CN114259492A - 硝唑尼特在***中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及硝唑尼特在***中的应用。具体而言,本发明涉及硝唑尼特单独或与另外的治疗剂或预防剂组合用于***中的应用和相关的药物组合物。
Description
技术领域
本发明属于药物化学技术领域,具体涉及硝唑尼特在***中的应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)是引起乙型肝炎(简称乙肝)的病原体。HBV感染是全球性的公共卫生问题,持续性HBV感染会导致肝硬化甚至肝癌。随着基因工程疫苗的生产和投入,乙肝疫苗的普及率逐年上升,乙肝的感染率呈下降趋势。在我国,由于乙肝病毒携带者的基数较大,因此,乙肝的防治在当前甚至未来几十年仍然是我国公共卫生的重点。
临床上对慢性乙肝患者的治疗主要是采取非特异性的抗病毒疗法,包括使用核苷类似物和I型干扰素。核苷类似物主要通过抑制HBV复制过程中的逆转录酶活性从而抑制HBV产生,临床可用药物包括以下类别:拉米夫定、泛昔洛韦、如阿昔洛韦、阿德福韦、恩替卡韦、替诺福韦、膦甲酸钠等,这些药物均有一定抑制HBV效果。
这些逆转录酶抑制剂虽然可以有效降低HBV DNA水平,在患者中控制乙肝病毒水平,但是由于其作用靶点为RNA逆转录为DNA的过程,对于HBeAg和HBsAg的清除无直接作用。因此核苷类似物单药治疗发生HBeAg和HBsAg血清学转化的概率极低,并不能真正治愈乙肝,患者需要长期甚至终身服用药物。I型干扰素的治疗疗程长、费用高,患者持久应答率也仅为10-47%,上述非特异性的抗病毒疗法的治疗策略,对乙肝患者的治疗效果不理想。
乙型肝炎疫苗是用于预防乙型肝炎的有效手段,常规重组乙型肝炎疫苗主要用于特异性预防新生儿和易感人群的HBV感染。新生儿乙肝疫苗免疫接种有效地预防了新发HBV感染。其中以天然结构的乙肝表面抗原(HBsAg)为靶抗原。但是,这一手段仅能在未经感染的健康人体内诱导产生抗体,发挥预防效果,是一种预防性疫苗。
慢性HBV感染的持续状态主要是由于机体对乙肝病毒抗原的免疫耐受。而免疫预防性乙肝疫苗对已患有慢性HBV感染者无效,也无任何治疗效果。慢性HBV感染患者如不做任何治疗,据统计将有25-40%的感染者会进展为失代偿性肝硬化或者肝癌。因此,目前全世界许多学者尝试通过诱导慢性HBV感染者产生针对HBV病毒抗原的特异性免疫应答反应,通过调动机体本身的特异性免疫力,清除慢性HBV感染性肝细胞的治疗性疫苗,现有的治疗性乙肝疫苗具有某些优点,但也存在着一些问题。如DNA疫苗能诱导强烈的细胞免疫和体液免疫应答,可打破特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)耐受,但其安全性(包括环境安全性和人体安全性)和标准化问题尚待深入研究。多表位基因疫苗或多表位多肽疫苗为多价疫苗研究提供了新的思路,但是由于MHC分子的限制性,其仅局限于表达某些特定MHC分子的患者,并且还需要克服表位疫苗免疫原性弱的固有缺点。抗原抗体复合物治疗性疫苗由于采用的是常规的铝盐佐剂,其免疫原性也具有一定的局限性。
目前市场上主要通过使用干扰素或者核苷类似物进行抗病毒治疗。其中核苷类似物通过抑制HBV复制过程中的逆转录酶活性从而抑制HBV产生。逆转录酶抑制剂虽然可以使患者控制乙肝病毒水平,但是成本较高,且缺乏靶向性,逆转录酶抑制剂在服用后大多通过肾脏排出,只有极少部分被肝脏器官吸收,治疗效果较差。
发明内容
为改善上述技术问题,本发明提供硝唑尼特(NTZ)或其药学上可接受的盐或其类似物在制备治疗或预防病毒性肝炎药物中的应用。本发明此外还提供硝唑尼特或其药学上可接受的盐或其类似物与另外的治疗剂或预防剂的组合在制备治疗或预防病毒性肝炎药物中的应用。优选地,所述应用包括在对此有需要的个体中降低乙型肝炎病毒(HBV)载量和/或HBsAg(乙型肝炎表面抗原)水平。
发明人出人意料地发现,通常用于杀灭和抑制寄生虫的药物硝唑尼特在细胞试验和动物试验中具备降低乙型肝炎病毒(HBV)载量和/或HBsAg(乙型肝炎表面抗原)水平的能力,因而有望达到清除乙肝病毒的效果,由此达到乙型肝炎的完全治愈。
根据本发明的实施方案,所述病毒性肝炎包括乙型肝炎或丁型肝炎。
根据本发明,所述药物尤其能够降低乙型肝炎病毒(HBV)载量和/或HBsAg水平。
因此,本发明还提供了一种药物组合物,所述药物组合物包含治疗有效量的硝唑尼特或其药学上可接受的盐或其类似物和任选的另外的治疗剂或预防剂。
根据本发明的实施方案,硝唑尼特或其药学上可接受的盐或其类似物增强任选的另外的治疗剂或预防剂的治疗和/或预防病毒性肝炎的效果。因此,本发明的主题还涉及硝唑尼特或其药学上可接受的盐或其类似物增强任选的另外的治疗剂或预防剂的治疗和/或预防病毒性肝炎的应用。
根据本发明的实施方案,所述另外的治疗剂或预防剂是抗病毒药物,优选抗乙肝病毒药物,包括干扰素或PEG-干扰素和核苷类似物,更优选地,所述第二治疗剂或预防剂可以选自拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替诺福韦或其衍生物,如富马酸替诺福韦二吡呋酯、替诺福韦艾拉酚胺等。
根据本发明的实施方案,所述药物组合物经配制而通过选自以下的途径给药:口服、注射、直肠、经鼻、经肺、局部、口腔和舌下、***、肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外。
根据本发明的实施方案,所述药物组合物优选以口服方式给药。
所述口服剂型没有特别限定,可以采用本领域熟知的任意口服剂型,优选包括片剂、胶囊、混悬剂或者口服溶液等本领域已知的口服剂型。作为口服剂型时,使用的剂量标准例如为500-1500mg/天硝唑尼特或其药学上可接受的盐或其类似物,优选用量为700-1200mg/天,优选800-1000mg/天,最优选为1000mg/天的硝唑尼特或其药学上可接受的盐或其类似物。
根据本发明的药物组合物的用药时间可以视病情程度而定,优选至少为1个月,例如可以为1、2、3、4、5或6个月,最长可能因病情需要而终身服药。
根据本发明的实施方案,在根据本发明的药物或药物组合物中,硝唑尼特与另外的治疗剂或预防剂之间的用量比例按重量计,优选为100:1~10:1,优选50:1~20:1,更优选30:1~25:1。根据本发明所证实,在此范围内的硝唑尼特与另外的治疗剂或预防剂之间的用量能够产生二者之间的协同作用,提高HBV DNA抑制率。
根据本发明的实施方案,所述药物组合物还可以包含药学上可接受的辅料,其选自包括但不限于下列辅料中的至少一种:填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、矫味剂、湿润剂、pH调节剂、增溶剂或助溶剂、渗透压调节剂。本领域技术人员根据具体剂型的需要,可以容易地确定如何选择相应的辅料及其相应用量。
术语和解释
在本文中,术语“硝唑尼特”是指[2-[(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)氨基甲酰基]苯基]乙酸酯(CAS登记号:55981-09-4),其具有以下结构:
硝唑尼特是一种硝噻柳酸酰胺的衍生物,其实际的作用机制虽尚未弄清,但被认为与抑制丙酮酸盐,铁氧化还原蛋白氧化还原酶的酶依赖性电子转移反应有关,后者对厌氧能量代谢至为重要。本品除了对隐孢子虫和肠贾第鞭毛虫之外,还对许多肠寄生虫,如贝氏等孢子虫、阿米巴原虫、人蛔虫、钩虫、毛首鞭虫、牛肉绦虫、短膜壳绦虫和肝片吸虫均有活性。目前硝噻柳酸酰胺的衍生物在治疗或预防病毒性肝炎上的应用研究较少,而硝唑尼特已经被美国FDA批准用于治疗多种病毒和寄生虫感染药物。
在本文中,术语“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒的酸(包括无机或有机酸)制成的盐。本发明的化合物可以是单盐、二盐或三盐,取决于在化合物的游离碱形式中存在的酸性官能团的数目。作为实例,所述酸包括乙酸、三氟乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙烷磺酸、富马酸、葡萄糖、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、杏仁酸、甲烷磺酸、粘酸、硝酸、扑酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、草酸、酒石酸、对甲苯磺酸等。
优选地,所述硝唑尼特或其药学上可接受的盐例如为盐酸盐。
优选地,硝唑尼特的类似物包括替唑尼特(Tizoxanide)和氘代的硝唑尼特。另外,替唑尼特通常被认为是硝唑尼特的活性代谢物,其具有下述结构:
氘代的硝唑尼特的实例可以包括但不限于如下几种及其氘代方案组合:
对应地,替唑尼特的氘代形式包括如下所示的结构:
在本文中,“对此有需要的个体”包括感染/携带乙型肝炎病毒或丁型肝炎病毒的个体,尤其是患有急性、慢性、重型肝炎或肝炎后肝硬化的患者,乙型肝炎表面抗原的携带者,和感染丁型肝炎的患者等。
病毒性肝炎
病毒性肝炎的病原学分型,目前已被公认的有甲、乙、丙、丁、戊五种肝炎病毒,分别写作HAV、HBV、HCV、HDV、HEV,除乙型肝炎病毒为DNA病毒外,其余均为RNA病毒。
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒引起的以肝脏病变为主的一种传染病。临床上以食欲减退、恶心、上腹部不适、肝区痛、乏力为主要表现。部分患者可有黄疸发热和肝大伴有肝功能损害。有些患者可慢性化,甚至发展成肝硬化,少数可发展为肝癌。
乙型病毒性肝炎的病原为乙型肝炎病毒(HBV),其为一种DNA病毒,其基因组是双链、环形、不完全闭合DNA。病毒最外层是病毒的外膜或衣膜,其内层为核心部分,核蛋白即是核心抗原(HBcAg),不能在血清中检出。HBsAg阳性者的血清在电子显微镜下可见3种颗粒,直径为22nm的圆形和丝状颗粒,还有较少的直径为42埃的球形颗粒,又称为Dane氏颗粒,是完整的HBV颗粒。
乙型肝炎的标志检测如下所述:①HBsAg与抗-HBs:HBsAg阳性示HBV目前处于感染阶段,抗-HBs为免疫保护性抗体阳性示已产生对HBV的免疫力。慢性HBsAg携带者的诊断依据为无任何临床症状和体征、肝功能正常,HBsAg持续阳性6个月以上者。②HBeAg与抗-HBe:HBeAg阳性为HBV活跃复制及传染性强的指标,被检血清从HBeAg阳性转变为抗-HBe阳性表示疾病有缓解感染性减弱。③HBcAg与抗-HBc:HBcAg阳性提示存在完整的HBV颗粒直接反应,HBV活跃复制由于检测方法复杂临床少用。抗-HBc为HBV感染的标志,抗-HBc IgM阳性提示处于感染早期,体内有病毒复制。在慢性轻度乙型肝炎和HBsAg携带者中HBsAg、HBeAg和抗-HBc三项均阳性具有高度传染性指标难以阴转。
在本文中,术语“另外的治疗剂或预防剂”通常是指选自干扰素或者核苷类似物的治疗剂或预防剂。在一个优选实施方案中,所述核苷类似物选自恩替卡韦、富马酸替诺福韦二吡呋酯和替诺福韦艾拉酚胺中的一种或两种以上的组合,优选至少两种的组合。
富马酸替诺福韦二吡呋酯(英文名:Tenofovir disoproxil fumarate,TDF;化学名为(R)-[[2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]膦酸二异丙氧羰基甲酯富马酸盐)是替诺福韦的酯类前体,属于新型核苷酸类逆转录酶抑制剂,具有抑制HBV病毒活性。
TDF是美国吉利德公司继阿德福韦酯后成功开发的另一个新型开环膦酸核苷类化合物于2001年10月首次在美国上市,目前已经在欧洲、澳大利亚和加拿大等国家上市。
TDF在体内可通过竞争性地结合于天然脱氧核糖底物来抑制病毒聚合酶,并通过***DNA中终止DNA链的合成。其主要作用机制为口服后水解为替诺福韦,替诺福韦被细胞激酶磷酸化,生成具有药理活性的代谢产物替诺福韦二磷酸,后者与5’-三磷酸脱氧腺苷酸竞争,参与病毒DNA的合成,进入病毒DNA后,由于缺乏3’-OH基团,导致DNA延长受阻,进而阻断病毒的复制。临床应用表明,TDF具有显著的抗HBV病毒疗效,并且毒副作用较小,因而具有较大的临床应用前景。
替诺福韦艾拉酚胺(Tenofovir Alafenamide,TAF),是由美国吉利德科学公司开发的一种新核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)替诺福韦(Tenofovir)的前体药物。与上一代的抗乙肝类似药物替诺福韦二吡呋酯TDF相比,替诺福韦艾拉酚胺的抗病毒活性为其10倍,在血浆中的稳定性为其200倍,半衰期较其提高了225倍。与TDF相比,替诺福韦艾拉酚胺只需要十分之一的TDF给药剂量,即可实现与TDF相同的抗病毒疗效。因此替诺福韦艾拉酚胺用于乙型肝炎病毒(HBV)感染的预防或/和治疗,具有更好的疗效、更高的安全性和更低的耐药性。
恩替卡韦(Entecavir)的化学名为2-氨基-1,9-二氢-9-[(1S,3R,4S)-4-羟基-3-(羟甲基)-2-亚甲基环戊烷]-6H-嘌呤-6-酮,其结构式如下:
美国专利US5206244公开了恩替卡韦及其***病毒的用途;WO9809964中公开了新的恩替卡韦合成方法;WO0164421公开了低剂量的恩替卡韦固体制剂。
恩替卡韦是一种高效的抗病毒剂,由美国施贵宝公司在20世纪90年代研发,具有较强的抗HBV作用。它能够通过磷酸化成为具有活性的三磷酸盐,三磷酸盐在细胞内的半衰期为15h。通过与HBV多聚酶的天然底物三磷酸脱氧鸟嘌呤核苷竞争,恩替卡韦三磷酸盐能抑制病毒多聚酶(逆转录酶)的所有三种活性:(1)HBV多聚酶的启动;(2)前基因组mRNA逆转录负链的形成;(3)HBV DNA正链的合成。
但是,这些核苷类似物存在不能清除乙肝病毒的缺陷,只能采取长期服药的方式来阻断病毒的复制,其对于HBsAg和HBeAg都没有清除的效果。
在本文中,“治疗有效量”或“有效量”是指在剂量下有效并且持续所需时间周期以实现期望的治疗结果的量。药物组合物的治疗有效量将取决于疾病或症状的特性和特定的药物,且可以通过本领域技术人员已知的标准临床技术确定。
治疗结果可以包括减轻症状、延长存活、提高移动性等。治疗结果不必然是“(完全)治愈”。治疗结果也可以是预防性的。
本申请的药物或药物组合物通过适合于待治疗疾病的任何途径给药。合适的途径包括口服、直肠、鼻、肺、局部(包括口腔和舌下)、***和肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外)等。将会理解,优选途径可根据例如接受者的状况而变化。根据本发明的药物或药物组合物的一个优点在于,它们是口服生物可利用的并且可以口服给药。
在一个优选实施方式中,所述药物组合物经配制通过选自以下的途径给药:口服、直肠、经鼻、经肺、局部、口腔和舌下、***、肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外。
在一个优选实施方式中,所述组合物经配制通过口服给药,优选为片剂或胶囊的形式。
根据本发明的药物组合物可以用常规载体和赋形剂(其将根据通常的实践选择)配制。片剂将含有赋形剂、助流剂、填充剂、粘合剂等。水性制剂以无菌形式制备,并且当用于通过非口服给药递送时,通常是等渗的。所有制剂将任选地含有赋形剂,例如“Handbookof Pharmaceutical Excipients”(1986)中所述的赋形剂。赋形剂包括抗坏血酸和其它抗氧化剂,螯合剂如EDTA,碳水化合物如葡聚糖,羟基烷基纤维素,羟基烷基甲基纤维素,硬脂酸等。制剂的pH范围为约3至约11,但通常为约7至10。在一些实施方式中,制剂的pH范围为约2至约5,但通常为约3至4。
制剂包括适用于前述给药途径的制剂。制剂可以方便地以单位剂型存在,并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。技术和制剂通常在Remington’s PharmaceuticalSciences(Mack Publishing Co.,Easton,PA)中找到。这样的方法包括使活性成分与由一种或多种辅助成分构成的载体结合的步骤。通常,通过将活性成分与液体载体或细分的固体载体或两者均匀地和紧密地结合在一起,然后根据需要使产品成形,来制备制剂。
适用于口服给药的本申请的制剂可以作为以下形式存在:各自含有预定量活性成分的离散单元,如胶囊剂或片剂;粉末或颗粒;水性或非水性液体中的溶液或混悬液;或者水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。
片剂通过任选地与一种或多种辅助成分一起压制或模制而制成。压制片剂可以通过以下来制备:在合适的机器中压制自由流动形式如粉末或颗粒的活性成分,其任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合。模制片剂可以通过在合适的机器中模制经惰性液体稀释剂润湿的粉末状活性成分的混合物而制备。片剂可任选地包衣或刻痕,并任选地配制,以便从该片剂提供活性成分的缓释或控释。
用于口服使用的制剂也可以呈现为硬明胶胶囊,其中活性成分与惰性固体稀释剂例如磷酸钙或高岭土混合,或呈现为软明胶胶囊,其中活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
有益效果
根据本发明,硝唑尼特对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)具有明显的抑制作用,在细胞和动物试验中,硝唑尼特能够使HBV DNA含量和HBsAg水平明显降低。此外,如果将硝唑尼特与现有的核苷类似物结合,在个体中降低HBV DNA含量和HBsAg水平方面将会具有协同增效作用,有望使HBsAg转阴。因此可以将硝唑尼特单独或任选地与另外的治疗剂/预防剂结合而用于制备抗病毒药物,尤其是抗乙肝病毒的药物,由此提供一种新的病毒性肝炎预防和治疗的手段,不仅能够使HBV DNA含量和HBsAg水平降低,而且有希望从个体中彻底清除乙肝病毒。
附图说明
图1为实施例1的HepG2.2.15细胞与硝唑尼特作用后的HBsAg抑制率图;
图2为实施例1的HepG2.2.15细胞与硝唑尼特作用后的细胞毒性图;
图3为实施例3中赋形剂与不同药物在不同作用时间下小鼠血浆中HBV DNA含量图;
图4为实施例4中不同药物在不同作用时间下小鼠血浆中HBV DNA含量图;
图5为实施例2中硝唑尼特与替诺福韦艾拉酚胺的协同作用分析;
图6为实施例2中硝唑尼特与替诺福韦艾拉酚胺(TAF)单独或组合使用时在不同浓度抑制HBsAg方面的效果的汇总图,其中的HD117对应于硝唑尼特。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的硝唑尼特在乙型肝炎中的应用做更进一步的详细说明。应当理解,下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明,而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明,以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品,或者可以通过已知方法制备。
实施例1:
按照下面所示的试验步骤来测定硝唑尼特对HBV的抑制作用。
化合物
硝唑尼特(NTZ)和替诺福韦艾拉酚胺(TAF)购自上海陶素生物科技有限公司。恩替卡韦(ETV),购自上海泰坦科技股份有限公司(批号:P1214012;99.0%纯度)。
以配制20mM浓度为例,化合物储备溶液配制方法如下,配制完成后在-20℃下保存:
溶剂DMSO的体积(μl)=样品质量(mg)×纯度÷分子量÷20×106。
培养基
冻存PHH培养用培养基:主要是含10%胎牛血清(FBS,Hyclon货号SV3008703)和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基(Gibco货号11960051),主要用于细胞的培养。
冻存PHH铺板用培养基:主要是含10%胎牛血清(FBS,Hyclon货号SV3008703)和1%青霉素-链霉素InvitroGRO CP Medium(BIOIVT货号S03316),主要用于细胞的铺板。
病毒感染用培养基:主要是含1%青霉素-链霉素Williams'Medium E(SIGMA货号W1878),主要用于HBV病毒感染。
其它实验材料
表1:其它试剂和细胞
实施例1.硝唑尼特与恩替卡韦的细胞学研究
试验方法
A.细胞培养、细胞铺板和化合物处理
第0天,将HepG2.2.15细胞(乙肝病毒稳转细胞)铺种到96孔板中(细胞密度为6×104个细胞/孔)。
第1天,将细胞加入含化合物的培养基,受试化合物共9个浓度,3倍稀释,三复孔,浓度从高到低是50μM,16.6667μM,5.5556μM,1.8519μM,0.6173μM,0.2058μM,0.0686μM,0.0229μM,0.0076nM,对照化合物恩替卡韦(ETV)共9个浓度,3倍稀释,三复孔,浓度从高到低是20nM,6.6667nM,2.2222nM,0.7407nM,0.2469nM,0.0823nM,0.0274nM,0.0091nM,0.003nM。将细胞放在5%CO2和37℃的条件下培养3天。
第4天,更换一次含化合物的新鲜培养基(化合物浓度不变),将细胞放在5%CO2和37℃的条件下培养3天。
第7天,收集细胞培养上清液,将收集的细胞培养上清液用ELISA法检测HBsAg,用qPCR法检测HBV DNA水平。同时,CellTiter-Glo检测细胞活力(检测方法细节见本实施例下文B部分);收集细胞冷冻保存。
化合物测试结果见下表2
表2
B、样品检测
采用qPCR法检测细胞培养上清中HBV DNA的含量:
参照QIAamp 96DNA试剂盒说明书,提取细胞培养上清液中的DNA。用qPCR检测HBVDNA的含量。PCR反应:95℃,10min;95℃,15sec,60℃,1min,40个循环。
ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg的含量:
检测方法参照试剂盒说明书进行,该方法简述如下:分别取50μl的标准品、样品和对照品加入到检测板中,然后每孔加入50μl酶结合物,37℃孵育60分钟,用洗液洗板后吸干,然后加入50μl预混发光底物,室温避光孵育10分钟,最后酶标仪测定发光值。
CellTiter-Glo细胞活力检测:
参照CellTiter-Glo试剂盒说明书测定细胞活力,方法简述如下:收集细胞培养上清液之后,每孔加入CellTiter-Glo(培养基1:1稀释),室温孵育10分钟,酶标仪测定发光值。
C、数据分析
HBV DNA抑制率(%)=(1-化合物组样品的HBV拷贝数/DMSO组的HBV拷贝数)×100%;
HBsAg抑制率(%)=(1-样品的HBsAg值/DMSO对照组HBsAg值)×100%;
细胞毒性(%)=1-((化合物组样品的值–空白对照组平均值)/(DMSO组平均值–空白对照组平均值)×100%;
应用GraphPad Prism软件(four parameter logistic equations)计算EC50值。
试验结果见图1和图2。可以看出至少在1.8519μM和0.6173μM两个浓度下,硝唑尼特对细胞中的HBsAg有显著的抑制作用,并且硝唑尼特的细胞毒性表现稳定。
实施例2.硝唑尼特与替诺福韦艾拉酚胺的细胞学研究
在本实施例中,试验方法所涉及的方法步骤与实施例1基本相同,不同之处在于采用下述表3的化合物测试浓度和将HepG2.2.15细胞替换为HepG2-NTCP细胞。
表3.各化合物的测试浓度
试验接受的指标
以ETV作为对照,如果试验中对照化合物测试得到预期结果,则认为该试验中的其他数据是有效可用,并且对数据进行分析说明。
结果分析
检测结果参见图5、图6和表4,可以看出,当硝唑尼特与替诺福韦艾拉酚胺(TAF)联用时,在抑制HBsAg方面具有协同/加成效应。
具体而言,为了更加清楚地分析硝唑尼特与替诺福韦艾拉酚胺的协同作用,采用联合指数分析Combination Index(CI)软件CompuSyn softeware V1.0.软件,以Non-Constant Combo方法进行分析,结果参见表4。
相比之下,恩替卡韦(ETV)的结果见表5。
表4硝唑尼特+TAF对HBsAg抑制率联合作用分析
数据点 | 硝唑尼特浓度(μM) | TAF浓度(nM) | 抑制率(%) | CI值 | 结果描述 |
1 | 2.0 | 50.0 | 92.17 | 0.8571 | 协同作用 |
2 | 0.5 | 50.0 | 40.09 | 0.8390 | 协同作用 |
3 | 0.2 | 50.0 | 20.71 | 0.6533 | 协同作用 |
4 | 2.0 | 15.0 | 90.80 | 0.9317 | 加成效应 |
5 | 0.5 | 15.0 | 37.50 | 0.8795 | 协同作用 |
6 | 2.0 | 5.0 | 90.35 | 0.9552 | 加成效应 |
7 | 0.5 | 5.0 | 39.46 | 0.8438 | 协同作用 |
8 | 0.2 | 5.0 | 21.82 | 0.5146 | 协同作用 |
表5ETV试验结果
以上试验结果显示,首先,对照化合物ETV的试验结果符合预期,因此整体试验结果属于可接受范围。
其次,硝唑尼特和TAF的联合用药试验和统计分析表明,硝唑尼特和TAF联用时能有效降低HBsAg,并有明显的协同作用或加成作用。
特别是TAF浓度为50nM,且硝唑尼特浓度在0.2-2.0μM时,二者的组合具有明显的协同作用,或TAF浓度为5nM,且硝唑尼特浓度在0.2-0.5μM时,以及TAF浓度为15nM,且硝唑尼特浓度在0.5μM时,二者的组合表现出明显的协同作用。
根据上述结果可知,治疗有效量的硝唑尼特和治疗有效量的替诺福韦艾拉酚胺组合能够产生加成作用和协同作用,有望成为新的乙肝药物治疗组合。
实施例3.硝唑尼特与替诺福韦艾拉酚胺的动物学研究
将6-8周龄的C57BL/6雄性小鼠用于AAVHBV小鼠模型。
一种重组病毒携带1.3个HBV基因组(基因型D)的拷贝,并被包装在AAV血清型8(AAV8)衣壳中。
成年C57BL/6小鼠通过尾静脉注射,注射指定数量的重组病毒(用磷酸盐缓冲盐水稀释),6-8周后,小鼠被分成两组,接受不同的测试样本剂量。每周监测血清中HBV表面抗原(HBsAg)和HBV DNA的水平。
表6试验方案
分组 | 药物 | 小鼠给药剂量 | 给药方式 |
G1 | 赋形剂 | 0(生理盐水) | 口服,每日一次 |
G2 | 替诺福韦艾拉酚胺(TAF) | 3.75mpk | 口服,每日一次 |
G6 | 硝唑尼特(NTZ) | 100mpk | 口服,每日一次 |
G8 | NTZ+TAF | 100mpk/天+3.75mpk/天 | 口服,每日一次 |
试验结果见图3,虽然口服给药硝唑尼特对HBV DNA抑制作用不甚明显,但与替诺福韦艾拉酚胺联用,有显著的协同作用,能增强对HBV DNA的抑制。
实施例4.硝唑尼特的动物学研究
硝唑尼特单独腹腔给药对AAVHBV小鼠HBV的体内抑制试验。
表7试验方案
试验结果见图4,虽然如实施例3所验证,硝唑尼特单独静脉给药对HBV DNA的降低作用不明显,但通过改变给药途径,即通过腹腔给药,使得HBV DNA有了大约1log的明显下降。
由此可见,在细胞试验和动物试验中,硝唑尼特分别显示了体外对HBsAg的强烈抑制作用,以及体内潜在的HBV DNA抑制作用,虽然硝唑尼特在体内与体外试验中的作用机制不一定完全相同,但上述试验显示硝唑尼特是潜在的有***前景的药物。并且,在硝唑尼特与另外的治疗剂/预防剂如替诺福韦艾拉酚胺联合给药的情况下,能够实现协同增效效果,从而增强对HBV DNA的抑制。
以上,对本发明的实施方式进行了说明。但是,本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.硝唑尼特或其药学上可接受的盐或其类似物单独或与另外的治疗剂或预防剂的组合在制备治疗或预防病毒性肝炎药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其中,所述病毒性肝炎包括乙型肝炎或丁型肝炎。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其中,所述药物降低乙型肝炎病毒(HBV)载量和/或HBsAg水平。
4.根据权利要求1至3任一项所述的应用,其中,所述另外的治疗剂或预防剂是抗病毒药物,优选抗乙肝病毒药物,包括干扰素或PEG-干扰素和核苷类似物;更优选地,所述另外的治疗剂或预防剂选自拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替诺福韦或其衍生物,如富马酸替诺福韦二吡呋酯、替诺福韦艾拉酚胺。
5.药物组合物,所述药物组合物包含治疗有效量的硝唑尼特或其药学上可接受的盐或其类似物和任选的另外的治疗剂或预防剂。
6.根据权利要求5所述的药物组合物,其为口服剂型。
7.根据权利要求5或6所述的药物组合物,其中,所述另外的治疗剂或预防剂是抗病毒药物,优选抗乙肝病毒药物,包括干扰素或PEG-干扰素和核苷类似物;更优选地,所述另外的治疗剂或预防剂选自拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替诺福韦或其衍生物,如富马酸替诺福韦二吡呋酯、替诺福韦艾拉酚胺。
8.根据权利要求6或7所述的药物组合物,其中,所述口服剂型包括片剂、胶囊、混悬剂或口服溶液;作为口服剂型时,使用的剂量标准例如为500-1500mg/天硝唑尼特或其药学上可接受的盐或其类似物,优选用量为700-1200mg/天,优选800-1000mg/天,最优选为1000mg/天的硝唑尼特或其药学上可接受的盐或其类似物。
9.根据权利要求6至8任一项所述的药物组合物,其中,硝唑尼特与另外的治疗剂或预防剂之间的用量比例按重量计,优选为100:1~10:1,优选50:1~20:1,更优选30:1~25:1。
10.根据权利要求6至9任一项所述的药物组合物,所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料,其选自下列辅料中的至少一种:填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、矫味剂、湿润剂、pH调节剂、增溶剂或助溶剂、渗透压调节剂。
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