CN114272378B - 一种使cttnbp2nl功能缺失的试剂在制备治疗疾病的药物中的用途 - Google Patents
一种使cttnbp2nl功能缺失的试剂在制备治疗疾病的药物中的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种使CTTNBP2NL功能缺失的试剂在制备治疗疾病的药物中的用途。主要提供了使CTTNBP2NL功能缺失的试剂在制备治疗STAT3蛋白磷酸化引起的疾病的药物中的用途;所述使CTTNBP2NL功能缺失的试剂为抑制CTTNBP2NL表达的试剂或者抑制CTTNBP2NL促进肿瘤细胞中STAT3蛋白磷酸化活性的试剂。使CTTNBP2NL功能缺失的试剂可以用于制备***、自身免疫病、神经疾病的药物,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种使CTTNBP2NL功能缺失的试剂在制备治疗疾病的药物中的用途。
背景技术
在蛋白表面特定位点发生的磷酸化与去磷酸化是重要的蛋白质翻译后修饰方法。这一生物学过程在细胞内信号转导及改变酶的活性状态中发挥了重要作用。磷酸化与去磷酸化之间最重要的区别是,在磷酸化过程中,磷酸根被蛋白激酶添加到蛋白的氨基酸上,而去磷酸化是指磷酸根被水解酶(尤其是磷酸酶)从蛋白表面移除。磷酸根通常来自ATP或ADP。这一过程普遍存在于生物体内的许多生理过程中,特别是在调节蛋白质功能、定位、构象、相互作用和清除等方面。磷酸化与去磷酸化是生物体中的两个关键生物学过程。蛋白磷酸化与去磷酸化对于信号转导、细胞***、蛋白翻译、代谢及存活至关重要。在细胞中,大约30%的蛋白可以被磷酸化修饰。
此外,磷酸化在细胞外信号传导中起关键作用。神经递质、激素、细胞因子等通过调节靶细胞的磷酸化而产生作用。更重要的是,磷酸化与去磷酸化过程几乎存在于所有种类的蛋白亚型中,如结构蛋白、酶、膜通道蛋白、信号分子等。人类蛋白质中有超过200000个磷酸化位点。超过500种不同的激酶参与了磷酸化过程。而蛋白磷酸化在癌细胞发展过程中也起到了重要的作用。
皮质肌动蛋白结合蛋白2(CTTNBP2),一种神经元特异性F-肌动蛋白相关蛋白,通过与皮质肌动蛋白相互作用,调节皮质肌动蛋白的运动,控制树突棘的形成。序列比较表明,CTTNBP2 N末端样蛋白(CTTNBP2NL)是CTTNBP2的同源蛋白。蛋白质组学研究表明,纹状体-蛋白磷酸酶2A(PP2A)蛋白复合物与HEK293细胞中的CTTNBP2NL相关。CTTNBP2NL与许多生理活动相关。但是,尚未见将本发明使CTTNBP2NL功能缺失的试剂用于制备药物,治疗疾病。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种使CTTNBP2NL功能缺失的试剂在制备治疗STAT3蛋白磷酸化引起的疾病的药物中的用途;所述使CTTNBP2NL功能缺失的试剂为抑制CTTNBP2NL表达的试剂或者抑制CTTNBP2NL促进肿瘤细胞中STAT3蛋白磷酸化活性的试剂。
进一步地,所述药物是治疗STAT3蛋白Y705位点磷酸化引起的疾病的药物。
进一步地,所述抑制CTTNBP2NL表达的试剂为敲除CTTNBP2NL基因、敲降CTTNBP2NL基因或干扰CTTNBP2NL基因表达的试剂;优选所述试剂为RNAi、shRNA、CRISPR/Cas9方法用试剂;
进一步优选地,
所述RNAi、shRNA方法用试剂靶向CTTNBP2NL的RNA序列为:
ATAACCCAGTTAGGTATTATA、GGTACTCACTAAGCGTTTATT、CTGAACTCCTGACACTATTTA、GCCCTCCATCCAGGGATTTAT、GCCACTCCTGCTTACTCATAT;
和/或,所述CRISPR/Cas9技术中使用的试剂靶向CTTNBP2NL的RNA序列为:
ACTTTCATTGAAGAACGCTA、GCCGCTGCCTTTCTTCCTCA、TGTCACCTACATGCTAGAGA。
进一步地,所述抑制CTTNBP2NL促进肿瘤细胞中STAT3蛋白磷酸化活性的试剂为抑制CTTNBP2NL促进肿瘤细胞中STAT3蛋白Y705位点磷酸化活性的试剂;
优选所述试剂为使得CTTNBP2NL突变的试剂;进一步优选所述试剂是使得CTTNBP2NL第488和/或第527位点磷酸化的试剂,进一步优选是使得CTTNBP2NL第488丝氨酸突变为谷氨酸和/或第527位点丝氨酸突变为谷氨酸的试剂;
或,所述试剂是CTTNBP2NL第488和/或第527位点磷酸化得到的CTTNBP2NL突变体,进一步优选是CTTNBP2NL第488丝氨酸突变为谷氨酸和/或第527位点丝氨酸突变为谷氨酸的CTTNBP2NL突变体。
进一步地,所述STAT3蛋白磷酸化引起的疾病为肿瘤、自身免疫病和/或神经疾病;
优选地,所述肿瘤为肺癌、肝癌、白血病、结直肠癌;
和/或,所述自身免疫病为风湿性关节炎、***性红斑狼疮、炎症性肠病、银屑病;
和/或,所述神经疾病为老年痴呆,帕金森病。
进一步地,所述使CTTNBP2NL功能缺失的试剂以腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或细胞为载体。
本发明还提供了一种治疗STAT3蛋白磷酸化引起的疾病的药物,所述药物以使CTTNBP2NL功能缺失的试剂为活性成分;所述使CTTNBP2NL功能缺失的试剂为抑制CTTNBP2NL表达的试剂或者抑制CTTNBP2NL促进肿瘤细胞中STAT3蛋白磷酸化活性的试剂;
优选地,所述药物是治疗STAT3蛋白Y705位点磷酸化引起的疾病的药物。
进一步地,所述抑制CTTNBP2NL表达的试剂为敲除CTTNBP2NL基因、敲降CTTNBP2NL基因或干扰CTTNBP2NL基因表达的试剂;优选所述试剂为RNAi、shRNA、CRISPR/Cas9方法用试剂;
进一步优选地,
所述RNAi、shRNA方法用试剂靶向CTTNBP2NL的RNA序列为:
ATAACCCAGTTAGGTATTATA、GGTACTCACTAAGCGTTTATT、CTGAACTCCTGACACTATTTA、GCCCTCCATCCAGGGATTTAT、GCCACTCCTGCTTACTCATAT;
和/或,所述CRISPR/Cas9技术中使用的试剂靶向CTTNBP2NL的RNA序列为:
ACTTTCATTGAAGAACGCTA、GCCGCTGCCTTTCTTCCTCA、TGTCACCTACATGCTAGAGA。
进一步地,所述抑制CTTNBP2NL促进肿瘤细胞中STAT3蛋白磷酸化活性的试剂为抑制CTTNBP2NL促进肿瘤细胞中STAT3蛋白Y705位点磷酸化活性的试剂;
优选所述试剂为使得CTTNBP2NL突变的试剂;进一步优选所述试剂是使得CTTNBP2NL第488和/或第527位点磷酸化的试剂,进一步优选是使得CTTNBP2NL第488丝氨酸突变为谷氨酸和/或第527位点丝氨酸突变为谷氨酸的试剂;
或,所述试剂是CTTNBP2NL第488和/或第527位点磷酸化得到的CTTNBP2NL突变体,进一步优选是CTTNBP2NL第488丝氨酸突变为谷氨酸和/或第527位点丝氨酸突变为谷氨酸的CTTNBP2NL突变体。
进一步地,所述STAT3蛋白磷酸化引起的疾病为肿瘤、自身免疫病和/或神经疾病;
优选地,所述肿瘤为肺癌、肝癌、白血病、结直肠癌;
和/或,所述自身免疫病为风湿性关节炎、***性红斑狼疮、炎症性肠病、银屑病;
和/或,所述神经疾病为老年痴呆,帕金森病。
进一步地,所述使CTTNBP2NL功能缺失的试剂以腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或细胞为载体。
RNA干扰(RNAi)是短干扰RNA(siRNA)诱导基因沉默的自然机制。基于载体的短发夹RNA(shRNA)是一种RNA干扰(RNAi)技术,用于研究未知基因的功能,也可以用于疾病治疗。簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)是一种RNA引导的靶向基因组编辑工具,它允许研究人员在细胞系和动物中进行基因敲除、***外源序列、修复突变碱基和删除序列。
CTTNBP2NL过表达会引起STAT3Y705位点磷酸化增加,导致疾病发生。使CTTNBP2NL功能丧失,如抑制CTTNBP2NL表达或者抑制CTTNBP2NL促进肿瘤细胞中STAT3蛋白磷酸化活性,可以治疗由STAT3蛋白磷酸化引起的疾病,特别是STAT3蛋白Y705位点磷酸化引起的疾病。使CTTNBP2NL功能丧失可以有效减少肿瘤细胞中STAT3蛋白Y705位点的磷酸化,显著增加肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖,进而抑制肿瘤生长;同时,使CTTNBP2NL功能缺失可以减少自身抗体产生,治疗***性红斑狼疮;还可以减轻风湿性关节炎症状、炎症性肠病症状以及银屑病症状等,有效治疗风湿性关节炎、炎症性肠病和银屑病等。因此使CTTNBP2NL功能缺失的试剂可以用于***、自身免疫病、神经疾病的药物,具有良好的应用前景。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为Hela细胞过表达CTTNBP2NL引起STAT3 Y705位点磷酸化增加。
图2为HEK293细胞过表达CTTNBP2NL不引起STAT3 Y705位点磷酸化增加。
图3为CTTNBP2NL的S488E及S527E突变破坏其促进STAT3磷酸化的能力。
图4为CTTNBP2NL的S488E及S527E突变破坏其促进STAT3磷酸化的能力。
图5为敲除CTTNBP2NL促进细胞凋亡同时减少细胞增殖。
图6为干扰CTTNBP2NL表达减少细胞增殖并促进细胞凋亡。
图7为敲除CTTNBP2NL抑制肿瘤在裸鼠皮下的生长。
图8为敲降CTTNBP2NL抑制裸鼠皮下肿瘤生长。
图9为敲降CTTNBP2NL缓解SLE小鼠体重下降趋势。
图10为敲降CTTNBP2NL缓解SLE小鼠自身抗体产生。
图11为敲降CTTNBP2NL缓解胶原诱导的关节炎小鼠足爪肿胀厚度增加趋势。
图12为敲降CTTNBP2NL减少炎症性肠病炎症因子含量。
图13为敲降CTTNBP2NL减少银屑病小鼠皮损处的免疫细胞浸润。
图14为Hela细胞过表达CTTNBP2NL对STAT S568位点磷酸化的影响。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品,通过购买市售产品获得。
实施例1、过表达CTTNBP2NL引起肿瘤细胞CTTNBP2NL磷酸化增加
一、实验方法
1、细胞培养
HEK293T及HEK293、HELA等细胞购自ATCC,使用DMEM高糖培养基培养,加入10%胎牛血清和1%青链霉素。细胞于37℃细胞培养箱中培养,CO2浓度为5%。细胞生长密度接近90%即进行传代。每个月使用试剂盒鉴定一次支原体,确保细胞没有支原体感染。保种的细胞使用75cm一次性细胞培养瓶培养,其余细胞使用不同规格培养皿培养。
2、载体构建
(1)细胞RNA提取
用10cm细胞培养皿培养HEK293细胞或HELA细胞,待细胞密度接近70%时,取出培养皿,倒掉细胞培养基,用无菌PBS(灭菌后加入1%双抗,4℃暂存,1周内使用,pH 7.2)快速洗涤三次后,加入1ml TRZOL。用细胞刮铲迅速挂下细胞,用1ml移液枪(RNase free)转移至1.5ml EP管(RNase free)中,冰上放置5min。加入200μl氯仿,混匀后,冰上放置5min后,观察液体分层情况,如果分层良好,则进行下一步操作。将EP管放入提前预冷的4℃离心机中,12000g,4℃离心10min。离心结束后,取出EP管,轻轻吸取400μl上层无色透明液体至新1.5ml EP管(RNase free)中,加入等体积提前预冷的异丙醇(400μl),上下颠倒混匀后,于冰上放置10min,之后于4℃离心机中离心12000g,30min。离心结束后,取出EP管,观察EP管底部是否存在白色沉淀,如果存在白色沉淀,即为RNA。轻轻吸走管内液体,向EP管中加入1ml提前预冷的75%乙醇,用移液枪吹打沉淀,至沉淀离开EP管底部。之后于4℃离心机中离心,12000g,5min。尽量全部吸走上清(乙醇),在通风厨中打开EP管盖子,晾干残留酒精后,加入20μl双蒸水(RNase free),用移液枪反复吹打至完全溶解。取2μl至新EP管中用于浓度检测,浓度检测后立即进行逆转录操作。
(2)DNA及RNA的浓度测定
使用Thermo公司Nano Drop One仪器进行检测。
DNA浓度检测:开机自检后,选择双链DNA选项,自检完成后,加入1μl与待测样品一致的溶剂,进行背景去除操作,背景去除后,用吸水纸擦掉残留液体,加入1μl待测样品进行检测,读出值即为DNA浓度。同时通过观察260nm/280nm的吸收峰之间的比值判断是否有DNA污染,比值为1.7-1.9之间为DNA,比值大于1.9为RNA。
RNA浓度检测:开机自检后,选择单链RNA选项,其余步骤同DNA检测。
(3)逆转录
使用天根公司cDNA合成试剂盒,取1μg RNA至200μl PCR管(RNase free)中,加入1μl DNase及2μl Buffer,7μl ddH2O(RNase free),37℃20min,去除可能存在的基因组DNA污染。去除基因组DNA操作结束后,加入2μl逆转录酶,4μl 5X逆转录Buffer,4μl ddH2O(RNase free)后,放入PCR仪,逆转录程序:42℃,30min→95℃,5min→4℃,5min。
(4)PCR扩增CTTNBP2NL mRNA全长
用SnapGene软件在CTTNBP2NL CDS区外侧设计巢式PCR引物,具体引物信息如下:
巢式PCR外侧引物:
上游:5’-GAGGACTGAAGTGTGACTCTGCCG-3’
下游:5’-GGACGAAATCTGATGGAATGTCAAAC-3’
巢式PCR内侧引物:
上游:5’-ATGAATCTGGAAAAACTCAGCAAGC-3’
下游:5’-CTAGCTGCTGGTAGGCAAAAGTAACTC-3’
PCR体系:25μl,使用天根公司Pfu酶mix(2X)
模板DNA:1μl;
上下游引物:各1μl;
ddH2O:9.5μl;
2X Pfu Mix:12.5μl。
PCR程序:95℃,5min→95℃,30s→55℃,30s;72℃,3min→72℃,10min→4℃,5min。循环数:30。因为后续需要连接T载体,所以需要在PCR结束后,加入5μl普通Tag mix,95℃,30s→60℃,30s;72℃,5min,4℃,5min后,将PCR产物暂存于-20℃冰箱中。
核苷酸序列:
SEQIDNO.1:GAGGACTGAAGTGTGACTCTGCCG
SEQIDNO.2:GGACGAAATCTGATGGAATGTCAAAC
SEQIDNO.3:ATGAATCTGGAAAAACTCAGCAAGC
SEQIDNO.4:CTAGCTGCTGGTAGGCAAAAGTAACTC
(5)核酸电泳
用1X TAE Buffer配制1%核酸分离胶:称取4g琼脂糖,倒入200ml锥形瓶中。用量筒量取40ml 1X TAE Buffer,加入锥形瓶中,摇匀后,于微波炉加热至沸腾,保持高温状态5min,至琼脂糖彻底溶解后,取出锥形瓶。加入2μl GelRed,混匀后,倒入制胶板,***10孔梳子。室温放置30min,胶凝固后,取出核酸胶,放入水平电泳槽。PCR产物上样后,120v,30min。电泳结束后,将核酸胶转移至凝胶成像仪,根据Marker大小,分别切下相应位置核酸条带,放入2ml EP管中,进行后续操作。
(6)胶回收
使用天根公司胶回收试剂盒。提前向收集柱中加入300μl平衡Buffer,7000g,室温离心5min。取出装有DNA凝胶的2ml EP管,用1.5ml移液枪尖捣碎,使用电子天平称量胶块重量,加入等量buffer PN(1g胶加入1ml PN),于热块上60℃溶解30min,期间上下颠倒混匀一次,确保核酸胶溶解完全。取下EP管,冷却至室温。将溶解后的液体转移至DNA收集柱,7000g,室温离心5min。弃掉废液后,向收集柱中加入500μl漂洗液(PW),7000g,室温离心5min。漂洗两次后,空管于室温离心5min,通风厨中晾干收集管中的残留液体后,向收集管中加入30μl洗脱液(TB),60℃孵育10min,7000g,室温离心5min。经Nano Drop测定DNA浓度后,进行后续操作。
(7)连接T载体及转化感受态细胞
使用全式金公司T载体,取1μg胶回收PCR产物,加入1μl T载体,用双蒸水调整体积至5μl,放入PCR仪,37℃反应30min后,得到CTTNBP2NL与T载体的连接产物,4℃暂存。感受态细胞购自全式金公司(Trans T1),转化时,取出-80℃保存的感受态细胞,冰上融化。取2.5μl CTTNBP2NL与T载体的连接产物,加入300μl感受态细胞中,冰上孵育20min后,于42℃水浴锅中热激90s后,立即放至冰上,加入200μl无抗性液体LB后,放入水平细菌摇床中,37℃,100转,复苏30min。取出复苏的感受态细胞,置于离心机中,5000g,室温离心5min,在超净台中吸走上清,留下100μl菌液,用移液枪重悬菌体沉淀后,取出含有100μg/ml氨苄青霉素的固体LB细菌培养平板,用玻璃棒将菌液均匀涂布于细菌培养平板表面。于37℃细菌培养箱中倒置培养12h后,观察菌落生长状态。
(8)细菌单克隆扩大培养及菌种保存
取10ml细菌培养管,加入5ml液体LB培养基,加入1X抗生素。用10μl无菌移液器枪尖挑取单菌落,将枪尖丢进10ml细菌培养管中,于水平细菌摇床中,37℃,200转,培养12h。选择处于对数生长期的菌液,在超净台中吸取700μl菌液,加入300μl 50%甘油中(甘油提前灭菌),上下颠倒混匀后,于-80℃冰箱中保存。
(9)质粒抽提
质粒抽提使用全式金公司质粒小提试剂盒。经两次离心,经多次离心,每次2ml,共收集4ml菌液至2ml EP管中,弃上清,加入250μl溶液1(25mMTris-HCl、10mMEDTA、50mM葡萄糖,调节pH至8.0),涡旋重悬后,加入250μl溶液2(0.2N NaOH、1%SDS),颠倒混匀后,室温放置5min,加350μl溶液3(2M醋酸、3M醋酸钾、75%酒精),颠倒混匀后,室温放置10min,12000g,室温离心10min。将上清转移至收集柱中,12000g,室温离心2min。倒掉收集管中的废液,向收集柱中加入500μl漂洗液,12000g,室温离心2min。倒掉收集管中的废液,将收集管换成新的1.5ml EP管,向收集柱中加入30μl TB buffer,60℃孵育10min,12000g,室温离心2min,EP管中的液体即为质粒。
(10)PLVX-CTTNBP2NL-3x Flag质粒构建(其他质粒构建原理步骤基本一致)
使用PLVX-3X Flag载体作为真核表达载体,载体购自Addgene。选择双酶切方案进行构建。上游酶切位点选择:XhoI,下游酶切位点选择:BamHI。使用NEB公司内切酶进行双酶切反应,反应体系:50μl,具体成分比例:
DNA:1μg;
Cutsmart buffer:5μl;
XhoI:1μl;
BamHI:1μl;
H2O:补齐至50μl。
酶切条件:37℃,1h。
酶切结束后,加入5μl 10X loading Dye,电泳及胶回收,胶回收产物暂存于-20℃冰箱中。取出含有CTTNBP2NL CDS的T载体菌液,直接进行菌液PCR,使用的PCR引物两侧含有XhoI及BamHI酶切位点及ATGC四个碱基作为保护碱基,PCR结束后,胶回收PCR产物,双酶切及胶回收后,产物暂存于-20℃冰箱中。
连接:将CTTNBP2NL CDS区片段与载体片段按摩尔比3:1进行连接,使用全式金公司T4连接试剂盒,连接体系:20μl,连接条件:16℃,过夜连接。连接产物转化感受态细胞,挑单克隆,测序确定正确***片段后,质粒大量抽提。
(11)PLVX-CTTNBP2NL-mCherry质粒构建(其他质粒构建原理步骤基本一致)
使用PLVX-C1-mCherry载体作为真核表达载体,载体购自Addgene。选择双酶切方案进行构建。上游酶切位点选择:XhoI,下游酶切位点选择:EcoRI。使用NEB公司内切酶进行双酶切反应。其余步骤同PLVX-CTTNBP2NL-3x Flag质粒构建过程。
(12)PLVX-CTTNBP2NL-AcGFP质粒构建(其他质粒构建原理步骤基本一致)
使用PLVX-C1-mCherry载体作为初始载体,通过同源重组方式,将mCherry置换为AcGFP,测序正确后,使用PLVX-C1-AcGFP载体作为真核表达载体,选择双酶切方案进行构建。上游酶切位点选择:XhoI,下游酶切位点选择:EcoRI。使用NEB公司内切酶进行双酶切反应。其余步骤同PLVX-CTTNBP2NL-3x Flag质粒构建过程。
(13)PLVX-CTTNBP2NLC1-3XHA质粒构建
使用PLVX-3XFlag载体作为初始载体,通过同源重组方式,将3xFlag置换为3xHA,测序正确后,使用PLVX-3XHA载体作为真核表达载体选择双酶切方案进行构建。上游酶切位点选择:EcoRI,下游酶切位点选择:BamHI。使用NEB公司内切酶进行双酶切反应。其余步骤同CTTNBP2NL-3x Flag质粒构建过程。
3、慢病毒包装
将构建好的病毒骨架载体连同psPAX2、pMD2.G包装质粒一同转染293T细胞,PLVX:psPAX2:pMD2.G=1:2:1(摩尔比)。转染48小时后收集细胞上清,转染72h后收集第二次细胞上清。使用PEG对病毒进行浓缩后,分装,暂存于-80℃冰箱。
4、稳定敲除单克隆细胞系构建
使用10cm细胞培养皿培养293细胞,感染CTTNBP2NL敲除慢病毒,感染一段时间后,加入Puromycin筛选,之后消化贴壁细胞,用含有青链霉素的DMEM培养基制成单细胞悬液后,经流式细胞仪筛选单个细胞。获得的单个细胞继续培养,显微镜下观察细胞生长状态,选20个单克隆细胞进行扩大培养,经Western-Blot方法和基因测序方法鉴定CTTNBP2NL表达状态,选出CTTNBP2NL蛋白完全消失和CTTNBP2NL CDS序列断裂移码的细胞作为稳定敲除单克隆细胞系。
5、Western blot
使用碧云天公司Co-IP及Western细胞裂解液,具体步骤:取出培养的细胞或分离的线粒体,PBS清洗细胞上清液后,根据细胞数量分别加入100~400μl不等的裂解液,冰上放置5min后,4℃,12000g,离心10min,将上清转移至新EP管中,取出5μl进行蛋白浓度测定,其余蛋白加入5X SDS蛋白上样缓冲液,置于恒温金属热块上,95℃变性5min,-20℃暂时保存。
采用10%SDS分离胶+5%SDS浓缩胶的组合进行电泳,电泳条件:浓缩胶中70V,约20min离开浓缩胶,进入分离胶后,电压调至110V,分离时间约60min。
使用SDS-甲醇转膜液进行转膜。转膜条件:250mA,恒流,冰上转膜90min后,将PVDF膜取出,于5%脱脂奶粉中室温封闭30min,一抗使用TBST进行稀释,稀释比例:1:1000,4℃,孵育过夜,使用TBST洗净一抗后,于水平摇床上加入二抗,二抗稀释比例为1:2000,37℃,孵育过1h。使用TBST于水平摇床上洗净二抗后,于化学发光仪上曝光并拍照。
二、实验结果
通过构建CTTNBP2NL过表达慢病毒并感染HEK293细胞和Hela细胞,经单克隆筛选,获得稳定表达CTTNBP2NL的细胞系。通过Western blot实验,检测了这两种细胞系中的STAT3磷酸化情况变化。在肿瘤细胞中过表达CTTNBP2NL明显增加细胞中的STAT3蛋白Y705位点的磷酸化(图1)。
然而,在正常细胞中分别过表达融合不同标签的CTTNBP2NL,包括CTTNBP2NL-3xHA、CTTNBP2NL-3x Flag、CTTNBP2NL-GFP、CTTNBP2NL-RFP,结果显示,过表达CTTNBP2NL并不影响正常细胞的STAT3 Y705位点磷酸化状况,在HEK293对照细胞与CTTNBP2NL过表达细胞中,STAT3Y705位点均无磷酸化表型(图2)。上述结果说明,CTTNBP2NL过表达可引起STAT3Y705位点磷酸化增加,并且这种现象只存在于肿瘤细胞中,正常细胞不受影响。
通过碱基突变,获得了527位点的丝氨酸(S)突变为谷氨酸(E)、488位点的丝氨酸(S)突变为谷氨酸(E)两种突变体,通过在Hela细胞中过表达上述两个突变体,发现突变后的CTTNBP2NL不能增加STAT3的705位点酪氨酸的磷酸化水平(图3)。由于丝氨酸突变为谷氨酸后,可以模拟磷酸化的丝氨酸,因此,488及527位点的两个丝氨酸的磷酸化可以抑制CTTNBP2NL对STAT3的促磷酸作用。
实验结果表明:CTTNBP2NL过表达会引起STAT3Y705位点磷酸化增加,导致疾病发生;因此抑制CTTNBP2NL表达或者抑制CTTNBP2NL促进肿瘤细胞中STAT3蛋白磷酸化活性,可以治疗由STAT3蛋白磷酸化引起的疾病,特别是STAT3蛋白Y705位点磷酸化引起的疾病。而使CTTNBP2NL第488及527位点磷酸化可以有效抑制CTTNBP2NL对STAT3的促磷酸作用。
实施例2、敲除CTTNBP2NL引起肿瘤细胞STAT3磷酸化减少
一、实验方法
Lenti-CRISPRV2-CTTNBP2NL-guide RNA载体构建
使用lentiCRISPR v2载体作为真核表达载体,载体购自Addgene。使用NEB公司BsmBI进行单酶切,酶切体系:50μl,缓冲液:NEB Buffer 3.1,反应时间:1h。胶回收使用天根公司胶回收试剂盒。
***片段采用公司合成单链后退火组成双链的形式获得,退火体系:20μl,在PCR仪上进行,退火条件:95℃,5min,4℃,5min。
连接采用全式金公司T4连接酶,将***片段和酶切后的lentiCRISPR v2载体按摩尔比7:1进行连接,连接条件:16℃,过夜连接,连接产物转化Stbl3感受态细胞。其余步骤同PLVX-CTTNBP2NL-3x Flag质粒构建过程。
慢病毒包装
将构建好的病毒骨架载体连同psPAX2、pMD2.G包装质粒一同转染293T细胞,lentiCRISPR v2:psPAX2:pMD2.G=1:2:1(摩尔比)。转染48小时后收集细胞上清,转染72h后收集第二次细胞上清。使用PEG对病毒进行浓缩后,分装,暂存于-80℃冰箱。
稳定敲除单克隆细胞系构建
使用10cm细胞培养皿培养293细胞,感染CTTNBP2NL敲除慢病毒,感染一段时间后,加入Puromycin筛选,之后消化贴壁细胞,用含有青链霉素的DMEM培养基制成单细胞悬液后,经流式细胞仪筛选单个细胞。获得的单个细胞继续培养,显微镜下观察细胞生长状态,选20个单克隆细胞进行扩大培养,经Western-Blot方法和基因测序方法鉴定CTTNBP2NL表达状态,选出CTTNBP2NL蛋白完全消失和CTTNBP2NL CDS序列断裂移码的细胞作为稳定敲除单克隆细胞系。
Western blot
使用碧云天公司Co-IP及Western细胞裂解液,具体步骤:取出培养的细胞或分离的线粒体,PBS清洗细胞上清液后,根据细胞数量分别加入100~400μl不等的裂解液,冰上放置5min后,4℃,12000g,离心10min,将上清转移至新EP管中,取出5μl进行蛋白浓度测定,其余蛋白加入5X SDS蛋白上样缓冲液,置于恒温金属热块上,95℃变性5min,-20℃暂时保存。
采用10%SDS分离胶+5%SDS浓缩胶的组合进行电泳,电泳条件:浓缩胶中70V,约20min离开浓缩胶,进入分离胶后,电压调至110V,分离时间约60min。
使用SDS-甲醇转膜液进行转膜。转膜条件:250mA,恒流,冰上转膜90min后,将PVDF膜取出,于5%脱脂奶粉中室温封闭30min,一抗使用TBST进行稀释,稀释比例:1:1000,4℃,孵育过夜,使用TBST洗净一抗后,于水平摇床上加入二抗,二抗稀释比例为1:2000,37℃,孵育过1h。使用TBST于水平摇床上洗净二抗后,于化学发光仪上曝光并拍照。
二、实验结果
STAT3是JAK-STAT家族的重要成员,调控细胞增殖及凋亡等重要过程。在肿瘤细胞中,STAT3通常被过度磷酸化,导致细胞恶性程度增加。因此,通过敲除CTTNBP2NL基因,可以抑制STAT3过度磷酸化,进而达到抑制肿瘤生长、***的目的。本发明中,通过CRISPR-Cas9技术成功构建了CTTNBP2NL敲除细胞,并通过Western blot实验检测STAT3磷酸化水平变化。使用“ACTTTCATTGAAGAACGCTA”、“GCCGCTGCCTTTCTTCCTCA”、“TGTCACCTACATGCTAGAGA”;作为靶向CTTNBP2NL的guideRNA,将上述序列构建入LentiCRISPR-GFP载体,感染Hela及HEK293细胞并挑选单克隆细胞,经Western blot鉴定获得稳定敲除细胞系。结果显示,在正常细胞中,STAT3没有被磷酸化,敲除正常细胞的CTTNBP2NL不影响STAT3的磷酸化状态。而在肿瘤细胞中,STAT3始终处于磷酸化状态,敲除CTTNBP2NL后,STAT3的Y705位点的磷酸化显著减少,同时,S727位点的磷酸化未受影响。上述结果说明,CTTNBP2NL的含量与磷酸化STAT3含量之间存在相关性,CTTNBP2NL含量减少后,磷酸化STAT3含量随之减少(图4)。
核苷酸序列:
SEQIDNO.5:ACTTTCATTGAAGAACGCTA
SEQIDNO.6:GCCGCTGCCTTTCTTCCTCA
SEQIDNO.7:TGTCACCTACATGCTAGAGA
实验结果表明:采用靶向CTTNBP2NL的guideRNA可以敲除CTTNBP2NL基因,进而可以抑制CTTNBP2NL表达,减少STAT3的Y705位点的磷酸化,治疗STAT3蛋白Y705位点磷酸化引起的疾病。
实施例3、在肿瘤细胞中敲除或敲降CTTNBP2NL表达引起肿瘤细胞的细胞增殖减少、凋亡增加
一、实验方法
1、干扰慢病毒载体构建
(1)合成DNA片段,退火条件:向PCR管中加入10μl正义链+10μl反义链DNA,混匀后于PCR仪中,95℃5min,4℃5min。
DNA序列为:
guide RNA:ACTTTCATTGAAGAACGCTA:
上游:CACCG ACTTTCATTGAAGAACGCTA(SEQIDNO.8)
下游:AAACTAGCGTTCTTCAATGAAAGTC(SEQIDNO.9)
guide RNA:GCCGCTGCCTTTCTTCCTCA:
上游:CACCG GCCGCTGCCTTTCTTCCTCA(SEQIDNO.10)
下游:AAACTGAGGAAGAAAGGCAGCGGCC(SEQIDNO.11)
guide RNA:TGTCACCTACATGCTAGAGA:
上游:CACCG TGTCACCTACATGCTAGAGA(SEQIDNO.12)
下游:AAACTCTCTAGCATGTAGGTGACAC(SEQIDNO.13)
(2)Plko.1载体双酶切:AgeI+EcoRI。
(3)按载体:片段=1:7比例连接,16℃,12h。
(4)转化感受态,单克隆挑选及测序,测序引物使用U6(序列为:ATGGACTATCATATGCTTACCGTA(SEQIDNO.14)),正向测序。
2、细胞凋亡检测
使用上海翊圣生物科技有限公司Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒(产品编号:40310ES20)进行检测,具体操作参照厂家说明书进行。
3、细胞增殖检测
使用碧云天公司BeyoClickTMEdU-555细胞增殖检测试剂盒(产品编号:C0075S)进行检测,具体操作参照厂家说明书进行。
二、实验结果
在体外培养的Hela细胞中,表达CTTNBP2NL的敲除慢病毒,引起STAT3磷酸化减少,细胞增殖减少,细胞凋亡增加。分别使用“ACTTTCATTGAAGAACGCTA”(命名为guide1)、“GCCGCTGCCTTTCTTCCTCA”(命名为guide2)、“TGTCACCTACATGCTAGAGA”(命名为guide3)作为靶向CTTNBP2NL的guideRNA,经EdU***法检测增殖,经Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。结果显示,敲除CTTNBP2NL显著增加细胞凋亡(图5a),与此同时,发现细胞增殖明显减少(图5b)。
为进一步确定CTTNBP2NL对肿瘤细胞生长的影响,合成了靶向CTTNBP2NL表达的干扰RNA,干扰序列分别为:“ATAACCCAGTTAGGTATTATA(命名为sh-1)”、“GGTACTCACTAAGCGTTTATT(命名为sh-2)”、“CTGAACTCCTGACACTATTTA(命名为sh-3)”、“GCCCTCCATCCAGGGATTTAT(命名为sh-4)”、“GCCACTCCTGCTTACTCATAT(命名为sh-5)”;利用脂质体3000转染,将上述RNA片段转染至Hela细胞,并观察细胞增殖及凋亡变化。结果显示:干扰CTTNBP2NL表达显著减少Hela细胞的细胞增殖比例(图6a),同时,发现细胞凋亡显著增加(图6b)。
核苷酸序列:
SEQIDNO.15:ATAACCCAGTTAGGTATTATA
SEQIDNO.16:GGTACTCACTAAGCGTTTATT
SEQIDNO.17:CTGAACTCCTGACACTATTTA
SEQIDNO.18:GCCCTCCATCCAGGGATTTAT
SEQIDNO.19:GCCACTCCTGCTTACTCATAT
为确定CTTNBP2NL敲除对在体肿瘤细胞生长的影响,将CTTNBP2NL敲除细胞经皮下注射接种于裸鼠,观察并记录肿瘤生长状况。结果显示,敲除CTTNBP2NL后,明显抑制肿瘤生长(图7)。
为进一步确定CTTNBP2NL对肿瘤细胞生长的影响,合成了靶向CTTNBP2NL表达的干扰慢病毒载体,干扰序列分别为:“ATAACCCAGTTAGGTATTATA”、“GGTACTCACTAAGCGTTTATT”、“CTGAACTCCTGACACTATTTA”、“GCCCTCCATCCAGGGATTTAT”、“GCCACTCCTGCTTACTCATAT”;感染Hela细胞并筛选稳定敲降CTTNBP2NL的单克隆细胞。CTTNBP2NL敲降细胞经皮下注射接种于裸鼠,观察并记录肿瘤生长状况。结果显示,敲降CTTNBP2NL后,明显抑制肿瘤生长(图8)。
实验结果表明:采用靶向CTTNBP2NL表达的干扰RNA可以干扰、减少CTTNBP2NL基因的表达,明显抑制肿瘤生长。
实施例4、AAV-sh-CTTNBP2NL治疗***性红斑狼疮
***性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)是一种自身免疫性炎症性***病,多发于青年女性,常累及多种脏器。SLE对健康造成了巨大破坏,给患者造成诸多不利影响。STAT3的过度磷酸化在SLE患者中扮演重要角色,因此,通过敲降CTTNBP2NL的方式阻断STAT3的过度磷酸化可以达到治疗SLE的目的。本发明计划通过构建靶向CTTNBP2NL干扰AAV病毒,经静脉注射治疗SLE。
一、实验方法
1、干扰AAV病毒构建:
(1)合成DNA片段,退火条件:向PCR管中加入10ul正义链+10反义链DNA,混匀后于PCR仪中,95℃5min,4℃5min。
DNA序列为:
核苷酸序列SEQIDNO.15:
上游:
GATCCATAACCCAGTTAGGTATTATACTCGAGTATAATACCTAACTGGGTTATTTTTTA(SEQIDNO.20)
下游:
AGCTTAAAAAATAACCCAGTTAGGTATTATACTCGAGTATAATACCTAACTGGGTTATG(SEQIDNO.21)
核苷酸序列SEQIDNO.16:
上游:
GATCCGGTACTCACTAAGCGTTTATTCTCGAGAATAAACGCTTAGTGAGTACCTTTTTA(SEQIDNO.22)
下游:
AGCTTAAAAAGGTACTCACTAAGCGTTTATTCTCGAGAATAAACGCTTAGTGAGTACCG(SEQIDNO.23)
核苷酸序列SEQIDNO.17:
上游:
GATCCCTGAACTCCTGACACTATTTACTCGAGTAAATAGTGTCAGGAGTTCAGTTTTTA(SEQIDNO.24)
下游:
AGCTTAAAAACTGAACTCCTGACACTATTTACTCGAGTAAATAGTGTCAGGAGTTCAGG(SEQIDNO.25)
核苷酸序列SEQIDNO.18:
上游:
GATCCGCCCTCCATCCAGGGATTTATCTCGAGATAAATCCCTGGATGGAGGGCTTTTTA(SEQIDNO.26)
下游:
AGCTTAAAAAGCCCTCCATCCAGGGATTTATCTCGAGATAAATCCCTGGATGGAGGGCG(SEQIDNO.27)
核苷酸序列SEQIDNO.19:
上游:
GATCCGCCACTCCTGCTTACTCATATCTCGAGATATGAGTAAGCAGGAGTGGCTTTTTA(SEQIDNO.28)
下游:
AGCTTAAAAAGCCACTCCTGCTTACTCATATCTCGAGATATGAGTAAGCAGGAGTGGCG(SEQIDNO.29)
(2)pAAV-ZsGreen-shRNA载体双酶切:BamHI+HindIII。
(3)按载体:片段=1:7比例连接,16℃,12h。
(4)转化感受态,单克隆挑选及测序,测序引物使用U6,正向测序。
2、干扰AAV病毒治疗:
(1)取成功诱导SLE的人源化免疫***小鼠,麻醉后进行AAV病毒注射。
(2)病毒用量:1×1011GC/只鼠,稀释成100μl后,利用显微注射仪进行尾静脉注射。
(3)AAV病毒注射15天后,观察小鼠表型变化。
二、实验结果
使用雌性成年MRL/lpr***性红斑狼疮(SLE)小鼠,通过尾静脉注射CTTNBP2NL的干扰RNA表达AAV病毒,成功缓解症状。通过称量体重,发现利用AAV病毒敲降CTTNBP2NL可显著减轻SLE小鼠的体重减轻趋势(图9),同时发现,敲降CTTNBP2NL可显著减少SLE模型小鼠自身抗体产生(图10)。
实验结果表明:抑制CTTNBP2NL表达可以治疗***性红斑狼疮。
实施例5、AAV-sh-CTTNBP2NL治疗风湿性关节炎
风湿性关节炎(rheumatic arthritis,RA)是一种自身免疫和炎症性疾病,通常起因于免疫***错误地攻击患者自身的健康细胞,受影响的身体部位引发炎症(疼痛性肿胀)。RA主要攻击关节组织,一次常攻击多个关节,手、手腕和膝盖的关节均受影响。研究发现,RA患者病免疫细胞通常表现为STAT3过度磷酸化。因此,通过敲降CTTNBP2NL的方式阻断STAT3的过度磷酸化可以达到治疗RA的目的。本发明计划通过构建靶向CTTNBP2NL干扰AAV病毒,经静脉注射治疗RA。
构建靶向CTTNBP2NL干扰AAV病毒方法同实施例4。
一、实验方法
(1)将牛Ⅱ型胶原与弗氏完全佐剂按1:1体积比例混合;
(2)取50只雌性成年人源化免疫***DBA/1J小鼠,每只小鼠尾根部皮下注射0.1mg
(3)25天后第二次注射;
(4)50天后对发病小鼠进行AAV治疗:病毒用量:1×1011GC/只鼠,稀释成100μl后,利用显微注射仪进行尾静脉注射。
(5)AAV病毒注射15天后,观察小鼠表型变化。
二、实验结果
使用雌性成年DBA/1J小鼠诱导风湿性关节炎产生,通过尾静脉注射CTTNBP2NL的干扰RNA表达AAV病毒,成功缓解症状。通过检测足爪肿胀厚度,发现利用AAV病毒敲降CTTNBP2NL可显著减轻风湿性关节炎小鼠的症状(图11)。
实验结果表明:抑制CTTNBP2NL表达可以治疗风湿性关节炎。
实施例6、AAV-sh-CTTNBP2NL治疗炎症性肠病
炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一类引起肠道发炎的自身免疫性疾病,IBD通常导致结肠和直肠(大肠或大肠)持续发炎,引起患者血性腹泻。研究发现,IBD患者病免疫细胞通常表现为STAT3过度磷酸化。因此,通过敲降CTTNBP2NL的方式阻断STAT3的过度磷酸化可以达到治疗IBD的目的。本发明计划通过构建靶向CTTNBP2NL干扰AAV病毒,经静脉注射治疗IBD。
构建靶向CTTNBP2NL干扰AAV病毒方法同实施例4。
一、实验方法
(1)将葡聚糖硫酸钠(DSS)用水溶解成5%溶液;
(2)通过饮水给药,反复刺激人源化免疫***C57BL/6小鼠,间隔时间为一周,共刺激2个月;
(3)对发病小鼠进行AAV治疗:病毒用量:1×1011GC/只鼠,稀释成100μl后,利用显微注射仪进行尾静脉注射。
(4)AAV病毒注射15天后,观察小鼠表型变化。
二、实验结果
购买雌性成年人源化免疫***C57BL/6小鼠,于SPF级环境中饲养一周后,经口服DSS法构建炎症性肠病小鼠模型。通过尾静脉注射CTTNBP2NL的干扰RNA表达AAV病毒,对炎症性肠病患病小鼠进行治疗。通过检测肠组织炎症因子含量,发现利用AAV病毒敲降CTTNBP2NL可显著减轻炎症性肠病小鼠的症状(图12)。
实验结果表明:抑制CTTNBP2NL表达可以治疗炎症性肠病。
实施例7、AAV-sh-CTTNBP2NL治疗银屑病
银屑病是一种自身免疫性疾病,通常表现为皮肤病,但也会出现多种脏器损伤的现象。银屑病通常导致患者皮肤出现红色瘙痒鳞片,多见于膝盖、肘部、躯干及头皮部位。银屑病是一种常见的、慢性疾病,目前尚彻底治愈。银屑病的发病具有一定周期性,该病一般发作几个星期或几个月后,往往消退一段时间或进入缓解期。但一段时间之后继续进入发病期。研究发现,银屑病患者病免疫细胞通常表现为STAT3过度磷酸化。因此,通过敲降CTTNBP2NL的方式阻断STAT3的过度磷酸化可以达到治疗银屑病的目的。本发明计划通过构建靶向CTTNBP2NL干扰AAV病毒,经静脉注射治疗银屑病。
构建靶向CTTNBP2NL干扰AAV病毒方法同实施例4。
一、实验方法
(1)7-8周龄左右雌性人源化免疫***Bab/c小鼠进行剃毛及脱毛膏处理,暴露背部皮肤。
(2)使用5%咪喹莫特乳膏(剂量:50mg/cm2)涂抹于脱毛部位,每天给药一次,连续给药15天。
(3)腹腔注射IFN-a(剂量:20U/g体重),每天给药一次,连续给药15天。
(4)皮损出现后,对发病小鼠进行AAV治疗:病毒用量:1×1011GC/只鼠,稀释成100μl后,利用显微注射仪进行尾静脉注射。
(5)AAV病毒注射15天后,处死小鼠,剪下背部皮肤制成单细胞悬液后,经染色及流式分析确定免疫细胞亚群比例变化。
二、实验结果
SPF级人源化免疫***BALB/c小鼠饲养至7周,选取雌性小鼠进行银屑病诱导发病。通过尾静脉注射CTTNBP2NL的干扰RNA表达AAV病毒,对银屑病模型小鼠进行治疗。通过检测小鼠银屑病皮损部位的免疫细胞比例变化,发现利用AAV病毒敲降CTTNBP2NL可显著减轻银屑病小鼠的症状(图13)。
实验结果表明:抑制CTTNBP2NL表达可以治疗银屑病。
实施例8、过表达CTTNBP2NL对于肿瘤细胞CTTNBP2NL磷酸化的影响
为确定CTTNBP2NL蛋白第568位丝氨酸的功能,构建了表达CTTNBP2NL蛋白S568A(无法被磷酸化的失活突变)及S568E(持续磷酸化的激活突变)的慢病毒载体,并感染Hela细胞,并向Hela细胞中转染STAT3下游转录活性的双荧光素酶报告基因质粒。通过萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶之间的比例可以判断过表达不同CTTNBP2NL突变体对STAT3转录活性的影响。结果显示(图14),过表达CTTNBP2NL的S568位点的失活突变不影响STAT3转录活性,但过表达CTTNBP2NL的S568位点的激活突变显著抑制STAT3转录活性。上述结果暗示,S568位点也是CTTNBP2NL发挥功能的关键位点。
综上,CTTNBP2NL过表达会引起STAT3Y705位点磷酸化增加,导致疾病发生。使CTTNBP2NL功能丧失,如抑制CTTNBP2NL表达或者抑制CTTNBP2NL促进肿瘤细胞中STAT3蛋白磷酸化活性,可以治疗由STAT3蛋白磷酸化引起的疾病,特别是STAT3蛋白Y705位点磷酸化引起的疾病。使CTTNBP2NL功能丧失可以有效减少肿瘤细胞中STAT3蛋白Y705位点的磷酸化,显著增加肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖,进而抑制肿瘤生长;同时,使CTTNBP2NL功能缺失可以减少自身抗体产生,治疗***性红斑狼疮;还可以减轻风湿性关节炎症状、炎症性肠病症状以及银屑病症状等,有效治疗风湿性关节炎、炎症性肠病和银屑病等。因此使CTTNBP2NL功能缺失的试剂可以用于***、自身免疫病、神经疾病的药物,具有良好的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种使CTTNBP2NL功能缺失的试剂在制备治疗疾病的药物中的用途
<130> GYKH1669-2020P0111236CC
<160> 29
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaggactgaa gtgtgactct gccg 24
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggacgaaatc tgatggaatg tcaaac 26
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaatctgg aaaaactcag caagc 25
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctagctgctg gtaggcaaaa gtaactc 27
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
actttcattg aagaacgcta 20
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<213> 人工序列
<400> 6
gccgctgcct ttcttcctca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgtcacctac atgctagaga 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
caccgacttt cattgaagaa cgcta 25
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aaactagcgt tcttcaatga aagtc 25
<210> 10
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<212> DNA
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caccggccgc tgcctttctt cctca 25
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aaactgagga agaaaggcag cggcc 25
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caccgtgtca cctacatgct agaga 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aaactctcta gcatgtaggt gacac 25
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<213> 人工序列
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atggactatc atatgcttac cgta 24
<210> 15
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ataacccagt taggtattat a 21
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ggtactcact aagcgtttat t 21
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<212> DNA
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<400> 17
ctgaactcct gacactattt a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gccctccatc cagggattta t 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gccactcctg cttactcata t 21
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<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
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gatccataac ccagttaggt attatactcg agtataatac ctaactgggt tatttttta 59
<210> 21
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
agcttaaaaa ataacccagt taggtattat actcgagtat aatacctaac tgggttatg 59
<210> 22
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gatccggtac tcactaagcg tttattctcg agaataaacg cttagtgagt accttttta 59
<210> 23
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<212> DNA
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<400> 23
agcttaaaaa ggtactcact aagcgtttat tctcgagaat aaacgcttag tgagtaccg 59
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<212> DNA
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<400> 24
gatccctgaa ctcctgacac tatttactcg agtaaatagt gtcaggagtt cagttttta 59
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
agcttaaaaa ctgaactcct gacactattt actcgagtaa atagtgtcag gagttcagg 59
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<400> 26
gatccgccct ccatccaggg atttatctcg agataaatcc ctggatggag ggcttttta 59
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<400> 27
agcttaaaaa gccctccatc cagggattta tctcgagata aatccctgga tggagggcg 59
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<400> 28
gatccgccac tcctgcttac tcatatctcg agatatgagt aagcaggagt ggcttttta 59
<210> 29
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
agcttaaaaa gccactcctg cttactcata tctcgagata tgagtaagca ggagtggcg 59
Claims (3)
1.一种使CTTNBP2NL功能缺失的试剂在制备治疗STAT3蛋白磷酸化引起的疾病的药物中的用途,其特征在于:所述STAT3蛋白磷酸化引起的疾病为***、风湿性关节炎、***性红斑狼疮、炎症性肠病、银屑病;所述使CTTNBP2NL功能缺失的试剂为抑制CTTNBP2NL表达的试剂或者抑制CTTNBP2NL促进肿瘤细胞中STAT3蛋白磷酸化活性的试剂;所述抑制CTTNBP2NL表达的试剂为RNAi、CRISPR/Cas9方法用试剂;所述RNAi方法用试剂靶向CTTNBP2NL的RNA序列为:
ATAACCCAGTTAGGTATTATA、GGTACTCACTAAGCGTTTATT、CTGAACTCCTGACACTATTTA、GCCCTCCATCCAGGGATTTAT、GCCACTCCTGCTTACTCATAT;
所述CRISPR/Cas9方法用试剂靶向CTTNBP2NL的RNA序列为:
ACTTTCATTGAAGAACGCTA、GCCGCTGCCTTTCTTCCTCA、TGTCACCTACATGCTAGAGA;
所述抑制CTTNBP2NL促进肿瘤细胞中STAT3蛋白磷酸化活性的试剂是使得CTTNBP2NL第488丝氨酸突变为谷氨酸和/或第527位点丝氨酸突变为谷氨酸的试剂。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述药物是治疗STAT3蛋白Y705位点磷酸化引起的疾病的药物。
3.根据权利要求1或2所述的用途,其特征在于:所述使CTTNBP2NL功能缺失的试剂以腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或细胞为载体。
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102027129A (zh) * | 2008-02-28 | 2011-04-20 | 俄亥俄州立大学研究基金会 | 用于***相关病症的诊断、预后和治疗的基于微rna的方法和组合物 |
CN108349943A (zh) * | 2015-09-09 | 2018-07-31 | 西奈山伊坎医学院 | 杂环受限三环磺酰胺作为抗癌试剂 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090227533A1 (en) * | 2007-06-08 | 2009-09-10 | Bader Andreas G | miR-34 Regulated Genes and Pathways as Targets for Therapeutic Intervention |
WO2012061754A2 (en) * | 2010-11-05 | 2012-05-10 | The Broad Institute, Inc. | Compounds and methods for treating autoimmune diseases |
JP2018517704A (ja) * | 2015-06-05 | 2018-07-05 | ミラゲン セラピューティクス, インコーポレイテッド | 筋萎縮性側索硬化症(ALS)を処置するためのmiR−155阻害剤 |
US20180153922A1 (en) * | 2016-12-06 | 2018-06-07 | New York Society For The Ruptured And Crippled Maintaining The Hospital For Special Surgery | Inhibition of expansion and function of pathogenic age-associated b cells and use for the prevention and treatment of autoimmune disease |
-
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102027129A (zh) * | 2008-02-28 | 2011-04-20 | 俄亥俄州立大学研究基金会 | 用于***相关病症的诊断、预后和治疗的基于微rna的方法和组合物 |
CN108349943A (zh) * | 2015-09-09 | 2018-07-31 | 西奈山伊坎医学院 | 杂环受限三环磺酰胺作为抗癌试剂 |
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