CN114269896A - 酵母中用于增加醇和赖氨酸生产的cdc42效应因子破坏 - Google Patents

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Abstract

描述的是组合物和方法，所述组合物和方法涉及具有遗传突变的酵母，所述遗传突变导致Cdc42效应因子蛋白的量减少，从而使醇和赖氨酸生产增加。这样的酵母非常适用于商业醇生产以提高产量并提高价值这样的酵母非常适用于商业醇生产以提高产量并提高含氨基酸的发酵联产物的价值。

Description

酵母中用于增加醇和赖氨酸生产的CDC42效应因子破坏
技术领域
本发明的菌株和方法涉及具有遗传突变的酵母，所述遗传突变导致Cdc42效应因子蛋白的量减少，从而使醇和赖氨酸生产增加。这样的酵母非常适用于在商业醇生产中使用以提高产量并提高含氨基酸的发酵产物和联产物的价值。
背景技术
许多国家从可发酵的底物(例如玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)制造燃料醇。根据可再生燃料协会(美国华盛顿特区)，仅仅在美国，2015年的燃料乙醇生产就接近150亿加仑。
除了生产约2.8加仑乙醇外，在干磨乙醇工厂加工的一蒲式耳(56磅)玉米还生产约17.5磅的动物饲料。动物饲料通常呈具溶解物的干酒糟(distillers dried grainswith solute，DDGS)的形式，并且代表耗尽淀粉的玉米部分加上用于发酵的酵母的生物质。按单位重量，DDGS对动物比未加工玉米更有营养，因为它更富含蛋白质和脂肪。除了DDGS，干磨乙醇工厂还能够生产用于动物饲料应用的其他富含蛋白质的玉米联产物。
赖氨酸是大多数动物的必需氨基酸，如果不能在DDGS中足量供应赖氨酸以满足饲料转化预期，则必须补充赖氨酸。合成的赖氨酸昂贵，并且可意味着动物饲料的一个重要成本。存在对改善或维持从含淀粉原料生产醇同时提高动物饲料联产物的营养价值的方法的需要。
发明内容
描述的是组合物和方法，所述组合物和方法涉及具有遗传突变的酵母细胞，所述遗传突变导致Cdc42效应因子蛋白的量减少，从而使醇和赖氨酸生产增加。这样的酵母非常适用于商业醇生产以提高产量并提高含氨基酸的发酵产物和联产物的价值。所述组合物和方法的方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。
1.在一个方面，提供了衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞，所述经修饰的细胞包含遗传改变，所述遗传改变导致所述经修饰的细胞生产与所述亲本细胞相比减少量的功能性Cdc42效应因子多肽，其中与所述亲本细胞相比，在等同发酵条件下，所述经修饰的细胞表现出增加的醇生产和/或增加的赖氨酸生产。
2.在如段落1所述的经修饰的细胞的一些实施例中，与所述亲本细胞相比，所述遗传改变减少了或阻止了功能性Gic1和/或Gic2多肽的生产。
3.在如段落1所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞生产了减少量的Gic1和/或Gic2多肽，或未生产可测量的量的Gic1和/或Gic2多肽。
4.在如段落1-3中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述遗传改变包括存在于所述亲本细胞中的YHR061c基因或其编码Gic1多肽的同源物的破坏和/或YDR309c基因或其编码Gic2多肽的同源物的破坏。
5.在如段落4所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述破坏是由所述YHR061c基因或其同源物和/或所述YDR309c基因或其同源物的分别全部或部分缺失导致。
6.在如段落4所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述破坏是由基因组DNA的分别包含所述YHR061c基因或其同源物和/或所述YDR309c基因或其同源物的一部分的缺失导致。
7.在如段落4所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述破坏是由所述YHR061c基因或其同源物和/或所述YDR309c基因或其同源物的分别诱变导致。
8.在如段落4-7中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述YHR061c基因或其同源物和/或所述YDR309c基因或其同源物的分别破坏与在相应遗传基因座处引入目的基因组合进行。
9.在如段落1-8中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞进一步包含磷酸转酮酶途径的一个或多个基因。
10.在如段落9所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述磷酸转酮酶途径的基因选自由以下组成的组：磷酸转酮酶、磷酸转乙酰酶、和乙酰化乙酰基脱氢酶。
11.在如段落1-10中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。
12.在一些实施例中，如段落1-11中任一项所述的经修饰的细胞进一步包含甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。
13.在一些实施例中，如段落1-12中任一项所述的经修饰的细胞进一步包含用于制备乙醇的替代途径(alternative pathway)。
14.在如段落1-13中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞属于酵母属(Saccharomyces)物种。
15.在另一方面，提供了用于生产经修饰的酵母细胞的方法，所述方法包括：向亲本酵母细胞中引入遗传改变，与所述亲本细胞相比，所述遗传改变减少了或阻止了功能性Cdc42效应因子多肽的产生，从而产生如下经修饰的细胞，与所述亲本细胞相比，在等同发酵下，所述经修饰的细胞在发酵期间生产增加量的醇和/或赖氨酸。
16.在如段落15所述的方法的一些实施例中，与所述亲本细胞相比，所述遗传改变减少了或阻止了功能性Gic1和/或Gic2多肽的生产。
17.在如段落15所述的方法的一些实施例中，所述细胞生产了减少量的Gic1和/或Gic2多肽，或未生产可测量的量的Gic1和/或Gic2多肽。
18.在如段落15-17中任一项所述的方法的一些实施例中，所述遗传改变包括存在于所述亲本细胞中的YHR061c基因或其编码Gic1多肽的同源物的破坏和/或YDR309c基因或其编码Gic2多肽的同源物的破坏。
19.在如段落18中任一项所述的方法的一些实施例中，所述破坏是由所述YHR061c基因或其同源物和/或YDR309c基因或其同源物的分别全部或部分缺失导致。
20.在如段落18中任一项所述的方法的一些实施例中，所述破坏是由基因组DNA的分别包含所述YHR061c基因或其同源物和/或所述YDR309c基因或其同源物的一部分的缺失导致。
21.在如段落18中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述破坏是由所述YHR061c基因或其同源物和/或所述YDR309c基因或其同源物的分别诱变导致。
22.在如段落18-21中任一项所述的方法的一些实施例中，所述YHR061c基因或其同源物和/或所述YDR309c基因或其同源物的分别破坏与在相应遗传基因座处引入目的基因组合进行。
23.在如段落15-22中任一项所述的方法的一些实施例中，所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因，甘油途径、乙酰辅酶A途径中的改变和/或用于制备乙醇的替代途径。
24.在如段落15-23中任一项所述的方法的一些实施例中，所述细胞属于酵母属物种。
25.在如段落15中任一项所述的方法的一些实施例中，所述细胞是如段落1-14中任一项所述的经修饰的细胞。
26.在另一方面，提供了用于增加发酵后产物中存在的赖氨酸的量的方法，所述方法包括：
(i)用α-淀粉酶水解含淀粉原料以生产淀粉液化物；(ii)用葡糖淀粉酶糖化所述淀粉液化物以生产葡萄糖；(iii)用衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞发酵所述葡萄糖，所述经修饰的酵母细胞包含遗传改变，所述遗传改变导致生产与所述亲本细胞相比减少量的功能性Cdc42效应因子多肽；以及(iv)回收相比从使用所述亲本酵母、在其他方面相同的工艺中回收的发酵后副产物富集了赖氨酸的发酵后副产物。
27.在如段落26所述的方法的一些实施例中，所述发酵后产物选自由以下组成的组：发酵液、全釜馏物、稀釜馏物、干酒糟、具溶解物的干酒糟、浓缩酒糟可溶物或其他含蛋白质联产物。
28.在如段落26或27所述的方法的一些实施例中，以同时或重叠的方式组合一个或多个步骤(i)-(iv)。
29.在另一方面，提供了用于增加发酵产物中存在的赖氨酸的量的方法，所述方法包括：(i)用衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞发酵葡萄糖或另一种糖，所述经修饰的酵母细胞包含遗传改变，所述遗传改变导致生产与所述亲本细胞相比减少量的功能性Cdc42效应因子多肽；以及(ii)回收相比从使用所述亲本酵母、在其他方面相同的工艺中回收的发酵产物富集了赖氨酸的发酵产物。
30.在如段落26-29中任一项所述的方法的一些实施例中，所述细胞是如段落1-14中任一项所述的经修饰的细胞。
31.在另一方面，提供了经修饰的酵母细胞，其通过如段落15-25中任一项所述的方法产生。
32.在另一方面，提供了发酵产物，其通过如段落26-30中任一项所述的方法产生。
33.在另一方面，提供了组合物或方法，所述组合物或方法具有如段落1-32所述的特征或说明书中所提及的特征中任一个。
根据包括附图的说明书，本发明的经修饰的细胞和方法的这些和其他方面以及实施例将是清楚的。
具体实施方式
I.概述
描述的是方法，所述方法涉及具有基因突变的酵母，所述基因突变导致Cdc42效应因子(或靶)蛋白的量减少，从而使醇和赖氨酸生产增加。这样的酵母非常适用于在商业醇生产中使用以提高产量并提高含氨基酸的发酵产物和联产物的价值。
II.定义
在详细地描述本发明的菌株和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合这些术语在相关领域中所用的普通含义。
如本文所使用的，“醇”是指其中羟基官能团(-OH)与饱和碳原子结合的有机化合物。
如本文所使用的，短语“聚合度”(DP)是指给定的糖中脱水吡喃葡萄糖单元的数目(n)。DP1的实例是单糖葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖麦芽糖和蔗糖。DP1、DP12、DP3、DP4、DP4+等的意思在碳水化合物加工科学中是熟知的。
如本文所使用的，“酵母细胞”、“酵母菌株”，或简称“酵母”是指来自子囊菌门和担子菌门的生物。示例性酵母是来自酵母目(Saccharomycetales)的芽殖酵母。酵母的特定实例是酵母属物种，包括但不限于酿酒酵母(S.cerevisiae)。酵母包括用于生产燃料醇的生物以及用于生产可饮用醇的生物，包括用于制造独特味道的啤酒、葡萄酒和其他发酵饮料的特种和专有酵母菌株。
如本文所使用的，短语“变体酵母细胞”、“经修饰的酵母细胞”或类似短语(参见上文)是指包括本文所述的遗传修饰和特征的酵母。变体/经修饰的酵母不包括天然存在的酵母。
如本文所使用的，短语“基本上无活性”或相似短语意指指定活性在混合物中不可检测或以不会干扰混合物的预期目的的量存在。
如本文所使用的，术语“多肽”和“蛋白质”(以及它们各自的复数形式)可互换地使用，是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文使用氨基酸残基的常规一字母或三字母代码，并且所有序列均从N-末端到C-末端方向进行呈现。聚合物可以是线性的或支化的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖天然地修饰的或通过干预(例如，通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合)而修饰的氨基酸聚合物。所述定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
如本文所使用的，功能上和/或结构上相似的蛋白质被认为是“相关的蛋白质”。此类蛋白质可衍生自不同属和/或物种的生物、或甚至不同纲的生物(例如，细菌和真菌)。相关的蛋白质还涵盖通过一级序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的、或者通过免疫交叉反应性确定的同源物。
如本文所使用的，术语“同源蛋白”是指与参考蛋白具有相似活性和/或结构的蛋白质。这并不旨在意味着同源物必定是进化上相关的。因此，所述术语旨在涵盖从不同生物获得的(即，在结构和功能方面)相同、相似、或相应的一种或多种酶。在一些实施例中，希望鉴定与参考蛋白具有类似的四级、三级和/或一级结构的同源物。在一些实施例中，同源蛋白作为参考蛋白诱导相似的一种或多种免疫应答。在一些实施例中，同源蛋白经过工程化以产生具有一种或多种所希望的活性的酶。
序列之间的同源性程度可以使用本领域已知的任何适合方法确定(参见，例如，Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444；威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)(遗传学计算机组公司(Genetics ComputerGroup)，威斯康星州麦迪逊(Madison,WI))中的程序，如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；以及Devereux等人(1984)Nucleic Acids Res.[核酸研究]12:387-95)。
例如，PILEUP是确定序列同源性水平的有用程序。PILEUP使用渐进的、两两比对创建了来自一组相关序列的多重序列比对。它还可以绘制显示用于创建所述比对的聚类关系的一个树。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法的简化(Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evol.[分子进化杂志]35:351-60)。所述方法类似于Higgins和Sharp描述的方法((1989)CABIOS[计算机在生物学中的应用]5:151-53)。有用的PILEUP参数包括为3.00的默认空位权重，为0.10的默认空位长度权重，以及加权的末端空位。有用算法的另一个实例是BLAST算法，由以下描述：Altschul等人((1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10)以及Karlin等人((1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-87)。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见，例如，Altschul等人(1996)Meth.Enzymol.[酶学方法]266:460-80)。参数“W”、“T”、以及“X”确定了所述比对的灵敏度与速度。所述BLAST程序使用字长(W)为11、BLOSUM62得分矩阵(参见，例如，Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M'5、N'-4、以及两条链的比较作为默认值。
如本文所使用的，在至少两个核酸或多肽的上下文中，短语“基本上相似”和“基本上相同”典型地意指多核苷酸或多肽包含与参考(即，野生型)序列相比具有至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、或甚至至少约99％同一性、或更高同一性的序列。使用具有默认参数的CLUSTAL W算法计算序列同一性百分比。参见Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数是：
空位开放罚分： 10.0
空位延伸罚分： 0.05
蛋白质权重矩阵： BLOSUM系列
DNA权重矩阵： IUB
延迟发散序列％： 40
空位分隔距离： 8
DNA转换权重： 0.50
列表亲水残基： GPSNDQEKR
使用负性矩阵： 关
切换特殊残基罚分： 开
切换亲水罚分： 开
切换结束空位分隔罚分 关。
两种多肽基本上相同的另一个指示是第一多肽与第二多肽具有免疫交叉反应性。典型地，差别在于保守氨基酸取代的多肽具有免疫交叉反应性。因此，多肽与第二多肽基本上相同，例如，其中两个肽的区别仅在于保守取代。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下(例如，在中等至高严格的范围内)彼此杂交。
如本文所使用的，术语“基因”与术语“等位基因”同义，是指编码和指导蛋白质或RNA表达的核酸。丝状真菌的营养体形式通常是单倍体，因此指定基因的单拷贝(即单个等位基因)足以赋予指定表型。
如本文所使用的，术语“野生型”和“天然的”可互换使用，并是指天然发现的基因、蛋白质或菌株。
如本文所使用的，术语“目的蛋白”是指希望在经修饰的酵母中表达的多肽。这样的蛋白质可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白、选择性标记等，并且能以高水平表达。目的蛋白由相对于亲本菌株的经修饰的内源基因或异源基因(即，目的基因)编码。目的蛋白可以在细胞内表达或作为分泌的蛋白表达。
如本文所使用的，“基因的缺失”是指所述基因从宿主细胞的基因组中除去。当基因包括与基因编码序列不紧邻的控制元件(例如，增强子元件)时，基因的缺失是指编码序列、以及任选地相邻增强子元件(例如，包括但不限于启动子和/或终止子序列)的缺失，但未要求非相邻控制元件的缺失。
如本文所使用的，“基因的破坏”泛指任何实质上阻止细胞在宿主细胞中产生功能性基因产物(例如，蛋白质)的遗传的或化学的操作(即，突变)。示例性破坏方法包括基因的任何部分的完全或部分(包括多肽编码序列、启动子、增强子或另一调节元件)缺失、或其诱变，其中诱变涵盖取代、***、缺失、倒位、及其组合和变化，任何这些突变基本上阻止功能基因产物的产生。也可以使用RNAi、反义、或任何其他消除基因表达的方法破坏基因。可以通过非相邻控制元件的缺失或遗传操作来破坏基因。
如本文所使用的，术语“遗传操作”和“遗传改变”可互换地使用，并且是指核酸序列的改变/变化。改变可包括但不限于核酸序列中至少一种核酸的取代、缺失、***或化学修饰。
如本文所使用的，“主要遗传决定子”是指基因或其遗传操作，所述基因或其遗传操作对于在不存在其他基因或其遗传操作的情况下赋予特定表型是必要和充分的。然而，特定基因对于赋予特定表型是必要和充分的，这并不排除通过进一步的遗传操作可以实现对表型产生额外的作用的可能性。
如本文所使用的，“功能性多肽/蛋白”是具有活性(例如酶活性、结合活性、表面活性特性等)的蛋白质，并且其未被诱变、截短、或以其他方式修饰以消除或减少此活性。如所指出的，功能性多肽可以是热稳定的或不耐热的。
如本文所使用的，“功能性基因”是能够被细胞组分用于产生活性基因产物(典型地是蛋白质)的基因。功能性基因是破坏的基因的对立体，破坏的基因被修饰使得它们不能被细胞组分用于产生活性基因产物，或者具有降低的被细胞组分用于产生活性基因产物的能力。
如本文所使用的，如果已对酵母细胞进行遗传或化学改变以阻止产生呈现出野生型蛋白质的活性特征的功能性蛋白/多肽，则对所述酵母细胞已经进行了“修饰以阻止产生指定蛋白”。这样的修饰包括但不限于编码蛋白质(如本文所述)的基因的缺失或破坏、使得编码的多肽缺乏前述活性的基因修饰、影响翻译后加工或稳定性的基因修饰、及其组合。
如本文所使用的，“发酵液”是用酵母发酵后但蒸馏前的乙醇生产设施的产物。
如本文所使用的，“全釜馏物”是蒸馏后乙醇生产设施的副产物。
如本文所使用的，“稀釜馏物”是分离固体材料后全釜馏物的液体部分。
如本文所使用的，“酒糟(DG)”是全釜馏物的固体/浆料组分。
如本文所使用的，“干酒糟(DDG)”是已干燥的DG。
如本文所使用的，“具溶解物的干酒糟(DDGS)”是与浓缩的稀釜馏物一起进行干燥以增加营养价值的DG。
如本文所使用的，“湿的”蒸馏副产物含有按重量计至少20％的水。
如本文所使用的，“干的”蒸馏副产物含有按重量计少于20％的水。
如本文所使用的，“需氧发酵”是指在氧存在下的生长。
如本文所使用的，“厌氧发酵”是指在不存在氧的情况下的生长。
如本文所使用的，除非上下文另外明确指明，否则单数冠词“一个/种(a/an)”以及“所述”涵盖复数个指示物。本文引用的所有参考文献均通过援引以其全文特此并入。除非另外说明，以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：
℃ 摄氏度
DG 酒糟
DDG 干酒糟
DDGS 具溶解物的干酒糟
DNA 脱氧核糖核酸
DP 聚合度
DS 干固体
EtOH 乙醇
g或gm 克
g/L 克/升
GA 葡糖淀粉酶
GAU/g DS 葡糖淀粉酶单元/克干固体
HPLC 高效液相色谱
hr或h 小时
kDa 千道尔顿
M 摩尔
mg 毫克
mL或ml 毫升
ml/min 毫升/分钟
mM 毫摩尔
N 当量浓度
Na 不适用
PCR 聚合酶链式反应
ppm 百万分率
SAPU/g DS 蛋白酶单元/克干固体
SSCU/g DS 真菌α-淀粉酶单元/克干固体
Δ 与缺失有关
μg 微克
μL和μl 微升
μM和μm 微摩尔
III.表达降低水平的Cdc42目标多肽的经修饰的酵母细胞
Cdc42是Rho家族的GTP酶，所述Rho家族的GTP酶在许多细胞类型(包括芽殖酵母)中作为细胞骨架重塑的主要调节物。活化的Cdc42集中于细胞皮层的一个区域，它在所述区域募集效应因子蛋白以极化方式重塑细胞骨架。至少在酵母细胞中，极化涉及正反馈回路，其中效应因子(包括被称为p21活化激酶(PAK)的那些)募集鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)，使得GTP-Cdc42浓度进一步局部提高。额外的效应因子蛋白包括Gic1和Gic2，其涉及肌动蛋白和隔膜蛋白(septin)细胞骨架的调节。
申请人已发现，与其他方面相同的酵母相比，具有降低Gic1或Gic2生产的遗传改变的酵母在发酵中表现出增加的乙醇生产。此外，申请人发现，与其他方面相同的酵母相比，具有这样的遗传改变的酵母在发酵中表现出增加的赖氨酸生产。
功能性Gic多肽的量的减少可能由酿酒酵母中编码Gic1多肽的基因(例如，YDR309c)和/或编码Gic2多肽的基因(例如，2YHR061c)的破坏导致。因为编码Gic多肽的基因的破坏是赋予经修饰的细胞改变的醇和赖氨酸生产表型的主要遗传决定子，因此，在一些实施例中，经修饰的细胞仅需要包含这样的破坏的基因，而所有其他基因可以保持完整。在其他实施例中，与衍生经修饰的细胞的亲本细胞相比，所述经修饰的细胞可任选地包括额外的遗传改变。虽然这样的额外的遗传改变不是赋予所述表型所必需的，但它们可赋予经修饰的细胞其他的优点。
可以使用任何合适的、基本上阻止功能性Gic多肽的表达的方法进行编码Gic多肽的基因的破坏。如本领域技术人员已知的示例性破坏方法包括但不限于：完全或部分缺失编码Gic多肽的基因，包括完全或部分缺失例如Gic编码序列、启动子、终止子、增强子或另一调节元件；以及完全或部分缺失染色体的包含编码Gic多肽的基因的任何部分的一部分。破坏编码Gic多肽的基因的具体方法包括在这样的基因的任何部分(例如，编码Gic多肽编码序列的基因、启动子、终止子、增强子或另一个调节元件)中进行核苷酸取代或***。
编码Gic多肽的基因中的突变可降低启动子的效率，降低增强子的效率，干扰mRNA的剪接或编辑，干扰mRNA的翻译，将终止密码子引入Gic编码序列以阻止全长Gic蛋白的翻译，改变Gic蛋白的编码序列以产生活性更低或无活性的蛋白质或减少Gic与其他蛋白质或DNA的相互作用，改变Gic蛋白的编码序列以产生更不稳定的蛋白质或靶向蛋白质进行破坏，导致Gic蛋白错误折叠或被错误修饰(例如，通过糖基化)，或干扰Gic蛋白的细胞运输。在一些实施例中，这些和其他遗传操作用于减少或阻止功能性Gic蛋白的表达，或减少或阻止Gic1或Gic2的正常功能。
优选地，通过使用序列特异性分子生物学技术的遗传操作进行编码Gic多肽的基因的破坏，而不使用化学诱变，化学诱变通常不靶向特定核酸序列。然而，不排除化学诱变作为制备经修饰的酵母细胞的方法。
本文所述的示例性Gic1多肽由Genbank登录号NP_011928和如下SEQ ID NO:2所示：
Figure BDA0003514777480000141
本文所述的示例性Gic2多肽由Genbank登录号NP_010595和如下SEQ ID NO:2所示：
Figure BDA0003514777480000142
预期本发明的组合物和方法可应用于其他结构相似的Gic多肽，以及其他相关的蛋白质、同源物和功能相似的多肽。
在本发明的组合物和方法的一些实施例中，以生产水平改变了的Gic蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有特定程度的整体氨基酸序列同一性，例如与SEQ ID NO:1或2具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％同一性。
在本发明的组合物和方法的一些实施例中，被破坏的编码Gic多肽的基因编码Gic蛋白，所述Gic蛋白与SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列具有特定程度的整体氨基酸序列同一性，例如与SEQ ID NO:1或2具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％同一性。
在本发明的组合物和方法的一些实施例中，被破坏的编码Gic多肽的基因是YDR309c(SEQ ID NO:3，同下)，其编码Gic2。在一些实施例中，被破坏的编码Gic多肽的基因是YHR061c(SEQ ID NO:4，同下)，其编码Gic1。在一些实施例中，被破坏的编码Gic多肽的基因具有与SEQ ID NO:3或4的核酸序列具有特定程度的整体氨基酸序列同一性，例如与SEQID NO:3或4具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％同一性。
本文提供的氨基酸和核酸序列信息容易地允许技术人员鉴定任何酵母中的Gic蛋白和编码Gic蛋白的核酸序列，并在编码Gic多肽的基因中产生适当的破坏以影响Gic蛋白的生产。
在一些实施例中，经修饰的细胞中功能性Gic1和/或Gic2多肽的量的减少是与在相同条件下生长的亲本细胞中的功能性Gic多肽的量相比，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多的减少。在一些实施例中，经修饰的细胞中功能性Gic1和/或Gic2蛋白的表达的减少是与在相同条件下生长的亲本细胞中的功能性Gic多肽的量相比，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多的减少。
在一些实施例中，经修饰的细胞生产的醇的增加是与在相同条件下生长的亲本细胞生产的醇的量相比，至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％或更多的增加。
在一些实施例中，经修饰的细胞生产的赖氨酸的增加是与在相同条件下生长的亲本细胞生产的赖氨酸的量相比，至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、或甚至至少2倍或更多的增加。在特定的实施例中，增加是在高-DS条件下。
在一些实施例中，被修饰的亲本细胞已经包括目的基因，例如编码可选择标记、碳水化合物加工酶或其他多肽的基因。在一些实施例中，随后将引入的基因引入经修饰的细胞中。
在一些实施例中，经修饰的细胞包括增加赖氨酸生产的其他基因或其他修饰。
IV.减少的Cdc42效应因子与影响醇生产的其他突变的组合
在一些实施例中，除表达减少量的Cdc42效应因子多肽之外，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包括影响醇生产的额外的修饰。
在特定的实施例中，经修饰的酵母细胞包含由引入异源磷酸转酮酶(PKL)基因、异源磷酸转乙酰酶(PTA)基因和异源乙酰化乙酰基脱氢酶(AADH)基因产生的人工或替代乙醇生产途径，如WO 2015148272(Miasnikov等人)中所述，将这些酶引入使通道碳通量远离甘油途径并且朝向乙酰辅酶A的合成，所述乙酰辅酶A然后转化为乙醇。
所述经修饰的细胞可以进一步包括导致天然甘油生物合成途径减弱的突变，已知所述突变可增加醇生产。用于减弱酵母中甘油生物合成途径的方法是已知的，并包括例如通过破坏基因GPD1、GPD2、GPP1和/或GPP2中的一个或多个来降低或消除内源NAD依赖性甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)或磷酸甘油磷酸酶(GPP)活性。参见例如美国专利号9,175,270(Elke等人)、8,795,998(Pronk等人)和8,956,851(Argyros等人)。
经修饰的酵母的特征可以进一步在于增加的乙酰辅酶A合酶(也称为乙酰辅酶A连接酶)活性(EC 6.2.1.1)以清除(即捕获)通过化学或酶水解乙酰-磷酸产生(或出于任何其他原因存在于酵母的培养基中)的乙酸盐并将其转化为Ac-CoA。这避免了乙酸盐对酵母细胞生长的不良影响，并且可以进一步有助于醇产量的提高。增加乙酰辅酶A合酶活性可以通过将异源乙酰辅酶A合酶基因引入细胞、增加内源乙酰辅酶A合酶基因的表达等来实现。用于引入细胞中的特别有用的乙酰辅酶A合酶可以从康斯力鬃毛甲烷菌(Methanosaetaconcilii)(UniProt/TrEMBL登录号：WP_013718460)获得。这些酶的同源物，包括与上述来自康斯力鬃毛甲烷菌的乙酰辅酶A合酶具有至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、以及甚至至少99％氨基酸序列同一性的酶，也可用于本发明的组合物和方法中。
在一些实施例中，经修饰的细胞可进一步包括编码具有NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的异源基因和/或编码丙酮酸甲酸裂解酶的异源基因。例如，在美国专利号8,795,998(Pronk等人)中描述了与甘油途径减弱进行组合的这样的基因的引入。
在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞可进一步过表达糖转运体样(STL1)多肽(参见，例如，Ferreira等人(2005)Mol Biol Cell[细胞分子生物学]16:2068-76；
Figure BDA0003514777480000171
等人(2015)Mol Microbiol[分子微生物学]97:541-59以及WO 2015023989 A1)，从而增加乙醇生产并且减少乙酸盐。
在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞可以进一步过表达聚腺苷酸结合蛋白，例如PAB1，从而增加醇生产并且减少乙酸盐生产。
在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包含丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径是异丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自由以下组成的组的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸盐；(c)2,3-二羟基异戊酸盐至2-酮异戊酸盐；(d)2-酮异戊酸盐至异丁醛；和(e)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包含编码具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶、和醇脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。
在一些实施例中，包含丁醇生物合成途径的经修饰的酵母细胞进一步包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰。在一些实施例中，酵母细胞在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源多核苷酸中包含缺失、突变和/或取代。在一些实施例中，具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽选自由以下组成的组：PDC1、PDC5、PDC6、及其组合。在一些实施例中，酵母细胞在编码FRA2、ALD6、ADH1、GPD2、BDH1、和YMR226C的一个或多个内源多核苷酸中进一步包含缺失、突变和/或取代。
V.减少的Cdc42效应因子与其他有益突变的组合
在一些实施例中，除表达减少量的Cdc42效应因子多肽之外，任选地与有益于醇生产的其他遗传修饰组合，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包含任何数目的编码目的蛋白质的额外的目的基因。可以在遗传操作之前、期间或之后引入额外的目的基因，所述遗传操作导致Cdc42效应因子多肽的表达降低。目的蛋白包括选择性标记、碳水化合物加工酶以及其他商业上相关的多肽，包括但不限于选自由以下组成的组的酶：脱氢酶、转酮醇酶、磷酸转酮酶、转醛醇酶、差向异构酶、植酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、海藻糖酶、脂肪酶、果胶酶、聚酯酶、角质酶、氧化酶、转移酶、还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶和漆酶。目的蛋白可以被分泌、糖基化并以其他方式修饰。
VI.适合修饰的酵母细胞
酵母是被归类为真菌界成员的单细胞真核微生物，并且包括来自子囊菌门和担子菌门的生物。可以用于醇生产的酵母包括但不限于酵母属物种，包括酿酒酵母、以及克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、拉茜斯酵母属(Lachancea)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种。许多酵母菌株是可商购的，其中许多已被选择或基因工程化以获得所需特征，例如高乙醇生产、快速生长速率等。一些酵母已被基因工程化以产生异源酶，如葡糖淀粉酶或α-淀粉酶。
VII.底物和条件
从许多碳水化合物底物(包括但不限于玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)中生产醇是众所周知的，正如酶条件和化学条件以及机械方法的无数变化和改善也是众所周知的。据信本发明的组合物和方法与这样的底物和条件完全相容。
乙醇生产工艺存在多种变化，包括冷蒸煮或无蒸煮，涉及处于糊化温度或低于糊化温度下的液化、同时糖化和发酵、分馏工艺等。预期上述工艺均与本发明的组合物和方法相容。
VIII.发酵产物和联产物
典型的醇发酵产物包括具有与碳原子结合的羟基官能团(-OH)的有机化合物。示例性醇包括但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、2-戊醇、异戊醇、和高级醇。最常制备的燃料醇是乙醇和丁醇。使用本发明的经修饰的酵母，可实现至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、或更多的增加。
醇生产(以及特别是干磨乙醇生产)的有价值的副产物(或联产物)是动物饲料产品，通常呈干酒糟(DDG)或更常见地，具溶解物的干酒糟(DDGS)的形式。这些动物饲料产品在许多方面比用于乙醇生产的初始原料更有营养，因为其中的碳水化合物消耗殆尽，但富含来自原料和发酵生物(即，产乙醇菌(ethanologen))的氨基酸。
DDGS或其他玉米联产物的特定氨基酸组成对动物饲料的质量十分重要，因为一些氨基酸远比其他氨基酸更重要。赖氨酸是大多数农场动物的必需氨基酸，如果没有通过DDG、DDGS或其他发酵后联产物适当地足量提供，则必须补充赖氨酸以使饲料转化率最大化。合成的赖氨酸昂贵，并且意味着动物饲料的一个重要成本。
因为酵母可以代表发酵后产物中的重要组分，因此酵母的氨基酸含量可显著影响发酵液、全釜馏物、稀釜馏物、干酒糟、具溶解物的干酒糟、浓缩酒糟可溶物或其他含蛋白质的发酵后联产物的氨基酸含量。用本发明的酵母替代常规酵母提高了这样的发酵后产物中赖氨酸的量，从而提高了它们作为动物饲料产品的价值。
使用本发明的经修饰的酵母，可以实现赖氨酸增加至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、或甚至至少2倍或更多。
鉴于本说明书，本发明的菌株和方法的这些和其他方面以及实施例对于技术人员将是清楚的。以下实例旨在进一步说明但不限制所述菌株和方法。
实例
实例1：酵母中Gic2的缺失
使用标准分子生物学技术，通过在FERMAXTM Gold(玛翠公司(Martrex,Inc.)，美国明尼苏达州查斯卡(Chaska,MN,USA)，本文中称为“FG”)(用于大规模乙醇生产的可商购的酿酒酵母菌株)中基本上缺失Gic2的整个编码序列来破坏YDR309c基因。所有程序基于可公开获得的YDR309c的核酸序列，其在下文提供为SEQ ID NO:3；9SGDID:S000002717；chrIV:1079048..1080199；相应Gic2效应因子多肽表示为SEQ ID NO:2(同上)：
ATGACTAGTGCAAGTATTACCAATACTGGAAACGAAACCATGAACCTTCCACAGATGCGGTCGATTTGGCTGGATGAAGATGAAGAAGCTGAAAAACTCTACGGTCTGCAGGCCCAGCAATTCATGGGATCTGATGATGAAGAAAACCTAGGCATTACTTTCATCAACAGCGATAAACCTGTGCTGAGTAACAAGAAAAACATTGAGTTGCCTCCACTTTCACCAAATTCACATCCGTCTTGCCACCACAGGAGAAGTAATTCTAACTCTGCAAAGTCTAAAGAATCATCGTCATCATCGTCCAGCGCCAACAAGACAAATCACAAAAAGGTTTTCCTTAAGCTTAATTTGTTGAAGAAAAAGTTGCTTGGTGCCCAACCGGACATAAGAGGTAAAGGTATCTCCACACCATTTGATTTTCAACATATTTCACATGCTGACACTAGAAATGGATTCCAAGATGAGCAATTGCAGGAACCTTCATCGCTGTCCACAGAGATTAAGGACGACTATACCTCCTCCTCAAGCAAGCGGGATTCGAAATCACTAAATAAAGCTTTTGTCACTGAAAGGATCCCTGCTAATCGTGAAAGCAAACTCATTTCAAGATCGCACGAAAATAAGACATCAAGACTATCAGTCGCGCGTTCGATCTCAGTAACGTCCTCCAATTACTCTAAAAACACACAAGGAAACAATCATTCCATTAATGGGAGAGTCGTATCTACGTCAACTATGGCTACATCTATTTTTGAGTATTCCCCAAACGCATCTCCAAAACAATTTAAAAATAAGTCACACGCTCTGGGTCATAGATACACTAATTCCACGGATTCTAGTGAGTCTTCGCTGGATTTTTTGAAGAACTACAACTTCCCCACACTACTTGAAGATAAGCCTATTTTAGACTTCTTGCCTCGTTCTCAGAGGTCAAGCGCTTATCGTAGCCTTTTAGAGACCCCAAACTCAAATAAGGACTCAGCAAAAGCCTTCTTTCCTTCACGCCAAAGCCCTCTTCCCAAGAGAAGAAACTCTATAGCTACGCCTTCTCCACAATCTAAATTTTCCTACTCTGACTCCCCTGTAAACCATAGAAAATCTTTCGATGATGTTCTTTATTCTTTCAACCAGCTCGAGCCCCTGCAAACTTAA
通过菌落PCR确认Gic2基因的缺失。使经修饰的酵母在非选择性培养基中生长，以除去赋予用于选择转化体的卡那霉素抗性的质粒，产生了与亲本酵母相比不需要生长补充物的经修饰的酵母。选择一个经修饰的菌株(命名为FG-Gic2)用于进一步研究。
实例2：酵母中Gic1的缺失
使用标准分子生物学技术，通过基本上缺失FG中Gic1的整个编码序列来破坏YHR061c基因。所有程序均基于可公开获得的YHR061c的核酸序列，其在下文提供为SEQ IDNO:4；SGDID:S000001103；chrVIII:221534..222478；相应Gic1效应因子多肽表示为SEQ IDNO:1(同上)：
ATGACTGAAGGAAAGAGGCTGCAACAGATGGAGCTTCCTCAAATGAAATCCATTTGGATTGACGAGGATCAGGAAATGGAAAAATTGTATGGATTCCAAGTAAGGCAACGATTCATGAATGGACCTAGTACGGATTCCGATGAAGACGCCGACGAAGATTTAGGAATTGTTCTCGTTGACAGTAAAAAGCTGGCTTTGCCGAACAAGAACAACATCAAATTGCCCCCTTTGCCCAATTACATGACGATCAACCCTAACATAAATTCCAATCACAAGTCATTAACTAATAAAAAGAAGAATTTCCTGGGCATGTTCAAAAAAAAGGACCTGTTGTCGAGGAGACATGGGTCTGCCAAAACCGCAAAACAGTCAAGTATATCTACACCATTTGATTTTCACCATATTTCGCATGCTAATGGTAAAAGGGAAGACAACCCTCTTGAGTCGCACGAAGAAAAACATGATGTAGAATCATTAGTCAAATTCACGTCTTTGGCACCGCAACCCCGACCAGATTCAAACGTCTCTTCTAAATATTCCAATGTTGTGATGAACGATTCGAGCAGAATAGTGTCTTCCTCCACAATAGCTACAACGATGGATTCTCACCACGATGGTAACGAAACCAACAATACCCCAAATGGCAATAAGCAATTAGACTCGCCTACAGATTTGGAAATGACCTTGGAAGACTTGAGAAATTATACATTTCCTTCTGTTCTTGGAGATAGCGTCAGCGAAAAGACCAATCCTTCCTCTCCCTCTGTTTCATCATTTTCTGGCAAATTCAAGCCAAGAGAGTTGAGTGCGCTACATACGCCCGAATTAGGAAATTGTTTCAATGTAGATCAGTCGCTAAATTCCCCTGGTAACAGAATATCTGTGGATGACGTGCTAAAATTCTACTATCAATGTAGTGAAACTAGTACTCCTCGAAATACCTGA
通过菌落PCR确认Gic1基因的缺失，并且使经修饰的酵母在非选择性培养基中生长，以除去赋予用于选择转化体的卡那霉素抗性的质粒，产生了与亲本酵母相比不需要生长补充物的经修饰的酵母。选择一个经修饰的菌株(命名为FG-Gic1)用于进一步研究。
实例3：单一温度下通过经修饰的酵母的乙醇生产
测试FG-Gic2和FG-Gic1酵母与FG基准酵母(对于两种基因均为野生型)相比在32℃的液化物中生产乙醇的能力。通过添加600ppm尿素、0.124SAPU/g DS FERMGENTM 2.5x(酸性真菌蛋白酶)、0.33GAU/g DS变体里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶和1.46SSCU/gDS白曲霉(Aspergillus kawachii)α-淀粉酶，在pH 4.8制备液化物(即，具有干固体(DS)值为33％的玉米面粉浆料)。
将50克液化物称入100ml容器中，并在32℃用来自经修饰的菌株或FG菌株的菌落的新鲜过夜培养物接种。在55.2hr时将样品通过离心收集，通过0.2μm过滤器过滤，并使用Bio-Rad Aminex HPX-87H柱(其在0.01N H2SO4洗脱液中的等度流速为0.6ml/min)在55℃通过HPLC(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)1200系列)分析乙醇、葡萄糖、乙酸盐和甘油含量(除非另有说明，所有数字均以g/L计)。使用2.5μl样品注射体积。用于定量的校准标准品包括已知量的DP4+、DP3、DP2、DP1、甘油和乙醇。分析结果示于表1中。报告了相对于FG菌株的乙醇增加。
表1.在32℃发酵55小时后对发酵液的分析
菌株 DP2 DP3 DP4+ 葡萄糖 甘油 乙酸盐 EtOH 倍数增加
FG 3.14 1.27 6 0.53 13.74 0.76 139.26 -0-
FG-Gic2 3.24 1.3 6.08 0.51 13.52 0.7 140.83 1.011
FG-Gic1 3.26 1.29 6.07 0.56 13.9 0.73 140.45 1.009
与未经修饰的FG参考菌株相比，在32℃，携带已破坏的Gic1或Gic2基因的酵母生产的乙醇增加约1％。
实例4：斜坡温度下通过经修饰的酵母的乙醇生产
测试FG-Gic2和FG-Gic1酵母与基准FG酵母(对于两种基因均为野生型)相比在35℃斜坡的液化物中生产乙醇的能力。将液化物(如上)称入100ml容器中，并使用如表2中总结的35℃斜坡条件用来自经修饰的菌株或FG菌株的菌落的新鲜过夜培养物接种。55.2hr后将样品通过离心收集，通过0.2μm过滤器过滤，并通过HPLC如上所述分析乙醇、葡萄糖、乙酸盐和甘油的含量。分析结果示于表3中。报告了相对于FG菌株的乙醇增加。
表2.温度斜坡条件
Figure BDA0003514777480000231
Figure BDA0003514777480000241
表3.斜坡条件下发酵后对发酵液的分析
菌株 DP2 DP3 DP4+ 葡萄糖 甘油 乙酸盐 EtOH 倍数增加
FG 3.87 1.43 5.87 18.32 14.24 0.93 128.96 -0-
FG-Gic2 4.28 1.46 5.86 8.93 13.74 0.97 133.64 1.036
FG-Gic1 4.37 1.46 5.89 10.47 14.02 1.02 132.89 1.030
如表3所示，携带Gic1或Gic2缺失的酵母与未经修饰的参考菌株相比，在35℃斜坡生产的乙醇多约3.0％至3.6％。
实例5：在高-DS条件下通过经修饰的酵母的乙醇生产
测试FG-Gic2和FG-Gic1酵母与基准FG酵母相比在32℃在高-DS(即35％)液化物条件中生产乙醇的能力。如上制备和分析液化物。分析结果如表4所示。报告了相对于FG菌株的乙醇增加。
表4：在高-DS条件下发酵后对发酵液的分析
Figure BDA0003514777480000242
如表4所示，携带Gic2或Gic1基因缺失的酵母与未经修饰的参考菌株相比，在35％DS生产的乙醇多约4.5％至5％。
实例6：使用经修饰的酵母的发酵最终产物中的赖氨酸含量
在基本培养基中生长24hr后，测试FG-Gic2和FG-Gic1酵母的细胞内游离赖氨酸含量，并与基准FG酵母(对于两种基因均为野生型)进行比较。使用标准氨基酸提取条件，以60％甲醇溶液(Villas-Boas,S.G.等人,(2005)Biochem J.[生物化学杂志]388:669-77)提取来自细胞沉淀物的细胞内代谢产物，并且使用HPLC处理样品。使用邻苯二甲醛进行衍生化处理后，分析样品中的L-赖氨酸含量。通过HPLC(安捷伦科技公司1260)，使用EclipsePlus C18柱(4.6x 150mm，3.5微米)，在40℃在磷酸盐缓冲液(pH 7.8)和乙腈:甲醇:水(45:45:10)的梯度中检测衍生化的L-赖氨酸。用于定量的校准标准品包括已知量的L-赖氨酸或包含L-赖氨酸的氨基酸标准混合物(安捷伦科技公司)。
如表5所示，与未经修饰的参考菌株相比，携带突变的酵母生产的游离细胞内赖氨酸多1.3至1.67倍。
表5.经修饰的和未经修饰的细胞中的细胞内游离赖氨酸
菌株 细胞内游离赖氨酸(mM) 相对于FG的倍数增加
FG 0.91 na
FG-Gic2 1.18 1.3
FG-Gic1 1.52 1.67
实例7：使用经修饰的酵母的发酵联产物的生物可利用的赖氨酸含量
测试使用FG-Gic2和基准菌株的发酵联产物的总赖氨酸含量。液化物(玉米醪浆料)通过添加600ppm尿素、0.124SAPU/g ds酸性真菌蛋白酶、0.33GAU/g ds变体里氏木霉葡糖淀粉酶以及1.46SSCU/g ds白曲霉α-淀粉酶，用硫酸调节至pH 4.8来制备。将100g制备好的玉米液化物与FG-Gic2或基准FG菌株在32℃伴随200rpm振荡进行发酵。67小时后，将一式两份发酵瓶中的发酵液收集在800-mL烧杯中，并置于95℃振荡水浴中以蒸发掉乙醇。允许发酵液孵育大约3-5小时，直至HPLC未检测出显著的乙醇。
所得材料(即全釜馏物)以6,000rpm旋转10min。收集上清液(即稀釜馏物)和沉淀物(即湿饼)。将湿饼在37℃干燥直至达到约34％-35％的干固体含量。称取稀釜馏物至600mL烧杯中并置于97℃振荡水浴中以将内容物浓缩约5倍(按重量计)从而产生浆液。
为了使发酵联产物与DDGS样品相似，将湿饼和相应浆液按2比1的质量比(如按重量)组合并混合好。将DDGS分散在金属托盘上并在99℃烘箱中干燥约3小时，偶尔混合直至干燥至>90％的干固体含量。
为测试生物可利用的氨基酸，基于先前报告的方法(Qiao,Y(2001),Routinetechniques for monitoring the nutritional value of animal meals[监测动物的膳食营养价值的常规技术],Doctoral thesis at North Carolina State University[北卡罗来纳州立大学博士论文])，将DDGS样品与胃蛋白酶和胰液素共同孵育。简言之，将0.33g的DDGS与3.33mL的0.05M柠檬酸盐缓冲液(pH 2)和大约0.012g胃蛋白酶(来自猪胃粘膜)一起以>400U/mg蛋白添加至20mL闪烁瓶中。允许混合物在200rpm振荡下在38℃孵育约24小时。此后，向各小瓶中添加5mL的磷酸盐缓冲液(0.2M，pH 11.5，含有0.025％w/w叠氮化钠)和大约0.023g胰液素(来自猪胰腺，4x UXP规格)。将小瓶放回38℃培养箱中(以200rpm振荡)66小时左右。此后，从每个小瓶中取样，使样品向下旋转通过0.2μM过滤器，并通过HPLC分析游离氨基酸。
表6中所示结果比较了用FG-Gic2菌株和FG基准生产的发酵联产物中测得的生物可利用的赖氨酸含量。如所示，观察到使用FG-Gic2菌株的联产物生物可利用的赖氨酸增加19％。
表5.通过经修饰和未经修饰的细胞生产的发酵联产物中的赖氨酸
Figure BDA0003514777480000261
Figure BDA0003514777480000271
使用携带外源性PKL途径的酵母和表达外源性葡糖淀粉酶的酵母获得了相似的结果(数据未示出)。

Claims (33)

1.一种衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞，所述经修饰的细胞包含遗传改变，所述遗传改变导致所述经修饰的细胞生产与所述亲本细胞相比减少量的功能性Cdc42效应因子多肽，其中与所述亲本细胞相比，在等同发酵条件下，所述经修饰的细胞表现出增加的醇生产和/或增加的赖氨酸生产。
2.如权利要求1所述的经修饰的细胞，其中与所述亲本细胞相比，所述遗传改变减少了或阻止了功能性Gic1和/或Gic2多肽的生产。
3.如权利要求1所述的经修饰的细胞，其中所述细胞生产了减少量的Gic1和/或Gic2多肽，或未生产可测量的量的Gic1和/或Gic2多肽。
4.如权利要求1-3中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述遗传改变包括存在于所述亲本细胞中的YHR061c基因或其编码Gic1多肽的同源物的破坏和/或YDR309c基因或其编码Gic2多肽的同源物的破坏。
5.如权利要求4所述的经修饰的细胞，其中所述破坏是由所述YHR061c基因或其同源物和/或所述YDR309c基因或其同源物的分别全部或部分缺失导致。
6.如权利要求4所述的经修饰的细胞，其中所述破坏是由基因组DNA的分别包含所述YHR061c基因或其同源物和/或所述YDR309c基因或其同源物的一部分的缺失导致。
7.如权利要求4所述的经修饰的细胞，其中所述破坏是由所述YHR061c基因或其同源物和/或所述YDR309c基因或其同源物的分别诱变导致。
8.如权利要求4-7中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述YHR061c基因或其同源物和/或所述YDR309c基因或其同源物的分别破坏与在相应遗传基因座处引入目的基因组合进行。
9.如权利要求1-8中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞进一步包含磷酸转酮酶途径的一个或多个基因。
10.如权利要求9所述的经修饰的细胞，其中所述磷酸转酮酶途径的基因选自由以下组成的组：磷酸转酮酶、磷酸转乙酰酶、和乙酰化乙酰基脱氢酶。
11.如权利要求1-10中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。
12.如权利要求1-11中任一项所述的经修饰的细胞，所述经修饰的细胞进一步包含甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。
13.如权利要求1-12中任一项所述的经修饰的细胞，所述经修饰的细胞进一步包含用于制备乙醇的替代途径。
14.如权利要求1-13中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞属于酵母属(Saccharomyces)物种。
15.一种用于生产经修饰的酵母细胞的方法，所述方法包括：向亲本酵母细胞中引入遗传改变，与所述亲本细胞相比，所述遗传改变减少了或阻止了功能性Cdc42效应因子多肽的产生，从而产生如下经修饰的细胞，与所述亲本细胞相比，在等同发酵下，所述经修饰的细胞在发酵期间生产增加量的醇和/或赖氨酸。
16.如权利要求15所述的方法，其中与所述亲本细胞相比，所述遗传改变减少了或阻止了功能性Gic1和/或Gic2多肽的生产。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述细胞生产了减少量的Gic1和/或Gic2多肽，或未生产可测量的量的Gic1和/或Gic2多肽。
18.如权利要求15-17中任一项所述的方法，其中所述遗传改变包括存在于所述亲本细胞中的YHR061c基因或其编码Gic1多肽的同源物的破坏和/或YDR309c基因或其编码Gic2多肽的同源物的破坏。
19.如权利要求18中任一项所述的方法，其中所述破坏是由所述YHR061c基因或其同源物和/或YDR309c基因或其同源物的分别全部或部分缺失导致。
20.如权利要求18中任一项所述的方法，其中所述破坏是由基因组DNA的分别包含所述YHR061c基因或其同源物和/或所述YDR309c基因或其同源物的一部分的缺失导致。
21.如权利要求18中任一项所述的方法，其中所述破坏是由所述YHR061c基因或其同源物和/或所述YDR309c基因或其同源物的分别诱变导致。
22.如权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述YHR061c基因或其同源物和/或所述YDR309c基因或其同源物的分别破坏与在相应遗传基因座处引入目的基因组合进行。
23.如权利要求15-22中任一项所述的方法，其中所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因，甘油途径、乙酰辅酶A途径中的改变和/或用于制备乙醇的替代途径。
24.如权利要求15-23中任一项所述的方法，其中所述细胞属于酵母属物种。
25.如权利要求15中任一项所述的方法，其中所述细胞是如权利要求1-14中任一项所述的经修饰的细胞。
26.一种用于增加发酵后产物中存在的赖氨酸的量的方法，所述方法包括：
(i)用α-淀粉酶水解含淀粉原料以生产淀粉液化物；
(ii)用葡糖淀粉酶糖化所述淀粉液化物以生产葡萄糖；
(iii)用衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞发酵所述葡萄糖，所述经修饰的酵母细胞包含遗传改变，所述遗传改变导致生产与所述亲本细胞相比减少量的功能性Cdc42效应因子多肽；以及
(iv)回收相比从使用所述亲本酵母、在其他方面相同的工艺中回收的发酵后副产物富集了赖氨酸的发酵后副产物。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述发酵后产物选自由以下组成的组：发酵液、全釜馏物、稀釜馏物、干酒糟、干酒糟及其可溶物、浓缩酒糟可溶物或其他含蛋白质联产物。
28.如权利要求26或27所述的方法，其中以同时或重叠的方式组合一个或多个步骤(i)-(iv)。
29.一种用于增加发酵产物中存在的赖氨酸的量的方法，所述方法包括：
(i)用衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞发酵葡萄糖或另一种糖，所述经修饰的酵母细胞包含遗传改变，所述遗传改变导致生产与所述亲本细胞相比减少量的功能性Cdc42效应因子多肽；以及
(ii)回收相比从使用所述亲本酵母、在其他方面相同的工艺中回收的发酵产物富集了赖氨酸的发酵产物。
30.如权利要求26-29中任一项所述的方法，其中所述细胞是如权利要求1-14中任一项所述的经修饰的细胞。
31.一种经修饰的酵母细胞，所述经修饰的酵母细胞通过如权利要求15-25中任一项所述的方法产生。
32.一种发酵产物，所述发酵产物通过如权利要求26-30中任一项所述的方法产生。
33.一种组合物或方法，所述组合物或方法具有权利要求1-32的特征或说明书中所提及的特征中任一个。
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