CN114259565A

CN114259565A - Wnt4在制备治疗纤维化药物中的应用

Info

Publication number: CN114259565A
Application number: CN202111627210.XA
Authority: CN
Inventors: 段金柱; 董文艳; 赵悦; 温达强; 蔡文倩; 林应炯; 曾锤
Original assignee: Guangzhou Women and Childrens Medical Center
Current assignee: Guangzhou Women and Childrens Medical Center
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2022-04-01

Abstract

本发明公开了Wnt4在制备治疗纤维化药物中的应用。本发明提供了促进Wnt4基因表达或提高Wnt4含量和/或活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的用途为治疗心肌纤维化、促进血管再生等。本发明通过实验证明，Wnt4基因过表达可诱导成纤维细胞向内皮细胞的转化、使成纤维细胞具有形成血管的能力、心功能增加、提高血管密度等。Wnt 4蛋白有望成为靶向心脏成纤维细胞，抑制心肌纤维化，促血管新生的有效治疗方法之一。对于不同机制形成的纤维化，均可产生转化作用，具有可观的发展前景。

Description

Wnt4在制备治疗纤维化药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及Wnt4在制备治疗纤维化药物中的应用。

背景技术

人体器官，比如心脏、肺、皮肤和肾脏等，在发生组织损伤时都会伴随着成纤维细胞的快速激活以替代死亡的组织或功能细胞，最终形成纤维化或疤痕，影响器官的功能和修复治疗。因此，如何改善或去除纤维化是各个器官疾病治疗中共同面临的亟需解决的难题之一。

心血管疾病是全世界高发病率和高致死率的主要疾病之一。在心血管疾病发生发展过程中出现的许多病理因素如氧化应激、压力和/或容量负荷过重、某些细胞因子、缺血缺氧以及神经-内分泌失调等都可诱导心肌细胞死亡。成年人的心脏不具有再生能力，死亡的心肌被激活的成纤维细胞所替代，形成纤维化，从而导致心脏功能下降最终恶性循环发展为心脏衰竭。

心肌纤维化是指在心肌的正常组织结构中胶原纤维过量积聚、心脏组织中胶原浓度显著升高或胶原成分发生改变。这种病理变化在多种心血管疾病中存在，并被认为其与心律失常、心功能障碍甚至心脏性猝死密切相关。血管弱化是伴随着心肌纤维化发生的一个病理生理机制。血管弱化促使心脏组织血供减少，进一步诱发心肌细胞死亡。

近年来心肌纤维化及心脏血管新生日益受到国内外心血管专家的重视，但有关其临床和实验的研究还相对较少。目前血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)类药物已广泛用于临床，但目前尚无明显的证据显示可以改善心肌纤维化。近年来的研究发现H1组织胺拮抗剂曲尼斯特(tranilast)还具有抗纤维化、刺激毛发生长和抑制胶原合成的作用。虽然已用于瘢痕的治疗中，但该药物能否改善心肌纤维化还有待进一步证实。

总而言之，目前临床上尚未有行之有效的抑制心肌纤维化、促进血管新生的药物，因此，开发新型心肌纤维化抑制剂/抑制因子不仅对于治疗心血管疾病本身有着极为重大的意义，而且对于其他器官损伤后纤维化的治疗具有同样重要的借鉴意义。

心肌纤维化常继发于各种心血管疾病。它可引起心肌结构紊乱、组织异质性增高，是发生心律失常的结构基础，也是猝死和慢性心功能不全的潜在危险因索。目前临床上治疗心血管疾病的常用药物主要包括针对增加心肌收缩力，减少心肌耗氧量的β受体阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂、利尿剂等。心肌纤维化是一个复杂的病理过程，涉及多个自身调节***，并且在不同心脏疾病甚至同种疾病的不同类型中都会伴随心肌纤维化的形成。而目前临床治疗中，并没有针对抑制纤维化的有效药物。

发明内容

本发明的目的在于提供Wnt4在制备治疗纤维化药物中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供Wnt4蛋白或调控Wnt4基因表达的物质在制备具有(I)～(VI)任一项所述功能产品中的应用：

(I)治疗纤维化；

(II)治疗心血管疾病；

(III)促进血管形成；

(IV)增强心脏功能；

(V)增加血管密度；

(VI)促进成纤维细胞转化为内皮细胞。

本发明的第二方面，提供调控本发明第一方面所述Wnt4蛋白活性的物质在制备具有(I)～(VI)任一项所述功能产品中的应用：

(I)治疗纤维化；

(II)治疗心血管疾病；

(III)促进血管形成；

(IV)增强心脏功能；

(V)增加血管密度；

(VI)促进成纤维细胞转化为内皮细胞。

本发明的第三方面，提供调控本发明第一方面所述Wnt4蛋白含量的物质在制备具有(I)～(VI)任一项所述功能产品中的应用：

(I)治疗纤维化；

(II)治疗心血管疾病；

(III)促进血管形成；

(IV)增强心脏功能；

(V)增加血管密度；

(VI)促进成纤维细胞转化为内皮细胞。

在本发明的一些实施方式中，所述调控Wnt4基因表达的物质为提高或增强所述Wnt4基因表达的物质；调控本发明第一方面所述Wnt4蛋白活性的物质为提高或增强所述Wnt4蛋白活性的物质，调控本发明第一方面所述Wnt4蛋白含量的物质为提高或增强所述Wnt4蛋白含量的物质。

在本发明的一些实施方式中，所述提高或增强所述Wnt4基因表达的物质、提高或增强所述Wnt4蛋白活性的物质或提高或增强所述Wnt4蛋白含量的物质为与Wnt4蛋白相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：

B1)编码所述Wnt4的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B1)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有

B3)所述重组载体的重组微生物。

本发明的第四方面，提供一种产品，其活性成分为提高或增强所述Wnt4基因表达的物质和/或提高或增强所述Wnt4蛋白活性的物质和/或提高或增强所述Wnt4蛋白含量的物质；所述产品的用途为如下(I)～(VI)中任一项所示：

(I)治疗纤维化；

(II)治疗心血管疾病；

(III)促进血管形成；

(IV)增强心脏功能；

(V)增加血管密度；

(VI)促进成纤维细胞转化为内皮细胞。

B1)编码所述Wnt4的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)所述重组载体的重组微生物。

在本发明的一些实施方式中，所述纤维化为心肌纤维化、皮肤纤维化(疤痕)、肾纤维化、肺纤维化、肝纤维化、脑损伤中星形细胞形成的胶质疤痕、肠胃的纤维化、肌肉纤维化等。因为不同器官纤维化原理都是一致的，都是器官损伤后成纤维细胞激活增殖形成，因此从可以推断，添加Wnt4到皮肤疤痕治疗产品增加疤痕处理效果或肾纤维化、肺纤维化、肝纤维化、脑损伤中星形细胞形成的胶质疤痕、肠胃的纤维化、肌肉纤维化等相关纤维化疾病。

在本发明的一些实施方式中，所述纤维细胞为心肌纤维细胞。

本发明的第五方面，提供一种促进心肌成纤维细胞转化为内皮细胞的方法，通过提高或增强所述Wnt4基因表达和/或提高或增强所述Wnt4蛋白活性和/或提高或增强所述Wnt4蛋白含量。

在本发明的一些实施方式中，可以通过含有Wnt4基因的病毒载体、调控Wnt4表达的上游基因及其分子信号途径的激活剂、潜在的促进Wn4蛋白表达的激活剂等方式提高或增强所述Wnt4基因表达；通过外源Wnt4蛋白直接给药、Wnt4功能模拟物等方式提高或增强所述Wnt4蛋白含量。

本发明的有益效果是：

本发明研究发现心脏损伤后一部分成纤维细胞可以通过间充质转分化为内皮细胞，将这一新现象称之为间质-内皮转化(MEndoT)。与此同时，增加成纤维向内皮细胞的转化，使心脏损伤边缘区生成新生血管，从而减少了心脏损伤。Wnt 4是一种分泌型糖蛋白。本发明发现Wnt4可以通过调控成纤维细胞向内皮细胞的转化，从而抑制心肌纤维化，促进血管新生，减少纤维化，保护心脏功能；在心脏修复中发挥关键作用。Wnt 4蛋白有望成为靶向心脏成纤维细胞，抑制心肌纤维化，促血管新生的有效治疗方法之一。对于不同机制形成的纤维化，以及不同疾病中形成的纤维化均可产生转化作用，具有可观的发展前景。

附图说明

图1为流程图。

图2为分离的小鼠心肌成纤维细胞中Wnt4表达量提高伴随内皮细胞相关标志基因表达量的增高。

图3为小鼠心脏损伤后，Wnt4在荧光标记的心脏损伤区成纤维细胞中的表达量随时间增高。

图4为心脏组织中心肌成纤维细胞转化的内皮细胞中显著高表达Wnt4。

图5为在小鼠成纤维细胞中过表达Wnt4使内皮细胞相关标志基因表达量显著增高。其中图5A为Wnt4的表达量；图5B为内皮细胞相关标志基因VECAD、vWF和eNOS的表达量。

图6为成管实验说明过表达Wnt4使成纤维细胞具有新生血管的能力。其中图6A为形态图；图6B为成管长度统计图。

图7为低密度脂蛋白(LDL)摄取实验表明过表达Wnt4使成纤维细胞具有内皮细胞的功能；白色箭头表示摄取了LDL的细胞。图7A为形态图；图7B为LDL摄取率统计图。

图8为动物体内过表达Wnt4提高损伤后的心脏功能。左室射血分数及左室短缩率均为反映的心室功能的指标；Pre、I/R 7d、I/R 14d分别表示心脏损伤前、心脏损伤术后7d及14d。图8A为形态图；图8B为左室射血分数统计图；图8C为左室短缩率统计图。

图9为在小鼠心脏成纤维细胞中过表达Wnt4能够减少心脏损伤后引起的纤维化。图9A为形态图；图9B为纤维化面积统计图。

图10为在小鼠心脏成纤维细胞中过表达Wnt4能够增加心脏损伤后的新生血管；图中灰白色代表血管。图10A为形态图；图10B为血管密度统计图。

图11为过表达Wnt4通过激活磷酸化JNK信号通路，使心肌成纤维细胞转化为内皮细胞。其中VECAD及Occludin为内皮细胞标记物。

图12为图11的表达量检测结果统计图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

本发明所述的通过过表达Wnt4诱导MEndoT以靶向在成纤维细胞治疗心脏疾病的方法如图1所示。

实施例1细胞实验

1、将C57野生型小鼠安乐死，取出心脏，通过胰酶和胶原酶消化，获心脏成纤维细胞。

2、通过慢病毒在分离获得的心脏成纤维细胞中过表达Wnt4，48h后提取细胞的RNA，检测Wnt4以及内皮细胞相关标志基因的表达水平。如图2～图5所示：转染病毒后，Wnt4的表达水平显著升高，同时内皮细胞相关标志基因VECAD、vWF和eNOS表达也显著增高，表明在正常体外培养的心肌成纤维细胞中过表达Wnt4能够诱导了成纤维细胞向内皮细胞的转化。

3、在提前铺有基质胶的培养小室中按照6×10⁴/cm²密度种下过表达Wnt4的心肌成纤维细胞，于37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养12h。如图6所示，过表达Wnt4的心肌成纤维细胞形成了小管，说明过表达Wnt4使成纤维细胞具有形成血管的能力。

4、在提前铺有明胶的24孔板中按照6×10⁴/cm²密度种下过表达Wnt4的心肌成纤维细胞，于37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养4h。如图7所示，观察到心肌成纤维细胞过表达Wnt4后，能摄取LDL的细胞数增加，摄取LDL是内皮细胞的主要功能之一。

以上结果表明通过体外过表达Wnt4，能够诱导心肌成纤维细胞向内皮细胞的转化，并且具有内皮细胞的功能，进一步促进血管新生。

实施例2动物实验

1、将Cre-依赖性表达的腺相关病毒照1×10¹¹U/只，经颈静脉注射至Col1a2-Cre小鼠体内，随后连续10天注射他莫昔芬，使在心肌成纤维细胞内特异过表达Wnt4。

2、对心肌成纤维细胞内特异过表达Wnt4小鼠及对照组小鼠分别吸入麻醉下开胸，与左心房下1mm处结扎冠状动脉左前降支，45分钟后解除结扎，确认血管再通后，关胸。术中连接心电图以确认心肌缺血再灌注损伤建模成功。术后给与消毒，镇痛，流食，保温。

3、分别于心脏损伤后术后7天、14天，通过超声心动图监测小鼠心脏功能。在心脏成纤维细胞中过表达Wnt 4能够显著的提高I/R术后小鼠的心功能。

其中，左室射血分数指每一次左心室收缩泵出血量所占左心室整体容积的比例,从容积的角度反映的心室的射血功能。左室缩短率是指每一次左心室收缩，心脏内径的变化比例,是从内径的长度反映的心室的射血功能。如图8所示，在心脏成纤维细胞中过表达Wnt4后，小鼠射血分数增加，心脏泵血能力增强，表现为心功能增加。

4、于心脏损伤术后14天收取小鼠心脏，进行Masson染色，计算纤维化面积。检测结果参见图9，根据图9可知在心脏成纤维细胞中过表达Wnt4后能够显著的减少小鼠术后心脏纤维化。

5、于心脏损伤术后14天收取小鼠心脏，进行荧光染色标记血管内皮(绿色荧光)，计算血管面积。检测结果参见图10，根据图10可知在心脏成纤维细胞中过表达Wnt4后能够显著的增加血管密度。

实施例3Wnt4促进成纤维细胞转化为内皮细胞的分子机制

2、在分离获得的心脏成纤维细胞中分别加入Wnt4下游信号通路JNK及β-catenin抑制剂，抑制下游信号通路之后，提取细胞蛋白，检测Wnt4以及内皮细胞相关标记物的表达水平。如图11-图12所示：过表达Wnt4通过激活磷酸化JNK信号通路，使心肌成纤维细胞转化为内皮细胞。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims

1.Wnt4蛋白或调控Wnt4基因表达的物质在制备具有(I)～(VI)任一项所述功能产品中的应用：

(I)治疗纤维化；

(II)治疗心血管疾病；

(III)促进血管形成；

(IV)增强心脏功能；

(V)增加血管密度；

(VI)促进成纤维细胞转化为内皮细胞。

2.调控权利要求1中所述Wnt4蛋白活性的物质在制备具有(I)～(VI)任一项所述功能产品中的应用：

(I)治疗纤维化；

(II)治疗心血管疾病；

(III)促进血管形成；

(IV)增强心脏功能；

(V)增加血管密度；

(VI)促进成纤维细胞转化为内皮细胞。

3.调控权利要求1中所述Wnt4蛋白含量的物质在制备具有(I)～(VI)任一项所述功能产品中的应用：

(I)治疗纤维化；

(II)治疗心血管疾病；

(III)促进血管形成；

(IV)增强心脏功能；

(V)增加血管密度；

(VI)促进成纤维细胞转化为内皮细胞。

4.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述调控Wnt4基因表达的物质为提高或增强所述Wnt4基因表达的物质；调控权利要求1中所述Wnt4蛋白活性的物质为提高或增强所述Wnt4蛋白活性的物质，调控权利要求1中所述Wnt4蛋白含量的物质为提高或增强所述Wnt4蛋白含量的物质。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述提高或增强所述Wnt4基因表达的物质、提高或增强所述Wnt4蛋白活性的物质或提高或增强所述Wnt4蛋白含量的物质为与Wnt4蛋白相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：

B1)编码所述Wnt4的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)所述重组载体的重组微生物。

6.一种产品，其活性成分为提高或增强所述Wnt4基因表达的物质和/或提高或增强所述Wnt4蛋白活性的物质和/或提高或增强所述Wnt4蛋白含量的物质；所述产品的用途为如下(I)～(VI)中任一项所示：

(I)治疗纤维化；

(II)治疗心血管疾病；

(III)促进血管形成；

(IV)增强心脏功能；

(V)增加血管密度；

(VI)促进成纤维细胞转化为内皮细胞。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述提高或增强所述Wnt4基因表达的物质、提高或增强所述Wnt4蛋白活性的物质或提高或增强所述Wnt4蛋白含量的物质为与Wnt4蛋白相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：

B1)编码所述Wnt4的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)所述重组载体的重组微生物。

8.Wnt4基因或Wnt4蛋白作为靶点，在筛选或开发(I)～(VI)任一项所述功能产品中的应用：

(I)治疗纤维化；

(II)治疗心血管疾病；

(III)促进血管形成；

(IV)增强心脏功能；

(V)增加血管密度；

(VI)促进成纤维细胞转化为内皮细胞。

9.根据权利要求1～5任一项所述的应用或权利要求6～7任一项所述的产品或权利要求8所述的应用，其特征在于，所述纤维化为心肌纤维化、皮肤纤维化、肾纤维化、肺纤维化、肝纤维化、脑损伤中星形细胞形成的胶质疤痕、肠胃的纤维化、肌肉纤维化。

10.一种促进成纤维细胞转化为内皮细胞的方法，其特征在于，通过提高或增强所述Wnt4基因表达和/或提高或增强所述Wnt4蛋白活性和/或提高或增强所述Wnt4蛋白含量。