提高原料的利用率,降低抗体偶联药物的制备成本。现有技术中并没有关于从抗体偶联药物的母液中分离纯化缀合物的相关报道。
发明内容
鉴于此,本发明提供一种从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,该方法回收得到的缀合物的纯度达95%以上,收率在59%以上,显著降低了抗体偶联药物的成本,而且操作简单、方便,适用于工业化生产。
为达到上述发明目的,本发明实施例采用了如下的技术方案:
一种从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,包括如下步骤:
将抗体偶联药物的母液上样于非极性大孔吸附树脂,对缀合物进行吸附;
对吸附有缀合物的非极性大孔吸附树脂依次用除杂液进行除杂、用洗脱液进行解吸附,收集含有缀合物的洗脱液经浓缩、溶析结晶,得所述缀合物;
其中,所述非极性大孔吸附树脂为苯乙烯系或苯乙烯-二乙烯苯系。
发明人经深入研究意外发现,通过采用特定填料(苯乙烯系或苯乙烯-二乙烯苯系)的非极性大孔吸附树脂,结合后续的溶析结晶步骤,可显著提高从抗体偶联药物的母液中回收得到的缀合物的产率和纯度,产率可达到59%以上,纯度可达到95%以上,可直接用于继续合成抗体偶联药物,大大提高了原料的利用率,而且,上述采用的大孔吸附树脂容易再生,涉及的各溶剂均可回收再利用,可降低抗体偶联药物的制备成本。此外,该方法操作简单、方便,对环境友好,易于控制,适用于工业化生产,对抗体偶联药物的深入研究和进一步发展具有重要意义。
可选的,所述苯乙烯系的非极性大孔吸附树脂的比表面积为800~1000m2/g;所述苯乙烯-二乙烯苯系的非极性大孔吸附树脂的比表面积为450~650m2/g。
可选的,所述苯乙烯系的非极性大孔吸附树脂的型号为A型,比表面积为800~1000m2/g。
可选的,所述苯乙烯-二乙烯苯系的非极性大孔吸附树脂的型号为C型、D型等。所述C型非极性大孔吸附树脂的比表面积为450~650m2/g;所述D型非极性大孔吸附树脂的比表面积为480~600m2/g。
通过进一步限定非极性大孔吸附树脂的比表面积和型号,尤其是采用A型非极性大孔吸附树脂时,回收得到的缀合物的纯度可达到98%以上,收率达67%以上。
可选的,所述从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法还包括将所述非极性大孔吸附树脂进行预处理的步骤。
可选的,所述A型非极性大孔吸附树脂的预处理包括如下步骤:
采用2BV的乙醇、甲醇或丙酮溶液(质量浓度为90%以上即可)进行清洗,清洗速度为2BV/h,然后用去离子水清洗至没有有机溶剂的气味,待用。
可选的,所述C型和D型非极性大孔吸附树脂的预处理包括如下步骤:
1)采用2BV的乙醇、甲醇或丙酮溶液(质量浓度在90%以上)进行清洗,清洗速度为2BV/h,然后用去离子水清洗至没有有机溶剂的气味;
2)用2BV的HCl溶液(含量为4wt%)以2-3BV/h的流速通过树脂,然后用纯水洗至pH=7左右;
3)用3BV的NaOH溶液(含量为4wt%)以2-3BV/h的流速通过树脂,然后用纯水洗至pH=7左右,待用。
可选的,在所述抗体偶联药物的母液上样于非极性大孔吸附树脂之前,还包括将所述抗体偶联药物的母液进行过滤以除去母液中不溶物的步骤,以免堵塞非极性大孔吸附树脂。
可选的,所述抗体偶联药物的母液的上样量为1~3BV,上样流速1~4BV/h,上样温度为5~35℃。
优选地,所述抗体偶联药物的母液的上样量为1.5~2BV,上样流速1~2BV/h。
通过对抗体偶联药物的母液的上样量、上样流速以及上样温度进行限定,可保证抗体偶联药物的母液中缀合物完全吸附在大孔树脂上,减少损失的同时,提高缀合物的纯度。
可选的,所述除杂液为去离子水,所述除杂液的用量除杂液的用量为1.5~4BV,所述除杂液的流速为3~6BV/h。
通过在解吸附之前用去离子水进行除杂,并限定去离子水的用量及流速,可最大程度地除去吸附在非极性大孔吸附树脂上的水溶性杂质,同时减少缀合物的损失。
可选的,所述洗脱液为无水醇类,所述洗脱液的洗脱流速为1~4BV/h,所述洗脱液的用量为2~5BV。
优选地,所述洗脱液的洗脱流速为2~4BV/h,所述洗脱液的用量为2BV。
通过限定洗脱液为无水醇类(如无水乙醇、无水甲醇等),结合非极性大孔吸附树脂的吸附性能以及缀合物的性质,可进一步提高缀合物的纯度,同时减少缀合物的损失。
可选的,所述浓缩为减压浓缩,所述减压浓缩的温度≤40℃;或
所述解吸附的温度为5~35℃。
通过限定减压浓缩的温度及解吸附的温度,可进一步防止在处理过程中缀合物的分解或者手性翻转等。
可选的,所述溶析结晶包括如下步骤:
向所述浓缩后得到的缀合物粗品中加入良性溶剂,溶解后滴加至不良溶剂中,所述滴加速率为0.5mL/min,所述良性溶剂与所述不良溶剂的体积比为1:10。
可选的,所述良性溶剂为二氯甲烷,所述不良溶剂为甲基叔丁基醚;或
所述缀合物粗品于所述良性溶剂的质量体积比为1g:(9.5~12)mL。
通过限定溶析结晶步骤中各参数及良性溶剂与不良溶剂的种类,可进一步提高缀合物的纯度。
可选的,所述缀合物为MMAE的衍生物,所述MMAE的衍生物的结构如下:
其中,n=1。
可选的,所述抗体偶联药物的母液中所述缀合物的浓度为3.0~3.7mg/mL。
可选的,在酶的催化作用下,抗体与所述缀合物进行偶联反应,反应结束后,经纯化,得到抗体偶联药物和所述抗体偶联药物的母液;
其中,所述抗体偶联药物的母液中还含有酶催化剂,可溶性无机盐,Tris缓冲盐,表面活性剂以及水溶性小分子物质等。
本发明提供的从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,不仅适用于上述特定的母液,对其它的类型的抗体偶联药物的母液同样适用,只需适应性对相关参数进行调整即可。
附图说明
图1是本发明中缀合物(n=1)的HPLC色谱图;
图2是本发明实施例1中回收的缀合物的HPLC色谱图;
图3是本发明实施例4中回收的缀合物的HPLC色谱图;
图4是本发明实施例5中回收的缀合物的HPLC色谱图;
图5是本发明对比例1中回收的缀合物的HPLC色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者,按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
抗体偶联药物母液中的成分复杂,干扰因素较多,再加上母液中缀合物含量较低,因此,现有的纯化方法在应用于抗体偶联药物的母液中回收缀合物的效果并不理想:得到的缀合物的纯度最高只能达到约90%,不能达到直接应用的需求(要求纯度达到95%以上)。因此,如何对抗体偶联药物的母液中的缀合物进行有效地回收是目前抗体偶联药物领域研究的重点和难点。
发明人经过大量的实验研究和尝试,最终回收得到的物质经核磁、质谱和液相检测,验证其为目标产物缀合物,但是回收得到的缀合物的纯度较低(最高只有约90%),不能满足实际的需求,如减压蒸馏(控制温度在50℃左右)回收溶剂,获得的油状液体经TLC检测发现较多的杂质点,需要进一步柱层析纯化,最终回收的缀合物的纯度和收率都较低,发明人分析可能是因为减压蒸馏法耗时长、所需温度较高,导致缀合物上的敏感氨基变质,减压蒸馏后体系中的杂质点较多,增加了后续纯化的难度。发明人在实验研究中发现,二氯甲烷对缀合物溶解性强,于是利用缀合物在两种互不相溶的溶剂中溶解度或分配系数的不同,采用溶剂萃取法使缀合物从水相转移到有机相中,但是溶剂萃取法所需溶剂量大,且最终得到的缀合物的纯度较低。在进行一系列的尝试之后,发明人总结经验,在后续的实验过程中意外发现采用特定的苯乙烯系或苯乙烯-二乙烯苯系的非极性大孔吸附树脂对抗体偶联药物的母液进行纯化,结合溶析结晶,回收得到的缀合物的纯度可达到95%以上,收率达59%以上。该方法与减压蒸馏法、溶剂萃取法相比,不仅所需溶剂量少、能耗低,而且对缀合物中热敏感的氨基影响小。此外,减压蒸馏法、溶剂萃取法分离得到的缀合物粗品均为黄色油状物,纯度较差,如果后续采用活性炭脱色或者是硅胶柱层析的纯化方式,损失较大,而溶析结晶法具有操作温度低、能耗低、效率高等优点。
以下各实施例及对比例中大孔吸附树脂均购买自西安蓝晓科技新材料股份有限公司。
市售的任何一种缀合物(MMAE衍生物)均能满足本发明方案的实施,但是,为方便比较,以下各实施例及对比例中的抗体偶联药物的母液均是采用如下方法制得:
参照中国专利文献CN113332449A中实施例2的方法(各原料进行适应性调整),在酶的催化作用下,抗体与所述缀合物(n=1)进行偶联反应,反应结束后,经纯化,得到抗体偶联药物和所述抗体偶联药物的母液。该抗体偶联药物的母液中所述缀合物的浓度为3mg/mL。
本发明中缀合物(n=1)的HPLC图谱如图1所示,其出峰时间为31.753min,HPLC纯度为96.91%。
以下各实施例及对比例中制得的缀合物的HPLC检测方法如下:
色谱柱:C18柱;柱温:30℃;检测波长:250nm;流速:0.5mL/min;
流动相A:0.1%三氟乙酸水溶液,流动相B:三氟乙酸:乙腈:水=0.1:90:10(体积比)的混合溶液,洗脱梯度如下表1所示:
表1洗脱梯度
时间/min | A% | B% |
0.00 | 90 | 10 |
60.00 | 10 | 90 |
65.00 | 90 | 10 |
70.00 | 90 | 10 |
以上HPLC检测方法部分的百分比均为体积百分比。
实施例1
本实施例提供一种从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,具体步骤如下:
预处理:在25-35℃下,称取30g A型非极性大孔吸附树脂,并用湿法装柱(树脂柱体积为50cm3),然后加入100mL无水乙醇对树脂柱进行清洗,控制清洗速度为2BV/h,然后用300mL去离子水清洗树脂柱至无乙醇的气味,备用;
上样:在25-35℃下,量取100mL上述抗体偶联药物的母液,以2BV/h的流速经过上述预处理之后的树脂柱,打开玻璃层析柱下端旋钮,使母液缓慢流出,上样的过程中在树脂柱的上端加氮气球进行保护;
除杂和解吸附:待上样结束后,TLC检测流出液中没有缀合物后,在25-35℃下,先用200mL去离子水以6BV/h流速清洗树脂柱,再用200mL无水乙醇以2BV/h的洗脱速率进行洗脱,并根据TLC检测收集含有缀合物的乙醇洗脱液(主要存在于前2BV乙醇洗脱液中),然后在37℃下减压浓缩,得缀合物粗品0.2801g;
溶析结晶:向上述缀合物粗品(0.2801g)加入3mL二氯甲烷,待完全溶解后,在15℃、搅拌状态下,将该含缀合物粗品的二氯甲烷溶液以0.5mL/min的速率滴加到30mL甲基叔丁基醚中,析出白色固体后,过滤,20℃真空干燥后得到0.2268g白色固体(缀合物),收率为75.60%,HPLC纯度为98.53%,缀合物的出峰时间为30.913min(如图2所示)。
实施例2
本实施例提供一种从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,具体步骤如下:
预处理:在15-25℃下,称取120g A型非极性大孔吸附树脂,并用湿法装柱(树脂柱体积为200cm3),然后加入400mL无水乙醇对树脂柱进行清洗,控制清洗速度为2BV/h,然后用800mL去离子水清洗树脂柱至无乙醇的气味,备用;
上样:在15-25℃下,量取400mL上述抗体偶联药物的母液,以2BV/h的流速经过上述预处理之后的树脂柱,打开玻璃层析柱下端旋钮,使母液缓慢流出,并在上样过程中在树脂柱的上端加氮气球进行保护;
除杂和解吸附:待上样结束后,TLC检测流出液中没有缀合物后,在15-25℃下,先用400mL去离子水以3BV/h流速清洗树脂柱,再用400mL无水乙醇以2BV/h的洗脱速率进行洗脱,并根据TLC检测收集含有缀合物的乙醇洗脱液(主要存在于前2BV乙醇洗脱液中),然后在37℃下减压浓缩,得缀合物粗品0.9047g。
溶析结晶:向上述缀合物粗品(0.9047g)加入9mL二氯甲烷,待完全溶解后,在15℃、搅拌状态下,将该含缀合物粗品的二氯甲烷溶液以0.5mL/min的速率滴加到90mL甲基叔丁基醚中,析出白色固体后,过滤,20℃下真空干燥后得到0.8182g白色固体(缀合物),收率为68.2%,HPLC纯度为98.07%。
实施例3
本实施例提供一种从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,具体步骤如下:
预处理:称取300g A型非极性大孔吸附树脂,并用湿法装柱(树脂柱体积为500cm3),然后加入1000mL无水乙醇对树脂柱进行清洗,控制清洗速度为2BV/h,然后用1800mL去离子水清洗树脂柱至无乙醇的气味,备用;
上样:在25-35℃下,量取1000mL上述抗体偶联药物的母液,以1BV/h的流速经过上述预处理之后的树脂柱,打开玻璃层析柱下端旋钮,使母液缓慢流出,并在上样过程中在树脂柱的上端加氮气球进行保护;
除杂和解吸附:待上样结束后,TLC检测流出液中没有缀合物后,在25-35℃下,先用800mL去离子水以3BV/h流速清洗树脂柱,再用1000mL无水乙醇以2BV/h的洗脱速率进行洗脱,并根据TLC检测收集含有缀合物的乙醇洗脱液(主要存在于前2BV乙醇洗脱液中),然后在37℃下减压浓缩,得缀合物粗品2.3285g。
溶析结晶:向上述缀合物粗品(2.3285g)加入24mL二氯甲烷,待完全溶解后,在15℃、搅拌状态下,将该含缀合物粗品的二氯甲烷溶液以0.5mL/min的速率滴加到240mL甲基叔丁基醚中,析出白色固体后,过滤,20℃真空干燥后得到2.0188g白色固体(缀合物),收率为67.29%,HPLC纯度为98.22%。
实施例4
本实施例提供一种从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,具体步骤如下:
预处理:1)称取30g C型非极性大孔吸附树脂,并用湿法装柱(树脂柱体积为62cm3),然后加入100mL无水乙醇对树脂柱进行清洗,控制清洗速度为2BV/h,然后用300mL去离子水清洗树脂柱至无乙醇的气味;2)用2BV质量浓度为4%的HCl溶液以3BV/h的流速清洗树脂柱,然后用去离子水清洗洗至树脂柱的pH=7左右;3)用3BV质量浓度为4%的NaOH溶液以3BV/h的流速清洗树脂柱,然后用去离子水清洗洗至树脂柱的pH=7左右。
上样:在25-35℃下量取100mL上述抗体偶联药物的母液,以2BV/h的流速经过上述预处理之后的树脂柱,打开玻璃层析柱下端旋钮,使母液缓慢流出,并在上样过程中在树脂柱的上端加氮气球进行保护;
除杂和解吸附:待上样结束后,TLC检测流出液中没有缀合物后,在25-35℃下先用200mL去离子水以6BV/h流速清洗树脂柱,再用200mL无水乙醇以2BV/h的洗脱速率进行洗脱,并根据TLC检测收集含有缀合物的乙醇洗脱液(主要存在于前2BV乙醇洗脱液中),然后在37℃下减压浓缩,得缀合物粗品0.2566g。
溶析结晶:向上述缀合物粗品(0.2566g)加入3mL二氯甲烷,待完全溶解后,在15℃、搅拌状态下,将该含缀合物粗品的二氯甲烷溶液以0.5mL/min的速率滴加到30mL甲基叔丁基醚中,析出白色固体后,过滤,20℃下真空干燥后得到0.1792g白色固体(缀合物),收率为59.73%,HPLC纯度为95.10%,缀合物出峰时间为31.300min(如图3所示)。
实施例5
本实施例提供一种从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,具体步骤如下:
预处理:1)称取30g D型非极性大孔吸附树脂,并用湿法装柱(树脂柱体积为55cm3),然后加入100mL无水乙醇对树脂柱进行清洗,控制清洗速度为2BV/h,然后用300mL去离子水清洗树脂柱至无乙醇的气味;2)用2BV质量浓度为4%的HCl溶液以2BV/h的流速清洗树脂柱,然后用去离子水清洗洗至树脂柱的pH=7左右;3)用3BV质量浓度为4%的NaOH溶液以2BV/h的流速清洗树脂柱,然后用去离子水清洗洗至树脂柱的pH=7左右。
上样:在25-35℃下量取100mL上述抗体偶联药物的母液,以2BV/h的流速经过上述预处理之后的树脂柱,打开玻璃层析柱下端旋钮,使母液缓慢流出,上样过程中在树脂柱的上端加氮气球进行保护;
除杂和解吸附:待上样结束后,TLC检测流出液中没有缀合物后,在25-35℃下先用200mL去离子水以6BV/h流速清洗树脂柱,再用200mL无水乙醇以2BV/h的洗脱速率进行洗脱,并根据TLC检测收集含有缀合物的乙醇洗脱液(主要存在于前2BV乙醇洗脱液中),然后在37℃下减压浓缩,得缀合物粗品0.2492g。
溶析结晶:向上述缀合物粗品(0.2492g)加入3mL二氯甲烷,待完全溶解后,在15℃、搅拌状态下,将该含缀合物粗品的二氯甲烷溶液以0.5mL/min的速率滴加到30mL甲基叔丁基醚中,析出白色固体后,过滤,20℃真空干燥后得到0.1904g白色固体(缀合物),收率为63.47%,HPLC纯度为96.35%,缀合物出峰时间为31.547min(如图4所示)。
对比例1
本实施例提供一种从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,具体步骤如下:
预处理:称取30g B型非极性大孔吸附树脂(比表面积为1000~1200m2/g),并用湿法装柱(树脂柱体积为46cm3),然后加入100mL无水乙醇对树脂柱进行清洗,控制清洗速度为2BV/h,然后用300mL去离子水清洗树脂柱至无乙醇的气味;
上样:在25-35℃下量取100mL上述抗体偶联药物的母液,以2BV/h的流速经过上述预处理之后的树脂柱,打开玻璃层析柱下端旋钮,使母液缓慢流出,上样过程中在树脂柱的上端加氮气球进行保护;
除杂和解吸附:待上样结束后,TLC检测流出液中没有缀合物后,在25-35℃下先用200mL去离子水以6BV/h流速清洗树脂柱,再用200mL无水乙醇以2BV/h的洗脱速率进行洗脱,并根据TLC检测收集含有缀合物的乙醇洗脱液(主要存在于前2BV乙醇洗脱液中),然后在37℃下减压浓缩,得缀合物粗品0.2255g。
溶析结晶:向上述缀合物粗品(0.2255g)加入3mL二氯甲烷,待完全溶解后,在15℃、搅拌状态下,将该含缀合物粗品的二氯甲烷溶液以0.5mL/min的速率滴加到30mL甲基叔丁基醚中,析出白色固体后,过滤,20℃下真空干燥后得到0.1452白色固体(缀合物),收率为48.4%,HPLC纯度为89.49%,缀合物出峰时间为31.410min(如图5所示)。
对比例2
本实施例提供一种从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,具体步骤如下:
预处理:1)称取30g E型(丙烯酸系)极性大孔吸附树脂,并用湿法装柱(树脂柱体积为47cm3),然后加入100mL无水乙醇对树脂柱进行清洗,控制清洗速度为2BV/h,然后用300mL去离子水清洗树脂柱至无乙醇的气味;2)用2BV质量浓度为4%的HCl溶液以2BV/h的流速清洗树脂柱,然后用去离子水清洗洗至树脂柱的pH=7左右;3)用3BV质量浓度为4%的NaOH溶液以2BV/h的流速清洗树脂柱,然后用去离子水清洗洗至树脂柱的pH=7左右。
上样:量取100mL上述抗体偶联药物的母液,以2BV/h的流速经过上述预处理之后的树脂柱,打开玻璃层析柱下端旋钮,使母液缓慢流出,并在上样过程中在树脂柱的上端加氮气球进行保护;
除杂和解吸附:待上样结束后,TLC检测流出液中没有缀合物后,先用200mL去离子水以6BV/h流速清洗树脂柱,再用200mL无水乙醇以2BV/h的洗脱速率进行洗脱,并根据TLC检测收集含有缀合物的乙醇洗脱液(主要存在于前2BV乙醇洗脱液中),然后在37℃下减压浓缩,得缀合物粗品0.1186g。
溶析结晶:向上述缀合物粗品(0.1186g)加入3mL二氯甲烷,待完全溶解后,在15℃、搅拌状态下,将该含缀合物粗品的二氯甲烷溶液以0.5mL/min的速率滴加到30mL甲基叔丁基醚中,析出白色固体后,过滤,20℃真空干燥后得到0.0896g白色固体(缀合物),收率为29.87%,HPLC纯度为94.53%。
对比例3
本对比例提供一种从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,具体步骤如下:
将50mL抗体偶联药物的母液在50℃下减压浓缩,约4h蒸出46mL溶剂,得油状缀合物粗品0.3189g(TLC显示有杂质),然后,经柱层析(采用的层析柱的直径为25mm、高度为440mm;硅胶规格为200-300目;洗脱剂为甲醇:二氯甲烷=1:8,体积比)洗脱剂用量500mL,得到缀合物0.0568g,产率为37.9%,HPLC纯度为80%。
对比例4
本对比例提供一种从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,具体步骤如下:
将100mL抗体偶联药物的母液置于分液漏斗中,用二氯甲烷搅拌萃取15min(20mL×3),合并萃取液并在20℃下减压浓缩得到黄色油状物0.2640g,然后经柱层析(采用的层析柱的直径为25mm、高度为440mm;硅胶规格为200-300目;洗脱剂为甲醇:二氯甲烷=1:8,体积比)洗脱溶剂用量400mL,得到缀合物0.0795g,产率为26.5%,HPLC纯度为84.81%。
对比例5
本对比例提供一种从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,具体步骤如下:
将100mL抗体偶联药物的母液置于分液漏斗中,用二氯甲烷搅拌萃取15min(20mL×3),合并萃取液并在20℃下减压浓缩得到黄色油状物0.2335g,然后将该黄色油状物溶于3mL二氯甲烷中,并将其在15℃、以0.5mL/min的速率滴加到30mL甲基叔丁基醚中,析出白色固体后,过滤,20℃真空干燥,得0.1772g白色固体(缀合物),收率为59.1%,HPLC纯度为90.04%。
对比例6
本对比例提供一种从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,具体步骤如下:
将100mL抗体偶联药物的母液置于分液漏斗中,用二氯甲烷搅拌萃取15min(20mL×3),合并萃取液并在20℃下减压浓缩得到黄色油状物0.2597g,然后将该黄色油状物溶于3mL异丙醇中,加入0.1g活性炭,在25℃下脱色1h,得0.1320g油状物(缀合物),收率为44.0%,HPLC纯度为80%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,其特征在于,包括如下步骤:
将抗体偶联药物的母液上样于非极性大孔吸附树脂,对缀合物进行吸附;
对吸附有缀合物的非极性大孔吸附树脂依次用除杂液进行除杂、用洗脱液进行解吸附,收集含有缀合物的洗脱液经浓缩、溶析结晶,得所述缀合物;
其中,所述非极性大孔吸附树脂为苯乙烯系或苯乙烯-二乙烯苯系;
所述苯乙烯系的非极性大孔吸附树脂的比表面积为800~1000m2/g;所述苯乙烯-二乙烯苯系的非极性大孔吸附树脂的比表面积为450~650m2/g;
所述除杂液为去离子水,所述洗脱液为无水醇类;
所述溶析结晶包括如下步骤:
向所述浓缩后得到的缀合物粗品中加入良性溶剂,溶解后滴加至不良溶剂中,所述滴加速率为0.5mL/min,所述良性溶剂与所述不良溶剂的体积比为1:10;
所述良性溶剂为二氯甲烷,所述不良溶剂为甲基叔丁基醚;
所述缀合物粗品于所述良性溶剂的质量体积比为1:9.5~12;
所述缀合物为MMAE的衍生物,所述MMAE的衍生物的结构如下:
其中,n=1。
2.如权利要求1所述的从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,其特征在于,所述抗体偶联药物的母液的上样量为1~3BV,上样流速为1~4BV/h,上样温度为5~35℃。
3.如权利要求1所述的从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,其特征在于,所述除杂液的用量为1.5~4BV,所述除杂液的流速为3~6BV/h。
4.如权利要求1所述的从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,其特征在于,所述洗脱液的洗脱流速为1~4BV/h,所述洗脱液的用量为2~5BV。
5.如权利要求1所述的从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,其特征在于,所述浓缩为减压浓缩,所述减压浓缩的温度≤40℃;和/或
所述解吸附的温度为5~35℃。
6.如权利要求1-5任一项所述的从抗体偶联药物的母液中回收缀合物的方法,其特征在于,所述抗体偶联药物的母液中所述缀合物的浓度为3.0~3.7mg/mL。
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