CN114269918A - 用于纯化体外转录的下游产物的方法 - Google Patents

用于纯化体外转录的下游产物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114269918A
CN114269918A CN202080059135.9A CN202080059135A CN114269918A CN 114269918 A CN114269918 A CN 114269918A CN 202080059135 A CN202080059135 A CN 202080059135A CN 114269918 A CN114269918 A CN 114269918A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rna
composition
resin
denatured
salt
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080059135.9A
Other languages
English (en)
Inventor
迈克尔·沙马什金
马修·斯克特
彼得·沃伊切霍夫斯基
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ModernaTx Inc
Original Assignee
ModernaTx Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ModernaTx Inc filed Critical ModernaTx Inc
Publication of CN114269918A publication Critical patent/CN114269918A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/32—Bonded phase chromatography
    • B01D15/325—Reversed phase
    • B01D15/327—Reversed phase with hydrophobic interaction
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
    • B01J20/264—Synthetic macromolecular compounds derived from different types of monomers, e.g. linear or branched copolymers, block copolymers, graft copolymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28054—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their surface properties or porosity
    • B01J20/28078—Pore diameter
    • B01J20/28085—Pore diameter being more than 50 nm, i.e. macropores
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/40—Aspects relating to the composition of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/44—Materials comprising a mixture of organic materials
    • B01J2220/445—Materials comprising a mixture of organic materials comprising a mixture of polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/52—Sorbents specially adapted for preparative chromatography

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

在一些实施方案中，本文提供了使用变性寡聚‑dT色谱来纯化低盐RNA组合物的方法。

Description

用于纯化体外转录的下游产物的方法
相关申请
本申请根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2019年8月14日提交的美国临时申请第62/886,840号的权益，所述临时申请的内容以引用的方式整体并入本文。
背景技术
体外转录(IVT)使用噬菌体DNA依赖性核糖核酸(RNA)聚合酶(例如，SP6、T3和T7)来合成模板导向的信使RNA(mRNA)转录物。例如，IVT反应中的问题会导致完全失败(例如，不产生转录物)或转录物的大小不正确(例如，比预期的短或长)。与IVT反应相关的具体问题包括，例如，反应过程中产生的无效(截短)转录物、连续转录物、多聚-A尾变体/3′异质性(包括低多聚-A加尾mRNA百分比)、突变转录物和/或双链污染物。减轻这些由IVT反应产生的问题的一种机制是在反应完成后纯化mRNA产物。
发明内容
在一些实施方案中，本公开提供了例如从体外转录(IVT)反应分离高收率的高纯度核糖核酸(RNA)诸如信使RNA(mRNA)的方法。以前的mRNA纯化主要集中在单独使用环境寡聚-dT或与反相HPLC组合使用。然而，这些纯化方法提供的加尾mRNA纯度百分比较低(单独的环境寡聚-dT)或者大规模纯化的成本过高(环境寡聚-dT与反相HPLC组合)。因此，需要新的mRNA纯化方法。出乎意料的是，本文的研究表明，高盐缓冲液与包含变性RNA的低盐组合物的在线混合显著增加了含有多聚-A尾的mRNA的相对收率。在一些实施方案中，使用本文提供的方法分离的至少95％的mRNA具有多聚-A尾；这种多聚A加尾RNA种类的百分比高于使用常规RNA纯化方法(诸如反相色谱法)所纯化的百分比。不受理论的束缚，据认为在与高盐缓冲液快速在线混合之前使RNA变性有助于除去与RNA相关的杂质并且有助于RNA与寡聚dT树脂的高度选择性结合。此外，在一些实施方案中，本文提供的方法易于扩大规模(例如，使用具有至少1升柱体积的色谱柱进行纯化)并且具有成本效益。
因此，本公开的一些方面提供了这样的方法，所述方法包括将包含变性RNA的组合物与高盐缓冲液在线混合，以产生包含变性RNA和盐(例如，浓度为至少50mM)的组合物，使所述组合物的所述变性RNA结合至寡聚-dT树脂(例如，在低于40℃的温度下)，以及从所述寡聚-dT树脂洗脱RNA(例如，其中至少95％是具有多聚-A尾的mRNA)。
在一些实施方案中，所述方法包括(a)使包含RNA的混合物(例如，IVT反应混合物)脱盐，以产生盐浓度小于20mM的低盐RNA组合物，(b)将所述低盐RNA组合物加热至高于60℃的温度，以产生变性RNA，(c)将所述包含变性RNA的组合物与高盐缓冲液在线混合，以产生包含变性RNA和至少50mM浓度的盐的组合物，(d)在低于40℃的温度下使(c)中产生的所述组合物的所述变性RNA结合至寡聚-dT树脂，以及(e)从所述寡聚-dT树脂洗脱RNA。
在一些实施方案中，所述方法包括(a)使包含RNA的混合物(例如，IVT反应混合物)脱盐，以产生电导率小于2mS/cm的低盐RNA组合物，(b)将所述低盐RNA组合物加热至高于60℃的温度，以产生变性RNA，(c)将所述包含变性RNA的组合物与高盐缓冲液在线混合，以产生包含变性RNA并且电导率为至少5mS/cm的组合物，(d)在低于40℃的温度下使(c)中产生的所述组合物的所述变性RNA结合至寡聚-dT树脂，以及(e)从所述寡聚-dT树脂洗脱RNA。在一些实施方案中，所述包含RNA的混合物是稀释的体外转录(IVT)反应。可以使用其他包含RNA的混合物。
在一些实施方案中，高盐缓冲液的所述盐包括氯化钠(NaCl)。可以使用其他盐。在一些实施方案中，高盐缓冲液具有100mM至1000mM的盐浓度。例如，高盐缓冲液可以具有50mM至450mM、50mM至400mM、50mM至350mM、50mM至300mM、50mM至250mM、50mM至200mM、50mM至150mM、50mM至100mM、100mM至500mM、100mM至450mM、100mM至400mM、100mM至350mM、100mM至300mM、100mM至250mM、100mM至200mM、100mM至150mM、150mM至500mM、150mM至450mM、150mM至400mM、150mM至350mM、150mM至300mM、150mM至250mM、150mM至200mM、200mM至500mM、200mM至450mM、200mM至400mM、200mM至350mM、200mN4至300mM、或200mM至250mM的盐浓度。在一些实施方案中，高盐缓冲液具有5mS/cm至85mS/cm的电导率。例如，高盐缓冲液可以具有5mS/cm至10mS/cm、5mS/cm至15mS/cm、5mS/cm至25mS/cm、5mS/cm至35mS/cm、5mS/cm至50mS/cm、5mS/cm至60mS/cm、5mS/cm至70mS/cm、10mS/cm至20mS/cm、15mS/cm至25mS/cm、20mS/cm至30mS/cm、25mS/cm至35mS/cm、30mS/cm至40mS/cm、35mS/cm至45mS/cm、40mS/cm至50mS/cm、45mS/cm至55mS/cm、50mS/cm至60mS/cm、55mS/cm至65mS/cm、60mS/cm至70mS/cm、65mS/cm至75mS/cm，70mS/cm至80mS/cm、或75mS/cm至85mS/cm的电导率。
在一些实施方案中，脱盐包括使来自粗混合物的所述RNA与疏水相互作用色谱(HIC)树脂结合，以及用低盐缓冲液从所述HIC树脂洗脱所述RNA，以产生所述低盐RNA组合物。在一些实施方案中，所述HIC树脂是(聚)苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)R150珠粒树脂(例如，具有2000埃的孔)。
在一些实施方案中，加热步骤进行(实施)1分钟或更短，或者少于1分钟(例如，10-60秒、10-50秒、10-40秒、10-30秒、10-20秒、20-60秒、20-50秒、20-40秒、20-30秒、30-60秒、30-50秒、30-40秒、40-60秒、40-50秒、或50-60秒)。在一些实施方案中，加热步骤进行(实施)至少10秒。
在一些实施方案中，加热步骤在60℃至90℃(例如，60℃至80℃、60℃至70℃、65℃至90℃、65℃至80℃、65℃至70℃、70℃至90℃、70℃至80℃、75℃至90℃、75℃至80℃、80℃至90℃、或85℃至90℃)的温度下进行(实施)。
在一些实施方案中，RNA的二级结构在加热步骤(例如，旨在使RNA变性的加热步骤)期间，使用例如紫外检测来监测。在一些实施方案中，RNA的变性在加热步骤(例如，旨在使RNA变性的加热步骤)期间使用例如紫外检测来监测。在一些实施方案中，RNA的变性通过收集所述RNA的增色性的紫外测量值来监测，例如，在加热步骤(例如，旨在使RNA变性的加热步骤)之前和之后进行。
在一些实施方案中，组合物中的总RNA的至少90％(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％)包括变性RNA。
在一些实施方案中，低盐RNA组合物在存在变性剂分子(诸如二甲基亚砜、胍、或尿素)的情况下加热。
在一些实施方案中，所述包含变性RNA的组合物与高盐缓冲液的在线混合进行(实施)1分钟或更短，或者少于1分钟(例如，10-60秒、10-50秒、10-40秒、10-30秒、10-20秒、20-60秒、20-50秒、20-40秒、20-30秒、30-60秒、30-50秒、30-40秒、40-60秒、40-50秒、或50-60秒)。在一些实施方案中，所述包含变性RNA的组合物与高盐缓冲液的在线混合在接触所述dT树脂之前进行。在一些实施方案中，所述包含变性RNA的组合物与高盐缓冲液的在线混合与使组合物与所述dT树脂接触同步(例如，同时)进行。不受理论束缚，据认为短时间的在线混合可防止变性RNA在接触所述dT树脂之前折叠和/或与杂质结合。
在一些实施方案中，在线混合包括将所述包含变性RNA的组合物在线冷却至低于60℃的温度(例如，低于60℃、55℃、50℃、45℃、40℃、35℃、30℃、25℃、20℃、15℃、10℃、或5℃)。在一些实施方案中，在线混合包括将包含变性RNA的组合物在线冷却至低于60℃但高于4℃的温度。在一些实施方案中，包含变性RNA的组合物在变性后储存在断流槽中。在一些实施方案中，包含变性RNA的组合物在变性和在线冷却后储存在断流槽中。在一些实施方案中，包含变性RNA的组合物在2-8℃(例如，2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、或8℃)下储存在断流槽中1-5天(例如，1、2、3、4或5天)。
在一些实施方案中，组合物的变性RNA与寡聚-dT树脂的结合在4℃至25℃(例如，4℃至20℃、4℃至15℃、或4℃至10℃)的温度下进行(实施)。
在一些实施方案中，寡聚-dT树脂是(聚)苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)珠粒树脂(例如，具有2000埃的孔，例如，用多聚dT衍生化的)。
在一些实施方案中，组合物的变性RNA与寡聚-dT树脂的结合进行(实施)20分钟或更短，或者少于20分钟(例如，5分钟(min)至20分钟、5分钟至15分钟、5分钟至10分钟、10分钟至20分钟、10分钟至15分钟、或15分钟至20分钟)。
在一些实施方案中，从寡聚-dT树脂洗脱的RNA包含至少90％的多聚-A加尾mRNA。例如，从寡聚-dT树脂洗脱的RNA可以包含至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的多聚-A加尾mRNA。在一些实施方案中，从寡聚-dT树脂洗脱的RNA包含至少95％的多聚-A加尾mRNA。
附图说明
图1描绘了使用变性寡聚-dT树脂来纯化mRNA的方法的实例的示意图。
图2描绘了显示在不同盐浓度存在下两种不同长度的RNA分子的解链曲线的图。
图3描绘了用于使用变性dT色谱法来纯化RNA的设备的实例的示意图。
图4描绘了显示如通过多聚-A加尾mRNA百分比所评估的IVT反应的不同纯化策略对RNA纯度的影响的图。
图5描绘了用于纯化由IVT反应产生的RNA的方法的实例的示意图。
图6描绘了使用疏水相互作用色谱(HIC)法来纯化mRNA的代表性色谱图。
具体实施方式
体外转录(IVT)反应为RNA(例如，mRNA)的产生提供了强大的平台。然而，除产生所需的RNA产物之外，IVT反应还会产生大量杂质。部分地由于这些杂质，纯化所需的RNA产物已经被证明是一项挑战。在一些实施方案中，本文提供了用于从大规模IVT反应中有效、具成本效益地除去RNA杂质的方法。这些具有RNA变性过程(包括脱盐过程，诸如疏水相互作用色谱(HIC))能够高收率地分离高纯度的mRNA群体。出乎意料的是，包括所述方法的在线(连续共混)混合过程还促进了变性mRNA与寡聚-dT树脂的高亲和力结合。据发现，在线混合过程允许变性RNA与高盐溶液的快速混合，对于防止变性RNA与杂质结合(例如，杂交)至关重要，同时还确保变性RNA的组合物具有使变性RNA与寡聚-dT树脂结合最大化的最佳高盐浓度。
因此，如本文所述，本公开提供了纯化包含RNA(例加，通过IVT反应产生的mRNA)的混合物的方法。在一些方面，所述方法包括将高盐缓冲液与包含变性核糖核酸(RNA)的低盐变性RNA组合物在线混合，以产生包含变性RNA的高盐组合物；随后(例如，立即)使变性RNA与寡聚-dT树脂结合。在其他方面，所述方法包括(a)使包含核糖核酸(RNA)的混合物脱盐，以产生盐浓度小于20mM的低盐RNA组合物；(b)将低盐RNA组合物加热至高于60℃的温度，以产生变性RNA；(c)将包含变性RNA的组合物与高盐缓冲液在线混合，以产生包含变性RNA和浓度为至少50mM的盐的组合物；(d)在低于40℃的温度下使(c)中产生的组合物的变性RNA与寡聚-dT树脂结合；以及(e)从寡聚-dT树脂洗脱RNA。
体外转录(IVT)反应混合物
在一些实施方案中，待使用本文所述的方法纯化或分离的混合物或RNA组合物通过体外转录(IVT)反应来产生。在一些实施方案中，IVT反应需要含有启动子、核苷三磷酸、包含二硫苏糖醇(DTT)和镁离子的缓冲液体系以及RNA聚合酶的线性DNA模板。转录反应中使用的确切条件取决于特定应用所需的RNA的量。IVT反应可以通过在转录缓冲液中温育DNA模板与RNA聚合酶和核苷三磷酸(包括GTP、ATP、CTP、和UTP(或核苷酸类似物))来进行。在一些实施方案中，用于IVT反应的RNA聚合酶如标题为“RNA聚合酶变体”的WO2019/036682中所述。在一些实施方案中，IVT反应是管灌补料分批IVT反应、连续补料分批IVT反应、或分批IVT反应。在一些实施方案中，具有5′帽结构的RNA转录物由该反应产生。
DNA模板可以包含编码所关注的多肽(例如，抗原性多肽)的多核苷酸。在一些实施方案中，DNA模板包含RNA聚合酶启动子(例如，T7 RNA聚合酶启动子)，所述RNA聚合酶启动子可操作地连接至编码所关注的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，DNA模板可以由RNA聚合酶转录。DNA模板还可以包含在编码所关注的多肽的多核苷酸的3′末端处编码多聚腺苷酸化(多聚-A)尾的核苷酸序列。
在一些实施方案中，RNA是IVT反应的产物。在一些实施方案中，RNA是信使RNA(mRNA)，所述信使RNA包含编码与多聚-A尾连接的所关注的多肽的核苷酸序列。
“多聚-A尾”是含有多个连续腺苷单磷酸的RNA区域，所述腺苷单磷酸位于编码所关注的多肽的区域的下游(例如，3′非翻译区的直接下游)。多聚-A尾可以含有10至300个腺苷单磷酸。例如，多聚-A尾可以含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、或300个腺苷单磷酸。在一些实施方案中，多聚-A尾含有50至250个腺苷单磷酸。在一些实施方案中，多聚-A尾可以含有少于10个腺苷单磷酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、或9个)。
在一些实施方案中，在IVT反应后，加尾RNA百分比(包含多聚-A尾的RNA转录物的百分比)大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于95％。如本文所用，加尾RNA百分比通常是指含有3’多聚A尾的转录RNA产物的相对丰度。在一些实施方案中，加尾RNA百分比(包含3′多聚-A尾的转录RNA产物的百分比)大于20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、或85％。在一些实施方案中，加尾RNA百分比大于大于90％、95％、97％、或99％。在一些实施方案中，加尾RNA百分比(包含3′多聚-A尾的转录RNA产物的百分比)为20-100％、20-90％、20-80％、20-70％、20-60％、20-50％、20-40％、20-30％、25-75％、30-50％、40-60％、50-70％、45-60％、55-70％、60-80％、60-100％、75-100％、50-95％、75-95％、80-100％、80-90％、90-95％、95-100％、90-99％、或95-99％。
在一些实施方案中，RNA是未经化学修饰的并且包含由腺苷、鸟苷、胞嘧啶和尿苷组成的标准核糖核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含标准核苷残基(例如A、G、C、或U)。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包括标准脱氧核糖核苷，诸如存在于DNA中的那些脱氧核糖核苷(例如dA、dG、dC、或dT)。
在一些实施方案中，RNA是经修饰的mRNA(mmRNA)，并且包括至少一个经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，术语“修饰”和“经修饰的”是指在核糖核苷或脱氧核糖核苷的核碱基位置、模式、百分比或数量的至少一者中关于腺苷(A)、鸟苷(G)、尿苷(U)、胸苷(T)、或胞苷(C)的修饰。RNA可以包含天然存在的、非天然存在的修饰，或者RNA可以包含天然存在的和非天然存在的修饰的组合。RNA可以包含任何有用的修饰，例如糖、核碱基或核苷间连键(例如，连接磷酸、磷酸二酯连键或磷酸二酯骨架)的修饰。
在一些实施方案中，RNA包含经修饰的核苷和/或核苷酸。“核苷”是指含有糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物与有机碱(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(在本文中也称为“核碱基”)组合的化合物。“核苷酸”是指包含磷酸基团的核苷。在一些实施方案中，RNA中的经修饰的核碱基选自由以下各项组成的组：假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)、N1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4′-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二-氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2′-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，RNA包含至少两个(例如，2、3、4或更多个)前述经修饰的核碱基的组合。
在一些实施方案中，RNA中的经修饰的核碱基选自由以下各项组成的组：1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-甲基-胞苷(m5C)、假尿苷(ψ)、α-硫代-鸟苷、和α-硫代腺苷。在一些实施方案中，RNA包含至少两个(例如，2、3、4或更多个)前述经修饰的核碱基的组合。
在一些实施方案中，RNA包含假尿苷(ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，RNA包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，RNA包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，RNA包含2-硫尿苷(s2U)。在一些实施方案中，RNA包含2-硫尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，RNA包含甲氧基-尿苷(mo5U)。在一些实施方案中，RNA包含5-甲氧基-尿苷(mo5U)和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，RNA包含21-O-甲基尿苷。在一些实施方案中，RNA包含2′-O-甲基尿苷和5-甲基-胞苷(m5C)。在一些实施方案中，RNA包含N6-甲基-腺苷(m6A)。在一些实施方案中，RNA包含N6-甲基-腺苷(m6A)和5-甲基-胞苷(m5C)。
RNA可以含有约1％至约100％的经修饰的核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即A、G、U或C中的任何一种或多种)或任何中间百分比(例如，从1％至20％、从1％至25％、从1％至50％、从1％至60％、从1％至70％、从1％至80％、从1％至90％、从1％至95％、从10％至20％、从10％至25％、从10％至50％、从10％至60％、从10％至70％、从10％至80％、从10％至90％、从10％至95％、从10％至100％、从20％至25％、从20％至50％、从20％至60％、从20％至70％、从20％至80％、从20％至90％、从20％至95％、从20％至100％、从50％至60％、从50％至70％、从50％至80％、从50％至90％、从50％至95％、从50％至100％、从70％至80％、从70％至90％、从70％至95％、从70％至100％、从80％至90％、从80％至95％、从80％至100％、从90％至95％、从90％至100％、以及从95％至100％)。应当理解，任何剩余百分比均由未经修饰的A、G、U或C的存在来解释。
在一些实施方案中，RNA包含帽类似物。RNA帽类似物通常会提高mRNA稳定性和翻译效率。传统的帽类似物包括GpppG、m7GpppG、和m2，2，7GpppG。在一些实施方案中，本公开的RNA帽类似物是二核苷酸帽、三核苷酸帽、或四核苷酸帽。在一些实施方案中，帽类似物是三核苷酸帽。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：GAA、GAC、GAG、GAU、GCA、GCC、GCG、GCU、GGA、GGC、GGG、GGU、GUA、GUC、GUG、和GUU。
在一些实施方案中，三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：m7GpppApA、m7GpppApC、m7GpppApG、m7GpppApU、m7GpppCpA、m7GpppCpC、m7GpppCpG、m7GpppCpU、m7GpppGpA、m7GpppGpC、m7GpppGpG、m7GpppGpU、m7GpppUpA、m7GpppUpC、m7GpppUpG、和m7GpppUpU。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：m7G3′OMepppApA、m7G3′OMepppApC、m7G3′OMepppApG、m7G3′OMepppApU、m7G3′OMepppCpA、m7G3′OMepppCpC、m7G3′OMepppCpG、m7G3′OMepppCpU、m7G3′ OMepppGpA、m7G3′OMePppGpC、m7G3′OMepppGpG、m7G3′OMepppGpU、m7G3′OMepppUpA、m7G3′OMePppUpC、m7G3′OMep即UpG、和m7G3′OMepppUpU。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：m7G3′OMepppA2′OMePA、m7G3′OMepppA2′OMepC、m7G3′OMePppA2′OMepG、m7G3′OMepppA2′OMePU、m7G3′ OMepppC2′oMepA、m7G3′OMepppC2′OMepC、m7G3′OMepppC2′OMepG、m7G3′OMepppC2′OMepU、m7G3′OMepppG2′ OMepA、m7G3′OMepppG2′OMePC、m7G3′OMepppG2′OMepG、m7G3′OMepppG2′OMePU、m7G3′OMepppU2′OMePA、m7G3′ OMepppU2′OMepC、m7G3′OMepppU2′OMePG、和m7G3′OMepppU2′OMePU。在一些实施方案中，三核苷酸帽包含选自以下序列的序列：m7GpppA2′OMePA、m7GpppA2′OMepC、m7GpppA2′OMepG、m7GpppA2′OMePU、m7GpppC2′OMePA、m7GpppC2′OMePC、m7GpppC2′OMePG、m7GpppC2′OMePU、m7GpppG2′OMePA、m7GpppG2′ OMePC、m7GpppG2′OMePG、m7GpppG2′OMepU、m7GpppU2′OMePA、m7GpppU2′OMePC、m7GpppU2′OMePG、和m7GpppU2′OMepU。
如本文所用，加帽RNA百分比通常是指在5′末端含有掺入的帽类似物的转录RNA产物的相对丰度。在一些实施方案中，帽类似物是RNA帽类似物。在一些实施方案中，RNA帽类似物是二核苷酸、三核苷酸、或四核苷酸。在一些实施方案中，加帽RNA百分比(包含5′帽类似物的转录RNA产物的百分比)大于20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、或85％。在一些实施方案中，加帽RNA百分比大于大于90％、95％、97％、或99％。在一些实施方案中，加帽RNA百分比在20-100％、20-90％、20-80％、20-70％、20-60％、20-50％、20-40％、20-30％、25-75％、30-50％、40-60％、50-70％、45-60％、55-70％、60-80％、60-100％、75-100％、50-95％、75-95％、80-100％、80-90％、90-95％、95-100％、90-99％、或95-99％之间。
RNA可以具有任何大小或长度。在一些实施方案中，RNA的长度为50-250、200-500、400-5000、400-4000、400-3000、400-2000、400-1000、500-5000、500-1500、750-2000、1000-1500、1250-2000、1500-2000、1750-2500、2000-3000、2500-3500、3000-4000、3500-4500、或4000-5000个核苷酸。
包含RNA的脱盐混合物
在一些实施方案中，使包含RNA的混合物脱盐，以产生低盐RNA组合物(例如，具有小于20mM的总盐浓度)。在一些实施方案中，使包含RNA的混合物(例如，通过IVT反应产生的混合物)在RNA的变性和/或与高盐缓冲液在线混合之前脱盐。
在一些实施方案中，低盐RNA组合物包含钠盐、钾盐、镁盐、锰盐、钙盐、硫酸盐、磷酸盐、和/或盐酸盐。在一些实施方案中，低盐RNA组合物包含氯化钠、磷酸钠、硫酸钠、氯化钾、磷酸钾、硫酸钾、氯化镁、磷酸镁、硫酸镁、氯化钙、磷酸钙、和/或硫酸钙。在一些实施方案中，低盐RNA组合物包含小于20mM、小于15mM、小于10mM、小于5mM、或小于1mM的总盐浓度。在一些实施方案中，低盐RNA组合物包含1-20mM、1-15mM、1-10mM、1-5mM、5-20mM、5-10mM、10-20mM、10-15mM、或15-20mM的盐浓度。在一些实施方案中，低盐RNA组合物产生小于2.5mS/em、小于2mS/cm、小于1.5mS/cm、小于1mS/em、或小于0.5mS/em的电导率。在一些实施方案中，低盐RNA组合物包含0.1-2.5mS/cm、0.1-2mS/em、0.5-2mS/cm、0.5-1mS/cm、1-2mS/cm、1-1.5mS/cm、或1-1.25mS/cm的电导率。
在一些实施方案中，使包含RNA的混合物脱盐通过以下步骤来完成：使RNA结合至疏水相互作用色谱(HIC)树脂，以及从HIC树脂洗脱RNA，以产生低盐RNA组合物。在一些实施方案中，HIC树脂在使RNA结合至树脂之前用缓冲液来平衡。在一些实施方案中，HIC树脂用包含100mM NaCl、10mM Tris、1mM EDTApH 7.4的缓冲液来平衡。在一些实施方案中，RNA使用水或缓冲液从HIC树脂洗脱。
此处描述的方法可以包括任何HIC树脂。在一些实施方案中，HIC树脂包含丁基、叔丁基、甲基、和/或乙基官能团。在一些实施方案中，HIC树脂是HiTrap丁基HP树脂、Capto苯基树脂、苯基SepharoseTM 6树脂、苯基SepharoseTM高性能树脂、辛基SepharoseTM高性能树脂、FractogelTM EMD丙基树脂、FractogelTM EMD苯基树脂、Macro-PrepTM甲基树脂、HiScreen丁基FF、HiScreen辛基FF、或Tosoh己基。在一些实施方案中，HIC树脂是具有2000埃的孔的(聚)苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)R150珠粒树脂。
在一些实施方案中，使包含RNA的混合物脱盐通过以下步骤来完成：用水稀释混合物(例如，10×水稀释)、将混合物切向流过滤(TFF)到水或环境寡聚-dT中(即，在天然、非变性RNA条件下)。
变性RNA
在一些实施方案中，使RNA组合物(例如，低盐RNA组合物)变性。在一些实施方案中，使低盐RNA组合物变性，然后与高盐缓冲液在线混合(例如，立即混合)，随后使变性RNA与寡聚-dT树脂结合。
RNA可以使用任何方法变性。在一些实施方案中，RNA通过将低盐RNA组合物加热至60℃至90℃、60℃至80℃、60℃至70℃、65℃至85℃、65℃至75℃、70℃至90℃、70℃至80℃、65℃至70℃、70℃至75℃、或75℃至95℃来变性。在一些实施方案中，将低盐RNA组合物加热少于2分钟、少于90秒、少于1分钟、少于50秒、少于40秒、少于30秒、少于20秒、或少于10秒。在一些实施方案中，将低盐RNA组合物加热5-90秒、5-60秒、5-30秒、5-15秒、10-60秒、10-30秒、20-60秒、20-40秒、30-90秒、30-60秒、40-90秒、40-60秒、60-120秒、60-90秒、或90-120秒。在一些实施方案中，高盐RNA组合物在存在变性剂分子(例如，使RNA不稳定或变性的化学小分子)的情况下加热。变性剂分子可以包括二甲基亚砜(例如，浓度为0.05-1％v/v、0.1-0.5％v/v、0.05-0.5％v/v或0.25-0.75％v/v)、胍(例如，浓度为50-250mM、100-500mM、250-1000mM、1-8M、2-6M、3-5M、或5-8M)、或尿素(例如，浓度为50-250mM、100-500mM、250-1000mM、1-8M、2-6M、3-5M、或5-8M)。
在一些实施方案中，在变性过程(例如，将低盐RNA组合物加热至60℃至90℃、60℃至80℃、60℃至70℃、65℃至85℃、65℃至75℃、70℃至90℃、70℃至80℃、65℃至70℃、70℃至75℃、或75℃至95℃)过程中RNA组合物中的变性RNA的相对量的变化由增色性曲线(例如，光谱解链曲线)来确定。在一些实施方案中，变性RNA的相对量的变化通过测量组合物中的总RNA的二级结构的变化(例如，通过确定紫外吸收的变化)来确定。在一些实施方案中，在变性过程(例如，将低盐RNA组合物加热至60℃至90℃、60℃至80℃、60℃至70℃、65℃至85℃、65℃至75℃、70℃至90℃、70℃至80℃、65℃至70℃、70℃至75℃、或75℃至95℃)之前和之后变性RNA的相对量的变化通过监测组合物中的总RNA的二级结构的变化(例如，通过确定紫外吸收的变化)来确定。
在一些实施方案中，变性RNA组合物中的总RNA的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、或85％包含变性RNA。在一些实施方案中，变性RNA组合物中的总RNA的至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)包含变性RNA。在一些实施方案中，变性RNA组合物中的总RNA的50-70％、45-60％、55-70％、60-80％、60-100％、75-100％、50-95％、75-95％、80-100％、80-90％、90-95％、95-100％、90-99％、或95-99％包含变性RNA。在一些实施方案中，变性RNA组合物中的变性RNA的相对量由增色性曲线(例如，光谱解链曲线)来确定。可以使用分光光度计来测量在加热过程中由于结构丧失而表现出消光系数增加的核酸(诸如RNA)的性质(例如，在RNA的变性过程中，例如，通过加热进行)。在一些实施方案中，测量在205nm、220nm、260nm、或200-300nm处RNA的消光系数。在一些实施方案中，变性RNA组合物中的变性RNA的相对量使用如S.J.Schroeder和D.H.Turner，“Optical melting measurements of nucleic acid thermodynamics”，Methods Enzymol.468(2009)371-387；或Gruenwedel，D.W.，“Nucleic Acids：Propertiesand Determination”，Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition，2003，第4147-4152页描述的方法来确定。
在一些实施方案中，将变性RNA组合物储存于断流槽(即，可以容纳变性RNA组合物的储存容器)中，然后与高盐缓冲液混合和/或上样到寡聚-dT树脂上。在一些实施方案中，断流槽能够储存变性RNA组合物，以使得RNA保持变性长达3天。在一些实施方案中，变性RNA组合物在断流槽中维持低盐浓度(例如，1-20mM、1-15mM、1-10mM、1-5mM、5-20mM、5-10mM、10-20mM、10-15mM、或15-20mM盐)。在一些实施方案中，断流槽能够储存变性RNA组合物，以使得RNA保持变性1-6小时、2-12小时、5-15小时、12-24小时、12-36小时、1-2天、1-3天、或2-3天。在一些实施方案中，断流槽保持在15℃至30℃、4℃至30℃、4℃至25℃、4℃至20℃、4℃至15℃、4℃至10℃、4℃至8℃、10℃至30℃、10℃至25℃、10℃至20℃、10℃至15℃、或15℃至25℃下。
在线混合
在一些实施方案中，在线混合是指将溶液的第一连续流与溶液的第二连续流混合。在一些实施方案中，第一和第二连续流由独立的泵(例如，独立的蠕动泵)控制。在一些实施方案中，在线混合依赖于流量控制条件，例如，其中流量参数(例如，流速、温度)由包括至少一个泵***的流量调节装置控制的工艺流量条件。在一些实施方案中，第一连续流是高盐缓冲液(例如，包含至少50mM盐)，第二连续流是包含脱盐(例如，低盐)和/或变性RNA的组合物。
在线混合通常在即将使包含变性RNA的组合物与寡聚-dT树脂结合之前进行。在一些实施方案中，在线混合进行少于2分钟、少于90秒、少于1分钟、少于50秒、少于40秒、少于30秒、少于20秒、或少于10秒。在一些实施方案中，在线混合进行5-90秒、5-60秒、5-30秒、5-15秒、10-60秒、10-30秒、20-60秒、20-40秒、30-90秒、30-60秒、40-90秒、40-60秒、60-120秒、60-90秒、或90-120秒。在一些实施方案中，在线混合在使包含变性RNA的组合物与寡聚-dT树脂结合之前进行5-90秒、5-60秒、5-30秒、5-15秒、10-60秒、10-30秒、20-60秒、20-40秒、30-90秒、30-60秒、40-90秒、40-60秒、60-120秒、60-90秒、或90-120秒。在一些实施方案中，在线混合在4℃至30℃、4℃至25℃、4℃至20℃、4℃至15℃、4℃至10℃、4℃至8℃、10℃至30℃、10℃至25℃、10℃至20℃、10℃至15℃、或15℃至25℃的温度下进行。
在一些实施方案中，高盐缓冲液(例如，可以与RNA组合物在线混合的高盐缓冲液)具有至少50mM、至少60mM、至少70mM、至少80mM、至少90mM、至少100mM4、至少125mM、至少150mM、至少200mM、至少250mM、至少300mM、至少350mM、至少400mM、至少500mM、至少600mM、至少700mM、至少800mM、至少900mM、或至少1000mM的盐浓度。在一些实施方案中，高盐缓冲液具有50-500mM、50-250mM、50-100mM、50-75mM、60-150mM、75-500mM、75-200mM、100-500mM、100-250mM、150-350mM、200-400mM、250-500mM、300-400mM、350-450mM、400-500mM、400-600mM、500-700mM、500-750mM、700-1000mM、750-900mM、或850-1000mM的盐浓度。在一些实施方案中，高盐缓冲液具有1-2M、2-3M、3-4M、或4-5M的盐浓度。在一些实施方案中，高盐缓冲液具有至少5mS/cm、至少6mS/cm、至少7mS/cm、至少8mS/cm、至少9mS/cm、至少10mS/cm、至少12mS/cm、或至少15mS/cm的电导率。在一些实施方案中，高盐缓冲液具有5-10mS/cm、5-15mS/cm、5-7mS/cm、6-9mS/cm、8-10mS/cm、9-12mS/cm、或10-15mS/cm的电导率。
在一些实施方案中，将包含变性RNA的组合物与高盐缓冲液在线混合产生包含变性RNA和浓度为至少50mM的盐的组合物。在一些实施方案中，将包含变性RNA的组合物与高盐缓冲液在线混合产生包含变性RNA和浓度为50-500mM、50-250mM、50-100mM、50-75mM、60-150mM、75-500mM、75-200mM、100-500mM、100-250mM、150-350mM、200-400mM、250-500mM、300-400mM、350-450mM、400-500mM、400-600mM、500-700mM、500-750mM、700-1000mM、750-900mM、或850-1000mM的盐的组合物。在一些实施方案中，将包含变性RNA的组合物与高盐缓冲液在线混合产生包含变性RNA和电导率小于2mS/cm的盐的组合物。在一些实施方案中，将包含变性RNA的组合物与高盐缓冲液在线混合产生包含变性RNA和电导率为2-5mS/cm、2-7mS/cm、5-10mS/cm、5-15mS/cm、5-7mS/cm、6-9mS/cm、8-10mS/cm、9-12mS/cm、或10-15mS/cm的盐的组合物。
在一些实施方案中，缓冲液(例如，低盐或高盐缓冲液)包含NaCl、KCl、LiCl、NaH2PO4、Na2HPO4、或Na3PO4。在一些实施方案中，缓冲液(例如，低盐或高盐缓冲液)包含任何来源的钠、钾、镁、磷酸根、氯化物或任何其他来源的盐离子。在一些实施方案中，缓冲液(例如，低盐或高盐缓冲液)可以另外包含缓冲剂，以保持一致的pH。在一些实施方案中，缓冲液(例如，低盐或高盐缓冲液)具有中性pH。在一些实施方案中，缓冲液(例如，低盐或高盐缓冲液)具有约6、约6.5、约7、约7.4、约8、或约6-8的pH。本文使用的缓冲剂的实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、琥珀酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸、谷氨酸、马来酸盐、二甲胂酸盐、2-(N-吗啉代)-乙烷磺酸(MES)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)、哌嗪-N，N′-2-乙烷磺酸(PIPES)、2-(N-吗啉代)-2-羟基-丙烷磺酸(MOPSO)、N，N-双-(羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸(BES)、3-(N-吗啉代)-丙烷磺酸(MOPS)、N-2-羟乙基-哌嗪-N-2-乙烷磺酸(HEPES)、3-(N-三-(羟甲基)甲基氨基)-2-羟基丙烷磺酸(TAPSO)、3-(N，N-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙烷磺酸(DIPSO)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙烷磺酸)(HEPPSO)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙烷磺酸(EPPS)、N-[三(羟甲基)-甲基]甘氨酸(Tricine)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、[(2-羟基-1，1-双(羟甲基)乙基)氨基]-1-丙烷磺酸(TAPS)、N-(1，1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙烷磺酸(AMPSO)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、和双[2-羟乙基]亚氨基三-[羟甲基]甲烷(Bis-Tris)。本文使用的溶液的其他缓冲液组合物、缓冲液浓度和另外的组分对于本领域的技术人员将是显而易见的。
在一些实施方案中，在线混合包括将包含变性RNA的组合物在线冷却至4℃至30℃、4℃至25℃、4℃至20℃、4℃至15℃、4℃至10℃、4℃至8℃、10℃至30℃、10℃至25℃、10℃至20℃、10℃至15℃、或15℃至25℃的温度。在一些实施方案中，在线混合包括将包含变性RNA的组合物在线冷却至低于60℃、55℃、50℃、45℃、40℃、35℃、30℃、25℃、20℃、15℃、10℃、或5℃的温度。在一些实施方案中，在线冷却与包含变性RNA和低盐缓冲液的组合物与高盐缓冲液的在线混合同时进行。在一些实施方案中，在在线冷却期间，包含变性RNA的组合物保持小于20mM、小于15mM、小于10mM、小于5mM、或小于1mM的总盐浓度。在一些实施方案中，在在线冷却期间，包含变性RNA的组合物保持1-20mM、1-15mM、1-10mM、1-5mM、5-20mM、5-10mM、10-20mM、10-15mM、或15-20mM的总盐浓度。在一些实施方案中，在线冷却与包含变性RNA和低盐缓冲液的组合物与高盐缓冲液的在线混合同时进行。在一些实施方案中，在在线冷却期间，包含变性RNA的组合物保持小于2.5mS/cm、小于2mS/cm、小于1.5mS/cm、小于1mS/cm、或小于0.5mS/cm。在一些实施方案中，在线冷却与包含变性RNA和低盐缓冲液的组合物与高盐缓冲液的在线混合同时进行。在一些实施方案中，在在线冷却期间，包含变性RNA的组合物保持0.1-2.5mS/cm、0.1-2mS/cm、0.5-2mS/cm、0.5-1mS/cm、1-2mS/cm、1-1.5mS/cm、或1-1.25mS/cm。
寡聚-dT树脂
本文的方法涉及将包含变性RNA的组合物与寡聚-dT树脂结合(即，接触)。在一些实施方案中，本文的方法包括在低盐变性RNA组合物与高盐缓冲液在线混合之后将包含变性RNA的组合物与寡聚-dT树脂结合。
本文所述的方法可以使用任何寡聚-dT树脂。在一些实施方案中，寡聚-dT树脂是具有用多聚dT衍生化的2000埃的孔的(聚)苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)珠粒树脂。在一些实施方案中，多聚dT包含5-200、10-50、10-100、50-200、100-150、或125-200个胸苷和/或尿嘧啶。在一些实施方案中，多聚dT具有的长度为20个胸苷。在一些实施方案中，多聚dT直接连接至珠粒树脂。在一些实施方案中，多聚dT通过接头连接至珠粒树脂。
在一些实施方案中，寡聚-dT树脂在使RNA结合至树脂之前用缓冲液来平衡。在一些实施方案中，寡聚-dT树脂用包含100mM NaCl、10mM Tris、和1mM EDTA pH 7.4的缓冲液来平衡。在一些实施方案中，在RNA与树脂结合之后，用缓冲液来洗涤寡聚-dT树脂。在一些实施方案中，洗涤步骤包括缓冲液，所述缓冲液包含100mM NaCl、10mM Tris、和1mM EDTApH7.4。
在一些实施方案中，RNA与寡聚-dT树脂的结合在低于40℃的温度下进行。在一些实施方案中，RNA与寡聚-dT树脂的结合在4℃至30℃、4℃至25℃、4℃至20℃、4℃至15℃、4℃至10℃、4℃至8℃、10℃至30℃、10℃至25℃、10℃至20℃、10℃至15℃、或15℃至25℃的温度下进行。
在一些实施方案中，包含变性RNA的组合物与寡聚-dT树脂结合或接触少于20分钟、少于18分钟、少于15分钟、少于12分钟、少于10分钟、少于9分钟、少于8分钟、少于7分钟、少于6分钟、少于5分钟、少于4分钟、少于3分钟、少于2分钟、或少于1分钟的总停留时间。在一些实施方案中，包含变性RNA的组合物与寡聚-dT树脂结合或接触1-2、1-5、2-5、2-10、5-20、5-10、5-15、8-15、10-15、12-20、或15-20分钟的总停留时间。
在一些实施方案中，所述方法包括从寡聚-dT树脂洗脱RNA。在一些实施方案中，RNA使用水或缓冲液(例如，包含10mM Tris、1mM EDTA pH 8.0的缓冲液)从HIC树脂洗脱。
在一些实施方案中，从寡聚-dT树脂洗脱的RNA包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、或85％的多聚-A加尾RNA。在一些实施方案中，从寡聚-dT树脂洗脱的RNA包含约20-100％、20-90％、20-80％、20-70％、20-60％、20-50％、20-40％、20-30％、25-75％、30-50％、40-60％、50-70％、45-60％、55-70％、60-80％、60-100％、75-100％、50-95％、75-95％、80-100％、80-90％、90-95％、95-100％、90-99％、或95-99％的多聚-A加尾mRNA。在一些实施方案中，从寡聚-dT树脂洗脱的RNA包含至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的多聚-A加尾mRNA。
设备
本公开的一些方面提供了一种用于使用变性dT色谱来纯化RNA的设备。在一些实施方案中，所述设备包括填充有寡聚-dT树脂的色谱柱，所述色谱柱具有入口和出口。在一些实施方案中，所述设备是包括至少一个泵***的流量调节装置，其中所述泵***允许在流量控制条件(例如，工艺流量条件)下连续共混混合两种或更多种溶液，以控制待混合的两种或更多种溶液的流量参数，诸如流速和温度。在一些实施方案中，所述设备在色谱柱的入口上游包括用于递送脱盐RNA的第一连续流，其中脱盐RNA的流由第一泵控制，并且其中第一流包裹在包括预热器然后是冷却器的变性室内；用于递送高盐缓冲液的第二流，其中高盐缓冲液的流量由第二泵控制；以及这样的室，其中两个连续流组合在一起，以提供脱盐RNA和高盐缓冲液的在线混合。
在一些实施方案中，所述设备包括寡聚-dT树脂，所述寡聚-dT树脂包括具有用多聚dT衍生化的2000埃的孔的(聚)苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)珠粒树脂。
在一些实施方案中，色谱柱(例如，填充有寡聚-dT树脂的色谱柱)具有1-10mL、1-5mL、5-25mL、10-100mL、25-150mL、50-100mL、75-150mL、100-200mL、100-500mL、250-1000mL、500-1500mL或更多的柱体积。在一些实施方案中，色谱柱(例如，填充有寡聚-dT树脂的色谱柱)具有约1mL、约5mL、约10mL、约25mL、约50mL、约100mL、约250mL、约500mL、约750mL、约1000mL、约1500mL、约2000mL或更多的柱体积。
在一些实施方案中，预热器将脱盐RNA加热至高于60℃的温度，以产生变性RNA组合物。在一些实施方案中，预热器保持60℃至90℃、60℃至80℃、60℃至70℃、65℃至85℃、65℃至75℃、70℃至90℃、70℃至80℃、65℃至70℃、70℃至75℃、或75℃至95℃。
在一些实施方案中，冷却器将变性RNA组合物冷却至低于30℃的温度。在一些实施方案中，冷却器保持15℃至30℃、4℃至30℃、4℃至25℃、4℃至20℃、4℃至15℃、4℃至10℃、4℃至8℃、10℃至30℃、10℃至25℃、10℃至20℃、10℃至15℃、或15℃至25℃。
在一些实施方案中，所述设备还包括断流槽(即，可以容纳变性RNA组合物的储存容器)。在一些实施方案中，断流槽能够储存变性RNA组合物，以使得RNA保持变性长达3天。在一些实施方案中，变性RNA组合物在断流槽中维持低盐浓度(例如，1-20mM、1-15mM、1-10mM、1-5mM、5-20mM、5-10mM、10-20mM、10-15mM、或15-20mM盐)。在一些实施方案中，断流槽能够储存变性RNA组合物，以使得RNA保持变性1-6小时、2-12小时、5-15小时、12-24小时、12-36小时、1-2天、1-3天、或2-3天。在一些实施方案中，断流槽保持在15℃至30℃、4℃至30℃、4℃至25℃、4℃至20℃、4℃至15℃、4℃至10℃、4℃至8℃、10℃至30℃、10℃至25℃、10℃至20℃、10℃至15℃、或15℃至25℃下。
在一些实施方案中，所述设备还包括至少一个紫外检测(UV)模块。在一些实施方案中，UV检测模块被定位为在变性过程期间(例如，在旨在使RNA变性的加热步骤期间)使用UV光来检测RNA。在一些实施方案中，UV检测模块被定位为在变性过程之后(例如，在旨在使RNA变性的加热步骤之后)使用UV光来检测RNA。在一些实施方案中，所述设备包括两个UV模块。在一些实施方案中，所述设备包括被定位为在变性过程之前(例如，在旨在使RNA变性的加热步骤之前)使用UV光来检测RNA的第一UV模块和被定位为在变性过程之后(例如，在旨在使RNA变性的加热步骤之后)使用UV光来检测RNA的第二UV模块。
在一些实施方案中，所述设备用于处理使用体外转录反应产生的脱盐RNA。在一些实施方案中，高盐缓冲液具有至少50mM的盐浓度。在一些实施方案中，高盐缓冲液具有50mM至500mM NaCl的盐浓度。
实施例
实施例1.变性dT(ddT)色谱
如图1所示，变性提高了寡聚-dT色谱对含多聚-A尾的mRNA(例如，IVT反应产生的全长RNA产物)的选择性。RNA组合物的变性可以通过在60℃至90℃的温度下加热RNA溶液10-60秒来实现。这种变性过程会破坏RNA二级和高级结构，从而破坏mRNA之间的任何相互作用和任何非共价杂质。变性还导致非共价结合的IVT相关杂质的解离。然后可以将变性RNA选择性地结合至寡聚-dT树脂，例如(聚)苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)珠粒树脂上，该树脂具有用聚dT衍生化的2000埃的孔，并且可以洗掉杂质并将其与变性RNA分离。
通过检查盐浓度对解链转变温度(Tm)中点的影响来研究mRNA的变性(图2)。使用两种不同长度的mRNA构建体来获得UV解链曲线：850个核苷酸(nt)和4000个核苷酸。将构建体在水、100mM三甲胺乙酸盐pH 7.0和100mM乙酸钠pH 7.0中稀释至0.035mg/mL。温度以1℃/分钟的速度从4℃上升到90℃。在加热过程中，使用Cary-300分光光度计测量260nm处的增色性，即核酸在加热过程中由于结构损失而表现出消光系数增加的性质。解链转变的中点由所得的增色性曲线来估算，并且发现随着介质离子强度的增加而增加。因此，变性的有效性随着盐浓度的降低而增加。解链转变点不受mRNA长度的影响。
然后进行纯化使用IVT反应制备的测试mRNA(长度为2525nt)的实验，以展示与替代性纯化方法相比，如本文所述的变性寡聚-dT方法提供了最佳的RNA纯化方法。用于变性寡聚-dT实验的设备的示意图如图3所示。
这些不同方法的结果如图4所示并且在下文有所描述。在任何纯化方法之前，具有69.1％的总RNA的IVT反应是多聚-A加尾mRNA。当所得的IVT溶液通过HIC树脂脱盐时，未观察到加尾纯度的变化。环境寡聚-dT树脂(即，其中mRNA未脱盐和变性，但是在环境温度下在高盐缓冲液中上样到寡聚-dT色谱柱上)在加尾纯度方面提供了适度的改进，达到85.3％的多聚-A加尾mRNA.然而，使用HIC树脂进行纯化(使混合物脱盐)，然后使寡聚-dT连续变性(包括将变性RNA与高盐缓冲液在线混合，同时上样到寡聚-dT色谱柱上)显著提高了加尾纯度，特别是与环境寡聚-dT相比，高达94.9％的多聚-A加尾mRNA。出乎意料的是，HIC脱盐和热变性mRNA在断流槽中的储存(在2℃-8℃下储存3天)保留了mRNA的变性特性，因为随后在寡聚-dT上样过程中与盐缓冲液的在线混合提供了95.5％的多聚-A加尾mRNA。然而，与通过在线混合进行的盐调整相比，在断流槽中储存变性mRNA期间的盐调整导致加尾纯度降低至91.6％，这表明杂质在储存过程中在高盐缓冲液中缓慢与全长mRNA结合。
因此，据发现，在上样到寡聚-dT树脂之前立即将变性RNA与高盐缓冲液在线混合可防止全长产物与杂质的再杂交，并且产生高纯度(～95％包含多聚-A尾的总RNA)。
当寡聚-dT树脂在连续(即，变性，然后与高盐缓冲液在线混合，然后立即使变性RNA与寡聚-dT树脂结合)变性寡聚-dT过程中过载或容量不足时，观察到类似的结果(数据未示出)。
进行环境寡聚-dT和变性寡聚-dT的进一步比较。使用分批补料IVT产生长度为2369nt的测试mRNA。纯度通过加尾mRNA百分比来测量。在IVT之后，总RNA包含64％的加尾mRNA。然后使用环境寡聚-dT来纯化总RNA，产生73％的加尾mRNA，然后分成两个不同的样品。使用环境dT对第一样品进行二次纯化，以提供77％的加尾mRNA，与第一环境dT纯化步骤相比略有改进。使用变性寡聚-dT代替第二轮环境dT来纯化第二样品，所得的产物有97％加尾。表1中提供了该实验的另外数据。
表1.低纯度RNA(2369nt)的纯化
环境寡聚-dT 变性寡聚-dT
上样％加尾 72.6 72.6
洗脱％回收，总mRNA 69.6 60.6
洗脱％加尾 76.6 96.7
实施例2.使用HIC和变性寡聚-dT进行纯化
在体外转录(IVT)之后，可以使用疏水相互作用色谱(HIC)对RNA原料进行脱盐。HIC树脂还能够除去残留的蛋白质和残留的未消化DNA。
将产生2525nt mRNA的IVT反应与100U/mL DNA酶一起温育，进行EDTA处理，然后稀释(4X)，之后上样到HIC色谱柱上。HIC树脂是
Figure BDA0003512590990000251
孔模式的POROSTM R150(AppliedBiosystems)。珠粒的开孔结构允许对大型mRNA构建体(例如超过2000nt的那些mRNA构建体)具有更高的结合能力。在IVT之后水中的RNA的上样浓度为1-2mg/mL，RNA上样挑战目标为每mL树脂5mg mRNA。停留时间/流速为3-5分钟(150cm/hr)。表2提供了HIC参数的汇总。
表2.HIC色谱参数
HIC 缓冲液组成 #CV
平衡 100mM NaCl、10mM Tris、1mM EDTApH 7.4 3CV
上样 IVT+DNA酶+50mM EDTA溶液 可变
追赶 100mM NaCl、10mM Tris、1mM EDTApH 7.4 3CV
洗涤 60mM NaCl、6mM Tris、0.6mM EDTApH 7.4 3CV
洗脱 水 3CV
剥离 0.1M NaOH 3CV
中和 50mM Tris pH 7.4 3CV
如图6所示，HIC允许未反应的NTP、酶、消化的DNA和IVT缓冲盐流过，而总mRNA则可以被分离。不可逆结合的RNA、蛋白质和DNA保留在色谱柱中。然后用水进行从HIC树脂分离的RNA的洗脱，而未消化的DNA优先保留在色谱柱上。
使用1956nt mRNA构建体从粗IVT原料获得的R150树脂的动态结合载量(DBC)为约5mg/mL，并且HIC纯化提供了出乎意料、但适度的纯度提高。
在HIC脱盐步骤之后，通过以下步骤使洗脱的RNA在线变性(参见图5)：将洗脱的RNA加热至60℃一分钟，冷却至15-30℃，将变性RNA与包含100mM NaCl、10mM Tris、1mMEDTA pH 7.4的缓冲液在线混合，以及将变性RNA加载到寡聚-dT色谱柱上。停留时间/流速为2分钟，上样量为1mg/mL。表3提供了HIC参数的汇总。
表3.寡聚-dT色谱参数
Figure BDA0003512590990000261
实施例3.使用HIC和变性寡聚-dT进行纯化
在本实施例中，使用IVT产生长度为1956个核苷酸(nt)的测试mRNA，然后使用HIC进行处理，然后使dT变性(ddT)。如表4所示，与环境寡聚-dT然后进行反相(RP)HPLC色谱相比，HIC和变性寡聚-dT过程的组合产生相似或更好的纯度。两个过程的性能都优于单独的dT色谱(中心色谱柱)。
表4.分析组：纯化方法
Figure BDA0003512590990000262
Figure BDA0003512590990000271
使用不同大小的mRNA构建体重复实验：2992nt、2497nt、658nt、1105nt、784nt、和913nt。如下表5和表6所示，单个dT色谱纯化步骤无法实现较长构建体(长度>2000nt的那些构建体)的所需纯度。与较长的构建体相比，使用HIC然后是变性寡聚-dT产生96-97％的加尾mRNA。
表5.在下游纯化后的加尾mRNA百分比
Figure BDA0003512590990000272
表6.分析组：下游纯化方法
Figure BDA0003512590990000273
Figure BDA0003512590990000281
Figure BDA0003512590990000291
使用六个不同长度的其他构建体来重复包括HIC然后是变性寡聚-dT(ddT)的纯化过程：2872nt、2852nt、692nt、2399nt、1772nt、和1007nt。结果表明，HIC和ddT的组合产生高纯度，特别是对于较长的构建体，在ddT之后具有95-99％的多聚-A加尾mRNA(参见表7和表8)。
表7.下游纯化：加尾mRNA百分比
Figure BDA0003512590990000292
Figure BDA0003512590990000301
表8.分析组：下游纯化方法
Figure BDA0003512590990000302
Figure BDA0003512590990000311
又一个实验表明，HIC和变性寡聚-dT的组合可以扩大到大体积(1升色谱柱使用由IVT反应产生的2545nt mRNA)。如表9所示，纯化过程提供高百分比的多聚-A加尾mRNA纯度(如通过Tris-RP和MP方法所评估)。
表9.HIC/ddT纯化扩大
Figure BDA0003512590990000321
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请就每篇所引用的主题而言均以引用的方式并入，在一些情况下，可以涵盖文档的全部内容。
在说明书和权利要求中使用的不定冠词“一个/种(a、an)”，除非明确表明相反，应理解为意指“至少一个/种”。
还应当理解，除非明确表明相反，在本文要求保护的包括一个以上步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不一定限于引用所述方法的步骤或动作的顺序。
在权利要求以及上述说明书中，所有转折连接词，诸如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“保持”、“由......构成”等等应理解为开放式的，即意味着包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述，只有转折连接词“由......组成”和“基本上由......组成”应分别为封闭式或半封闭式转折连接词。
在数值之前的术语“约”和“基本上”意指所列举数值的±10％。
在提供数值范围的情况下，所述范围的上限和下限之间的每个值在本文中被具体考虑和描述。

Claims (56)

1.一种方法，其包括：
(a)使包含核糖核酸(RNA)的混合物脱盐，以产生盐浓度小于20mM的低盐RNA组合物；
(b)将所述低盐RNA组合物加热至高于60℃的温度，以产生变性RNA；
(c)将包含变性RNA的组合物与高盐缓冲液在线混合，以产生包含变性RNA和浓度为至少50mM的盐的组合物；
(d)在低于40℃的温度下使(c)中产生的所述组合物的所述变性RNA与寡聚-dT树脂结合；以及
(e)从所述寡聚-dT树脂洗脱RNA。
2.一种方法，其包括：
(a)使包含核糖核酸(RNA)的混合物脱盐，以产生电导率小于2mS/cm的低盐RNA组合物；
(b)将所述低盐RNA组合物加热至高于60℃的温度，以产生变性RNA；
(c)将包含变性RNA的组合物与高盐缓冲液在线混合，以产生包含变性RNA和电导率为至少5mS/cm的组合物；
(d)在低于40℃的温度下使(c)中产生的所述组合物的所述变性RNA与寡聚-dT树脂结合；以及
(e)从所述寡聚-dT树脂洗脱RNA。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中(a)的所述混合物是体外转录反应。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中(a)和/或(c)的所述盐包括NaCl。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述高盐缓冲液具有100mM至1000mM的盐浓度和/或5mS/cm至85mS/cm的电导率。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述脱盐包括使所述RNA结合至疏水相互作用色谱(HIC)树脂，以及从所述HIC树脂洗脱所述RNA，以产生所述低盐RNA组合物。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述低盐RNA组合物具有1至20mM的盐浓度和/或0.1至2mS/cm的电导率。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述HIC树脂是具有2000埃的孔的(聚)苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)R150珠粒树脂。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中(b)的所述加热进行少于1分钟。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中(b)的所述加热进行至少10秒。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中(b)的所述加热进行10至60、10至30、20至40、或30至60秒。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中(b)的所述加热在60℃至90℃的温度下进行。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中在存在变性剂分子的情况下加热所述低盐RNA组合物。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述变性剂分子是二甲基亚砜、胍、或尿素。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，还包括，在(b)和(c)之间，将所述包含变性RNA的组合物在线冷却至低于60℃的温度。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，还包括，在(b)和(c)之间，
将所述包含变性RNA的组合物在线冷却至低于40℃的温度。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，还包括，在(b)和(c)之间，将所述包含变性RNA的组合物储存于断流槽中。
18.如权利要求17所述的方法，其中将所述包含变性RNA的组合物在2至8℃下储存于所述断流槽中1至5天。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中(c)的所述在线混合进行少于1分钟。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中(c)中产生的所述包含变性RNA的组合物具有50至500mM的盐浓度和/或5至85mS/cm的电导率。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中(c)的所述组合物中的总RNA的至少90％包含变性RNA。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中(d)的所述结合在4℃至25℃的温度下进行。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中(d)的所述结合进行少于20分钟。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述寡聚-dT树脂是具有用多聚dT衍生化的2000埃的孔的(聚)苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)珠粒树脂。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中从所述寡聚-dT树脂洗脱的所述RNA包含至少90％的多聚-A加尾mRNA。
26.如权利要求25所述的方法，其中从所述寡聚-dT树脂洗脱的所述RNA包含至少95％的多聚-A加尾mRNA。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述在线混合与将所述混合物结合在所述寡聚-dT树脂上同步进行。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中在(b)之前和之后使用紫外检测来监测所述RNA的二级结构。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法，其中使用紫外检测来监测(b)期间所述RNA的变性。
30.一种方法，其包括：
将高盐缓冲液与包含变性核糖核酸(RNA)的低盐变性RNA组合物在线混合，以产生包含变性RNA的高盐组合物；以及
将所述变性RNA与寡聚-dT树脂结合。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述在线混合在所述变性RNA与所述寡聚-dT树脂结合之前进行少于1分钟。
32.如权利要求30或31所述的方法，其中所述高盐缓冲液具有至少100mM的盐浓度和/或至少10mS/cm的电导率。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述高盐缓冲液具有100mM至1000mM NaCl的盐浓度。
34.如权利要求30-33中任一项所述的方法，其中所述低盐变性RNA组合物具有小于20mM的盐浓度和/或小于2mS/cm。
35.如权利要求30-34中任一项所述的方法，其中所述低盐变性RNA组合物具有1至20mM的盐浓度和/或0.1至2mS/cm的电导率。
36.如权利要求30-35中任一项所述的方法，其中所述高盐组合物具有50至500mM的盐浓度和/或5至85mS/cm的电导率。
37.如权利要求30-36中任一项所述的方法，其中所述高盐组合物中的所述变性RNA构成所述高盐组合物中的总RNA的至少90％。
38.如权利要求30-37中任一项所述的方法，其中所述结合进行少于20分钟。
39.如权利要求30-38中任一项所述的方法，其中所述结合在低于40℃的温度下进行。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述结合在4℃至25℃的温度下进行。
41.如权利要求30-40中任一项所述的方法，其中所述寡聚-dT树脂是具有用多聚dT衍生化的2000埃的孔的(聚)苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)珠粒树脂。
42.如权利要求30-41中任一项所述的方法，还包括在低盐缓冲液中从所述寡聚-dT树脂洗脱RNA。
43.如权利要求42所述的方法，其中从所述寡聚-dT树脂洗脱的所述RNA包含至少90％的多聚-A加尾mRNA。
44.如权利要求43所述的方法，其中从所述寡聚-dT树脂洗脱的所述RNA包含至少95％的多聚-A加尾mRNA。
45.如权利要求30-44中任一项所述的方法，还包括：
在与高盐缓冲液在线混合之前，将包含RNA和盐浓度低于20mM的组合物加热至高于60℃的温度，以产生变性RNA组合物。
46.如权利要求30-44中任一项所述的方法，还包括：
在与高盐缓冲液在线混合之前，将包含RNA和具有小于2mS/cm的电导率的组合物加热至高于60℃的温度，以产生变性RNA组合物。
47.如权利要求45或46所述的方法，其中所述加热进行少于1分钟。
48.如权利要求45-47中任一项所述的方法，其中所述加热进行至少10秒。
49.如权利要求45-48中任一项所述的方法，其中所述加热进行10至60、10至30、20至40、或30至60秒。
50.如权利要求45-49中任一项所述的方法，其中所述加热在60℃至90℃的温度下进行。
51.如权利要求30-50中任一项所述的方法，还包括：
在与高盐缓冲液在线混合之前，使包含RNA的混合物脱盐，以产生具有低于20mM的盐浓度的RNA组合物；以及
将具有低于20mM的盐浓度的所述RNA组合物加热至高于60℃的温度，以产生所述变性RNA组合物。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述混合物是体外转录反应。
53.如权利要求51或52所述的方法，其中所述脱盐包括使所述RNA结合至疏水相互作用色谱(HIC)树脂，以及从所述HIC树脂洗脱所述RNA，以产生RNA组合物。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述HIC树脂是具有2000埃的孔的(聚)苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)R150珠粒树脂。
55.如权利要求30-54中任一项所述的方法，其中在所述组合物的加热期间使用紫外检测来监测所述RNA的二级结构。
56.如权利要求30-55中任一项所述的方法，其中在所述组合物的加热期间使用紫外检测来监测所述RNA的变性。
CN202080059135.9A 2019-08-14 2020-08-13 用于纯化体外转录的下游产物的方法 Pending CN114269918A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962886840P 2019-08-14 2019-08-14
US62/886,840 2019-08-14
PCT/US2020/046069 WO2021030533A1 (en) 2019-08-14 2020-08-13 Processes for purifying downstream products of in vitro transcription

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114269918A true CN114269918A (zh) 2022-04-01

Family

ID=74571243

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080059135.9A Pending CN114269918A (zh) 2019-08-14 2020-08-13 用于纯化体外转录的下游产物的方法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20220348900A1 (zh)
EP (1) EP4013865A4 (zh)
JP (1) JP2022544416A (zh)
CN (1) CN114269918A (zh)
AU (1) AU2020329226A1 (zh)
BR (1) BR112022002548A2 (zh)
CA (1) CA3149498A1 (zh)
WO (1) WO2021030533A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117603958A (zh) * 2023-11-23 2024-02-27 江苏耀海生物制药有限公司 一种纯化体外转录mRNA的方法及应用

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
US11564893B2 (en) 2015-08-17 2023-01-31 Modernatx, Inc. Methods for preparing particles and related compositions
EP3364950A4 (en) 2015-10-22 2019-10-23 ModernaTX, Inc. VACCINES AGAINST TROPICAL DISEASES
JP6921833B2 (ja) 2015-10-22 2021-08-18 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド ヒトサイトメガロウイルスワクチン
MA47016A (fr) 2015-10-22 2018-08-29 Modernatx Inc Vaccins contre les virus respiratoires
TW201729838A (zh) 2015-10-22 2017-09-01 現代公司 用於水痘帶狀疱疹病毒 (vzv)之核酸疫苗
JP7080172B2 (ja) 2015-12-10 2022-06-03 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療薬の送達のための組成物及び方法
CN109937253B (zh) 2016-09-14 2023-06-30 摩登纳特斯有限公司 高纯度rna组合物及其制备方法
CA3041307A1 (en) 2016-10-21 2018-04-26 Giuseppe Ciaramella Human cytomegalovirus vaccine
US10925958B2 (en) 2016-11-11 2021-02-23 Modernatx, Inc. Influenza vaccine
US11384352B2 (en) 2016-12-13 2022-07-12 Modernatx, Inc. RNA affinity purification
US11752206B2 (en) 2017-03-15 2023-09-12 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
US11045540B2 (en) 2017-03-15 2021-06-29 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (VZV) vaccine
US11576961B2 (en) 2017-03-15 2023-02-14 Modernatx, Inc. Broad spectrum influenza virus vaccine
EP3595713A4 (en) 2017-03-15 2021-01-13 ModernaTX, Inc. RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS VACCINE
MA47790A (fr) 2017-03-17 2021-05-05 Modernatx Inc Vaccins à base d'arn contre des maladies zoonotiques
WO2018187590A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Modernatx, Inc. Reduction or elimination of immune responses to non-intravenous, e.g., subcutaneously administered therapeutic proteins
MA49421A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Modernatx Inc Formulations d'arn
WO2019036683A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Modernatx, Inc. ANALYTICAL METHODS BY HPLC
MA49922A (fr) 2017-08-18 2021-06-02 Modernatx Inc Procédés pour analyse par clhp
EP3668971B8 (en) 2017-08-18 2024-05-29 ModernaTX, Inc. Rna polymerase variants
WO2019046809A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Modernatx, Inc. METHODS OF MANUFACTURING LIPID NANOPARTICLES
EP3681514A4 (en) 2017-09-14 2021-07-14 ModernaTX, Inc. RNA VACZINE AGAINST ZIKA VIRUS
EP3746090A4 (en) 2018-01-29 2021-11-17 ModernaTX, Inc. RSV RNA Vaccines
CN113795579A (zh) 2019-02-20 2021-12-14 摩登纳特斯有限公司 用于共转录加帽的rna聚合酶变体
US11851694B1 (en) 2019-02-20 2023-12-26 Modernatx, Inc. High fidelity in vitro transcription
EP3901261A1 (en) 2020-04-22 2021-10-27 BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH Coronavirus vaccine
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
WO2022162027A2 (en) 2021-01-27 2022-08-04 Curevac Ag Method of reducing the immunostimulatory properties of in vitro transcribed rna
WO2022266389A1 (en) * 2021-06-17 2022-12-22 Modernatx, Inc. Alternative rna purification strategies
WO2024002985A1 (en) 2022-06-26 2024-01-04 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2024026005A1 (en) * 2022-07-28 2024-02-01 Modernatx, Inc. Methods of rna purification

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU655766A (en) * 1967-06-06 1968-12-12 William Wake David Bulk handling bin
EP0649908A1 (en) * 1988-07-08 1995-04-26 Cetus Oncology Corporation Uses of gap gene sequences
US5763573A (en) * 1988-08-10 1998-06-09 Chiron Corporation GTPase activating protein fragments
ATE181332T1 (de) * 1989-08-21 1999-07-15 Chiron Corp Vom gtpase-aktivierenden protein (gap) abgeleitete peptide sowie deren diagnostische und therapeutische verwendung
ATE169028T1 (de) * 1991-10-16 1998-08-15 Chiron Corp Glykoprotein komplexe und glykoproteine
US11377470B2 (en) * 2013-03-15 2022-07-05 Modernatx, Inc. Ribonucleic acid purification

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117603958A (zh) * 2023-11-23 2024-02-27 江苏耀海生物制药有限公司 一种纯化体外转录mRNA的方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CA3149498A1 (en) 2021-02-18
WO2021030533A1 (en) 2021-02-18
AU2020329226A1 (en) 2022-02-24
EP4013865A4 (en) 2023-08-23
US20220348900A1 (en) 2022-11-03
BR112022002548A2 (pt) 2022-06-14
JP2022544416A (ja) 2022-10-18
EP4013865A1 (en) 2022-06-22
WO2021030533A8 (en) 2021-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114269918A (zh) 用于纯化体外转录的下游产物的方法
EP3668979A1 (en) Methods for hplc analysis
US11866696B2 (en) Analytical HPLC methods
TW202321446A (zh) 多管柱層析ｍＲＮＡ純化
DK2971102T3 (en) QUANTITATIVE DETERMINATION FOR CAPPING EFFECTIVENESS OF MESSENGER RNA
EP2066792B1 (en) Nucleic acid purification method using anion exchange
WO2022266389A1 (en) Alternative rna purification strategies
EP3653723B1 (en) Methods for nucleic acid capture
Freitas et al. Plasmid purification by hydrophobic interaction chromatography using sodium citrate in the mobile phase
JP2022500025A (ja) グアニンリッチオリゴヌクレオチドのための精製方法
CA3221100A1 (en) Assay for quantitative assessment of mrna capping efficiency
US20230151351A1 (en) A method of single-stranded rna purification
EP2250182B1 (en) Isolation of dna, rna and protein from a single sample
WO2024026005A1 (en) Methods of rna purification
Feng et al. Rapid and high recovery isolation of mRNA from in vitro transcription system by ammonium sulphate precipitation at room temperature
JPS604174A (ja) 核酸塩基およびヌクレオシドとヌクレオチドの分離方法
CN117603958A (zh) 一种纯化体外转录mRNA的方法及应用
KR100622606B1 (ko) 단일공정에 의한 플라스미드 ｄｎａ 정제용 조성물과 그를이용하여 플라스미드 ｄｎａ를 정제하는 방법
US20230142167A1 (en) A method of single strand rna purification employing an anion exchanger
EP4388090A1 (en) Screening codon-optimized nucleotide sequences
WO2024025815A1 (en) Use of imac to improve rna purity
Ohmichi et al. A novel approach of cell-free peptide synthesis and SNPs detection using nano-circular single-stranded DNA

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination